Summary
גרסאות גנטי המשויכים מחלות אנושיות מתחילים להיות חשפו, זה הופך יותר ויותר חשוב לפתח מערכות אשר במהירות והערכת החשיבות הביולוגית של משתנים אלה שזוהו. פרוטוקול זה מתאר שיטות להערכת תפקוד הגן האנושי במהלך המיוזה הנשי אני משתמש בעכבר oocytes.
Abstract
אנאפלואידיה עובריים הוא הגורם הגנטי פוריות אצל בני אדם. רוב האירועים האלה מקורם במהלך המיוזה הנשי, אמנם בקורלציה חיובית עם גיל, גיל לבד לא תמיד חזוי של הסיכון של יצירת העובר aneuploid. לכן, ג'ין גרסאות אולי חשבון סגרגציה כרומוזום שגוי במהלך oogenesis. בהתחשב בכך גישה oocytes האנושי מוגבל למטרות מחקר, סדרה של מבחני פותחו כדי לחקור פונקציה גנים אנושיים במהלך המיוזה אני משתמש בעכבר oocytes. ראשית, RNA שליח (mRNA) של ג'ין, ג'ין וריאנט של עניין הם microinjected לתוך prophase העכבר עצרתי oocytes. לאחר המאפשר זמן הביטוי, oocytes משתחררים באופן סינכרוני אל ההבשלה meiotic להשלמת מיוזה אני. על-ידי תיוג של mRNA עם רצף של עיתונאי פלורסנט, כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק (Gfp), הלוקליזציה של החלבון האנושי יכול להיות מוערך בנוסף התיקונים פנוטיפי. לדוגמה, רווח או הפסד של הפונקציה יכול ייחקרו על-ידי יצירת תנאים ניסיוני זה אתגר המוצר ג'ין כדי לתקן שגיאות meiotic. המערכת הזו אמנם יתרון בחקירת פונקציה חלבון אנושי במהלך oogenesis, פרשנות נאותה של תוצאות צריך להתבצע בהתחשב בכך ביטוי חלבון אינה ברמות אנדוגני, ו, אלא אם כן מבוקר על (קרי הפיל . או למטה), מאתר homologs נמצאים גם במערכת.
Introduction
פוריות היא מחלה המשפיעה על 10-15% מן האוכלוסייה האנושית של גיל הרבייה 1, שממנה כמעט למחצית מחפשים טיפול רפואי 2. למרות האטיולוגיה של בעיות פוריות היא מגוונת, ובמקרים רבים multifactorial, סטייה גנטית הנפוץ ביותר אצל בני אדם הוא אנאפלואידיה עובריים 3. אנאפלואידיה מוגדר הסטייה (רווח או הפסד) של המספר הנכון של הכרומוזומים בתא. התופעה של aneuploidy של עוברי אדם נפוצים, עולה עם גיל מתקדם 4,5. ארבעה מחקרים אקראיים מבוקרים הדגישו את היתרון של בחירת הנורמלי היחיד chromosomally (euploid) עוברי להעברה הרחם כי אסטרטגיה זו, גרמו המחירים השרשה מוגברת, נמוכים הפלה, זמן קצר יותר להשגת הריון 6,7,8,9. לכן, הבנת האטיולוגיה של aneuploidy האנושי יכול להיות השלכות חשובות ברבייה בסיוע.
למרות בדיקה גנטית טרום השרשה, עבור aneuploidies הוא מועיל בטיפולי פוריות, הבנה מעמיקה של מה aneuploidies מקורם עדיין לוקה בחסר. מקובל כי קיים מתאם חיובי של aneuploidies meiotic (מקורו בתהליך הייצור תא רבייה), גיל, עם זאת, כמה נשים אנאפלואידיה עובריים התעריפים הנוכחיים שסטו מהתעריף הממוצע שלהם נתון בגיל 4. במקרים אלה מראים כי גיל לבד אינה תמיד חזוי של הסיכון של יצירת העובר aneuploid. גורמים אחרים עשויים לשחק תפקיד בהגדלת הסיכון של aneuploidy עובריים, כגון גן משתנים.
היבט מרכזי של חוקרים פוטנציאל התרומה של variant ג'ין כדי אנאפלואידיה במהלך המיוזה oocyte היא לתכנן מערכת להעריך במהירות ג'ין meiotic הפונקציה. בשל אילוצים אתית גישה מוגבלת, זה לא מעשי לבצע ניסויים אלה באמצעות ביצים אנושי. נושאים אלה יכולים שיפרו באמצעות העכבר oocytes, ויש כאן סדרה של מבחני להעריך תפקוד הגן האנושי במהלך המיוזה אני המתואר. על ידי microinjecting קידוד RNA שליח (mRNA) את הווריאציה גנים של הריבית, הלוקליזציה של החלבון האנושי של הביצה העכבר יכול להיות דמיינו ועל משמש כדי לקבוע אם ביטוי חוץ רחמי של החלבון אדם פראי-סוג של מוטציה תוצאות בכל שינויים פנוטיפי העלולה להוביל אנאפלואידיה. פנוטיפים אלה כוללים עלייה ב- microtubules כי לצרף אחותי לא במקום קינטוכור וחוסר יכולת לתמוך יישור כרומוזום-מפה של מיוזה אני חשוב, פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לחקור גם להפסד ורווח של פונקציה וריאציות גנטיות על-ידי יצירת תנאים מסוימים ניסיוני לאתגר את אירועי מפתח oocyte מיוזה כגון ציר יישור ובניית כרומוזום 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. שיבוט מולקולרי
- להשיג רצף קידוד באורך מלא של הגן עניין, פלסמיד במבחנה שעתוק (pIVT) וקטור11.
הערה: שיבוטים cDNA באורך מלא זמינים מסחרית של ספקים שונים או יכול להיווצר באמצעות תגובת שרשרת של פולימראז שעתוק במהופך (RT-PCR). המרכז הלאומי עבור משאב מקוון ביוטכנולוגיה מידע (NCBI) מספק התעתיק רצפי הגנים נוקלאוטיד ו ביטא רצף מתויג מסדי נתונים (EST). על מנת להקל על חלבון הדמיה וניתוח של רמות הביטוי, פיוז'ן כדי חלבון פלואורסצנטי ירוק (Gfp) או אחר מתאים תגית פלורסנט ייתכן בעיצובן באסטרטגיית שיבוט. - באמצעות אסטרטגיה שיבוט מאומתים, הכנס את רצף קידוד של הגן עניין האזור שיבוט מרובים של pIVT. תיאור מפורט של שיבוט מולקולרי ואת הפעולות הנדרשות כבר בעבר תיאר 12.
הערה: אם המוצר ג'ין-fusion שיווצר, להיות בטוח כי השיבוט הוא במסגרת שקריאה תקינה. - רצף הבונה באמצעות תחל גלובין להבטחת ההכנסה הגן הנכון, פיוז'ן במסגרת נכונה, כי אין מוטציות נקודה פולימראז-induced שנוצרו.
