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Chemistry

Análise de minerais produzidos por hFOB 1.19 e Saos-2 células usando microscopia eletrônica de transmissão com energia dispersiva microanálise de raios-x

doi: 10.3791/57423 Published: June 24, 2018

Summary

Apresentamos um protocolo para comparar o estado de minerais em vesículas lançadas por duas linhas de células de osso humano: hFOB 1.19 e Saos-2. Seus perfis de mineralização foram analisados por alizarina Red-S (AR-S) coloração, visualização de luz ultravioleta (UV), imagem de microscopia eletrônica (TEM) de transmissão e microanálise de raios-x energia dispersiva (EDX).

Abstract

Este vídeo apresenta o uso da microscopia eletrônica de transmissão com microanálise de raios-x energia dispersiva (EDX-TEM) para comparar o estado de minerais em vesículas lançadas por duas linhas de células de osso humano: hFOB 1.19 e Saos-2. Estas linhas de celular, após o tratamento com ácido ascórbico (AA) e β-glicerofosfato (β-GP), submetido a completa transdiferenciação celular osteogênico de proliferação de mineralização e produzir vesículas de matriz (MVs) que desencadeiam a nucleação de apatita na matriz extracelular (ECM).

Com base na coloração de vermelho de alizarina-S (AR-S) e análise da composição dos minerais em lisados celulares usando luz ultravioleta (UV) ou em vesículas utilizando imagens TEM seguida por íon mapeamento e quantificação de EDX, podemos inferir que osteossarcoma Saos-2 e osteoblásticas células hFOB 1.19 revelaram perfis distintos de mineralização. SAOS-2 células mineralize mais eficientemente do que as células hFOB 1.19 e produzem maiores depósitos minerais que não são visíveis sob luz UV, mas são semelhantes a hidroxiapatita (HA), em que eles têm mais Ca e F substituições.

Os resultados obtidos com estas técnicas nos permitem concluir que o processo de mineralização difere dependendo do tipo de célula. Propomos que, a nível celular, a origem e as propriedades das vesículas predeterminar o tipo de minerais.

Introduction

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Osso é um tipo de tecido conjuntivo composto de duas partes: orgânico (células e fibras colágenas) e mineral (compostos de cálcio e fosfato). Os principais componentes minerais nos ossos são apatites1. Diferentes tipos de células competentes de mineralização no osso (osteoblastos), dentes (odontoblastos) e cartilagem (condrócitos) regulam os passos iniciais da mineralização através da produção de proteínas da matriz extracelular (ECM) e liberando a matriz vesículas (MVs) (Figura 1). MVs são vesículas de diâmetro de nm de 100-300 que acumulam cálcio e fosfato, facilitando a nucleação de apatita e posteriormente vincular a colágeno2,3. Em seguida, MVs desintegrar-se para liberar apatites para o meio extracelular. Os apatites continuam a crescer em contato com as fibras de colágeno e formam a matriz óssea. A mineralização é sustentada pela oferta constante de Peu e Ca2 + no meio extracelular. Alguns dados publicados recentemente apoiar nosso modelo4,5. Tecidos moles não mineralize sob condições fisiológicas. No entanto, calcificação ectópica pode ocorrer sob condições patológicas como calcificação vascular3. Células vasculares que adquirem o fenótipo de osteoblastos podem produzir MVs que induzem a nucleação de apatites e iniciar a mineralização nas camadas da parede medial e da íntima dos vasos sanguíneos. Desde calcificação ectópica se assemelham a endocondral normal mineralização3, compreender os mecanismos moleculares da mineralização das células ósseas e condrócitos devem fornecer algumas pistas sobre gravidez ectópica calcificação dos tecidos moles que são formada.

O desenvolvimento dos tecidos esqueléticos é regulado por diversas enzimas, fatores de crescimento e promotores ou inibidores de mineralização. A ação antagonista de tecido-inespecíficos da fosfatase alcalina (TNAP) (Figura 1) e ectonucleotide pyrophosphatase/fosfodiesterase eu (NPP1), juntamente com ankyrin (ANK), controla a concentração de pirofosfato inorgânico (PPeu) 6. PPeu, um potente inibidor da formação de HA, é hidrolisado por TNAP; NPP1 hidrolisa trifosfatos de nucleotídeos para formar PPeu enquanto ANK exporta-PPeu da célula para o ECM. A proporção de Pi/PPi pode regular apatita formação7,8 , com possíveis consequências patológicas9.

