Summary
Som genetiske variantene forbundet med menneskelig sykdom begynner å bli avdekket, blir det stadig viktigere å utvikle systemer som å raskt vurdere biologiske betydningen av de identifiserte variantene. Denne protokollen beskriver metoder for å vurdere menneskelige gen funksjon i kvinnelige meiose jeg bruker musen oocytes.
Abstract
Embryonale aneuploidy er den viktigste genetiske årsaken til ufruktbarhet i mennesker. De fleste av disse hendelsene oppstår under kvinnelige meiose, og riktignok positivt korrelert med mors alder, alder alene er ikke alltid forutsigbar av risikoen for å generere et aneuploid embryo. Gene varianter kan derfor utgjør feil kromosom segregering under oogenesis. Gitt at tilgang til menneskelig oocytes er begrenset til forskningsformål, en rekke analyser ble utviklet for å studere human gen funksjon under meiose jeg bruker musen oocytes. Først budbringer RNA (mRNA) av genet og genet variant av interesse er microinjected i prophase jeg-arrestert musen oocytes. Etter at tiden for uttrykket, oocytes synkront slippes meiotic modning å fullføre meiose jeg. Ved å merke mRNA med en sekvens med fluorescerende reporter, som grønne fluorescerende protein (Gfp), kan lokalisering av menneskelig protein vurderes i tillegg til de fenotypiske endringene. For eksempel få eller tap av funksjon kan undersøkes ved å etablere eksperimentelle forhold som utfordrer gene produktet å fikse meiotic feil. Selv om dette systemet er en fordel i undersøker menneskelige protein funksjonen under oogenesis, bør tilstrekkelig tolkning av resultatene foretas gitt at protein uttrykk ikke er endogene og hvis kontrollert for (dvs. slått ut eller ned) finnes murine homologs også i systemet.
Introduction
Infertilitet er en tilstand som påvirker 10-15% av den menneskelige befolkningen reproduktiv alder 1, som nesten en halv søker medisinsk behandling 2. Selv om etiologien for infertilitet er mangfoldig og i mange tilfeller multifaktoriell, er den vanligste genetiske abnormiteten i mennesker embryonale aneuploidy 3. Aneuploidy er definert som avvik (gevinst eller tap) av riktig antall kromosomer i en celle. Fenomenet aneuploidy i menneskelige embryo er vanlig og øker med mors alder 4,5. Fire randomiserte kontrollerte forsøk har fremhevet fordelen av å velge bare chromosomally normal (euploid) embryo for livmor overføring fordi denne strategien resultert i økt implantasjon priser, lavere spontanabort priser og en kortere tid for oppnå graviditet 6,7,8,9. Derfor kan forstå etiologi av menneskelig aneuploidy ha viktige implikasjoner i assistert reproduksjon.
Selv om før implantasjon genetisk testing for aneuploidies er gunstig for ufruktbarhet behandlinger, mangler fortsatt en grundig forståelse av hvordan aneuploidies kommer. Det er allment akseptert at det er en positiv korrelasjon meiotic aneuploidies (stammer under Kjønnscelle produksjon) og mors alder, men noen kvinner tilstede embryonale aneuploidy priser som avviker fra midlere sats for deres gitt alder 4. Disse tilfellene foreslår at alder alene ikke er alltid forutsigbar av risikoen for å generere et aneuploid embryo. Andre faktorer kan spille en rolle i å øke risikoen for embryonale aneuploidy, som gene varianter.
Et viktig aspekt å undersøke det potensielle bidraget av en genet variant til aneuploidy under oocyte meiose er å utforme et raskt evaluere meiotic gen funksjon. Etiske begrensninger og begrenset tilgang er det upraktisk å utføre disse eksperimenter ved hjelp av menneskelig egg. Disse problemene kan omgås ved hjelp av musen oocytes, og en rekke analyser å vurdere menneskelige gen funksjon under meiose jeg er beskrevet her. Microinjecting budbringer RNA (mRNA) koding for genet variant av interesse, kan lokalisering av menneskelig proteinet i musen egg visualisere og brukes til å bestemme om ektopisk uttrykket av vill-type og mutert menneskelige protein fører noen fenotypiske endringer som kan føre til aneuploidy. Disse fenotyper inkluderer en økning i piskehale som henger som festes til den uriktig å søster kinetochore og manglende evne til å støtte kromosom justeringen på metaphase av meiose I. viktigere, denne protokollen kan brukes å undersøke både gevinst og tap av funksjon genetisk varianter ved bestemte eksperimentelle forhold å utfordre viktige hendelser i oocyte meiose som vri bygningen og kromosom justering 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. molekylær kloning
- Få full lengde koding sekvens av genet av interesse og plasmider i vitro transkripsjon (pIVT) vektor11.
Merk: Full lengde cDNA kloner er kommersielt tilgjengelig fra ulike leverandører eller kan genereres via omvendt transkripsjon polymerasekjedereaksjons (RT-PCR). National Center for bioteknologi informasjon (NCBI) online ressurs gir transkripsjon sekvenser for gener fra Nucleotide og uttrykt sekvens merket (EST)-databaser. For enkel protein kan visualisering og analyse av uttrykk nivåer, fusion grønne fluorescerende protein (Gfp) eller en annen egnet fluorescerende kode være ønsket i kloning strategi. - Bruker en godkjent kloning strategi, sett inn koding sekvensen av genet av interesse i flere kloning regionen pIVT. En detaljert beskrivelse av molekylære kloning og nødvendige trinn har tidligere blitt beskrevet 12.
Merk: Hvis en gen-fusion produktet skal genereres, være sikker på at kloning er i riktig lesing rammen. - Sekvens Konstruer bruke Globin primere for å sikre riktig genet innsetting, riktig i rammer fusion, og at ingen polymerase-indusert punkt mutasjoner ble opprettet.
Merk: Hvis Sanger DNA sekvensering utstyret ikke er tilgjengelig, mange selskaper tilbyr lavpris DNA sekvensering alternativer. - Mutagenize DNA hvis genererer single nukleotid (SNPer) eller innsettinger/slettinger (INDELER). DNA mutagenese er beskrevet i trinnene 1.5-1.7 nedenfor. For vill-type konstruerer, Fortsett linearization trinn 1.7.