הערה: אם ציוד רצפי DNA סנגר אינה זמינה, חברות רבות מציעות אפשרויות בעלות נמוכה של רצפי DNA. - Mutagenize DNA אם יצירת פולימורפיזמים נוקלאוטיד יחיד (SNPs) או הוספות/מחיקות (INDELS). מוטגנזה מכוונת דנ א מתואר במסגרת צעדים 1.5-1.7 להלן. עבור פראי-סוג המבנים, להמשיך עם הצעד לינאריזציה 1.7.
- עיצוב מוטגנזה מכוונת תחל והשלם את תגובת ה-PCR מוטגנזה מכוונת ליצירת מוטציה לבנות לכל הפרוטוקול של היצרן. בתיווך PCR מוטגנזה כבר שתואר לעיל 13. בנוסף, חברות רבות מציעות מוטגנזה קיטים הכוללים פרוטוקולים.
- להפוך mutagenized DNA חיידקי המארח. לבודד ולטהר פלסמיד.
הערה: חברות רבות לבצע ערכות שיכול לשמש בקלות לבודד, לטהר את הדנ א פלסמיד. בצע את יצרני פרוטוקול בהתאם. אם משתמש זן חיידקי גראם שליליים כגון e. coli, מומלץ להשתמש ערכת מסיר endotoxins. - רצף ה-DNA מבודד של חיידקי transformants באמצעות רצפי DNA סנגר סטנדרטי כדי לאשר מבוא הסנ פ או ויאסין הרצוי.
- Linearize המוצרים הסופיים באמצעות אנזים הגבלה יחיד העיכול של ה-DNA מטוהרים.
הערה: וקטור pIVT מכילה מספר יחיד-האנזים חותך אתרים רשומים במפת פלסמיד Addgene 14. - ודא שהמוצר ליניארית באמצעות agarose בג'ל. המתודולוגיה עבור agarose בג'ל בעבר כבר מוגדר 14.
הערה: כל השלבים הנותרים, לשימוש מכשול (מסנן) pipet עצות וחומרים ללא RNase כדי להבטיח ייצור איכותי יציב RNA. - לטהר המוצר מתעכל באמצעות פרוטוקול ניקוי הדנ א מאומתים או קיט, elute 30 µL RNase/DNase ללא מים.
הערה: ספין סיליקה-מטריקס ערכות מבוססי עמודה מומלצים לאיכות גבוהה, טהור הדנ א. בצע את יצרני פרוטוקול בהתאם. - במבחנה לתעתק את הדנ א באמצעות פולימראז T7 ע פ הפרוטוקול של היצרן.
- לטהר, elute RNA ב 30 µL של מים בחינם RNase/DNase באמצעות מטריצה סיליקה ספין מבוססי עמודה חומצת גרעין ערכת טיהור ע פ הפרוטוקול של היצרן.
- מבצע denaturing agarose ג'ל אלקטרופורזה באמצעות פורמלין לאשר לגודל הסופי של מוצר ה-RNA. ראה שלבים 1.13-1.22 מתחת 14. (איור 1).
- הכנת ג'ל על ידי חימום agarose 1 g ב- 72 מ ל מים עד התפרקה, ואז צנני עד 60 מעלות צלזיוס.
- הכינו 10 X מגבים, מכשירי ריצה מאגר על-ידי הוספת 0.4 מ' מגבים (pH 7.0), 0.1 M סודיום אצטט ו 0.01 M EDTA.
- להוסיף 10 מ של 10 X מגבים, מכשירי הפעלה מאגר, ו- 18 מ של 37% פורמלדהיד (12.3 M) לפתרון agarose מקורר.
- קאסטה הג'ל על ידי מזיגת הפתרון agarose לתוך מיכל יוצרי ג'ל. השתמש מסרק גדול דיו כדי להתאים 10 µL. לאחר ג'ל הגדיר מוצקה למגע, להסיר בעדינות את המסרק.
- להרכיב את ג'ל אלקטרופורזה טנקים, והוסף מספיק 1 X מגבים, מכשירי ריצה מאגר, המבטיח שהג'ל מכוסה לגמרי.
- להכין RNA לדוגמה על-ידי הוספת 1 µg של RNA X 0.5, נפחי המכילים פורמלדהיד לצבוע טעינה.
- הוסף אתידיום ברומיד לפתרון ה-RNA-ריכוז של 10 µg/mL.
- Denature רנ א פתרון לדוגמה ב- 70 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.
- שימוש סטרילי, 10 טיפים מסנן µL, לטעון µL 5 של משקל מולקולרי סמן ו- 5 µL של RNA sample(s) לתוך בארות נפרדים של הג'ל electrophorese ב V 5/ס מ עד לצבוע יש היגרו לפחות שני שליש מאורכו של הג'ל.
- דמיינו את הרנ א הג'ל על המאייר טרנס UV. ודא שהרנ א תהיה בגודל הנכון על-ידי השוואת עד לסימון משקל מולקולרי.
- כדי למדוד את ריכוז וטוהר RNA, העברה µL 1.2 של RNA מטוהרים באמצעות סטרילי טיפים מסנן 10 µL אל ספקטרופוטומטרים-UV.
שים לב שיש RNA באיכות גבוהה ספיגת יחס של A260/280 (1.8-2.2), 260/230 (> 1.7) בהתאמה. - באמצעות 10 µL מסנן טיפים, aliquot את הרנ א מטוהרים הנותרים לתוך סטרילי 0.5 µL צנטריפוגה צינורות (3-5 µL/צינור). מאחסנים צינורות ב-80 מעלות צלזיוס עד מוכן microinjection.
הערה: ריכוז הזרקת הסופי של 500 ng/µL היא נקודת מוצא אופטימלית. מומלץ לדלל את הרנ א 1:2 ב RNase H20 לפני microinjection כדי להפחית את הדביקות של רנ א ב microinjection פיפטה חינם.
2. קינטוכור-Microtubule מצורף Assay
- לחלק oocytes קבוצות שוות עבור microinjection.
הערה: אוסף Oocyte, העברה, microinjection ו- meiotic ההבשלה בכללותה תוארה בפירוט יופיטר בעבר 15. - Microinject קבוצה אחת עם ה-mRNA ניסיוני ולא על קבוצות אחרות עם הפקד WT, PBS או Gfp mRNA.
הערה: 500 ng/µL הוא ריכוז הזרקה מומלץ להתחיל עם 10. Picoinjector יכול לשמש כדי לשלוט סכומי ההזרקה. אמצעי הזרקה של 5-10 pL מומלץ 15. - שימוש ביד או בפה מכשירים המופעלים pipetting איפה הזכוכית פיפטה הפתיחה הוא מעט גדול יותר מקוטר oocyte (100-150 מיקרומטר), העברה oocytes לתוך טיפת 100 µL מילרינון ללא תרבות במדיום צלחת פטרי מכוסה העובר איכות שמן מינרלי דגירה oocytes במשך 7 שעות ב- 37 מעלות צלזיוס ב 5% C02 כדי לאפשר התבגרות מספיקות כדי מפה של מיוזה אני (פגשתי אני) 15.
- לאחר דגירה, באמצעות המנגנון פיפטה אותו כאמור לעיל, להעביר oocytes לתוך תבשיל תרבות מרכז-ובכן איברים המכילים µL 700 בינוני אוסף המדיה חיוני המינימלי טרום מקורר (מאמ) במרכז טוב ו- 500 µL H20 בזירה מבחוץ, מניחים צלחת על קרח במשך 7 דקות.