A membrana de MV é rico em proteínas de transporte de íons que facilitam a precipitação inicial do cálcio e fosfato dentro os MVs durante o processo de nucleação (Figura 1). O transportador de fosfato 1 (PiT) ajuda a incorporar Peu gerados no espaço perivesicular para o MVs10,11. Anexinas podem estar envolvidas na ligação e transporte de Ca2 + e no processo de Biofísica que inicia a mineralização na MV lúmen12,13. Favorecemos a hipótese, sugerida anteriormente, para mineralização dentro de vesículas intracitoplasmática de nucleação interna de apatita dentro o MV antes de sua propagação na ECM14,15. Modelagem em vitro confirmou a indução de Ca2 +/ peu complexos formação em proteoliposomes feitas de PS e AnxA516. Isso pode indicar que a acumulação de Ca2 +, Peu, AnxA5 e PS complexos em balsas lipídicas de membranesrepresent microvilli-como o núcleo de nucleação (NC) de apatita dentro Mvs anexinas e TNAP também possuem ligação de colágeno capacidades que podem ser úteis na colocação de MVs ao longo de fibras de colagénio e, para estimular a propagação da mineralização em ECM. Fetuin A e osteopontin (OPN)17, são conhecidos como inibidores da formação de apatita que pode abrandar a propagação de mineralização no cadafalso colágenas. Nucleação e propagação são eventos distintos, o primeiro anterior a último, e ambos podem ser relevantes para o processo de mineralização patológica.

Para descobrir como a química de complexos de fosfato de cálcio pode alterar mineralização fisiológica e calcificação ectópica, é necessário identificar os minerais produzidos por células. Apatites são um grupo de cálcio e fosfato contendo minerais com cristal geral unidade célula fórmula Ca10(PO4)6X2, onde X = Cl, F, OH. Eles são classificados como segue18: fluorapatita (FA) Ca10(PO4)6F2, chlorapatite (CA) Ca10(PO4)6Cl2 e hidroxiapatita (HA) Ca10(PO4 )6(OH)2.

A escolha de linhas de células osteoblast para induzir a formação de minerais é crucial, pois cada linha celular apresenta um perfil distinto de mineralização. Neste relatório, nós comparamos a nucleação de minerais por dois modelos de célula selecionada humana de mineralização: células osteoblásticas hFOB 1.19 e osteossarcoma Saos-2 células. Osteossarcoma-derivado de células são comumente usadas como modelos osteoblásticas e Saos-2 células têm preservado o caráter osteoblástica mais maduro19 enquanto células indiferenciadas hFOB fetal humano são amplamente utilizadas como um modelo para o normal osteoblástica diferenciação de20. Seus perfis de mineralização foram analisados por métodos diferentes: coloração vermelho de alizarina-S (AR-S), ultravioleta (UV) luz visualização, imagem de microscopia eletrônica (TEM) de transmissão, energia dispersiva raio-x (EDX) de microanálise quantificação da e íon mapeamento. A vantagem da temperatura-EDX sobre alternativas técnicas utilizadas em estudos anteriores é que dá resultados quantitativos e qualitativos de substituição iônica em cristais de apatita a4,5,21. O objetivo geral de usar TEM-EDX foi encontrar um método simples para geração de imagens e quantificação da distribuição dos íons Ca, F e Cl em vários minerais de diferentes tipos de células durante estágios distintos do processo de mineralização. Este método tem sido utilizado com sucesso, por exemplo, para monitorar a interação de nanopartículas de zinco com produtos químicos coexistentes e seus efeitos combinados em organismos aquáticos22. Em outro estudo, um photocatalyst cobre em materiais de titânio em solução aquosa foi extensivamente caracterizado por espectrometria de emissão óptica de plasma indutivo (ICP-OES), physisorption N2 (BET), XRD, DRS UV-vis, FT-IR, Raman espectroscopia, TEM-EDX e photoelectrochemical medidas23. Nosso objetivo foi comparar a origem e propriedades de vesículas e minerais em duas linhas de celular para entender o mecanismo que controla a mineralização durante a diferenciação óssea.

