Summary
Comme les variantes génétiques associées à des maladies humaines commencent à devenir non couvert, il devient de plus en plus important de développer des systèmes permettant d’évaluer rapidement l’importance biologique de ces variants identifiés. Ce protocole décrit les méthodes d’évaluation de la fonction du gène humain au cours de la méiose femelle j’ai utiliser les ovocytes de souris.
Abstract
Aneuploïdie embryonnaire est la principale cause génétique de la stérilité chez l’homme. La plupart de ces événements sont créés au cours de la méiose femelle, et quoique corrélés avec l’âge maternel, âge seul n’est pas toujours prédictive du risque de générer un embryon aneuploïde. Donc, les variantes génétiques pourraient expliquer pour la ségrégation des chromosomes incorrect au cours de l’ovogenèse. Étant donné que l’accès à des ovocytes humains est limitée à des fins de recherche, une série de tests ont été développés pour étudier la fonction du gène humain au cours de la méiose I à l’aide des ovocytes de souris. Tout d’abord, l’ARN messager (ARNm) du gène et variant du gène d’intérêt sont microinjected dans des ovocytes de souris que j’ai arrêté la prophase. Après avoir laissé le temps à l’expression, ovocytes sortent de façon synchrone en maturation méiotique pour compléter la méiose I. Par le marquage de l’ARNm avec une séquence d’un reporter fluorescent, tels que de la protéine fluorescente verte (Gfp), la localisation de la protéine humaine peut être évaluée en plus les altérations phénotypiques. Par exemple, gain ou perte de fonction peut être étudiée par l’établissement de conditions expérimentales qui remettent en question le produit du gène pour corriger les erreurs méiotiques. Bien que ce système est avantageux dans les enquêtes sur la fonction de protéine humaine durant l’ovogenèse, l’interprétation adéquate des résultats devrait être entreprise, étant donné que l’expression de la protéine n’est pas aux niveaux endogènes et, à moins que contrôlé (c'est-à-dire frappé out ou vers le bas), murins homologues sont également présents dans le système.
Introduction
L’infertilité est une maladie qui touche 10 à 15 % de la population humaine d’âge procréateur 1, d'où presque moitié cherche un traitement médical 2. Bien que l’étiologie de l’infertilité est diversifiée et une anomalie génétique la plus courante chez l’homme est souvent multifactorielle, aneuploïdie embryonnaire 3. Aneuploïdie est définie comme l’écart (gain ou perte) du bon nombre de chromosomes dans une cellule. Le phénomène de l’aneuploïdie sur les embryons humains est fréquent et augmente avec l’âge maternel avancé 4,5. Quatre essais comparatifs randomisés ont mis en évidence l’avantage de la sélection des embryons (euploïdes) seulement chromosomique normales pour le transfert de l’utérus parce que cette stratégie a donné lieu à des taux accrus d’implantation, taux d’avortement spontané et un temps plus court pour atteindre la grossesse 6,7,8,9. Par conséquent, comprendre l’étiologie de l’aneuploïdie humaine peut avoir des implications importantes en procréation assistée.
Bien que le dépistage génétique pré-implantatoire pour aneuploïdies est bénéfique dans les traitements contre l’infertilité, une compréhension approfondie de la façon dont sont originaires les aneuploïdies fait encore défaut. Il est largement admis qu’il existe une corrélation positive des aneuploïdies méiotiques (son originaires au cours de la production des gamètes) et âge de la mère, cependant, certains taux d’aneuploïdie embryonnaires présents des femmes qui s’écartent de la moyenne pour leur âge donné 4. Ces cas donnent à penser que l’âge seul n’est pas toujours prédictive du risque de générer un embryon aneuploïde. Autres facteurs peuvent jouer un rôle dans l’augmentation du risque d’aneuploïdie embryonnaire, comme les variantes génétiques.
Un aspect clé de l’enquête sur la contribution potentielle d’un variant du gène de l’aneuploïdie au cours de la méiose de l’ovocyte est de concevoir un système pour évaluer rapidement la fonction du gène méiotique. En raison des contraintes éthiques et un accès limité, il est impossible de réaliser ces expériences à l’aide d’ovules humains. Ces problèmes peuvent être contournés en utilisant des ovocytes de souris, et ici une série de tests pour évaluer la fonction du gène humain au cours de la méiose I sont décrites. Par microinjecting l’ARN messager (ARNm) codant pour la variante du gène d’intérêt, la localisation de la protéine humaine dans le œuf de souris peut être visualisée et utilisée pour déterminer si l’expression ectopique de la protéine humaine sauvage et mutante dans un altérations phénotypiques qui pourraient conduire à une aneuploïdie. Ces phénotypes comprennent une augmentation dans les microtubules qui s’attachent à la mauvaise sœur kinétochore et l’incapacité de soutenir l’alignement des chromosomes en métaphase de la méiose I. ce qui est important, ce protocole peut être utilisé pour étudier le gain et perte de fonction variants génétiques en établissant des conditions expérimentales spécifiques à contester les événements clés de la méiose de l’ovocyte tels que broche d’alignement bâtiment et le chromosome 10.
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Protocol
1. molecular Cloning
- Obtenir le DVD complet séquence codante du gène d’intérêt et le plasmide dans vitro transcription (pIVT) vecteur11.
NOTE : Clones d’ADNc pleine longueur sont disponibles dans le commerce de différents fournisseurs ou peuvent être générés via la chaîne par polymérase transcription inverse (RT-PCR). Le Centre National de ressources en ligne Biotechnology Information (NCBI) fournit des séquences de la transcription des gènes de nucléotide et exprimés séquence étiqueté les bases de données (EST). Pour la facilité de la protéine, visualisation et l’analyse des niveaux d’expression, fusion de la protéine fluorescente verte (Gfp) ou une autre balise fluorescente appropriée peuvent être souhaitable dans la stratégie de clonage. - En utilisant une stratégie de clonage validée, insérez la séquence codante du gène d’intérêt dans la région de clonage multiples de pIVT. Une description détaillée du clonage moléculaire et les étapes nécessaires ont été précédemment décrits 12.