הערה: מומלץ מראש להירגע MEM המדיה, מרכז טוב איברים מנות תרבות ב-20 מעלות צלזיוס למשך לפחות 20 דקות לפני טיפול של oocytes. - לתקן את oocytes על-ידי העברת אותם באמצעות המנגנון פיפטה לבאר של צלחת זכוכית שקופה ספוט המכיל 400 µL של 2% paraformaldehyde ב- PBS X 1 עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר.
- באמצעות אותו פיפטה המנגנון, להעביר את oocytes לבאר עוד על צלחת ספוט המכיל 400 µL פתרון חסימה (PBS + 0.3% BSA + 0.01% % Tween-20 + 0.02 נקודות נאן3) וחנות ב 4 ° C עד מוכן לעבד עבור immunostaining.
הערה: עבור אחסון oocytes ב 4 ° C, לוח הזכוכית המכסה ספוט עם מצלמות-מיקרוסקופים כדי למנוע אידוי. - באמצעות אותו מנגנון פיפטה, העברה oocytes אל באר חדשה במקום צלחת פתרון permeabilization המכיל 400 µL (PBS + 0.3% BSA + 0.1% TritonX-100 + נאן 0.02%3), דגירה בטמפרטורת החדר במשך 20 הגבלת העברת oocytes במהירות באמצעות שלוש טיפות של 400 µL חסימת פתרון כדי להסיר את שאריות חומרי ניקוי.
הערה: צלחת זכוכית שקופה 9-ובכן ספוט עובד היטב עבור העברת קבוצות באמצעות טיפולים מרובים על מנה אחת (שלבים 2.4-2.5). - בצע את ההליכים immunocytochemistry הנותרים כדורים humidified, מוגן מפני אור בטמפרטורת החדר. השתמש מיכל פלסטיק בגודל בינוני שלאורכו מגבות נייר לח ומכסים ברדיד אלומיניום.
- שימוש במנגנון פיפטה, להעביר oocytes 30 µL חסימת פתרון על המכסה 96-ובכן צלחת ומקום בתוך תא humidified למשך 10 דקות.
הערה: טיפות מוצבים על indentions מעגלית על הצלחת. - תווית centromeres, פלך, שימוש במנגנון פיפטה, להעביר oocytes 30 µL חסימת המכילה centromeric נגד אנטיגן (ACA, קרסט) (1:30) וטובולין אנטי-acetylated (1:1000), תקופת דגירה של פחות שעה.
- לשטוף oocytes על ידי העברת דרך µL 30 שלוש טיפות של חסימת פתרון עבור 10 דקות כל אחד.
- באמצעות המנגנון פיפטה, העברה oocytes כדי µL 30 ירידה של פתרון חסימה המכיל נוגדנים משניים משלימים את הגוף כמתואר לעיל (האדם אנטי איג 1:200, העכבר אנטי איג 1:200) ולאחר תקופת דגירה של 1 h.
- חזור על השלבים 3, 10 דקות השטיפה ב 30 µL חוסם הפתרון כפי שמתואר בשלב 2.11.
- להעביר את oocytes, באמצעות המנגנון פיפטה, אל תוך 3-5 µL הרכבה דאפי המכילות בינוני (5.9 µg/µL) על משטח זכוכית מיקרוסקופ.
- במקום 4 טיפות קטנות (בגודל של ראש סיכה) של וזלין על הפינות של תגית כיסוי כדי למנוע ריסוק של oocytes.
- הנח בעדינות את הצד וזלין מכסה את אותן לשקופית.
- חותם coverslip קצוות עם לק ויכין אפשר להתייבש במשך 5 דקות.
- לאחסן שקופיות ב 4 ° C, מוגן מפני אור, עד עיבוד באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.
הערה: ודא מקדם שבירה של התאמות הרכבה בינונית, ואת coverslip, מטרות מיקרוסקופ מנוצל. הרכבה מומלץ חומרים היו בעבר תיאר 15. - תמונה oocytes באמצעות מטרה x 40-63 על מיקרוסקופ קונפוקלי, לכידת צעדים קטנים (≤ 1 מיקרומטר) ב z-המישור, ממוטב עבור המטרה עבודה וכן תמונה בכל האזור בכישור מפה של.
הערה: הקפד תמונה כל הערוצים 3 מבוסס על נוגדנים ספציפיים משני בשימוש בשלב 2.11. התמונה בממוצע ≥ 4 וזום של 3 הינם אידיאליים עבור פתרון הולם. גודל צעד 1 מיקרומטר מספק הדמיה ברורה של microtubules, kinetochores ב oocytes העכבר. ההליך עבור לכידת התמונה תשתנה מיקרוסקופ כדי מיקרוסקופ. עיין במדריך למשתמש קונאפוקלית של יצרני השלבים על אופן קביעת התצורה של הגדרות מיקרוסקופ. - לזהות מצב קובץ מצורף קינטוכור-microtubule באמצעות תוכנת הדמיה בעקבות צעדים 2.21-2.23 להלן.
הערה: השלבים הבאים מתארים הליך זה באמצעות תוכנה חופשית להורדה תמונות J (NIH), עם זאת, ניתן להשתמש בתוכנה הדמיה חלופי. מצב מצורפים סוגי בעבר היה מוגדר 16 . - תמונה פתוחה על-ידי גרירת קובץ לתוך סרגל הכלים תמונה J.
- נפתח z-הסדרה, הופכות כל ערוצי גלוי (DNA קינטוכור, פלך) על ידי לחיצה על 'מזג ערוציםזמינים בתפריט הנפתח 'תמונה', תחת הלשונית sub "צבע".
- שימוש של דו-מצבי בחלק התחתון של התמונה, לעבור כל z-פרוסה ולקבוע קינטוכור microtubule המצורף. מפורט מצורף התיאור היה בעבר תיאר 16
3. כרומוזום יישור אתגר Assay
- באמצעות המנגנון פיפטה כפי שמתואר בשלב 2.3, להעביר oocytes לתוך טיפת 100 µL מילרינון ללא תרבות בינוני תחת שמן ואת דגירה oocytes במשך 7 שעות לאפשר התבגרות מספיקות כדי מפה של מיוזה אני (פגשתי אני) כאמור שמתואר בשלב 2.3 17 .
הערה: ההליכים אוסף microinjection, ההבשלה Oocyte היו שתואר קודם לכן 15. עיין פרוטוקול assay מצורף בשלבים 2.1-2.2 עבור פקדים, ריכוזי microinjection RNA. - באמצעות אותו מנגנון פיפטה, העברה oocytes איברים. ובכן מרכז לתרבות מאכל המכיל 700 µL תרבות בינוני המכיל monastrol [100 מיקרומטר] מרכז µL 400 ובקו H20 בזירה שמסביב, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים.