- Utforme mutagenese primere og fullføre mutagenese PCR reaksjonen å generere mutant konstruere per produsentens protokollen. PCR-mediert området-rettet mutagenese har vært beskrevet tidligere 13. Mange selskaper tilbyr i tillegg nettstedet-rettet mutagenese kits inkluderer protokoller.
- Forvandle bakteriell vert mutagenized DNA. Isolere og rense plasmider.
Merk: Mange selskaper gjør kits som kan brukes til å isolere og rense plasmider. Følg produsenter protokollen tilsvarende. Hvis bruker en gram-negative bakterielle belastningen som E. coli, anbefales det å bruke et kit som fjerner endotoxins. - Sekvens isolert DNA fra bakteriell transformants bruker standard Sanger DNA sekvensering for å bekrefte innføring av ønsket SNP eller INDEL.
- Linearize siste produkter med én begrensning enzym fordøyelsen av renset DNA.
Merk: PIVT vektoren inneholder flere single-enzym kutte områder oppført i plasmider kartet Addgene 14. - Kontroller at produktet er lineær via agarose gel geleelektroforese. Metodikken for agarose gel geleelektroforese har tidligere blitt definerte 14.
Merk: For alle trinnene, bruke barriere (filter) Pipetter tips og RNase-frie materialer slik produksjon av stabile, høy kvalitet RNA. - Rense fordøyd produktet bruker en godkjent DNA oppryddingen protokollen eller kit, og elute i 30 µL RNase/DNase-fritt vann.
Merk: Silica matrise spinn kolonne-baserte kits er anbefalt for høy kvalitet, renset DNA. Følg produsenter protokollen tilsvarende. - In vitro transkribere DNA ved å bruke T7 utvalg etter produsentens protokoll.
- Rense og elute RNA i 30 µL RNase/DNase gratis vann med en silica matrise spinn kolonne-baserte nukleinsyre rensing kit etter produsentens protokoll.
- Utføre denaturing agarose gel geleelektroforese med formaldehyd for å bekrefte den endelige RNA produkt størrelsen. Se hva 1.13-1,22 under 14. (Figur 1).
- Klargjør gel ved oppvarming 1 g agarose i 72 mL vann til oppløst, og deretter avkjøles til 60 ° C.
- Forberede 10 X MOPPER kjører bufferen ved å legge til 0,4 M MOPPER (pH 7.0) og 0.1 M natrium acetate 0,01 M EDTA.
- Legge til 10 mL 10 X MOPPER kjører buffer og 18 mL 37% formaldehyd (12.3 M) til avkjølt agarose løsning.
- Kaste gel ved å helle den agarose løsningen i en gel-forming beholder. Bruk en kam stor nok til 10 µL. Etter gel har satt og er fast å ta, Fjern kam.
- Montere gel i geleelektroforese tanken, og legge til nok 1 X MOPPER kjører buffer, sikre gel er helt dekket.
- Forberede RNA prøven ved å legge til 1 µg av 0.5 X mengder formaldehyd inneholder lasting fargestoff.
- Legge til ethidium bromide RNA løsning i en konsentrasjon av 10 µg/mL.
- Denature RNA eksempel løsning på 70 ° C i 5 minutter.
- Bruker sterilt, 10 µL filter tips, laste 5 µL av molekylvekt merketråden og 5 µL av prøven (e) i separate brønner i gel og electrophorese på 5 V/cm til fargebad har migrert minst to tredjedeler av gel.
- Visualisere RNA i gel på en UV trans illuminator. Kontroller RNA er riktig størrelse ved å sammenligne molekylvekt markøren.
- For å måle konsentrasjonen og renhet av den, kan du overføre 1,2 µL av renset ved hjelp av sterile 10 µL filter tips på et UV-spektrofotometer.
Merk at høy kvalitet RNA bør ha absorbansen forholdstall på A260/280 (1.8-2.2) og 260/230 (> 1.7) henholdsvis. - Bruker 10 µL filter tips, aliquot de resterende renset RNA i sterilt 0,5 µL sentrifuge rør (3-5 µL/rør). Lagre rør ved-80 ° C til klar for microinjection.
Merk: En siste injeksjon konsentrasjon av 500 ng/µL er et optimalt utgangspunkt. Det anbefales å fortynne RNA 1:2 i RNase gratis H20 før microinjection å redusere stickiness av RNA i microinjection pipette.
2. kinetochore-Microtubule vedlegg analysen
- Del oocytes i like grupper for microinjection.
Merk: Oocyte samling, overføring, microinjection og meiotic modning har blitt beskrevet i detalj i JoVE tidligere 15. - Microinject en gruppe med eksperimentelle mRNA og de andre gruppene med WT kontroll og PBS eller Gfp mRNA.
Merk: 500 ng/µL er anbefalt injeksjon konsentrasjonen til å begynne med 10. En picoinjector kan brukes til å styre injeksjon beløp. En injeksjon volum på 5-10 pL anbefales 15. - Ved hjelp av en hånd eller munn styres pipettering apparatet der glasset Pipetter åpning er litt dekket større enn diameteren på en oocyte (100-150 µm), overføre oocytes til en dråpe milrinone-fri kultur medium i en Petriskål 100 µL i fosteret kvalitet mineralolje og Inkuber oocytes 7 h på 37 ° C i 5% C02 å tillate tilstrekkelig modning til metaphase av meiose jeg (møtte jeg) 15.
- Etter inkubasjon bruker samme pipette apparatet som ovenfor, overføre oocytes til en center-og orgel kultur parabol med 700 µL av pre kjølt minimum viktige medier (MEM) samling medium i midten godt og 500 µL H20 i utenfor ringen og plass rett på is 7 min.
Merk: Det anbefales å pre chill MEM media og senter godt orgel kultur retter på 20 ° C i minst 20 min før behandling av oocytes. - Fastsette oocytes ved å overføre dem med Pipetter apparatet i et godt av et klart glass spotplate inneholder 400 µL av 2% paraformaldehyde i 1 X PBS for 20 min ved romtemperatur.