Figure 1
Figura 1 . Esquema das etapas iniciais de mineralização em células ósseas envolvendo a síntese de proteínas da matriz extracelular (ECM) e a liberação das vesículas de matriz (MVs) da membrana. MVs acumulam cálcio através da ação de proteínas de ligação de cálcio, anexinas e fosfato, através da ação do transportador de fosfato inorgânico (PiT) seguido pela actividade de tecido não-específica da fosfatase alcalina (TNAP), que dephosphorylates PPeu Peu, facilitando assim a nucleação de apatita. Em seguida, MVs desintegrar-se e liberar apatites para o meio extracelular. A mineralização é sustentada pela oferta constante de Peu e Ca2 + no meio extracelular4,5. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Protocol

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1. cultura e tratamento da pilha

  1. Coloque todo o material necessário, sob a capa de fluxo laminar e esterilizá-los sob luz UV. Os meios de cultura são: uma mistura 1:1 de presunto é mídia F12 e DMEM com 2,5 mM L-glutamina suplementado com 100 penicilina U/mL, 100 U/mL estreptomicina, 0,3 mg/mL G418 e 10% de soro Fetal bovino (FBS) (v/v) para antígeno grande do T de feto humano hFOB 1.19 SV40 transfectadas osteoblastos e meio de 5A McCoy com 1,5 mM L-glutamina suplementado com 100 penicilina U/mL, 100 U/mL Estreptomicina e 15% FBS (v/v) para as células humanas osteossarcoma Saos-2.
  2. Cultura de células hFOB 1.19 34 ° c numa atmosfera de 5% de CO2 e células Saos-2 a 37 ° C numa atmosfera de 5% CO2. Transferência de culturas de células, células de 1.19 ou Saos-2 ou hFOB, da incubadora para o bairro de fluxo laminar e mudar o médio a 10 mL de meio de cultura fresco com FBS.
  3. Incubar as células sem estimuladores (células de descanso) ou estimulá-los com 50 µ g/mL ácido ascórbico (AA) seguido de 7,5 mM β-glicerofosfato (β-GP), preparado anteriormente em água ultrapura e filtrada através de filtros de seringa 0,22 µm. Adicione os estimuladores de tubos de plástico microcentrifuga sobre a superfície do meio de cultura. Suavemente agitar o prato de cultura e incubar durante 7 dias.

2. detecção de minerais de cálcio

  1. Lave as culturas de células com salina de tampão fosfato (PBS: 125 mM de NaCl, 5 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1mm KH2PO4, pH 7,0).
  2. Adicionar 5 mL de 2% (g:100 mL) AR-S em PBS, pH 5,0 e incubar as placas durante 30 min manchar os minerais.
  3. Lavar 3 vezes com PBS. Cuidadosamente adicionar PBS para a parede de prato, não tente destruir os minerais.
  4. Observar minerais cálcio sob um microscópio invertido e tirar fotos.

3. visualização das sondas sob luz UV

  1. Para lisados celulares, trate as culturas de células, ou descansando ou estimulada por 7 dias, de acordo com a digestão de colagenase protocolo24.
  2. Coletar o meio de culturas de células e lavar as células com PBS.
  3. Digeri as células com 3 mL de 500 colagenase U/mL em uma solução de 0,25 M de sacarose, 0.12 M NaCl, 0,01 M KCl e buffer de 0,02 M Tris-HCl, pH 7,45, a 37 ° C por 3 h.
  4. Raspar as células mecanicamente, transferi-los para tubos de plástico microcentrifuga e passá-las 10 vezes através de uma seringa de U 1 mL 40 com 0,5 × 16 de agulha.
  5. Centrifugar as amostras a 500 × g por 5 min.
  6. Desprezar o sobrenadante e suspender o centrifugado em 500 µ l de linfa de cartilagem sintética (SCL, 100 mM de NaCl, 12,7 mM KCl, 0,57 mM MgCl2, 1,83 mM NaHCO3, 0,57 mM NaH2PO4, 5,5 mM D-glicose, sacarose 63mm, 16,5 mM Hepes, pH 7,4).
  7. Transferir a hidroxiapatita (HA), fluorapatita (FA) e chlorapatite (CA) pós de garrafas em transiluminador de UV com uma espátula e utilizar como controles.
  8. Transferir os lisados celulares dos tubos de plástico com pontas de plástico e coloque cuidadosamente o transiluminador UV.
  9. Tire fotos sob visível e UV luz.