- לשטוף monastrol על ידי העברת oocytes, בעזרת המנגנון פיפטה כמו לעיל, דרך 3 טיפות של 100 µL CZB תרבות בינוני, ולאחר מכן להעביר את oocytes לצלחת תרבות מרכז-ובכן איבר חדש המכיל 700 µL תרבות בינוני + MG132 [5 מיקרומטר] עבור 3 שעות במרכז טבעת. להוסיף 400 µL H20 הטבעת מבחוץ.
- לתקן את oocytes על-ידי העברת אותם, באמצעות המנגנון פיפטה, לבאר של צלחת זכוכית שקופה ספוט המכיל 400 µL 2% paraformaldehyde ב- PBS במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
- לאחר קיבוע, להעביר את oocytes, באמצעות המנגנון פיפטה, לתוך באר חדשה של צלחת זכוכית שקופה ספוט המכיל 400 µL פתרון חסימה וחנות ב 4 ° C עד מעובד עבור immunostaining.
הערה: עבור אחסון oocytes ב 4 ° C, לוח הזכוכית המכסה ספוט עם מצלמות-מיקרוסקופים כדי למנוע אידוי. - Permeabilize, תווית oocytes ויה immunocytochemistry כמתואר בצעדים 2.6-2.16.
- תמונה oocytes באמצעות מטרה x 40-63-מיקרוסקופ קונפוקלי, לכידת < 1 מיקרומטר צעדים במישור z-מקפיד תמונה את כל האזור של מפה של כישור.
- כדי לזהות כרומוזום יישור מצב לפתוח קבצי תמונה באמצעות תוכנת הדמיה.
הערה: השלבים הבאים מתארים הליך זה באמצעות תוכנה חופשית להורדה תמונות J (NIH), עם זאת, ניתן להשתמש בתוכנה הדמיה חלופי. - גרור תמונה תמונה J הבקרה.
- בסדרה שנפתחו z-, השתמש בכלי פוינט (זמין על-ידי לחיצה על סמל הכלי נקודה על הבר פקד התמונה J) לסמן נקודות בסוף אחד מקטביו ציר ב- z-פרוסה בהתאמה שלהם על-ידי הצבת את הכלי מעל הקוטב פלך בתמונה ולחיצה על התמונה. להוסיף נקודות אלה לאזור של מנהל ריבית (ROI) על-ידי לחיצה על הפקודה + t במקלדת.
- לקבוע את נקודות הציון ספציפי לכל אחת העמדות שהגדרת בשלב 3.10 על ידי הדגשת הנקודה ספציפי במנהל רועי ולחיצה על לחצן אמצעי. פעולה זו תספק תוצאות המכיל טבלה x ו- y קואורדינטות עבור כל נקודה. הם יהיו הנקודות X1, Y1, ו- X1, Y2, בהתאמה.
- בשלב הבא, לקבוע את הקואורדינטה true Z. פעולה זו מתבצעת על-ידי הכפלת מספר הפרוסה הפרוסה z מסוים במחסנית z-שבו זוהה הקוטב פלך (קרי פרוסה #2 של 6) כי כל נקודה בודדת הוא על-ידי העובי מחסנית (כלומר 1 מיקרומטר) (דוגמה: פורסים 2 x 1 מיקרומטר = 2). הם יהיו נקודות Z1 Z2 בהתאמה.
- לקבוע אורך ציר באמצעות המשוואה משפט פיתגורס (2 + b2 = c2) באמצעות שהוגדרו בעבר x, y ו- z קואורדינטות מצעדי 3.11-3.13. עבור כל ציר האורך הסופי הוא שווה ל:
√((X1-X2)2+(Y1-Y2)2+(Z1-Z2)2) - לקבוע את midzone פלך. זה מחושב כמו חצי האורך של כישור. שימוש בכלי קו ב- J התמונה, על ידי לחיצה על סמל הקו בבר כלי תמונה J, לצייר קו זה מהקוטב ציר אחד כדי midzone ציר. האורך יוצגו בסרגל כלי תמונה J.
- לקבוע מצב היישור כרומוזום על ידי הערכת כרומוזום מרחק midzone פלך בעזרת הכלי מדידה קו. באמצעות הכלי קו זמינות על-ידי לחיצה על סמל קו בסרגל כלי תמונה J, לצייר קו מ midzone פלך הכרומוזום. האורך יוצגו בסרגל כלי תמונה J. כרומוזומים גדול מ- 4 מיקרומטר מ midzone פלך נחשבים unaligned 18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
לאחר במבחנה שעתוק RNA באיכות גבוהה יהיה יחס A260/A280 של (1.8-2.2) ≥1.7 יחס של A260/A230 כאשר נמדד באמצעות ספקטרופוטומטרים. התמונה באיור 1 מציגה את ההעברה של במבחנה-ייצרו RNA על ג'ל agarose denaturing לאחר אלקטרופורזה. להקה הוא מרוח תבנית או מדגם בעל מספר להקות בגודל ניתן לציין זיהום או השפלה של המדגם. לחלופין, מספר להקות עשוי להצביע על זה ה-mRNA הוא לא לגמרי שפגע בסימני או פלסמיד ההתחלתי היה לא לגמרי לליניארית. ה-mRNA יפעל גדולים יותר חזה בגלל זנב poly-adenylated בנוי לתוך pIVT, אשר מאפשר ביטוי יציב של mRNA בתוך חוץ גופית. לאחר microinjection מומלץ להבטיח הזרקת אחיד ואמצעי אחסון רמות הביטוי באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. בתמונה באיור 2 מוצג prophase-עצרתי oocytes בצורה אחידה הזריק Gfp. טכניקת microinjection עקבית הוא קריטי עבור פרוטוקול זה. תוכנת ניתוח התמונה, כגון תמונה J, יכול לשמש כדי לאמת את רמות הביטוי כדי להבטיח אחידות טכניקה. שימו לב כי ניתן להשיג מידע לוקליזציה subcellular בזמן ביצוע ההדמיה עבור שני מבחני. עבור כל הניסויים microinjection הערכת ההשפעות של variant ג'ין, הגן פראי-סוג צריך להיות מוזרק תת-ערכה של oocytes כדי לשמש פקד. זה מאפשר אחד לפיקוח על פוטנציאל פנוטיפים ביטוי של הגן האנושי ב- oocyte העכבר. PBS, או Gfp עבור התווית על-ידי fluorophore בונה, צריך להיות גם להיות מוזרק תת-קבוצה של oocytes לפקד עבור פנוטיפים הנוצרות על-ידי microinjection. עבור מבנים ללא תגית פלורסנט, Gfp mRNA יכול להיות מוזרק משותפת כדי להבטיח microinjection מספיק. אם שותף הזרקת בונה שניים או יותר בו זמנית להיות בטוח להעלות את ריכוז ה-mRNA כזה הפתרון הסופי מכיל 500 ng/µL של כל ה-mRNA.