- Bruker samme Pipetter apparater, overføre oocytes i en brønn på en flekk tallerken med 400 µL blokkerer løsning (PBS + 0,3% BSA + 0,01% Tween-20 + 0.02% NaN3) og lagre på 4 ° C helt klar til å behandle for immunostaining.
Merk: For å lagre oocytes på 4 ° C, dekke glass spotplate med parafilm å hindre fordampning. - Bruker samme pipette apparater, overføre oocytes til en ny brønn en plate som inneholder 400 µL permeabilization løsning (PBS 0,3% BSA + 0,1% TritonX-100 + 0.02% NaN3) og Inkuber ved romtemperatur for 20 min. overføring oocytes raskt gjennom tre dråper 400 µL blokkerer løsning for å fjerne eventuelle gjenværende vaskemiddel.
Merk: En 9-og klart glass spotplate fungerer bra for flytte grupper gjennom flere behandlinger på hovedrett (trinn 2.4-2.5). - Utføre de resterende immunocytochemistry fremgangsmåtene i en fuktet kammer, beskyttet fra lys ved romtemperatur. Bruk en middels stor plastbeholder foret med fuktig papirhåndklær og dekk med aluminiumsfolie.
- Bruke pipette apparatet, overføre oocytes til 30 µL blokkerer løsning på lokket på en 96-brønns plate og sted innenfor fuktet kammeret i 10 min.
Merk: Drops plasseres i de sirkulære indentions på tallerkenen. - Etiketten centromeres og spindel, med Pipetter apparatet, overføre oocytes til 30 µL blokkerer løsning som inneholder anti-centromeric antigen (ACA, Crest) (1:30) og anti-acetylated tubulin (1:1000) og Inkuber minst 1t.
- Skyll oocytes ved å overføre gjennom tre 30 µL dråper blokkerer løsning for 10 min.
- Bruker pipette apparater, overføre oocytes til en 30 µL dråpe blokkerer løsning som inneholder sekundære antistoffer gratis for antistoffer brukt ovenfor (anti-IgG 1:200, anti-musen IgG 1:200) og ruge 1t.
- Gjentar 3, 10-minutters skyllingsprosess 30 µL blokkerer løsning som beskrevet i trinn 2.11.
- Overføre oocytes, med Pipetter apparater, i 3-5 µL montering medium som inneholder DAPI (5.9 µg/µL) på en barometer microscope skyve.
- Sett 4 små dråper (størrelsen på en pin hode) vaselin på hjørnene av cover slip å hindre crushing av oocytes.
- Forsiktig plass cover slip vaselin siden på lysbildet.
- Forsegle dekkglassvæske kantene med blank neglelakk og la det tørke i 5 minutter.
- Lagre lysbilder på 4 ° C, beskyttet fra lys, til behandling via AC confocal mikroskopi.
Merk: Kontroller brytningsindeks montering medium, og dekkglassvæske, kamper mikroskop målene utnyttet. Anbefalt montering materialer har tidligere blitt beskrevet 15. - Bilde oocytes bruker en 40-63 x målet på en AC confocal mikroskop, fange små skritt (≤ 1 µm) i z-flyet, optimalisert for arbeider mål og image hele regionen metaphase spindelen.
Merk: Husk å bilde alle 3 kanaler basert på spesifikke sekundære antistoffer brukte i trinn 2.11. Bilde gjennomsnitt ≥ 4 og en zoom 3 er ideelle for tilstrekkelig oppløsning. En 1 µm steg størrelse gir tydelig visualisering av piskehale som henger og kinetochores i mus oocytes. Prosedyren for bildebehandling varierer fra mikroskop til mikroskopet. Se produsenter AC confocal brukerhåndboken for bestemte trinn om hvordan du konfigurerer innstillinger for mikroskop. - Identifisere kinetochore-microtubule vedlegg status ved hjelp av bildebehandlingsprogramvare følge trinnene 2,21-2,23 nedenfor.
Merk: Trinnene nedenfor beskriver denne prosedyren med bilde J (NIH) gratis nedlastbar programvare, men alternativ programvare kan brukes. Vedlegg status typer tidligere har vært definert 16 . - Åpne bildet ved å dra filen til bildet J verktøylinjen.
- I åpnet z-serien, vise alle kanaler (DNA, kinetochore og spindel) ved å klikke "slå sammen kanaler" i rullegardinmenyen "bilde" sub-fanen "farge".
- Bruker veksle nederst på bildet, flytte gjennom hver z-skive og bestemme kinetochore microtubule vedlegg. Detaljert vedlegg beskrivelser er tidligere beskrevet 16
3. kromosom justering utfordring analysen
- Bruke pipette apparatet som beskrevet i trinn 2.3, overføre oocytes til en 100 µL dråpe milrinone-fri kultur medium under olje og ruge oocytes 7 h å tillate tilstrekkelig modning til metaphase av meiose jeg (møtte jeg) som tidligere beskrevet i trinn 2.3 17 .
Merk: Oocyte samling, microinjection og kjønnsmodning prosedyrer ble skissert tidligere 15. Se vedlegg analysen protokollen i trinn 2.1-2.2 for kontroller og RNA microinjection konsentrasjoner. - Bruker samme pipette apparater, overføre oocytes til en center-og orgel kultur parabol med 700 µL kultur medium med monastrol [100 µM] i center godt og 400 µL H20 i rundt ringen og ruge på 37 ° C for 2T.
- Skyll ut monastrol ved å overføre oocytes, med Pipetter apparatet som ovenfor, gjennom tre dråper 100 µL CZB kultur medium, og deretter overføre oocytes til en ny center-og orgel kultur parabol med 700 µL kultur medium + MG132 [5 µM] 3 h i midten Ring. Legge til 400 µL H20 utenfor ringen.
- Fastsette oocytes ved å overføre dem, bruke pipette apparater, inn i en brønn av et klart glass spotplate inneholder 400 µL 2% paraformaldehyde i PBS for 20 min ved romtemperatur.