4. preparação de sondas de temperatura-EDX

  1. Preparação de minerais para a coloração negativa
    1. Suspender a 2,5 mg de produzido sinteticamente minerais HA, CA e FA25 em 500 µ l de água deionizada e incubar a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO2 por 1h.
    2. Tirar grades Formvar/carbono 300 Mesh Ni da caixa com pinça antiestática, coloque em um prato de porcelana multi bem e soltar 10 µ l de suspensões HA, CA e FA nas grades.
    3. Seca as amostras por 30 min à temperatura ambiente.
  2. Preparação de descansar e estimulou as células para a incorporação de 26
    1. Coletar o médio das culturas de células e lavar as células com o meio de dessensibilização fisiológicos (PD) (125 mM de NaCl, 5 mM KCL, 10mm NaHCO3, 1mm KH2PO4, glicose 10 mM, 20 mM HEPES, pH 7,4).
    2. Fixe as células com 5 mL de uma mistura de 3% (g:100 mL) paraformaldehyde/1% (g:100 mL) de glutaraldeído em tampão de fosfato de sódio de 100 mM, pH 7,2, por 1h à temperatura ambiente sob a coifa.
    3. Lavar as células com 5 mL de tampão de fosfato de sódio de 100 mM e com cuidado, remova o tampão após a lavagem.
    4. No quarto escuro, o postfix as amostras com 2 mL de tetróxido de ósmio (g:100 mL) 1% em tampão de fosfato de sódio de 100 mM, pH 7,2, por 20 min em temperatura ambiente sob a coifa.
    5. Remover o tetróxido de ósmio e utilizá-lo.
    6. Lave as células com 5 mL de tampão de fosfato de sódio de 100 mM.
    7. Então, desidrata-se as amostras em alíquotas de 5 mL de uma série de solução gradual do etanol à temperatura ambiente: 25% (Vol.) por 5 min, 50% (Vol.) por 10 min, 75% (Vol.) por 15 min, 90% (Vol.) por 20 min. Finalmente, usar etanol absoluto duas vezes e incube por 30 min e 12 h.
    8. Mecanicamente, raspar as células desde os plástico Petri pratos de cultura, coletar em tubos de plástico microcentrifuga e centrifugar as amostras a 130 x g por 1 min.
    9. Remover os sobrenadantes e suspender as células em 1 mL de uma mistura de resina de LR White e etanol absoluto em uma relação de volume de 1:2.
    10. Misture bem o conteúdo dos tubos de vidro antes do uso e incube por 30 min à temperatura ambiente.
    11. Centrifugar as amostras a 130 x g por 1 min.
    12. Remover os sobrenadantes e repita a etapa anterior usando 1 mL de uma mistura 1:1 de resina LR White e etanol absoluto.
    13. Misture bem e incube por 30 min à temperatura ambiente.
    14. Centrifugar as amostras a 130 x g por 1 min.
    15. Remova os sobrenadantes.
    16. Finalmente, adicionar 1 mL de resina pura LR White para as amostras de duas vezes e incubar por 1h à temperatura ambiente em tubos de plástico.
    17. Coloque 500 µ l de cada amostra em cápsulas de gelatina.
      Nota: As amostras são etiquetadas usando uma pequena folha de papel e um lápis para que a resina não destrói os rótulos.
    18. Fechar as cápsulas de gelatina, coloque-os em tubos de plástico microcentrifuga e centrifugar a 130 x g por 1 min em um rotor basculante.
    19. Remova as cápsulas dos tubos de plástico usando uma bomba de vácuo.
    20. Mover as amostras para o forno e polimerizar a 56 ° C por 48 h.
    21. Prepare os blocos montá-los no suporte e apará-los para a pirâmide.
    22. Colocar o suporte a ultramicrotome, anexar a faca Ultra 45° de diamante e preenchê-lo com água desionizada; Lembre-se de limpar a lâmina de bolhas de ar incidentais.
    23. Então corte seções (700 Å) usando a faca de diamante para o banho de água desionizada.
    24. Definir as sobras usando cílios bovina e lugá-los no lado brilhante da Formvar/carbono 300 malha grade Ni e secá-las.
    25. Prepare o acetato de uranilo 2.5% (Vol.) em etanol absoluto no escuro sob uma coifa. Manter o acetato de uranilo em um recipiente de chumbo e lembre-se de não pegar o sedimento.
    26. No quarto escuro, counterstain as grades de apatites sintéticos e amostras de células com 2,5% (Vol.) acetato de uranilo em etanol por 20 min em temperatura ambiente sob a coifa.
    27. Lavar as grades em etanol a 50% (Vol.), em seguida em água desionizada e secar em temperatura ambiente por 24 h. Finalmente, coloque as grelhas na caixa.