וזמינותו microtubule קר יציב מספק כלי חשוב להערכת המצב מצורף של kinetochores כדי microtubules. איור 3 הוא z-השלכה של תמונת מיקרוסקופ קונפוקלי של מפה של אני oocyte. Oocyte הזה היה נתון לטיפול מדיה קר אל depolymerize כל microtubules כי לא היה מחובר kinetochores. Oocytes אשר טופלו זמן מספיק יכילו סיבי microtubule שאינו מחובר כרומוזומים (קצר מדי תוצאות של סיבי מדי) או חוסר סיבים יחד (יותר מדי זמן תוצאות במבנה אין צירים) וזה מומלץ oocytes האלה לא ניתן להשתמש בניתוח. -מפה של מיוזה אני מקובל oocytes להכיל כעיגולים בצבע או רוחבית מחובר kinetochores, לכן מומלץ כי קבוצת ביקורת לשמש בכל מחקר המצורף. בממוצע, פראי-סוג oocytes יכיל 5-10% של kinetochores כרצונו MI לא עדיין להיות צמוד stably 19. זה הכרחי כי כל oocytes להיות בשלב זהה לניתוח של מצב קובץ מצורף microtubule קינטוכור. כדי להבטיח כי ניסיוני ולשלוט קבוצות בוגרים עם קשקשת זמן דומה מומלץ להעריך קינטיקה מחזור התא. כדי לבצע את assay, תת-קבוצה של oocytes ניסיוני ובקרה עליו להיות התבגר, דמיינו חי תחת microcopy זמן לשגות. השימוש מילרינון מאפשר oocytes להיות מסונכרנים prophase של מיוזה, כך שחרור לתוך המדיה חסר מילרינון עם אפשר חידוש מיוזה- 20באותו זמן. Oocytes שליטה והן קבוצות הניסוי צריך הבלטת גוף קוטב, הרומז על מצבה העגום של הגעה מפה של מיוזה II (פגשתי II), בנקודות זמן דומה. אם לחיות תאים במיקרוסקופ אינה זמינה, oocytes יכול להיות הבשיל כדי Met אני (7 שעות), פגש את השני (16 שעות), קבוע, צבעונית לגילוי DNA ו microtubules כמתואר קודם לכן. ב- Met I ו- II נפגשו זה פלך בצורת חבית, הפרעה דו קוטבית צריך להיות גלוי. ב- oocytes שליטה, צריך ליישר כרומוזומים בתחנה מפה. היישור של כרומוזומים יהיה שונה בקבוצות ניסיוני תלוי משתנה משפיע, עם זאת, כרומוזומים צריך להיות מרוכז, המצורפת microtubules עם הרוב של כרומוזומים לבוצ'ה בכישור. מספר דומה של oocytes צריך הגיעו מיוזה II שליטה וקבוצות ניסיוני. כדי להפחית את הקשיים בקביעת מצורף מצב מומלץ הדמיה oocytes באמצעות צעדים קטנים בתוך המטוס-z, אופטימיזציה עבור המטרה עבודה ספציפיים. ניתוח כרוך במלונות z-לפרוסות בנפרד, בהגדרות הממוזג כדי לקבוע אילו המוט המחובר microtubules מפנימיותו. איור 3B מדגים דוגמאות קינטוכור חריג-microtubule קבצים מצורפים. המוצג הוא טרינארית באיזו אחות אחת בלבד קינטוכור זוג מחובר microtubule פלך, מוגדר כקובץ מצורף אין. בשלב הבא, קובץ מצורף syntelic מוצג באיזו אחות בשני זוגות קינטוכור מחוברים הקוטב פלך אותו. לבסוף, קובץ מצורף merotelic מוצג באיזו אחות אחת קינטוכור קשורה בשני הקטבים פלך בעוד אחרים אחותו קינטוכור של הזוג מחובר מוט ציר יחיד.
הדימויים באיור 4 ממחישים את הדנ א הצפוי מתקדמת והתצורות פלך בתור אחד מהלכים לאורך השלבים של כרומוזום יישור אתגר וזמינותו. Assay הזה הוא קריטי כי קבוצות שונות ניסיוני להתקדם דרך מיוזה עם קינטיקה דומה. כפי שתואר קודם לכן זה ממליצים כדי להשלים את מחזור התא קינטיקה ניתוחים לפני ביצוע וזמינותו אתגר. ב הזה assay, שקובעת את היכולת של oocytes לתקן בהצלחה קינטוכור חריג-microtubule קבצים מצורפים. כדי לבדוק את זה, oocytes קודם התבגר כדי Met כדי לאפשר קינטוכור-microtubule מצורפים שתוקם. בשלב הבא, oocytes מודגרת monastrol, מעכב קינזין 5 (EG5), שמכווצת בכישור דו-קוטבי לתוך ציר monopolar 21. הדור של זה פלך monopolar גורם 100% microtubule שגוי-קינטוכור קבצים מצורפים. החומר המדכא monastrol ואז נשטף כדי לאפשר שחזור. במהלך תקופת ההחלמה oocytes להתחדש זה פלך דו-קוטבי ולנסות לתקן microtubule קבצים מצורפים. תוספת של מעכב פרוטאזום MG132 מונע התפרצות "אנאפאזה". כפקד, תת קבוצה קטנה של oocytes מכל קבוצה ניסיוני יכול להיות קבוע בכל שלב בפרוטוקול (פגש את, אני, monastrol מטופלים, לפרסם שחזור) כדי להבטיח כל הקבוצות מגיבים לטיפולים, באותה מידה. מפה של אני oocytes צריכה להכיל זה בצורת חבית פלך דו קוטבי עם כרומוזומים מיושר בתחנה מפה של. Oocytes שטופלו monastrol צריך להכיל זה פלך monopolar עם כרומוזומים מונחה מסביב למוט יחיד. Oocytes התאושש להכיל שוב זה בצורת חבית פלך הפרעה דו קוטבית. יישור כרומוזום מוגדר כל הכרומוזומים μM יותר מ-4 מ פלך midzone 22. זה עוזר כתם oocytes לגילוי DNA ו kinetochores כדי לקבוע אם הן kinetochores נמצאים מחוץ אזור מרכזי זה משום שזה יכול להיות קשה לקבוע באמצעות זיהוי ה-DNA בלבד.