- Etter fiksering, overføre til oocytes, med Pipetter apparater, i en ny brønn av et klart glass spotplate inneholder 400 µL blokkerer løsning og butikk på 4 ° C før behandlet for immunostaining.
Merk: For å lagre oocytes på 4 ° C, dekke glass spotplate med parafilm å hindre fordampning. - Permeabilize og merke oocytes via immunocytochemistry som beskrevet i trinnene 2.6-2,16.
- Bilde oocytes bruker en 40-63 x mål på AC confocal mikroskop, fange < 1 µm trinn i z-flyet standardhylle bilde hele regionen metaphase spindelen.
- For å identifisere kromosom justering status åpne bildefiler ved hjelp av bildebehandlingsprogramvare.
Merk: Trinnene nedenfor beskriver denne prosedyren med bilde J (NIH) gratis nedlastbar programvare, men alternativ programvare kan brukes. - Dra bildet inn i bildet J Kontrollpanel.
- I åpnet z-serien, kan du bruke punktverktøyet (tilgjengelig ved å klikke punktverktøyikonet på verktøylinjen bilde J) merker poeng på slutten av hver spindel Pol i deres respektive z-stykke ved å plassere verktøyet over spindel Polen i bildet og klikke på bildet. Legge til disse punktene i regionen av interesse (ROI) manager ved å trykke Kommando + t på tastaturet.
- Bestemme spesifikke koordinatene for hver av posisjonene angitt i trinn 3.10 ved å merke den spesifikke punktet i Avkastningen manager og klikke mål. Dette vil gi en tabell som inneholder x- og y-koordinatene for hvert punkt. Disse vil være X1, Y1 og X1, Y2, poeng hhv.
- Deretter bestemme sann Z koordinater. Dette gjøres ved å multiplisere stykkenummer på bestemte z-sektoren i z-stakken der spindelen Polen ble identifisert (i.e. slice #2 av 6) som punktbelastningen i av stabelen tykkelsen (dvs. 1 µm) (eksempel: Skjær 2 x 1 µm = 2). Disse vil være Z1 og Z2 poeng hhv.
- Bestemme spindel lengde ved hjelp av Pythagoras teorem formelen (en2 + b2 = c2) bruke den tidligere definerte x, y og z koordinater fra trinn 3.11-3,13. For hver spindel er den endelige lengden lik:
√((X1-X2)2+(Y1-Y2)2+(Z1-Z2)2) - Bestemme spindel-midzone. Dette blir beregnet som halvparten lengden på spindelen. Bruker linjeverktøyet i bildet J, ved å klikke ikonet på bildet J verktøylinjen, tegne en linje som er fra en spindel Pol til spindelen midzone. Hvor vises på verktøylinjen bilde J.
- Kontrollere kromosom justering ved å vurdere kromosom avstand fra spindelen midzone ved hjelp av måleverktøyet linje. Bruke linjeverktøyet tilgjengelig ved å klikke ikonet på verktøylinjen bilde J, tegne en linje fra spindelen midzone til kromosomet. Hvor vises på verktøylinjen bilde J. Kromosomene større enn 4 µm fra spindelen midzone anses unaligned 18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etter in vitro har transkripsjon høykvalitets RNA en A260/A280 forholdet (1.8-2.2) og en A260/A230 forholdet ≥1.7 målt med et spektrofotometer. Bildet i figur 1 viser overføringen av in vitro-produsert RNA på en denaturing agarose gel etter geleelektroforese. Et band som er smurt i mønster eller en som har flere store band kan angi forurensning eller nedbrytning av prøven. Eventuelt kan flere band tyde på at mRNA ikke er helt denaturert, eller Start plasmider var ikke helt linearized. MRNA kjører større enn forutsett på grunn av poly-adenylated halen innebygd i pIVT, som gir stabil uttrykk for mRNA i vitro. Etter microinjection anbefales å sikre ensartet injeksjon volumer og uttrykk nivåer via fluorescerende mikroskopi. Bildet i figur 2 viser prophase jeg-arrestert oocytes jevnt injisert med Gfp. Konsekvent microinjection teknikk er avgjørende for denne protokollen. Image analyseprogramvare, som bildet J, kan brukes til å validere uttrykk nivåer for å sikre ensartethet og mestring av teknikken. Merk at subcellular lokalisering informasjon kan fås mens avbilding for begge analyser. For alle microinjection eksperimenter måle effekten av en genet variant, skal vill-type genet settes inn i et delsett av oocytes som en kontroll. Dette gjør det mulig å kontrollere for potensielle overuttrykte fenotyper av menneskelig genet i en mus oocyte. PBS, eller Gfp for fluorophore-merket konstruerer, skal også være injisert i en undergruppe av oocytes å kontrollere for microinjection-indusert fenotyper. For konstruksjoner uten en fluorescerende kode være Gfp mRNA co injisert å sikre tilstrekkelig microinjection. Hvis co sprøytebruk to eller flere konstruksjoner samtidig må du øke mRNA konsentrasjonen slik at den endelige løsningen inneholder 500 ng/µL av hver mRNA.