5. TEM EDX-análise

  1. Imagem latente TEM por um microscópio eletrônico de transmissão (TEM) equipado com microanálise de raios x dispersiva energia gama completa (EDX) sistema e 11 Megapixel câmera
    1. Prepare-se para a observação de minerais e células um titular de berílio. Use ferramentas antiestáticas.
    2. Remover o par de parafusos e levantar a placa de berílio e a arruela de berílio longe do resto do retentor.
    3. Monte a grade, lado brilhante, no suporte.
    4. Cuidadosamente coloque a arruela de berílio e placa de berílio e Dane-se firmemente os parafusos de fixação.
    5. Coloque o suporte para a câmara de vácuo e ligue a bomba de vácuo.
    6. Depois de um vácuo é alcançado, delicadamente, encaixe o suporte da câmara de imagem e ligue o feixe.
    7. No monitor fluorescente, defina os parâmetros de abertura do microscópio. Realizar correção de astigmatismo de imagem; definir o zoom, foco e quadro; e tirar fotos TEM em uma ampliação de 50, 000 X.
  2. Imagem latente do tronco e microanálise de raios-x para análise espectral e composição
    1. Insira o detector de raios-x (EDX) energia dispersiva na microscopia eletrônica (tronco) de imagens câmara de varredura transmissão.
    2. Ajuste a nitidez da imagem no modo de foco.
    3. Tirar fotos de haste em uma ampliação de 15, 000 X.
    4. Selecione um ponto da amostra para microanálise de raios-x e coletar espectros.
    5. Obter dados, somando todos os pesos de atômica para todos os elementos da tabela periódica na amostra (como 100%) e significando o conteúdo de elementos selecionados: Ca, F, Cl e P (como % atômica). Em seguida, calcule os rácios de Ca, F ou Cl de P para cada amostra.
  3. Mapeamento de íon
    1. Selecione elementos como cálcio, flúor, cloro e fósforo para fazer o mapeamento de íon e executar mapas EDX dos elementos selecionados nas amostras.
    2. Obter dados indicando a localização dos elementos analisados: Ca, F, Cl e P (como % atômica) e calcular a localização co (em %) do Ca, F ou Cl com P para cada amostra.

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Representative Results

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Temperatura-EDX permite obter a imagem em vitro das vesículas de matriz (MVs) lançadas pela mineralização de células e de minerais produzidos por Mvs. os resultados obtidos usando esta técnica demonstram que o processo de mineralização pode proceder de forma diferente em vários tipos de células. As linhas de duas células receberam o mesmo tratamento de transdiferenciação celular osteoblástica, ainda estimulados Saos-2 células mais eficientemente do que hFOB mineralizado 1,19 osteoblastos, como evidenciado pelo AR-S coloração (Figura 2). Isto pode ser devido o fenótipo osteoblast mais maduro de Saos-2 células19 em comparação com hFOB 1.19 células20. A visualização das amostras usando um transiluminador UV feito claro que fluorapatites só podem ser observadas sob luz UV (Figura 3). Imagens TEM indicaram que estimulados Saos-2 células produzem mais vesículas contendo minerais em comparação às células hFOB estimulada ou com células Saos-2 (Figura 4, os painéis esquerdos e meio) a descansar. Apatites sintéticos têm formas diferentes de minerais (Figura 4, painel direito). TEM imagens mostraram a presença de vesículas em hFOB 1.19 e Saos-2 células sob descansando e estimulou as condições (Figura 5, deixada o painel). Em mapas de íon EDX, os pontos vermelhos indicam cálcio, pontos verdes mostram pontos de azul e fósforo apontar para as distribuições de flúor (Figura 5, painel médio). Sob condições estimuladas, há uma forte sobreposição entre as distribuições de cálcio e fósforo em vesículas produzidas pelas células Saos-2 e entre flúor e fósforo em vesículas produzidas pelas células hFOB 1.19 (Figura 5, painel direito).

Figure 2
Figura 2 . AR-S coloração de minerais (vermelho) produzido pela hFOB 1.19 (painel superior) e Saos-2 (painel inferior) células quer descansar (R) ou após 7 dias de estimulação com AA e β-GP (S). Bar: 25 µm. Um resultado típico com n = 3 é apresentado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3 . Visible (painel superior) e visualização de luz UV (painel central) de minerais sintéticos de HA, CA e FA e de minerais produzidos por hFOB 1.19 (painel esquerdo inferior) e Saos-2 (painel à direita inferior) células quer descansar (R) ou após 7 dias de estimulação com AA e β-GP (S) . Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 

Figure 4
Figura 4 . TEM imagens de vesículas e minerais produzidas por hFOB 1.19 (painel esquerdo) e Saos-2 (painel central) células quer descansar (R) ou após 7 dias de estimulação com AA e β-GP (S). Minerais sintéticos de HA, CA e FA são mostrados como controles (painel direito). Bar: branco 500 nm, preto 250 nm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 