איור 1. Denaturingagarose בג'ל של רנ א. RNA איכות וגודל יכול להיות מוערך על ידי אלקטרופורזה על ג'ל agarose denaturing. ג'ל denaturing מומלץ כדי למנוע היווצרות מבנה שניוני. ליין 1 מכיל סמן משקל מולקולרי RNA. ליין 2 הוא דוגמה RNA. שימו לב כי הרנ א יפעל גדולים יותר מחושב בשל הזנב תיקים עשויים מובנה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
באיור 2. אימות oocyte microinjection. מיקרוסקופ פלואורסצנטי יכול לשמש כדי לאמת oocyte מוצלח microinjection וביטוי. Oocytes עצרתי prophase microinjected עם Gfp מוצגים לאחר לילה ביטוי של הבונה. תמונה זו הושג באמצעות Invitrogen EVOS פל האוטומטית הדמיה למערך עם קוביית אור GFP. סולם בר הוא 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3. הערכת קינטוכור-microtubule מצורפים. נציג (א) A z-הקרנה של שטופלו קר פגשתי אני oocyte. פלך (ירוק), kinetochores (אדום) ו- DNA (כחול) מוצגים. תיבת מציינת את האזור של הזום האופטי. ראשי חץ מציינות סוף-על קבצים מצורפים של kinetochores microtubules של טרינארית יחיד. סולם בר הוא 10 מיקרומטר פלך, קינטוכור, ה-DNA של מזג ערוצים. סולם בר עבור זום אופטי הוא 5 מיקרומטר. (B) דוגמאות קינטוכור חריג-microtubule סוגי קבצים מצורפים ב- oocytes העכבר. חיצים מציינים קינטוכור-microtubule מצורף אתרים. סולם בר הוא 5 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
באיור 4. כרומוזום יישור אתגר assay. תרשים זרימה של ההליך עם z-תחזיות נציג של oocytes בכל שלב. Oocytes קודם התבגר כדי מפה של מיוזה אני (פגשתי אני), הועבר לאחר מכן תבשיל חדש המכיל monastrol עבור 2 h לעודד היווצרות ציר monopolar. Oocytes הבאה מותר להתאושש ב בינוניים בתוספת מעכב פרוטאוזום (MG132) כדי למנוע התפרצות "אנאפאזה" במשך 3 שעות. Oocytes פעם התאושש קבוע, עם תוויות ציר (ירוק), kinetochores (אדום) של ה-DNA (כחול), עם תמונה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית לקביעת מצב היישור. קווים מציינים אורך ציר (40 מיקרומטר), ציר midzone (20 מיקרומטר) באמצעות משוואת פיתגורס. חיצים מציינים נקודת עמדות כלי בקוטב בכל. כל kinetochores > 4 מיקרומטר מ midzone פלך נחשבים unaligned. הכוכבית מציינת unaligned כרומוזום (5.6 מיקרומטר מ midzone). סולם בר הוא 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בגלל הזיהוי הגובר וברכבות של האדם משתנים גנטיים הקשורים במחלה, זה חיוני כי מערכות נקבעו כדי להעריך את משמעותם ביולוגי. הבנת וחלבון לתפקד מיוזה האנושי מציבה אתגרים מסוים כי oocytes האדם יקרים ואינם זרע נדיר, האדם לבצע מניפולציות גנטיות. עכבר oocytes הם מערכת מודל בתרבית של ערך להערכת ג'ין meiotic האנושי פונקציה 10,23. מודל זה עוקף את impracticalities של שימוש ביצים האנושי תוך מתן זמינים ומקור oocytes נמוכים, manipulable עוברים מיוזה דומים לתאי נבט האדם בזמן להיות שימושי להבנת גרסאות איך גנטי עשוי להשפיע נקבה פוריות.
כי שיטות אלה מעסיקים ביטוי חוץ רחמי של החלבון האנושי של העכבר oocytes ויה microinjection, חיוני להקים לראשונה ריכוז של שליטה, RNA פראי-סוג זה אינו משנה ההבשלה meiotic. מומלץ כי ההבשלה meiotic קינטיקה הם בפיקוח (התמוטטות מעטפת הגרעין, גוף קוטב ההבלטה) שליטה oocytes כדי ליצור פרמטרים בסיסית, להערכת המורפולוגיה פלך, כרומוזום. בנוסף, המבטיח אחסון microinjection אחידה הינה קריטית השוואת קבוצות. כולל תגית פלורסנט על הגן עניין יכולים לפשט את זה אתגר טכני. טכניקות מאסטרינג oocyte microinjection כבר הפגינו בעבר 15. ויזואליזציה של oocytes מוזרק תחת מיקרוסקופ זריחה או קביעת חלבון ביטוי דרך תספיג גם הם כלי רב ערך עבור המאשר הזרקת עקבי ריכוזים.
בגלל שגיאות ההפרדה כרומוזום oocytes בתרבית של הסיבה המובילה של aneuploidy עובריים ו- אובדן הריון5, ניתוח של קבצים מצורפים קינטוכור-microtubule לספק כלי רב ערך עבור הערכת אם הגן עניין משפיע סגרגציה כרומוזום (כלומר לא תקין מצורפים תגרום סגרגציה שגויה). 10 דקות חשיפה למדיה צוננת מספיקה depolymerize microtubules כי לא עשו קובץ מצורף קינטוכור-microtubule, המאפשר ויזואליזציה של קבצים מצורפים יציבה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית 24. על זה assay, חשוב להירגע לא יתר על המידה את oocytes כפי שזה יוביל depolymerization של microtubules יציב. בנוסף, אופטימיזציה של צביעת הליכים הוא מפתח עבור ויזואליזציה של קינטוכור microtubule מבנים. כדי להבטיח רזולוציית תמונה מתאימה לניתוח, צעדים קטנים (≤ 1 μm) במישור z-באמצעות סימן x x-63 40 צריך להיות בשבי המטרה ולאחר להשיג תמונות דרך מבנה פלך כולו כדי להבטיח כל הקבצים המצורפים גלויים. שים לב כי זה נפוץ שיש kinetochores כעיגולים בצבע במהלך prometaphase של מיוזה אני 25.
כרומוזום יישור אתגר וזמינותו שימושית על ההערכה של רווח או הפסד-של-פונקציה משתנים. רווח-של-פונקציה משתנים יכול להיות קשה להעריך כי העכבר oocytes של נשים צעירות יש רמות נמוכות של aneuploidy. Assay זו גוברת על משוכה זו על ידי יצירת מצב שבו oocyte חייב לתקן השפעול המושרה שגוי קינטוכור-microtubule קבצים מצורפים. הקמת נקודת זמן שבה פקד oocytes מכילים כרומוזומים לא מיושרים 1-2 לאחר התאוששות מספק תרחיש לכימות לקביעת אם מוטציה מספק יעילות מוגברת יישור (כלומר יותר היישור יהיו יכולות להגן על euploidy). על כימות של כרומוזום אי-התאמות, פרוטוקול שנקבעו קודם איזה כרומוזומים גדול מ- 4 μm בכישור midzone מאופיינים unaligned יכולים להיות בשימוש 18.
ללמוד אובדן-של-פונקציה גרסאות, נחוצים תנאים ניסויים נוספים בגלל homolog אנדוגני בתוך מערכת הלימודים. דרך אחת כדי להקל על בעיה זו היא להשתמש או ליצור מודל העכבר נוקאאוט של variant עניין. כניסתו של המערכת הטיגון/Cas9 יכול לספק דרך מהירה ליצירת כזה הסתרה 26. לחלופין, אם דוגמנית מהממת היא לא אופציה, טכניקות תמונות ציפורים קלאסית כגון שיתוף הזרקת oligonucleotides מורפולינו antisense או RNAs מפריעות קטן יכול להיות מועסק. עם זאת, תשומת הלב לעיצוב רצף נדרשת כדי למנוע כל הפרעה אפשרית עם הגרסה microinjected במחקר. לדוגמה, oligonucleotide מורפולינו יכול להיות מתוכנן כדי לאגד 5' האזור לא מתורגם (5' UTR) של הגן העכבר שלא נכלל ב- variant mRNA האנושי הציג דרך microinjection. אם משתמש הפרעה קטנה RNAs אחד יכול למקד אזור רצף שאינם הומולוגיים או להציג מוטציות נקודה שקטה הגן האנושי זה להתחמק מיקוד. עם זאת, יש את העותק חלבון אנדוגני עדיין נוכחים על ביטוי של variant יכול להיות אינפורמטיבי כפי וריאציות רבות מצויים במדינה משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים הגנום האנושי.