Kald-stabil microtubule analysen gir et verdifullt verktøy for å vurdere status vedlegg som kinetochores til piskehale som henger. Figur 3 er en z-projeksjon av en AC confocal mikroskop-bilde av en metaphase jeg oocyte. Denne oocyte ble utsatt for kalde media behandling til depolymerize alle piskehale som henger som ikke hadde knyttet til kinetochores. Oocytes som har blitt behandlet for en tilstrekkelig tid vil inneholde microtubule fiber ikke tilknyttet kromosomene (for kort resultater i mange fiber) eller mangel fibre sammen (lenge resultater i ingen spindel struktur) og det er anbefalt at disse oocytes ikke bli brukt i analysen. På metaphase av meiose jeg er det vanlig for oocytes inneholder eller sidelengs festet kinetochores, derfor anbefales det at en kontrollgruppe brukes i noen vedlegg studie. Gjennomsnittlig vill-type oocytes inneholder 5-10% av kinetochores på MI vil ikke ennå være stabilt knyttet 19. Det er viktig at alle oocytes være på samme scene for analyse av kinetochore-microtubule vedlegg status. For å sikre at eksperimentelle og kontroll grupper moden med lignende tidsskalaer det anbefales å vurdere celle syklus kinetics. For å utføre denne analysen, bør et delsett av kontroll og eksperimentell oocytes være modnet og visualisert live under time-lapse microcopy. Bruk av milrinone kan oocytes synkronisert i prophase av meiose I, slik at utgivelsen i media mangler milrinone med tillate gjenopptakelse av meiose på samme tid 20. Oocytes fra både kontrollen og eksperimentelle grupper bør extrude en polar kropp, indikativ å nå metaphase på meiose II (møtte II), på samme tid poeng. Hvis live-celle mikroskopi ikke er tilgjengelig, oocytes kan være modnet til Met jeg (7 h) og møtte II (16 h), faste, og farget å oppdage DNA og piskehale som henger som beskrevet tidligere. På Met I og møtte II et fat-formet, bipolar spindel skal vises. I kontrollen oocytes, skal kromosomer justeres metaphase plate. Justeringen av kromosomer vil variere i eksperimentell grupper avhengig av varianten påvirker, men kromosomer skal være kondensert og festet til piskehale som henger med flertallet av kromosomer sentralt på spindelen. Et tilsvarende antall oocytes bør ha nådd meiose II i kontroll og eksperimentelle grupper. For å redusere problemer ved vedlegg optimalisert status anbefales imaging oocytes med små skritt i z-flyet, for arbeider målsetting. Analyse vil innebære viser z-skiver individuelt og i flettede for å avgjøre hvilke pole som knyttet piskehale som henger kommer fra. Figur 3B illustrerer eksempler på unormal kinetochore-microtubule vedlegg. Vist er en bivalent i som eneste søster kinetochore par er knyttet til en spindel microtubule, definert som ingen vedlegg. Deretter vises en syntelic vedlegg i som både søster kinetochore par er knyttet til samme spindel Sydpolen. Endelig en merotelic vedlegg vises i som en søster kinetochore er knyttet til både spindel polakkene mens andre søster kinetochore av par er knyttet til en enkelt spindel stang.
Bildene i Figur 4 illustrerer den progressive forventet DNA og spindel konfigurasjoner som en flytter gjennom trinnene av kromosom justering utfordring analysen. I denne analysen er det viktig at ulike eksperimentelle grupper fremdrift gjennom meiose med lignende kinetics. Som beskrevet tidligere er det anbefaler for å fullføre cellen syklus kinetics analyser før gjennomfører utfordring analysen. I denne analysen vurderes muligheten for oocytes å kunne korrigere unormal kinetochore-microtubule vedlegg. Test dette ved oocytes er første modnet til Met jeg tillate kinetochore-microtubule vedlegg skal etableres. Deretter er oocytes ruges i monastrol og Kinesin 5 (EG5) hemmere, som skjuler bipolar spindelen i monopolar spindel 21. Generering av et monopolar spindel induserer 100% feil microtubule-kinetochore vedlegg. Den monastrol inhibitor deretter vasket at utvinning. Under restitusjonsperioden oocytes lag et bipolar spindel og prøver å rette microtubule vedlegg. Tillegg av proteasome hemmer MG132 hindrer anaphase utbruddet. Som en kontroll, en undergruppe av oocytes fra hver eksperimentelle gruppe kan bli fikset på hvert trinn i protokollen (møtte jeg, monastrol behandlet, legge utvinning) å sikre alle reagerer på behandling, og i samme grad. Metaphase jeg oocytes bør inneholde en fat-formet bipolar spindelen med kromosomene justert metaphase plate. Oocytes behandles med monastrol bør inneholde en monopolar spindelen med kromosomene orientert rundt enkelt stangen. Gjenopprettede oocytes inneholde igjen et fat-formet bipolar spindel. Kromosom justering er definert som noen kromosomer mer enn 4 μM spindel midzone 22. Det er nyttig å flekk oocytes for å oppdage DNA og kinetochores å etablere hvis begge kinetochores er utenfor denne sentrale sonen som dette kan være vanskelig å fastslå bruker bare DNA gjenkjenning.
Figur 1. Denaturingagarose gel geleelektroforese av RNA. RNA kvaliteten og størrelsen kan vurderes av geleelektroforese på en denaturing agarose gel. En denaturing gel anbefales å unngå sekundær formasjon. Lane 1 inneholder en RNA molekylvekt markør. Lane 2 er en RNA prøve. Merk at RNA vil kjøre større enn beregnet på grunn av innebygd polyA halen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Validere oocyte microinjection. Fluorescerende mikroskopi kan brukes til å validere vellykket oocyte microinjection og uttrykk. Prophase jeg-arrestert oocytes microinjected med Gfp vises etter overnatting uttrykk for Konstruer. Dette bildet ble oppnådd med Invitrogen EVOS FL Auto tenkelig system utstyrt med GFP lys kuben. Skala bar er 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Vurdere kinetochore-microtubule vedlegg. (A) A representant z-projeksjon av en kald-behandlet møtte jeg oocyte. Spindel (grønn), kinetochores (rød) og DNA (blå) vises. Boksen angir regionen optisk zoom. Pilspisser betegne slutten på vedlegg av kinetochores til piskehale som henger på en enkelt bivalent. Skala er 10 µm for spindelen, kinetochore, DNA og slå sammen kanaler. Skala er for optisk zoom 5 µm. (B) eksempler på unormal kinetochore-microtubule vedlegg i musen oocytes. Pilene angir kinetochore-microtubule vedlegg nettsteder. Skala bar er 5 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Kromosom justering utfordring analysen. Flytdiagram for prosedyren med representant z-anslag av oocytes på hvert trinn. Oocytes er først modnet til metaphase av meiose jeg (møtte jeg), deretter overført til en ny rett som inneholder monastrol for 2t å skape monopolar spindel. Neste oocytes kan gjenopprette i modning medium supplert med en proteasome hemmer (MG132) for å hindre anaphase utbruddet 3 h. En gang gjenopprettet oocytes fast, merket for spindel (grønn), kinetochores (rød) og DNA (blå) og fotografert via AC confocal mikroskopi kontrollere justering. Angi lengden på spindel (40 µm) og vri midzone (20 µm) bestemmes ved hjelp av Pythagoras teorem ligningen. Pilene angir punkt verktøyet posisjoner på hver stang. Noen kinetochores > 4 µm fra spindelen midzone anses unaligned. Stjerne angir unaligned kromosom (5.6 µm fra midzone). Skala bar er 10 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
På grunn av rask og økende identifikasjon av menneskelig genetisk varianter forbundet med sykdom, er det viktig at systemer er etablert for å vurdere deres biologisk betydning. Forstå protein funksjon i menneskelig meiose utgjør spesielle utfordringer fordi menneskelig oocytes er verdifulle og sjeldne og menneskelige sperm er ikke mottakelig for genetisk manipulasjon. Mus oocytes er et pattedyr modellsystem som er verdifulle for å vurdere menneskelige meiotic gene funksjonen 10,23. Denne modellen går utenom impracticalities ved bruk av menneskelige egg samtidig som det gir en lett tilgjengelig kilde til lave kostnader, manipulable oocytes som gjennomgå meiose ligner menneskelige bakterie celler mens å være nyttig for å forstå hvordan genetiske varianter kan påvirke kvinner fruktbarhet.