Remarque : Si un produit de gène-fusion doit être générée, veillez à ce que le clonage est dans le cadre de lecture adéquat. - Séquence de la construction à l’aide des amorces de globine afin d’assurer l’insertion du gène correcte, bonne fusion dans le cadre, et qu’aucune mutation induite par la polymérase de point ont été créées.
Remarque : Si l’équipement de séquençage de l’ADN Sanger n’est pas disponible, beaucoup de compagnies offre faible coûts options de séquençage de l’ADN. - Mutagenize ADN si génère des polymorphismes de nucléotides simples (SNP) ou insertions/délétions (INDELS). Mutagénèse d’ADN est décrite dans les étapes 1,5 à 1,7 ci-dessous. Pour des constructions de type sauvage, passez à l’étape de linéarisation 1.7.
- Concevoir des amorces de mutagenèse et compléter la réaction de PCR de mutagenèse pour générer la construction mutante selon le protocole du fabricant. PCR-mediated de mutagénèse dirigée a été décrit précédemment 13. En outre, beaucoup de compagnies offre des kits de mutagenèse incluent les protocoles.
- Transformer mutagénisé ADN hôte bactérien. Isoler et purifier les plasmides.
Remarque : Beaucoup d’entreprises font des kits qui peuvent être utilisés pour isoler et purifier l’ADN plasmidique facilement. Suivre le protocole de fabricants en conséquence. Si vous utilisez une souche bactérienne Gram-négative telles que Escherichia coli, il est recommandé d’utiliser un kit qui supprime des endotoxines. - Séquencer l’ADN isolé des transformants bactériennes à l’aide de standard séquençage Sanger pour confirmer l’introduction du SNP ou INDEL désirée.
- Linéariser des produits finaux à l’aide de la même enzyme de restriction digestion de l’ADN purifié.
Remarque : Le vecteur pIVT contient plusieurs single-enzyme coupe sites inscrits sur la carte plasmidique sur Addgene 14. - S’assurer que le produit est linéaire par électrophorèse sur gel d’agarose. La méthode d’électrophorèse sur gel d’agarose a été précédemment défini 14.
Remarque : Pour toutes les étapes restantes, utilisez embouts barrière (filtre) et des matériaux sans RNase pour assurer une production stable et de haute qualité RNA. - Purifier le produit digéré à l’aide d’un protocole de nettoyage ADN ou kit validé et éluer dans de l’eau exempte de RNase/DNase 30 µL.
NOTE : Spin de silice-matrice colonne à base de produits sont recommandés pour la qualité, purifié l’ADN. Suivre le protocole de fabricants en conséquence. - In vitro transcrire ADN polymérase T7 suivant le protocole du fabricant à l’aide.
- Purifier et éluer l’ARN dans 30 µL d’eau libre de RNase ni DNase utilisant un kit de purification de basée sur les colonnes des acides nucléiques spin de silice-matrice suivant le protocole du fabricant.
- Effectuer la dénaturation électrophorèse sur gel d’agarose à l’aide de formaldéhyde pour confirmer la taille finale du produit RNA. Reportez-vous aux étapes 1.13-1,22 au-dessous de 14. (Figure 1).
- Préparer le gel en chauffant 1 g d’agarose dans 72 mL eau jusqu'à dissolution, puis laisser refroidir à 60 ° C.
- Préparer 10 X vadrouilles tampon en cours d’exécution en ajoutant des vadrouilles 0,4 M (pH 7,0), acétate de sodium 0,1 M et EDTA 0,01 M.
- Ajouter 10 mL de 10 X vadrouilles exécutant tampon et 18 mL de 37 % de formaldéhyde (12,3 M) à la solution d’agarose refroidi.
- Caste le gel en versant la solution d’agarose dans un conteneur de formation de gel. Utilisez un peigne assez grand pour accueillir 10 µL. Après que gel a sélectionné et est ferme au toucher, retirez délicatement le peigne.
- Assembler le gel dans la cuve d’électrophorèse et ajouter assez 1 X vadrouilles tampon, assurant que le gel soit complètement recouvert.
- Préparation échantillons RNA en ajoutant 1 µg d’ARN à 0,5 volumes X de colorant de chargement contenant du formaldéhyde.
- Ajouter le bromure d’éthidium à RNA solution à une concentration de 10 µg/mL.
- Dénaturer la solution échantillon RNA à 70 ° C pendant 5 min.
- À l’aide de stérile, 10 µL pointes à filtre, charger 5 µL de marqueur de poids moléculaire et 5 µL d’ARN échantillons dans les puits séparés du gel et electrophorese à 5 V/cm jusqu'à ce que la teinture a migré au moins deux-tiers de la longueur du gel.
- Visualiser l’ARN dans le gel sur un illuminateur de trans UV. S’assurer que l’ARN est la bonne taille en comparant le marqueur de poids moléculaire.
- Pour mesurer la concentration et la pureté de l’ARN, transférer 1,2 µL d’ARN purifié à l’aide de filtre stérile de µL 10 conseils sur un spectrophotomètre UV.
Notez que RNA haute qualité devrait avoir rapports absorbance A260/280 (1,8 à 2,2) et 260/230 (> 1,7) respectivement. - En utilisant 10 µL bouts filtrants, aliquotes le restant de l’ARN purifié dans 0,5 µL centrifugation des tubes stériles (3-5 µL/tube). Stocker les tubes à-80 ° C jusqu’au moment de microinjection.
Remarque : Une concentration de la dernière injection de 500 ng/µL est un point de départ optimal. Il est recommandé de diluer RNA 1:2 en RNase libre H20 avant microinjection pour réduire la viscosité de l’ARN dans la pipette de micro-injection.
2. kinétochore-Microtubule attachement Assay
- Diviser les ovocytes en groupes égaux de microinjection.
NOTE : Collecte des ovocytes, transfert, microinjection et maturation méiotique a été décrite en détail dans JoVE précédemment 15. - Microinject un groupe avec l’ARNm expérimentale et les autres groupes au contrôle WT ou Gfp et PBS ARNm.