Figure 5
Figura 5 . TEM imagens (painel esquerdo) do hFOB 1.19 e Saos-2 células quer descansar (R) ou após 7 dias de estimulação com AA e β-GP (S). Íon de mapas para Ca (vermelho), Cl (amarelo), F (azul) e P (verde) de EDX (painel central). Localização de co dos elementos (painel direito): cálcio para fósforo (Ca), flúor de fósforo (F), ou cloro para fósforo (Cl) foi quantificado com base nos mapas EDX. Bar: 500 nm. Foram realizados três experimentos independentes para ambas as linhas de célula. 10 fotos de cada variante (descansando e estimulada) foram tomadas e, em seguida, de 2 a 6 deles foram selecionadas para mais cálculo de localização co elemento. Um resultado típico é apresentado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 

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Discussion

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No jornal atual, descrevemos os protocolos de coloração, identificação de luz UV de fluorapatita AR-S e TEM-EDX em vitro imagem de MVs lançados pela mineralização de células e de minerais produzidos por MVs. É possível abordar todos os métodos mencionados acima, seguindo algumas etapas de solução de problemas comuns. A fim de obter resultados óptimos, vários passos críticos devem ser realizados com cuidado. Primeiro, é melhor adicionar AA (que é ácida) seguido por β-GP (que é alcalino) para preservar o pH 7,4, do meio de cultura. Em segundo lugar, após coloração de AR-S, os depósitos de cálcio manchadas são muito frágeis e as células devem ser lavadas com muito cuidado para evitar a destruição dos cristais após adição de PBS. Em terceiro lugar, mantenha sempre o acetato de uranilo em um recipiente de chumbo e não pegue o sedimento porque apenas a fração diluída deve ser usada para fixação. Em quarto lugar, lembre-se que o acetato de AA e uranilo são sensíveis à luz e devem ser manuseados no quarto escuro. Em quinto lugar, a mistura de branco de LR com etanol absoluto deve ser misturada bem antes de serem adicionados às amostras. Sexto, as amostras em cápsulas de gelatina devem ser rotulado, usando uma pequena folha de papel e um lápis para que a resina não destrói os rótulos. Sétimo, a lâmina da faca diamante deve ser cuidadosamente limpo de quaisquer bolhas de ar. Oitavo, amostras devem ser colocadas com cautela no lado brilhante da grade onde se situa o filme Formvar/carbono. Nono, posicione corretamente o ponto no qual microanálise de raios-x e íon mapeamento é realizado a imagem TEM para limitar eventuais problemas com reconhecimento de apatita.

Embora o protocolo apresentado provou para ser mais favorável em nosso projeto experimental, é possível modificá-lo para ajustar objetivos diferentes. Como com qualquer outra técnica, esta também tem suas limitações. Técnicas adicionais, tais como FTIR, devem ser aplicadas para confirmar ou verificar a existência de relação obtida dos elementos examinados8,12,26. O método TEM-EDX aqui apresentado é uma melhoria significativa em relação ao método existente, que é uma combinação de métodos de mapeamento e quimiométricas baseados em micro-Raman e é semelhante à imagem de nanopartículas de prata (AgNPs) distribuição de vários superfícies de minerais e o mecanismo de suas interações moleculares21. Geração de imagens baseada em Raman foi testada em dois modelos de minerais (macro e micro porte). Mapas de Raman feitos de n = 600-900 espectros para cada amostra/controle foram analisados pelo software Vespucci e os resultados foram confirmados através de outros métodos como ICP-OES, AFM e SEM-EDX. Nossa EDX-TEM mapas composta por n = 30 frames e n = 6 espectros para cada amostra/controle também foram analisados pelo software Suite microanálise, e os resultados foram confirmados através de outros métodos como FTIR, FM, TEM, SPM e AFM de topográfico 3D4 , 5. a microanálise EDX-TEM proposto, como geração de imagens baseada em Raman, requer apenas a preparação da amostra mínima, é super sensível, não invasiva e cost-effective e pode ser estendido para outros sistemas relevantes para o ambiente humano.

A técnica apresentada pode ser usada em um amplo campo de pesquisa no futuro. Pode ser modificado para a investigação de diferentes apatites naturais e sintéticas. Ele também pode ser ajustado para caber os protocolos de experimentos com biológico e químico sondas. Além disso, todos os elementos da tabela periódica podem ser analisados a fim de Visualizar não só a morfologia dos minerais, mas também mudanças na sua composição de íon e substituições. Troca iônica em apatites é um procedimento conhecido para aplicação biomédica27. Um possível fator fisiológico que controla os íons Ca, F e Cl ou Sr, Mg, Mn e Zn substituição do íon do metal no HA durante a formação de minerais, que é um ponto de viragem entre mineralização fisiológico e patológico, pode ser o Pi/PPi proporção de7. Se aplicado corretamente, esta técnica permite realizar o mapeamento de vários elementos da mesma região celular, vesicular ou mineral várias vezes em uma fileira.