Fordi disse metodene ansetter ektopisk uttrykk for menneskelige proteinet i musen oocytes via microinjection, er det viktig å først opprette en konsentrasjon av kontroll, vill-type RNA som ikke endrer meiotic modning. Det anbefales at meiotic modning kinetics er overvåket (kjernefysiske konvolutten sammenbrudd, polar kroppen ekstrudering) kontroll oocytes å etablere planlagte parametere og vurdering spindel og kromosom morfologi. I tillegg sikrer jevn microinjection volumer er kritisk til å sammenligne grupper. Inkludert en fluorescerende kode på genet av interesse kan forenkle denne tekniske utfordringen. Teknikker for å mestre oocyte microinjection har vært tidligere vist 15. Visualisering av injisert oocytes under fluorescens mikroskop eller bestemme protein uttrykk via western blot er også verdifulle verktøy for bekrefter konsekvent injeksjon konsentrasjoner.
Fordi feil i kromosom segregering i pattedyr oocytes er en ledende årsak til embryonale aneuploidy og graviditet tap5, analyse av kinetochore-microtubule vedlegg gir et verdifullt verktøy for å vurdere om en genet av interesse påvirker Kromosom segregering (dvs. ugyldig vedlegg medfører mis segregering). En 10 min eksponering for kjølt media er tilstrekkelig til å depolymerize piskehale som henger som ikke har gjort en kinetochore-microtubule-vedlegg, slik at visualisering av stabil vedlegg via AC confocal mikroskopi 24. For denne analysen er det viktig å ikke over chill i oocytes som dette vil føre til depolymerization stabile piskehale som henger. I tillegg er optimalisering av Ning-prosedyrer nøkkelen for visualisering av kinetochore og microtubule. Å sikre tilstrekkelig bildeoppløsning for analyse, små skritt (≤ 1 μm) i z-flyet med en 40 x-63 x målet skal bli tatt, og å få bilder gjennom hele spindel strukturen å sikre alle vedlegg er synlige. Merk at det er vanlig å ha ledige kinetochores under prometaphase av meiose jeg 25.
Kromosom justering utfordring analysen er nyttig for vurdering av gevinst eller tap av funksjon varianter. Gevinst-av-funksjon varianter kan være vanskelig å vurdere fordi musen oocytes fra yngre kvinner har lave nivåer av aneuploidy. Denne analysen overvinner dette hinderet ved å generere en situasjon der oocyte må rette eksperimentelt indusert feil kinetochore-microtubule vedlegg. Etablere et punkt som inneholder kontrollen oocytes 1-2 feiljustert kromosomene etter gjenoppretting gir målbare scenario for å avgjøre om en mutant gir økt justering effektivitet (dvs. bedre justering evner beskytte euploidy). For kvantifisering kromosom skjevheter, en tidligere etablert protokoll i hvilke kromosomene større enn 4 μm fra spindelen midzone kjennetegnes unaligned kan være brukt 18.
For å studere tap-av-funksjon varianter, er mer eksperimentelle forhold den endogene homolog i studien systemet. En måte å lindre problemet er å bruke eller generere en knockout musemodell variant av interesse. Ankomsten av crispar/Cas9 kan gi en rask måte å generere slike fortrenging 26. Alternativt, hvis en knockout modell ikke er et alternativ, klassisk knockdown teknikker som co injeksjonsbruk antisense morpholino oligonucleotides eller lite forstyrrende RNAs kan brukes. Men er oppmerksomhet til sekvens design nødvendige for å unngå eventuelle forstyrrelser av microinjected varianten under studien. For eksempel kan morpholino oligonucleotide utformes til å binde til 5' uoversatt regionen (5' UTR) av musen genet som ikke er inkludert i menneskelig mRNA varianten introdusert via microinjection. Hvis bruker lite konflikt kunne RNAs en målrette en ikke-homologe sekvens region eller introdusere stille punkt mutasjoner i menneskelig genet som ville unngå målretting. Imidlertid kan har endogene protein kopien fremdeles på uttrykk for varianten være informativ som mange varianter finnes i heterozygote tilstand som det menneskelige genomet.
Til slutt, selv om ikke beskrevet i denne protokollen, kromosom aneuploidy vurdering kan lett vurderes i møtte II egg som den endelige analysen i rørledningen for menneskelige varianten analyse. En detaljert beskrivelse av dette i situ kromosom spre protokollen har tidligere beskrevet 15. Kort, microinjected oocytes er modnet i vitro før de når møtte II scenen, etter behandling med en meiotic spindel-depolymerizing agent før fiksering. Kinetochore og kromosom flekker som beskrevet her gir vurdering av kromosom innhold.