NOTE : 500 ng/µL est la concentration d’injection recommandé de commencer par 10. Un picoinjector peut être utilisé pour contrôler la quantité d’injection. Un volume d’injection de 5-10 pL est recommandé 15. - À l’aide d’une main ou la bouche des appareils pipetage à jeton où le verre pipette ouverture est légèrement plus grand que le diamètre d’un ovocyte (100-150 µm), transfert des ovocytes dans une goutte de 100 µL de milieu de culture sans milrinone dans une boîte de Pétri couverts en huile minérale de qualité embryonnaire et incuber pendant 7 h à 37 ° C en 5 % C02 pour permettre la maturation suffisante jusqu'à la métaphase de la méiose, les ovocytes j’ai (j’ai rencontré) 15.
- Après incubation, utilisant le même appareillage de pipette comme ci-dessus, transfert des ovocytes dans une boîte de Petri orgue Centre-puits contenant 700 µL de milieu collection préalablement réfrigérées média essentiel minimum (MEM) dans le centre bien et 500 µL H20 dans l’anneau extérieur et Placer le plat sur la glace pendant 7 min.
Remarque : Il est recommandé de refroidir des médias MEM et de centrer bien Pétri orgue à-20 ° C pendant au moins 20 min avant le traitement des ovocytes. - Difficulté les ovocytes en transférant à l’aide de l’appareil de la pipette dans un puits d’une plaque de verre clair spot contenant 400 µL de paraformaldéhyde à 2 % en 1 X PBS pendant 20 min à température ambiante.
- Utilisant la même pipette appareil, transférez les ovocytes dans un autre puits sur une plaque spot contenant 400 µL de solution de blocage (0,3 % de BSA + 0,01 % Tween-20 + 0,02 % NaN3, PBS) et magasin à 4 ° C jusqu’au moment de traiter pour immunostaining.
Remarque : pour le stockage des ovocytes à 4 ° C, plaque spot lamelle couvre-objet avec parafilm pour éviter l’évaporation. - Utilisant le même appareillage de pipette, ovocytes transfert à un nouveau puits sur un terrain plat contenant 400 µL de solution de perméabilisation (PBS BSA de 0,3 % + 0,1 % TritonX-100 + 0,02 % NaN3) et incuber à température ambiante pendant 20 min. ovocytes transfert rapidement par le biais de trois gouttes de 400 µL bloquant la solution pour supprimer n’importe quel détergent résiduel.
Remarque : Une plaque de verre clair 9 puits spot fonctionne bien pour aller de groupes par le biais de traitements multiples en un seul plat (étapes 2,4-2,5). - Effectuer les reste des procédures immunocytochimie dans une chambre humidifiée, abri de la lumière à température ambiante. Utiliser un récipient en plastique de taille moyenne doublé avec un essuie-tout humide et couvrir avec du papier aluminium.
- En utilisant l’appareil de la pipette, transférez les ovocytes dans 30 µL bloquant la solution sur le couvercle d’une plaque à 96 puits et les place dans la chambre humidifiée pendant 10 min.
NOTE : Les gouttes sont placés dans les renfoncements circulaires sur la plaque. - Pour étiqueter des centromères et la tige, à l’aide de l’appareil de la pipette, transférez les ovocytes à 30 µL bloquant la solution contenant l’antigène anti-centromérique (ACA, Crest) (01:30) et anti-acétylé tubuline (1 : 1000) et incuber pendant au moins 1 heure.
- Rincez les ovocytes en transférant par gouttes trois 30 µL de bloquant la solution pendant 10 min chaque.
- À l’aide de l’appareil de la pipette, transfert des ovocytes à un 30 µL goutte de solution de saturation contenant des anticorps secondaires gratuits aux anticorps utilisés ci-dessus (anti-humain IgG 1 : 200, 1 : 200 de anti-souris IgG) et incuber pendant 1 heure.
- Répétez les étapes de rinçage de 10 min 3, dans 30 µL solution de blocage comme indiqué au point 2.11.
- Transférez les ovocytes, à l’aide de l’appareil de la pipette, dans 3-5 µL montage moyen contenant DAPI (5,9 µg/µL) sur une lame de microscope.
- Placer 4 petites gouttes (taille d’une tête d’épingle) de gelée de pétrole sur les coins de la lamelle couvre-objet pour empêcher l’écrasement des ovocytes.
- Déposer délicatement la côté de vaseline de lamelle couvre-objet sur le toboggan.
- Sceller la lamelle bords avec clairement vernis à ongles et laisser pour sécher pendant 5 min.
- Stocker les lames à 4 ° C, abri de la lumière, jusqu’au traitement par microscopie confocale.
Remarque : Assurez-vous que l’indice de réfraction du milieu de montage et lamelle, matches les objectifs de microscope utilisés. Montage recommandées matériaux ont été précédemment décrit 15. - Image des ovocytes en utilisant un objectif de 40-63 x sur un microscope confocal, capturant les petits pas (≤ 1 µm) dans le plan z, optimisé pour le travail objectif et l’image de l’ensemble de la région de la broche de la métaphase.
Remarque : Assurez-vous d’image toutes les 3 canaux fonction spécifiques Anticorps secondaires utilisés à l’étape 2.11. Image en moyenne ≥ 4 et un zoom de 3 est idéal pour une résolution suffisante. Une taille de palier 1 µm fournit une visualisation claire des microtubules kinétochores dans des ovocytes de souris. La procédure de capture d’image variera d’un microscope à un microscope. Veuillez consulter le guide de l’utilisateur confocal de fabricants pour des mesures précises sur la façon de configurer les paramètres du microscope. - Déterminer l’état de fixation kinétochore-microtubule en utilisant des logiciels d’imagerie suivant étapes 2.21-2.23 ci-dessous.
Remarque : Les étapes suivantes décrivent cette procédure à l’aide d’un logiciel téléchargeable gratuit Image J (NIH), cependant, l’autre logiciel d’imagerie peut être utilisé. Pièce jointe types ont été précédemment défini 16 . - Ouvrez l’image en faisant glisser le fichier dans la barre d’outils Image J.