Nos últimos anos, muito progresso foi feito sobre os mecanismos de osso mineralização28,29,30,31,32,33. Percebemos que a linhagens celulares diferentes podem ter perfis distintos de vesículas e formação mineral. A este respeito, nós selecionamos duas linhas de células humanas: osteoblástica hFOB 1.19 osteossarcoma Saos-2, que passam por completa osteogênica transdiferenciação celular da proliferação de mineralização e produzir MVs que desencadeiam a nucleação de apatita em ECM 34 , 35.

AR-S coloração dos depósitos de cálcio revelou que estimulados Saos-2 células mineralizado diferente hFOB 1.19 osteoblastos. Isto foi correlacionado com a produção de minerais pelas células Saos-2 que eram indetectáveis em contraste com aqueles produzidos por células hFOB 1.19 à luz UV. Nossos dados de EDX-TEM revelaram que os minerais produzidos em vesículas de Saos-2 células eram semelhantes aos sintético HA devido a sobreposição em distribuições de cálcio e fósforo. Em contraste, a sobreposição em distribuições de fósforo e flúor em vesículas de células hFOB 1.19 indicou a formação de outros tipos de minerais além de apatites.

Em conclusão, nossos resultados indicam que as vesículas são determinantes de nucleação de minerais, especialmente no nível celular5,25. Além disso, nossos dados são de acordo com uma teoria anterior que MVs podem ser considerados como uma forma especializada de microvesicles que são capazes de começar a mineralização dentro bem como fora da cela4. A comparação das vesículas libertadas da Saos-2 células, que mineralize mais eficientemente, e vesículas libertadas hFOB 1.19 células usando o método microanalytical TEM-EDX suporta a hipótese de que a MVs são vesículas cheias de mineral. Isto deixa em aberto a questão se a presença de MVs é necessária para induzir a nucleação de apatita, e como isso pode alterar fisiológicos para mineralização patológica.

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Disclosures

Os autores declaram que não têm nenhum conflito de interesses.

Acknowledgments

MK e ASK executadas operações manuais e LB preparou desenhos e fez o filme. ASK escreveu o manuscrito, LB escreveu o roteiro e MK preparou a mesa. SM, RB e SP ler criticamente a tabela, o script e o manuscrito. Os autores gostaria de agradecer a Hanna Chomontowska pela sua excelente assistência com Ultramicrotomia bem como Szymon Suski e Henryk Bilski pela excelente assistência com análise TEM-EDX. Os autores gostaria de agradecer o dr Patrick bosques para correção profissional de língua inglesa e Barbara Sobiak para gravar as instruções.