בסופו של דבר, למרות שאינה מתוארת ב פרוטוקול זה, כרומוזום אנאפלואידיה הערכת יכול בקלות להידרש בביצים השני פגשתי כמו הסופית assay בצבר לניתוח variant אנושי. תיאור מפורט של זה בחיי עיר פרוטוקול כרומוזום להפיץ בעבר תיאר 15. בקצרה, microinjected oocytes הם התבגר במבחנה עד שיגיעו השלב השני נפגשו, לאחר הטיפול עם סוכן depolymerizing פלך meiotic לפני קיבוע. קינטוכור, הכרומוזום מכתים כפי שמתואר כאן לאפשר הערכה של כרומוזום תוכן.
בעוד העכבר oocytes לספק כלי חשוב לצורך המחקר של חלבונים קריטית מיוזה הנשי כמה מגבלות כדי קיימים מודל. ביטוי של חלבונים יכולים perturb meiotic ההבשלה, ולכן ריכוז ה-RNA אינם יכולים להתקיים זה לא לגרום פנוטיפ. בנוסף, homolog העכבר אנדוגני עלולים להפריע לוקליזציה של חלבון אנושי אקסוגני. דור של נוקאאוט העכבר מודלים מספק פתרון לבעיה זו; עם זאת, זה לא יכול להיות ריאלי בכל המצבים. גישה אלטרנטיבית יהיה לרוקן את החלבון העכבר באמצעות שיתוף הזרקת RNAi או מורפולינו oligonucleotides שנועדו לא המטרה של אקסוגני RNA וחלבון. לבסוף, חשוב לציין כי בעוד חלבונים רבים הם הומולוגיים בין אדם ועכבר, ייתכן הבדלים, מובילים להבדלים לוקליזציה ומתפקדים זה יכול למנוע סוג זה של ניתוח קרוס-מינים. ככל מניפולציה גנטית כלים כמו הגנום Cas9 עריכה27 זול וטוב יותר משותף-מקום, פרוטוקול זה יכולה להתפתח עושה בטוק, humanized עכבר קווים במקום להסתמך על microinjection.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענק מחקר של האגודה האמריקנית לרפואת פוריות ו מן צ'ארלס בוש לקרן יוהנה לומד, המדינה באוניברסיטה של ג'אי כדי K.S. A.L.N. נתמך על ידי מענק של N.I.H. (F31 HD0989597).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 mL Seal-Rite PCR tube | USA Scientific | 1602-4300 | |
| 1 kb DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0313 | |
| 100 bp DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0243 | |
| 6X DNA loading Dye | Thermo Scientific | R0611 | |
| 9-well glass spot plate | Thomas Scientific | 7812G17 | |
| Agarose | Sigma Aldrich | A9539 | |
| Albumin from bovine serum | Sigma-Aldrich | A3294 | |
| Alexa-fluor-568 conjugated anti-mouse IgG | Thermo Scientific | A21050 | 1:200 dilution |
| Alexa-fluor-633 conjugated anti-human IgG | Thermo Scientific | A21091 | 1:200 dilution |
| Ampicillin | VWR | AA0356 | |
| Anti-vibration table | Technical Manufacturing Corp | any standard model | |
| Anti-Acetylated Tubulin antibody | Sigma Aldrich | T7451 | 1:100 diution |
| Anti-centromeric (CREST) antibody | Antibodies Incorportated | 15-234 | 1:30 dilution |
| Barrier (Filter) Pipette tips | Thermo Scientific | AM12635 | Make sure compatable with your brand of pipettors. These are compatible with Eppendorf brand pipettors. |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Agar, Miller (Luria Bertani) | Fisher Scientific | DF0445-07-6 | |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria Bertani) | Fisher Scientific | DF0446-07-5 | |
| Capillary tubing | Sutter | B100-75-10 | |
| Center Well organ culture dish | VWR | 25381-141 | |
| CO2 tank | For incubator | ||
| Confocal microscope | Zeiss | any standard model | |
| Centrifuge (With cooling ability) | Thomas Scientific | any standard model | |
| Cover Glass 11 x 22 mm | Thomas Scientific | 6663F10 | |
| Coverslips | Thomas Scientific | 6663-F10 | thickness will vary for particular microscopes |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | |
| DEPC H20 | Life Technologies | AM9922 | |
| Digital Dry Bath | Thermo Scientific | 888700001 | |
| Easy A high fidelity cloning enzyme | Agilent | 600400 | For DNA cloning |
| Enzymes for linearizing pIVT | New England Biolabs | NdeI or KasI can be used | |
| Ethidium Bromide | Thermo Scientific | 155585011 | |
| Fluorescent Microscope | Any Fluorescent microscope may be used | ||
| Formaldehyde (37%) | Thermo Fisher Scientifc | 9311 | |
| Formaldehyde RNA loading dye | Ambion | 8552 | |
| Frosted Microscope Slides (Uncharged) 25X75 mm | Fisher Scientific | 12-544-3 | |
| Full Length cDNA Clones | Can be obtained from any vendor that supplies open reading frame clones | ||
| Gel electrophoresis apparatus | Bio-Rad | any standard model | |
| Glass Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-200 | |
| Globin Forward Primer for pIVT Construct | 5'- GAA GCT CAG AAT AAA CGC -3'. Can be purchased from any company that generates custom oligonucelotides | ||
| Globin Reverse Primer for pIVT Construct | 5'- ATT CGG GTG TTC TTG AGG CTG G -3' Can be purchased from any company that generates custom oligonucelotides | ||
| Holding pipettes | Eppendorf | 930001015 | Vacutip |
| Humidified Chamber | Tupperware can be used | ||
| Illustra Ready-To-Go RT-PCR beads | GE Life Sciences | 27925901 | |
| Incubator | any standard model with CO2 and water jacketed technology | ||
| Inverted Microscope | Nikon instruments | Any Standard model | |
| Image J (NIH) Software | NIH | Image Analysis software | |
| Lid of 96 well plate | Nalgene Nunc International | 263339 | |
| Low Adhesion 0.5 mL microcentrifgue tube | USA Scientific | 1405-2600 | |
| MacVector | MacVector | Sequence analysis software | |
| MG132 | Selleckchem | S2619 | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-3 | |
| Millenium RNA Markers-Formaldehyde | Ambion | AM7151 | |
| Milrinone | Sigma-Aldrich | M4659 | Resuspend in DMSO at 2.5mM |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M5310 | Only used embryo-tested, sterile-filtered |
| Monastrol | Sigma-Aldrich | M8515 | Resuspend in DMSO at 100 mM |
| Mouthpiece | Biodiseno | MP-001-Y | |
| N2 tank | for antivibration table | ||
| Nail Polish; Clear | Any clear nailpolish can be used | ||
| NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | any standard model | |
| NorthernMax 10X Denaturing Gel Buffer | Life Technologies | AM8676 | |
| NorthernMax 10X Running buffer | Life Technologies | AM8671 | |
| NuPAGE MOPS SDS Running buffer | Thermo Scnentific | NP0001 | |
| Organ Culture Dish 60x15mm | Life Technologies | 08-772-12 | |
| Paraformaldehyde | Polysciences, Inc. | 577773 | |
| PCR Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | 4484075 | |
| Petri Dish 139 mm | Thermo Fisher Scientifc | 501V | |
| Petri dish 35 mm | Thermo Fisher Scientifc | 121V | |
| Petri Dish 60 mm | Falcon BD | 351007 | |
| Picoinjector | XenoWorks Digital Microinjector | any standard model | |
| Pipette puller | Flaming-Brown Micropipette puller | Model P-1000 | |
| pIVT plasmid | AddGene | 32374 | Empty vector suitable for oocyte expression. |