Mens musen oocytes gir et verdifullt verktøy for studiet av proteiner avgjørende for kvinnelige meiose noen begrensninger i modellen eksisterer. Overuttrykte proteiner kan forurolige meiotic modning og derfor en RNA konsentrasjon finnes ikke det ikke føre en fenotypen. I tillegg kan endogene musen homolog forstyrre lokalisering av eksogene menneskelige protein. Generasjonen knockout musen modeller gir en løsning på dette problemet; men kan dette ikke være gjennomførbart i alle situasjoner. En alternativ tilnærming ville være å utarme musen protein ved å injisere co RNAi eller morpholino oligonucleotides utformet ikke mål eksogene RNA og protein. Endelig er det viktig å merke seg at mens mange proteiner er homologe mellom menneske og mus, forskjeller finnes, fører til forskjeller i lokalisering og funksjon som kan utelukke denne type av cross-species analyse. Som genetisk manipulasjon verktøy som Cas9-genome redigering27 blir billigere og mer felles-sted, denne protokollen kan utvikle seg til å banke inn, humanized musen linjer i stedet for å stole på microinjection.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av et forskningsstipend fra American Society for Reproductive Medicine og Charles og Johanna Busch minnefond ved Rutgers, The State University i NJ til K.S. A.L.N. ble støttet av et stipend fra N.I.H. (F31 HD0989597).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 mL Seal-Rite PCR tube | USA Scientific | 1602-4300 | |
| 1 kb DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0313 | |
| 100 bp DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0243 | |
| 6X DNA loading Dye | Thermo Scientific | R0611 | |
| 9-well glass spot plate | Thomas Scientific | 7812G17 | |
| Agarose | Sigma Aldrich | A9539 | |
| Albumin from bovine serum | Sigma-Aldrich | A3294 | |
| Alexa-fluor-568 conjugated anti-mouse IgG | Thermo Scientific | A21050 | 1:200 dilution |
| Alexa-fluor-633 conjugated anti-human IgG | Thermo Scientific | A21091 | 1:200 dilution |
| Ampicillin | VWR | AA0356 | |
| Anti-vibration table | Technical Manufacturing Corp | any standard model | |
| Anti-Acetylated Tubulin antibody | Sigma Aldrich | T7451 | 1:100 diution |
| Anti-centromeric (CREST) antibody | Antibodies Incorportated | 15-234 | 1:30 dilution |
| Barrier (Filter) Pipette tips | Thermo Scientific | AM12635 | Make sure compatable with your brand of pipettors. These are compatible with Eppendorf brand pipettors. |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Agar, Miller (Luria Bertani) | Fisher Scientific | DF0445-07-6 | |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria Bertani) | Fisher Scientific | DF0446-07-5 | |
| Capillary tubing | Sutter | B100-75-10 | |
| Center Well organ culture dish | VWR | 25381-141 | |
| CO2 tank | For incubator | ||
| Confocal microscope | Zeiss | any standard model | |
| Centrifuge (With cooling ability) | Thomas Scientific | any standard model | |
| Cover Glass 11 x 22 mm | Thomas Scientific | 6663F10 | |
| Coverslips | Thomas Scientific | 6663-F10 | thickness will vary for particular microscopes |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | |
| DEPC H20 | Life Technologies | AM9922 | |
| Digital Dry Bath | Thermo Scientific | 888700001 | |
| Easy A high fidelity cloning enzyme | Agilent | 600400 | For DNA cloning |
| Enzymes for linearizing pIVT | New England Biolabs | NdeI or KasI can be used | |
| Ethidium Bromide | Thermo Scientific | 155585011 | |
| Fluorescent Microscope | Any Fluorescent microscope may be used | ||
| Formaldehyde (37%) | Thermo Fisher Scientifc | 9311 | |
| Formaldehyde RNA loading dye | Ambion | 8552 | |
| Frosted Microscope Slides (Uncharged) 25X75 mm | Fisher Scientific | 12-544-3 | |
| Full Length cDNA Clones | Can be obtained from any vendor that supplies open reading frame clones | ||
| Gel electrophoresis apparatus | Bio-Rad | any standard model | |
| Glass Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-200 | |
| Globin Forward Primer for pIVT Construct | 5'- GAA GCT CAG AAT AAA CGC -3'. Can be purchased from any company that generates custom oligonucelotides | ||
| Globin Reverse Primer for pIVT Construct | 5'- ATT CGG GTG TTC TTG AGG CTG G -3' Can be purchased from any company that generates custom oligonucelotides | ||
| Holding pipettes | Eppendorf | 930001015 | Vacutip |
| Humidified Chamber | Tupperware can be used | ||
| Illustra Ready-To-Go RT-PCR beads | GE Life Sciences | 27925901 | |
| Incubator | any standard model with CO2 and water jacketed technology | ||
| Inverted Microscope | Nikon instruments | Any Standard model | |
| Image J (NIH) Software | NIH | Image Analysis software | |
| Lid of 96 well plate | Nalgene Nunc International | 263339 | |
| Low Adhesion 0.5 mL microcentrifgue tube | USA Scientific | 1405-2600 | |
| MacVector | MacVector | Sequence analysis software | |
| MG132 | Selleckchem | S2619 | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-3 | |
| Millenium RNA Markers-Formaldehyde | Ambion | AM7151 | |
| Milrinone | Sigma-Aldrich | M4659 | Resuspend in DMSO at 2.5mM |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M5310 | Only used embryo-tested, sterile-filtered |
| Monastrol | Sigma-Aldrich | M8515 | Resuspend in DMSO at 100 mM |
| Mouthpiece | Biodiseno | MP-001-Y | |
| N2 tank | for antivibration table | ||
| Nail Polish; Clear | Any clear nailpolish can be used | ||
| NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | any standard model | |
| NorthernMax 10X Denaturing Gel Buffer | Life Technologies | AM8676 | |
| NorthernMax 10X Running buffer | Life Technologies | AM8671 | |
| NuPAGE MOPS SDS Running buffer | Thermo Scnentific | NP0001 | |
| Organ Culture Dish 60x15mm | Life Technologies | 08-772-12 | |
| Paraformaldehyde | Polysciences, Inc. | 577773 | |
| PCR Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | 4484075 | |