- Dans la série-z ouverte, faire tous les canaux visibles (ADN, kinétochore et broche) en cliquant sur «canaux de fusion», disponible dans le menu déroulant «Image», sous le sous-onglet «couleur».
- À l’aide de la bascule au bas de l’image, passer chaque tranche z et déterminer l’attachement des microtubules kinétochores. Fixation détaillée descriptions ont été précédemment décrit 16
3. essai de défi alignement du chromosome
- En utilisant l’appareil de pipette comme indiqué au point 2.3, transfert des ovocytes dans une goutte de 100 µL de milieu de culture sans milrinone sous huile et incuber pendant 7 h afin de permettre une maturation suffisante jusqu'à la métaphase de la méiose, les ovocytes j’ai (j’ai rencontré) comme décrit dans l’étape 2.3 17 .
Remarque : Les procédures de collecte, microinjection et la maturation ovocytaire ont été décrits précédemment 15. Consulter le protocole d’essai de pièce jointe à l’étape 2.1-2.2 pour les contrôles et pour les concentrations de microinjection de RNA. - Utilisant le même appareillage de pipette, ovocytes transfert à une culture d’organes puits Centre plat contenant 700 µL milieu de culture contenant monastrol [100µm] dans le centre bien et 400 µL H20 dans l’anneau entourant et incuber à 37 ° C pendant 2 h.
- Rincez le monastrol par le transfert des ovocytes, à l’aide de l’appareil de la pipette comme ci-dessus, par le biais de trois gouttes de 100 µL CZB milieu de culture et puis transférez les ovocytes à un nouveau centre-puits orgue boîte de Petri contenant 700 µL de milieu culture + MG132 [5 µM] pendant 3 h dans le centre bague. Ajouter 400 µL H20 de l’anneau extérieur.
- Difficulté les ovocytes de transférer, à l’aide de l’appareil de la pipette, dans un puits d’une plaque de verre clair spot contenant 400 µL 2 de paraformaldéhyde % dans du PBS pendant 20 min à température ambiante.
- Après fixation, transférez les ovocytes, à l’aide de l’appareil de la pipette, dans un nouveau puits d’une plaque de verre clair spot contenant 400 µL solution de saturation et de conserver à 4 ° C jusqu’au traitement d’immunomarquage.
Remarque : pour le stockage des ovocytes à 4 ° C, plaque spot lamelle couvre-objet avec parafilm pour éviter l’évaporation. - Permeabilize et l’étiquette des ovocytes par immunocytochimie comme décrit aux points 2.6-2.16.
- Ovocytes en utilisant un objectif de 40-63 x sur un microscope confocal, capture d’image < 1 µm pas dans le plan z en veillant à l’image de l’ensemble de la région de la broche de la métaphase.
- Pour définir l’alignement du chromosome statut ouvrir des fichiers image à l’aide de logiciels d’imagerie.
Remarque : Les étapes suivantes décrivent cette procédure à l’aide d’un logiciel téléchargeable gratuit Image J (NIH), cependant, l’autre logiciel d’imagerie peut être utilisé. - Faites glisser image dans Panneau de configuration image J.
- Dans la série-z ouverte, utilisez l’outil de point (accessible en cliquant sur l’icône dans la barre de contrôle Image J point) pour marquer des points à la fin de chaque pôle du fuseau dans leur respectif z-tranche en plaçant l’outil au-dessus du pôle du fuseau dans l’image en cliquant sur l’image. Ajouter ces points dans la région de gestionnaire d’intérêt (ROI) en appuyant sur commande + t sur le clavier.
- Déterminer les coordonnées spécifiques pour chacun des emplois définis à l’étape 3.10 en sélectionnant le point spécifique dans le gestionnaire de ROI, puis en cliquant sur le bouton de mesure. Cela fournira un résultats contenant de table coordonnées x et y pour chaque point. Ce seront les points X1, Y1 et X1, Y2, respectivement.
- Ensuite, déterminez la coordonnée Z de true. Cela se fait en multipliant le nombre de tranche de la z-tranche spécifique dans la pile de z dans lequel figurait le pôle du fuseau (c.-à-d. tranche #2 de 6) c'est-à-dire par chaque point individuel dans l’épaisseur de la pile (c'est-à-dire 1 µm) (exemple : couper 2 x 1 µm = 2). Ceux-ci seront respectivement les points Z1 et Z2.
- Déterminer la longueur d’axe à l’aide de l’équation du théorème de Pythagore (a2 + b2 = c2) en utilisant le défini précédemment x, y et z coordonnées des étapes 3.11-3.13. Pour chaque axe la longueur finale est égale à :
√((x1-x2)2+(Y1-Y2)2+(Z1-Z2)2) - Déterminer le milieu de l’axe. Cela correspond à la moitié de la longueur de la broche. À l’aide de l’outil en ligne dans l’Image J, en cliquant sur l’icône de la ligne dans la barre d’outils Image J, tracez une ligne qui est d’un pôle du fuseau pour le milieu de l’axe. La longueur s’affichera dans la barre d’outils Image J.
- Déterminer statut d’alignement du chromosome en évaluant la distance de chromosome de la milieu de la broche à l’aide de l’outil de mesure de ligne. À l’aide de l’outil en ligne disponible en cliquant sur l’icône de la ligne dans la barre d’outils Image J, tracer une ligne depuis le milieu de l’axe au chromosome. La longueur s’affichera dans la barre d’outils Image J. Supérieur à 4 µm de la milieu de l’axe des chromosomes sont considérés comme non aligné 18.