Este trabalho foi apoiado pela concessão N N401 140639 do Ministério da ciência e do ensino superior polonês ao perguntar, por subvenções do centro nacional de ciência, Polónia 2016/23/N/NZ4/03313 LB e 2016/23/N/NZ1/02449 para MK, UE FP7 projeto BIOIMAGINE : BIO-imagem latente em investigação, inovação e educação, GA n. º 264173 e pelos fundos estatutários do Instituto Nencki Instituto de Biologia Experimental, polonês Academia de Ciências.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
Ham’s DMEM/F12 media mixture PAA E15-813 1:1, for human fetus hFOB 1.19 SV40 large T antigen transfected osteoblasts (ATCC CRL-11372)
McCoy’s 5A medium PAA E82312-0025 for human osteosarcoma Saos-2 cells (ATCC HTB-85)
Antibiotics mixture (penicillin/streptomycin) Sigma P0781-100ML 100 U/mL each
G-418 Sigma 68168 0.3 mg/mL
FBS Gibco 10270 10% for hFOB 1.19 and 15% for Saos-2
AA Sigma A-5960 50 µg/mL
ß-GP Sigma G9422-100G 7.5 mM
Bio-Gel HTP Gel Bio-Rad 130-0420 for HA
FA synthesized by us
CA synthesized by us
Sodium phosphate buffer Na2HPO4/NaH2PO4 mixture Sigma S7907/S8282 0.1 M, pH 7.2
PBS pH 7.0, prepared by us
AR-S in PBS Sigma A5533-25G 0.5 g/100 mL, pH 5.0
Collagenase type IA Sigma C2674 500 U/mL
SCL buffer prepared by us
Deionized wather produced by us
Ethanol POCh BA6480111 absolut 99.8% and solutions 25, 50, 75, 90%
Uranyl acetate in 50% ethanol Polysciences Inc. 21447-25 0.25 g/10 mL
PD medium pH 7.4, prepared by us
Fixation mixture (paraformaldehyde/glutaraldehyde) Sigma 158127/G-6257 3%:1%
Post-fixation OsO4 Sigma 75633 1%
LR White resin in ethanol Polysciences Inc. 17411-MUNC 500g 1:2, 1:1, 100%
Acetone CHEMPUR 111024800 pure
Tool
Cryogenic vials Corning Inc. 430487 1.2 mL
Plastic Petri culture dishes Falcon 353003 100 mm
Plastic tubes Falcon 352096 and 352070 15 and 50 mL
Serological pipettes Falcon and VWR 357521 and 612-3700 1 and 10 mL
Plastic microcentrifuge tubes Sigma Z688312 and Z628034 1.5 mL black and 2 mL transparent
Plastic tips VWR 613-0364, 613-0239 and 613-1050 0.1-10 µL natural, 1-200 µL yellow and 200-1000 µL blue
Plastic racks Light Labs A-7055-Z, A-7053-C green for tubes, orange for micro tubes and blue for TEM probes
Laminar Hera Save Thermo Scientific Co. KS12 HEPA filter (H14 according to DIN EN 1822)
Incubators Hera Cell Thermo Scientific Co. 150 34°C for hFOB 1.19 and 37°C for Saos-2
Fume hood POLON WCS-2 for TEM stainings
Glass bottles SIMAX 1632414501050 and 1632414501100 50 and 100 mL
Quartz glass tubes SIMAX 638422010100 Ø 10 mm, L 100 mm
Pump IBS Integra Biosciences VACUSAFE comfort for vacuum
Oven Memmert UNE 400 56°C
Porcelain multi-well plate Rosenthal technik 229/12 12 wells
Glass beakers SIMAX 632417010025 25 mL
Glass bottles Pocord DIN22 10 mL
Plastic box Agar Scientific Ltd. for darkness
Snap Fit Gelatin Capsules Agar Scientific Ltd. G3741 size 1
Formvar/Carbon 300 Mesh Ni grids in box Agar Scientific Ltd. S162N3 film on the shiny side
Silicon cell scraper Sigma SIAL0010-100EA size 1.8/25 cm
Syringe with needle BogMark 007 syringe 1 mL 40 U, needle 0.5 x 16
Syringe Chirana CH005L 5 mL
Centrifuge MPW Medical Instruments MPW-350R 130 x g and 500 x g
UV transluminator UVP M-20 for visible and UV light
Ultramicrotome LKB NOVA 700Å sections
Block holder LKB E6711 round shape
Diamond knife DiATOME Ultra 45° size 3
Eyelash holder bovine, prepared by us
Forceps ROTH 2855.1 antistatic for grids
Spatulas set ROTH E286.1 antistatic for powders
Imaging
Inverted Light Microscope Zeiss with Canon AxioObserver Z1 equipped with PowerShot G9 Phase contrast, Transmitted light, 20 x objective, RGB filters
Transmission Electron Microscope TEM Jeol Co. with Oxford Instruments and SiS-Olympus JEM-1400 TEM equipped with full range INCA Energy Dispersive X-ray microanalysis (EDX) System and 11 Megapixel MORADA G2 camera magnification 50,000X for TEM and 15,000X for STEM and EDX
Camera body and lenses Nikon Nikon D7100
Nikkor AF Micro 105 mm f/2.8D
Nikkor AF-S 50 mm f/1.8G
Nikkor AF 28 mm f/2.8D
for movie recordings
Microphone MXL Mics Tempo for voice recordings

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References

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Análise de minerais produzidos por hFOB 1.19 e Saos-2 células usando microscopia eletrônica de transmissão com energia dispersiva microanálise de raios-x
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Bozycki, L., Komiazyk, M., Mebarek, S., Buchet, R., Pikula, S., Strzelecka-Kiliszek, A. Analysis of Minerals Produced by hFOB 1.19 and Saos-2 Cells Using Transmission Electron Microscopy with Energy Dispersive X-ray Microanalysis. J. Vis. Exp. (136), e57423, doi:10.3791/57423 (2018).More

Bozycki, L., Komiazyk, M., Mebarek, S., Buchet, R., Pikula, S., Strzelecka-Kiliszek, A. Analysis of Minerals Produced by hFOB 1.19 and Saos-2 Cells Using Transmission Electron Microscopy with Energy Dispersive X-ray Microanalysis. J. Vis. Exp. (136), e57423, doi:10.3791/57423 (2018).

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