| Pregnant Mare Serum Gonadotropin | Lee BioSolutions | 493-10 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | purification of up to 20 uL of plasmid DNA |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| Quikchange II site directed mutagenesis kit | Agilent | 200523 | mutagenesis kit for insertions and deletions |
| Quikchange lightning multi-site directed mutagenesis kit | Agilent | 210512 | mutagenesis kit for single site changes |
| Scissors (Fine point) | Fine science tools | 14393 | |
| Scissors (Medium point) | Fine science tools | WP114225 | |
| Seal-Rite 1.5 mL microcentrifuge tube | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Slide Warmer | any standard model | ||
| Spectrophotometer (Nanodrop) | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | |
| Stereomicroscope | any standard model | ||
| Subcloning Efficiency DH5a Competent Cells | Thermo Fisher Scientifc | 18265017 | |
| Syringe | BD Bioscienes | 309623 | 1 ml, 27G(1/2) |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202L | |
| T7 mMessage Machine high-yield capped RNA transcription kit | Life Technologies | AM1340 | |
| TritonX-100 | Sigma-Aldrich | x-100 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | 274348 | |
| Tweezer (Fine point- Size 5) | Fine science tools | SN.743.12.1 | |
| UltraPure Dnase/Rnase-Free Distilled Water | Thermo Fisher Scientifc | 10977015 | |
| UltraPure Ethidium Bromide 10mg/mL | Thermo Fisher Scientifc | 15585011 | |
| UVP UV/White lite transilluminator | Fisher Scientific | UV95041501 | |
| Vectashield Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 |
References
- Thoma, M. E., et al. Prevalence of infertility in the United States as estimated by the current duration approach and a traditional constructed approach. Fertil Steril. 99 (5), 1324-1331 (2013).
- Boivin, J., Bunting, L., Collins, J. A., Nygren, K. G. International estimates of infertility prevalence and treatment-seeking: potential need and demand for infertility medical care. Human Reproduction. 22 (6), 1506-1512 (2007).
- Treff, N. R., Zimmerman, R. S. Advances in Preimplantation Genetic Testing for Monogenic Disease and Aneuploidy. Annu Rev Genomics Hum Genet. , (2017).
- Franasiak, J. M., et al. The nature of aneuploidy with increasing age of the female partner: a review of 15,169 consecutive trophectoderm biopsies evaluated with comprehensive chromosomal screening. Fertil Steril. 101 (3), 656-663 (2014).
- Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).
- Scott, R. T. Jr Blastocyst biopsy with comprehensive chromosome screening and fresh embryo transfer significantly increases in vitro fertilization implantation and delivery rates: a randomized controlled trial. Fertil Steril. 100 (3), 697-703 (2013).
- Scott, R. T. Jr, Upham, K. M., Forman, E. J., Zhao, T., Treff, N. R. Cleavage-stage biopsy significantly impairs human embryonic implantation potential while blastocyst biopsy does not: a randomized and paired clinical trial. Fertil Steril. 100 (3), 624-630 (2013).
- Yang, Z., et al. Selection of single blastocysts for fresh transfer via standard morphology assessment alone and with array CGH for good prognosis IVF patients: results from a randomized pilot study. Mol Cytogenet. 5 (1), 24 (2012).
- Rubio, C., et al. In vitro fertilization with preimplantation genetic diagnosis for aneuploidies in advanced maternal age: a randomized, controlled study. Fertil Steril. 107 (5), 1122-1129 (2017).
- Nguyen, A. L., et al. Identification and characterization of Aurora Kinase B and C variants associated with maternal aneuploidy. Mol Hum Reprod. , (2017).
- Igarashi, H., Knott, J. G., Schultz, R. M., Williams, C. J. Alterations of PLCbeta1 in mouse eggs change calcium oscillatory behavior following fertilization. Dev Biol. 312 (1), 321-330 (2007).
- Database, J. S. E. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. JoVE. , (2017).
- Carey, M. F., Peterson, C. L., Smale, S. T. PCR-mediated site-directed mutagenesis. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (8), 738-742 (2013).
- Armstrong, J. A., Schulz, J. R. Current Protocols Essential Laboratory Techniques. , John Wiley & Sons, Inc. (2008).
- Stein, P., Schindler, K. Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment. J Vis Exp. (53), (2011).
- Watanabe, Y. Geometry and force behind kinetochore orientation: lessons from meiosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (6), 370-382 (2012).
- Shuda, K., Schindler, K., Ma, J., Schultz, R. M., Donovan, P. J. Aurora kinase B modulates chromosome alignment in mouse oocytes. Mol Reprod Dev. 76 (11), 1094-1105 (2009).
- Lane, S. I., Yun, Y., Jones, K. T. Timing of anaphase-promoting complex activation in mouse oocytes is predicted by microtubule-kinetochore attachment but not by bivalent alignment or tension. Development. 139 (11), 1947-1955 (2012).
- Nguyen, A. L., et al. Phosphorylation of threonine 3 on histone H3 by haspin kinase is required for meiosis I in mouse oocytes. J Cell Sci. 127 (Pt 23), 5066-5078 (2014).
- Tsafriri, A., Chun, S. Y., Zhang, R., Hsueh, A. J., Conti, M. Oocyte maturation involves compartmentalization and opposing changes of cAMP levels in follicular somatic and germ cells: studies using selective phosphodiesterase inhibitors. Dev Biol. 178 (2), 393-402 (1996).
- Kapoor, T. M., Mayer, T. U., Coughlin, M. L., Mitchison, T. J. Probing spindle assembly mechanisms with monastrol, a small molecule inhibitor of the mitotic kinesin, Eg5. Eg5. J Cell Biol. 150 (5), 975-988 (2000).
- Jones, K. T., Lane, S. I. Molecular causes of aneuploidy in mammalian eggs. Development. 140 (18), 3719-3730 (2013).
- Fellmeth, J. E., et al. Expression and characterization of three Aurora kinase C splice variants found in human oocytes. Mol Hum Reprod. 21 (8), 633-644 (2015).
- Rieder, C. L. The structure of the cold-stable kinetochore fiber in metaphase PtK1 cells. Chromosoma. 84 (1), 145-158 (1981).
- Brunet, S., et al. Kinetochore fibers are not involved in the formation of the first meiotic spindle in mouse oocytes, but control the exit from the first meiotic M phase. J Cell Biol. 146 (1), 1-12 (1999).
- Joung, J., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening. Nat Protoc. 12 (4), 828-863 (2017).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