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Representative Results
Après in vitro transcription haute qualité RNA aura un ratio A260/A280 (1,8 à 2,2) et un ≥1.7 de ratio A260/A230 lorsqu’elle est mesurée à l’aide d’un spectrophotomètre. L’image dans la Figure 1 montre la migration de in vitro-produit RNA sur un gel d’agarose dénaturation après électrophorèse. Un groupe qui est étalé dans le modèle ou un échantillon qui a plusieurs bandes de tailles peut indiquer la contamination ou la dégradation de l’échantillon. Alternativement, les bandes multiples peuvent indiquer que l’ARNm n’est pas complètement dénaturé ou le plasmide de départ n’était pas complètement linéarisé. L’ARNm s’exécutera plus grande que prévu à cause de la queue poly-adenylated intégrée dans pIVT, qui permet l’expression stable de mRNA in vitro. Après microinjection, il est recommandé de s’assurer que les volumes d’injection uniforme et les niveaux d’expression par microscopie de fluorescence. L’image dans la Figure 2 montre la prophase ovocytes j’ai arrêté uniformément injectés avec Gfp. Technique de microinjection cohérente est essentielle pour ce protocole. Logiciel d’analyse image, comme Image J, peut servir à valider les niveaux d’expression afin d’assurer l’uniformité et la maîtrise de la technique. Notez que la localisation sous-cellulaire informations peuvent être obtenues en faisant de l’imagerie pour les deux tests. Pour toutes les expériences de microinjection évaluer les effets d’un variant du gène, le gène sauvage doit être injecté dans un sous-ensemble d’ovocytes pour servir un contrôle. Cela permet au contrôle pour des phénotypes potentiels de la surexpression du gène humain dans un ovocyte de souris. PBS, ou Gfp pour constructions marqués au fluorophore, devrait être également être injecté dans un sous-groupe d’ovocytes au contrôle pour les phénotypes induite par microinjection. Pour des constructions sans étiquette fluorescente, Gfp ARNm peut être injecté conjointement pour assurer suffisamment microinjection. Si co de s’injecter simultanément deux ou plusieurs constructions n’oubliez pas d’augmenter la concentration de l’ARNm, telle que la solution finale contient 500 ng/µL de chaque ARNm.
Le dosage de microtubules stables froid fournit un outil précieux pour évaluer l’état de l’attachement des kinétochores aux microtubules. La figure 3 est une z-projection d’une image de microscope confocal une métaphase I ovocyte. Cet ovocyte a été soumis à traitement de médias froids pour dépolymériser tous les microtubules qui n’avaient pas joint aux kinétochores. Les ovocytes qui ont été traités pour un temps insuffisant contiendra des fibres de microtubules ne pas attachés aux chromosomes (trop court entraîne trop de fibres) ou manque de fibres tous ensemble (les résultats trop longs dans aucune structure de broche) et il est recommandé que ces ovocytes ne pas être utilisées dans l’analyse. En métaphase de la méiose j’ai il est courant pour les ovocytes contenir les kinétochores seules ou attachés latéralement, c’est pourquoi il est recommandé qu’un groupe témoin servir dans toute étude de pièce jointe. En moyenne, ovocytes sauvage contient 5 à 10 % des kinétochores à volonté MI pas encore être solidement attaché 19. Il est essentiel que tous les ovocytes soient au même stade pour l’analyse du statut de pièce jointe kinétochore-microtubule. Pour veiller à ce qu’expérimental et le groupe témoin mature avec des échelles de temps semblables il est recommandé d’évaluer la cinétique du cycle cellulaire. Pour effectuer ce test, un sous-ensemble des ovocytes expérimentales et de contrôle doit être mûri et visible direct sous les microcopy Time-lapse. L’utilisation de milrinone permet ovocytes à synchroniser en prophase de la méiose I, tel que communiqué dans des milieux dépourvus de milrinone avec permettent de reprise de la méiose à la même heure 20. Ovocytes de contrôle et de groupes expérimentaux doivent s’écouler un globule polaire, indicatif d’atteindre la métaphase de la méiose II (II a rencontré), à des points similaires. Si microscopie des cellules vivantes n’est pas disponible, les ovocytes peuvent être mûri à Met je (7 h) et à rencontré II (16 h), fixées et colorées pour détecter l’ADN et les microtubules comme décrit précédemment. Au Met I et II a rencontré une broche en forme de tonneau, bipolaire doit être visible. Dans les ovocytes de contrôle, les chromosomes sont alignés à la plaque métaphasique. L’alignement des chromosomes sera différente dans les groupes expérimentaux selon variante affecte, cependant, les chromosomes devraient être condensés et attachés aux microtubules avec la majorité des chromosomes situé sur l’axe. Un nombre similaire d’ovocytes doit avoir atteint la méiose II en contrôle et groupes expérimentaux. Afin de réduire les difficultés dans la détermination de fixation statut qu'il est recommandé d’imagerie ovocytes à l’aide de petits pas dans le plan z, optimisé pour l’objectif spécifique de travail. Analyse concernera Regarde un z-tranches individuellement et en fusion des paramètres pour déterminer quel pôle attachés aux microtubules émanent. Figure 3 b illustre des exemples de pièces jointes anormale kinétochore-microtubule. Montré est un bivalent dans laquelle seule sœur paire kinétochore est attachée à un microtubule broche, défini comme un aucun attachement. Ensuite, un attachement de syntélique s’affiche dans lequel les deux soeur paires kinétochore sont attachés au même pôle du fuseau. Enfin, un attachement de Kinetochores s’affiche dans laquelle une sœur kinétochore est attaché aux deux pôles du fuseau tandis que l’autre sœur kinétochore de la paire est attaché à un poteau de broche unique.
Les images dans la Figure 4 illustrent les ADN attendu progressive et les configurations de broche comme on passe à travers les étapes de l’analyse de défi de l’alignement des chromosomes. Dans cet essai, il est essentiel que les différents groupes expérimentaux progressent grâce à la méiose et la cinétique similaire. Comme décrit précédemment, il est recommandé de compléter les analyses de cinétique du cycle cellulaire avant d’effectuer l’essai de défi. Dans cet essai, la capacité pour les ovocytes de corriger avec succès attachements anormaux kinétochore-microtubule est évaluée. Pour tester ceci, les ovocytes sont affinés tout d’abord à Met j’à autoriser les pièces jointes kinétochore-microtubules à établir. Ensuite, les ovocytes sont incubés dans monastrol et inhibiteur de la kinésine 5 (EG5), qui s’effondre l’axe bipolaire dans une broche monopolaire 21. La génération de la quenouille monopolaire induit 100 % accessoires de microtubule-kinétochore incorrect. L’inhibiteur de la monastrol est alors délavé pour permettre le recouvrement. Au cours de la période de récupération, les ovocytes régénèrent un axe bipolaire et tentent de corriger les pièces jointes de microtubules. Ajout de l’inhibiteur du protéasome MG132 empêche l’apparition de l’anaphase. Comme un contrôle, un petit sous-ensemble des ovocytes de chaque groupe expérimental peut être fixé à chaque étape du protocole (rencontra I, monastrol traité, poster de récupération) pour s’assurer que tous les groupes répondent aux traitements et dans la même mesure. Métaphase I ovocytes doivent contenir un axe bipolaire en forme de tonneau avec chromosomes alignés dans la plaque métaphasique. Ovocytes traités avec monastrol devraient contenir une broche monopolaire avec chromosomes orientés autour du pôle unique. Ovocytes récupérés doivent contenir une fois de plus un axe bipolaire en forme de tonneau. Alignement de chromosome est défini comme toute chromosomes plus de 4 μM de la topographie de broche 22. Il est utile colorer les ovocytes pour détecter l’ADN et kinétochores pour établir si les deux kinétochores sont en dehors de cette zone centrale comme cela peut être difficile de déterminer à l’aide de la détection de l’ADN seulement.
Figure 1. Électrophorèse en gel d’ARN Denaturingagarose. Taille et qualité de RNA peuvent être évaluées par l’électrophorèse sur un gel d’agarose dénaturation. Un gel dénaturant est recommandé pour prévenir la formation de la structure secondaire. Lane 1 contient un marqueur de poids moléculaire de RNA. 2 Lane est un échantillon de RNA. Notez que l’ARN s’exécutera plu calculées à cause de la queue polyA intégré. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2. Validation de microinjection ovocytaire. Microscopie fluorescente peut être utilisée pour valider l’expression et la microinjection ovocytaire réussie. Des ovocytes j’ai arrêté de la prophase micro avec Gfp figurent après expression durant la nuit de la construction. Cette image a été obtenue à l’aide de la Invitrogen EVOS FL Auto système équipé de lumière cube GFP d’imagerie. Barre d’échelle est 100 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3. Évaluation des pièces jointes kinétochore-microtubule. (A) A représentant z-projection d’un froid imprégnées j’ai rencontré ovocyte. Broche (vert), kinétochores (rouges) et l’ADN (bleu) sont indiquées. La boîte indique la région du zoom optique. Pointes de flèches indiquent les bout fixations des kinétochores aux microtubules d’un seul bivalent. Barre d’échelle est 10 µm pour broche, kinétochore, ADN et canaux de fusion. Echelle de zoom optique est de 5 µm. (B) exemples de types de pièces jointes anormale kinétochore-microtubules dans les ovocytes de souris. Les flèches indiquent les sites d’attachement kinétochore-microtubule. Barre d’échelle est 5 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4. Analyse de défi de l’alignement des chromosomes. Organigramme de la procédure avec z-projections représentant des ovocytes à chaque étape. Les ovocytes sont affinés tout d’abord à la métaphase de la méiose j’ai (j’ai rencontré), puis transféré à une autre boite contenant monastrol pendant 2 h à induire la formation de broche monopolaire. Prochaines ovocytes sont autorisés à récupérer dans le milieu de maturation additionné d’un inhibiteur du protéasome (MG132) pour prévenir l’apparition de l’anaphase pendant 3 h. Une fois récupérées les ovocytes sont fixe, étiquetés pour broche (vert), kinétochores (rouges) et l’ADN (bleu) et imagés par l’intermédiaire de la microscopie confocale à déterminer le statut de l’alignement. Les lignes indiquent la longueur de la broche (40 µm) et milieu (20 µm), déterminée à l’aide du théorème de Pythagore équation de broche. Les flèches indiquent les positions outil point à chaque pôle. Les kinétochores > 4 µm depuis le milieu de l’axe sont considérés comme des non alignés. Astérisque indique chromosome non aligné (5,6 µm de milieu). Barre d’échelle est 10 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
En raison de l’identification rapide et croissante des humains variantes génétiques associées à la maladie, il est essentiel que les systèmes sont établies afin d’évaluer leur importance biologique. Comprendre la fonction des protéines dans la méiose humain pose des défis particuliers car les ovocytes humains sont précieux et sperme rare et humaine ne se prêtent pas aux manipulations génétiques. Les ovocytes de souris sont un système modèle mammifère précieux pour l’évaluation humaine gène méiotique fonction 10,23. Ce modèle permet de contourner l’impossibilité d’utiliser les ovules humains tout en fournissant une source facilement accessible d’ovocytes à faible coût, manipulables qui subissent la méiose semblable aux cellules germinales humaines tout en étant utiles à la compréhension des variants génétiques comment peut-être avoir une incidence femelle fertilité.
Parce que ces méthodes utilisent l’expression ectopique de la protéine humaine dans des ovocytes de souris par microinjection, il est essentiel d’établir tout d’abord une concentration du contrôle, les ARN sauvage qui n’altère pas la maturation méiotique. Il est recommandé que la maturation méiotique cinétiques sont surveillés (ventilation de l’enveloppe nucléaire, extrusion de globule polaire) dans des ovocytes de contrôle pour définir des paramètres de ligne de base et évaluer la morphologie broche et chromosome. En outre, assurant des volumes de microinjection uniforme est essentiel pour comparer les groupes. Incluant une balise fluorescente sur le gène d’intérêt peut simplifier ce défi technique. Techniques pour maîtriser la microinjection ovocytaire ont été précédemment démontré 15. Visualisation des ovocytes injectés sous un microscope à fluorescence ou de mesurer l’expression de la protéine par l’intermédiaire de la tache occidentale sont également des outils précieux pour confirmer des concentrations compatibles injection.
Parce que les erreurs dans la ségrégation des chromosomes dans des ovocytes de mammifères sont une cause importante d’aneuploïdie embryonnaire et grossesse perte5, analyse des pièces jointes kinétochore-microtubule offre un outil précieux pour évaluer si un gène d’intérêt affecte ségrégation des chromosomes (c.-à-d. une mauvaise pièce détachée cause mauvaise ségrégation). Une exposition de 10 min aux médias réfrigéré est suffisante pour dépolymériser microtubules qui ne font pas un attachement kinétochore-microtubule, permettant la visualisation des attachements stables par microscopie confocale 24. Pour ce test, il est important de ne pas trop refroidir les ovocytes que cela conduira à la dépolymérisation des microtubules stables. En outre, optimisation des procédures de coloration est la clé pour la visualisation des structures kinétochore et les microtubules. Pour assurer la résolution de l’image adéquat pour l’analyse, de petites étapes (≤ 1 μm) dans le plan z à l’aide d’un x-63 40 x objectif devrait être capturé, et obtention d’images à travers la structure de broche ensemble pour s’assurer que toutes les pièces jointes sont visibles. Notez qu’il est fréquent d’avoir des kinétochores seules pendant prométaphase de la méiose j’ai 25.
Le test de défi d’alignement chromosomique est utile pour l’évaluation des variantes de gain ou perte de fonction. Variantes de gain de fonction peuvent être difficiles à évaluer car les ovocytes de souris de jeunes femelles présentent de faibles taux d’aneuploïdie. Ce test permet de surmonter cet obstacle en générant une situation dans laquelle l’ovocyte doit corriger pièces jointes expérimentalement induite kinétochore-microtubule incorrect. Création d’un point de temps dans lequel contrôle ovocytes contiennent 1-2 chromosomes mal alignées après que récupération fournit un scénario quantifiable permettant de déterminer si un mutant offre une efficacité accrue de l’alignement (c'est-à-dire meilleur alignement capacités seront protéger les euploïdie). Pour la quantification du désalignement du chromosome, un protocole établi précédemment dans quels chromosomes supérieures à 4 μm de l’axe du milieu sont caractérisées comme non aligné peut être utilisé 18.
Afin d’étudier les variantes de la perte de fonction, les conditions expérimentales supplémentaires sont nécessaires en raison de l’endogène homologue au sein du système d’étude. Une façon d’atténuer ce problème est d’utiliser ou de générer un modèle de souris knockout de la variante d’intérêt. L’avènement du système de bac à légumes/Cas9 pourrait fournir un moyen rapide pour générer ces masquages 26. Par ailleurs, si un modèle de coup de grâce n’est pas une option, techniques knockdown classiques tels que co injection d’oligonucléotides antisens morpholino ou petits ARN interférants pourraient être employés. Cependant, attention à la conception de la séquence est nécessaire afin d’éviter toute interférence avec la variante micro-injection sous étude. Par exemple, l’oligonucléotide morpholino pourrait être conçu pour lier à la région 5' non traduite (5' UTR) du gène souris qui ne figure pas dans la variante humaine de mRNA introduite par microinjection. Si vous utilisez interférant petit RNAs celui pourraient cibler une région de séquence non homologue ou d’introduire des silencieux des mutations ponctuelles du gène humain qui auraient échapper ciblant. Cependant, avoir la copie de protéine endogène encore présente sur l’expression de la variante peut être instructive puisque de nombreuses variantes sont présents à l’état hétérozygote dans le génome humain.
Enfin, bien que ne pas décrits dans le présent protocole, évaluation d’aneuploïdie chromosomique peut facilement évaluée d’oeufs II a rencontré que le test final en préparation pour l’analyse de variante humaine. Une description détaillée de cette in situ du chromosome répartis protocole a décrit précédemment de 15. En bref, micro-injection ovocytes sont ayant subi une maturation in vitro jusqu'à ce qu’ils atteignent le stade II a rencontré, après un traitement avec un agent de dépolymérisation de fuseau méiotique avant fixation. Kinétochore et chromosome coloration comme décrit ici permettent pour l’évaluation du contenu chromosomique.
Alors que les ovocytes de souris offrent un outil précieux pour l’étude des protéines essentielles à la méiose femelle quelques limitations à l’exister de modèle. Surexpression de protéines peut perturber la maturation méiotique et donc une concentration d’ARN peut ne pas exister qui n’induit pas un phénotype. En outre, l’homologue de souris endogène peut interférer avec la localisation de la protéine humaine exogène. La génération de modèles de souris knock-out dispose d’une solution à ce problème ; Cependant, c’est peut-être pas possible dans toutes les situations. Une autre approche consisterait à épuiser la protéine souris en injectant des Arni ou oligonucléotides morpholino conçu pour pas de cible l’exogène ARN et des protéines. Enfin, il est important de noter que tandis que beaucoup de protéines est homologues entre humain et de souris, des différences peuvent exister, ce qui conduit à des différences dans la localisation et la fonction qui pourrait empêcher ce type d’analyse interspécifique. Comme les outils de manipulation génétique comme Cas9-génome édition27 deviennent moins cher et plus banals, ce protocole pourrait évoluer dans la prise des lignées de souris knock-in, humanisé au lieu de dépendre de microinjection.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par une subvention de recherche de l’American Society for Reproductive Medicine et du Charles et Johanna Busch Memorial Fund à l’Université Rutgers, The State University de NJ à K.S. est a été financée par une subvention de la N.I.H. (F31 HD0989597).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 mL Seal-Rite PCR tube | USA Scientific | 1602-4300 | |
| 1 kb DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0313 | |
| 100 bp DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0243 | |
| 6X DNA loading Dye | Thermo Scientific | R0611 | |
| 9-well glass spot plate | Thomas Scientific | 7812G17 | |
| Agarose | Sigma Aldrich | A9539 | |
| Albumin from bovine serum | Sigma-Aldrich | A3294 | |
| Alexa-fluor-568 conjugated anti-mouse IgG | Thermo Scientific | A21050 | 1:200 dilution |
| Alexa-fluor-633 conjugated anti-human IgG | Thermo Scientific | A21091 | 1:200 dilution |
| Ampicillin | VWR | AA0356 | |
| Anti-vibration table | Technical Manufacturing Corp | any standard model | |
| Anti-Acetylated Tubulin antibody | Sigma Aldrich | T7451 | 1:100 diution |
| Anti-centromeric (CREST) antibody | Antibodies Incorportated | 15-234 | 1:30 dilution |
| Barrier (Filter) Pipette tips | Thermo Scientific | AM12635 | Make sure compatable with your brand of pipettors. These are compatible with Eppendorf brand pipettors. |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Agar, Miller (Luria Bertani) | Fisher Scientific | DF0445-07-6 | |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria Bertani) | Fisher Scientific | DF0446-07-5 | |
| Capillary tubing | Sutter | B100-75-10 | |
| Center Well organ culture dish | VWR | 25381-141 | |
| CO2 tank | For incubator | ||
| Confocal microscope | Zeiss | any standard model | |
| Centrifuge (With cooling ability) | Thomas Scientific | any standard model | |
| Cover Glass 11 x 22 mm | Thomas Scientific | 6663F10 | |
| Coverslips | Thomas Scientific | 6663-F10 | thickness will vary for particular microscopes |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | |
| DEPC H20 | Life Technologies | AM9922 | |
| Digital Dry Bath | Thermo Scientific | 888700001 | |
| Easy A high fidelity cloning enzyme | Agilent | 600400 | For DNA cloning |
| Enzymes for linearizing pIVT | New England Biolabs | NdeI or KasI can be used | |
| Ethidium Bromide | Thermo Scientific | 155585011 | |
| Fluorescent Microscope | Any Fluorescent microscope may be used | ||
| Formaldehyde (37%) | Thermo Fisher Scientifc | 9311 | |
| Formaldehyde RNA loading dye | Ambion | 8552 | |
| Frosted Microscope Slides (Uncharged) 25X75 mm | Fisher Scientific | 12-544-3 | |
| Full Length cDNA Clones | Can be obtained from any vendor that supplies open reading frame clones | ||
| Gel electrophoresis apparatus | Bio-Rad | any standard model | |
| Glass Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-200 | |
| Globin Forward Primer for pIVT Construct | 5'- GAA GCT CAG AAT AAA CGC -3'. Can be purchased from any company that generates custom oligonucelotides | ||
| Globin Reverse Primer for pIVT Construct | 5'- ATT CGG GTG TTC TTG AGG CTG G -3' Can be purchased from any company that generates custom oligonucelotides | ||
| Holding pipettes | Eppendorf | 930001015 | Vacutip |
| Humidified Chamber | Tupperware can be used | ||
| Illustra Ready-To-Go RT-PCR beads | GE Life Sciences | 27925901 | |
| Incubator | any standard model with CO2 and water jacketed technology | ||
| Inverted Microscope | Nikon instruments | Any Standard model | |
| Image J (NIH) Software | NIH | Image Analysis software | |
| Lid of 96 well plate | Nalgene Nunc International | 263339 | |
| Low Adhesion 0.5 mL microcentrifgue tube | USA Scientific | 1405-2600 | |
| MacVector | MacVector | Sequence analysis software | |
| MG132 | Selleckchem | S2619 | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-3 | |
| Millenium RNA Markers-Formaldehyde | Ambion | AM7151 | |
| Milrinone | Sigma-Aldrich | M4659 | Resuspend in DMSO at 2.5mM |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M5310 | Only used embryo-tested, sterile-filtered |
| Monastrol | Sigma-Aldrich | M8515 | Resuspend in DMSO at 100 mM |
| Mouthpiece | Biodiseno | MP-001-Y | |
| N2 tank | for antivibration table | ||
| Nail Polish; Clear | Any clear nailpolish can be used | ||
| NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | any standard model | |
| NorthernMax 10X Denaturing Gel Buffer | Life Technologies | AM8676 | |
| NorthernMax 10X Running buffer | Life Technologies | AM8671 | |
| NuPAGE MOPS SDS Running buffer | Thermo Scnentific | NP0001 | |
| Organ Culture Dish 60x15mm | Life Technologies | 08-772-12 | |
| Paraformaldehyde | Polysciences, Inc. | 577773 | |
| PCR Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | 4484075 | |
| Petri Dish 139 mm | Thermo Fisher Scientifc | 501V | |
| Petri dish 35 mm | Thermo Fisher Scientifc | 121V | |
| Petri Dish 60 mm | Falcon BD | 351007 | |
| Picoinjector | XenoWorks Digital Microinjector | any standard model | |
| Pipette puller | Flaming-Brown Micropipette puller | Model P-1000 | |
| pIVT plasmid | AddGene | 32374 | Empty vector suitable for oocyte expression. |
| Pregnant Mare Serum Gonadotropin | Lee BioSolutions | 493-10 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | purification of up to 20 uL of plasmid DNA |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| Quikchange II site directed mutagenesis kit | Agilent | 200523 | mutagenesis kit for insertions and deletions |
| Quikchange lightning multi-site directed mutagenesis kit | Agilent | 210512 | mutagenesis kit for single site changes |
| Scissors (Fine point) | Fine science tools | 14393 | |
| Scissors (Medium point) | Fine science tools | WP114225 | |
| Seal-Rite 1.5 mL microcentrifuge tube | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Slide Warmer | any standard model | ||
| Spectrophotometer (Nanodrop) | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | |
| Stereomicroscope | any standard model | ||
| Subcloning Efficiency DH5a Competent Cells | Thermo Fisher Scientifc | 18265017 | |
| Syringe | BD Bioscienes | 309623 | 1 ml, 27G(1/2) |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202L | |
| T7 mMessage Machine high-yield capped RNA transcription kit | Life Technologies | AM1340 | |
| TritonX-100 | Sigma-Aldrich | x-100 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | 274348 | |
| Tweezer (Fine point- Size 5) | Fine science tools | SN.743.12.1 | |
| UltraPure Dnase/Rnase-Free Distilled Water | Thermo Fisher Scientifc | 10977015 | |
| UltraPure Ethidium Bromide 10mg/mL | Thermo Fisher Scientifc | 15585011 | |
| UVP UV/White lite transilluminator | Fisher Scientific | UV95041501 | |
| Vectashield Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 |
References
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