| Petri Dish 139 mm | Thermo Fisher Scientifc | 501V | |
| Petri dish 35 mm | Thermo Fisher Scientifc | 121V | |
| Petri Dish 60 mm | Falcon BD | 351007 | |
| Picoinjector | XenoWorks Digital Microinjector | any standard model | |
| Pipette puller | Flaming-Brown Micropipette puller | Model P-1000 | |
| pIVT plasmid | AddGene | 32374 | Empty vector suitable for oocyte expression. |
| Pregnant Mare Serum Gonadotropin | Lee BioSolutions | 493-10 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | purification of up to 20 uL of plasmid DNA |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| Quikchange II site directed mutagenesis kit | Agilent | 200523 | mutagenesis kit for insertions and deletions |
| Quikchange lightning multi-site directed mutagenesis kit | Agilent | 210512 | mutagenesis kit for single site changes |
| Scissors (Fine point) | Fine science tools | 14393 | |
| Scissors (Medium point) | Fine science tools | WP114225 | |
| Seal-Rite 1.5 mL microcentrifuge tube | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Slide Warmer | any standard model | ||
| Spectrophotometer (Nanodrop) | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | |
| Stereomicroscope | any standard model | ||
| Subcloning Efficiency DH5a Competent Cells | Thermo Fisher Scientifc | 18265017 | |
| Syringe | BD Bioscienes | 309623 | 1 ml, 27G(1/2) |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202L | |
| T7 mMessage Machine high-yield capped RNA transcription kit | Life Technologies | AM1340 | |
| TritonX-100 | Sigma-Aldrich | x-100 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | 274348 | |
| Tweezer (Fine point- Size 5) | Fine science tools | SN.743.12.1 | |
| UltraPure Dnase/Rnase-Free Distilled Water | Thermo Fisher Scientifc | 10977015 | |
| UltraPure Ethidium Bromide 10mg/mL | Thermo Fisher Scientifc | 15585011 | |
| UVP UV/White lite transilluminator | Fisher Scientific | UV95041501 | |
| Vectashield Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 |
References
- Thoma, M. E., et al. Prevalence of infertility in the United States as estimated by the current duration approach and a traditional constructed approach. Fertil Steril. 99 (5), 1324-1331 (2013).
- Boivin, J., Bunting, L., Collins, J. A., Nygren, K. G. International estimates of infertility prevalence and treatment-seeking: potential need and demand for infertility medical care. Human Reproduction. 22 (6), 1506-1512 (2007).
- Treff, N. R., Zimmerman, R. S. Advances in Preimplantation Genetic Testing for Monogenic Disease and Aneuploidy. Annu Rev Genomics Hum Genet. , (2017).
- Franasiak, J. M., et al. The nature of aneuploidy with increasing age of the female partner: a review of 15,169 consecutive trophectoderm biopsies evaluated with comprehensive chromosomal screening. Fertil Steril. 101 (3), 656-663 (2014).
- Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).
- Scott, R. T. Jr Blastocyst biopsy with comprehensive chromosome screening and fresh embryo transfer significantly increases in vitro fertilization implantation and delivery rates: a randomized controlled trial. Fertil Steril. 100 (3), 697-703 (2013).
- Scott, R. T. Jr, Upham, K. M., Forman, E. J., Zhao, T., Treff, N. R. Cleavage-stage biopsy significantly impairs human embryonic implantation potential while blastocyst biopsy does not: a randomized and paired clinical trial. Fertil Steril. 100 (3), 624-630 (2013).
- Yang, Z., et al. Selection of single blastocysts for fresh transfer via standard morphology assessment alone and with array CGH for good prognosis IVF patients: results from a randomized pilot study. Mol Cytogenet. 5 (1), 24 (2012).
- Rubio, C., et al. In vitro fertilization with preimplantation genetic diagnosis for aneuploidies in advanced maternal age: a randomized, controlled study. Fertil Steril. 107 (5), 1122-1129 (2017).
- Nguyen, A. L., et al. Identification and characterization of Aurora Kinase B and C variants associated with maternal aneuploidy. Mol Hum Reprod. , (2017).
- Igarashi, H., Knott, J. G., Schultz, R. M., Williams, C. J. Alterations of PLCbeta1 in mouse eggs change calcium oscillatory behavior following fertilization. Dev Biol. 312 (1), 321-330 (2007).
- Database, J. S. E. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. JoVE. , (2017).
- Carey, M. F., Peterson, C. L., Smale, S. T. PCR-mediated site-directed mutagenesis. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (8), 738-742 (2013).
- Armstrong, J. A., Schulz, J. R. Current Protocols Essential Laboratory Techniques. , John Wiley & Sons, Inc. (2008).
- Stein, P., Schindler, K. Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment. J Vis Exp. (53), (2011).
- Watanabe, Y. Geometry and force behind kinetochore orientation: lessons from meiosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (6), 370-382 (2012).
- Shuda, K., Schindler, K., Ma, J., Schultz, R. M., Donovan, P. J. Aurora kinase B modulates chromosome alignment in mouse oocytes. Mol Reprod Dev. 76 (11), 1094-1105 (2009).
- Lane, S. I., Yun, Y., Jones, K. T. Timing of anaphase-promoting complex activation in mouse oocytes is predicted by microtubule-kinetochore attachment but not by bivalent alignment or tension. Development. 139 (11), 1947-1955 (2012).
- Nguyen, A. L., et al. Phosphorylation of threonine 3 on histone H3 by haspin kinase is required for meiosis I in mouse oocytes. J Cell Sci. 127 (Pt 23), 5066-5078 (2014).
- Tsafriri, A., Chun, S. Y., Zhang, R., Hsueh, A. J., Conti, M. Oocyte maturation involves compartmentalization and opposing changes of cAMP levels in follicular somatic and germ cells: studies using selective phosphodiesterase inhibitors. Dev Biol. 178 (2), 393-402 (1996).
- Kapoor, T. M., Mayer, T. U., Coughlin, M. L., Mitchison, T. J. Probing spindle assembly mechanisms with monastrol, a small molecule inhibitor of the mitotic kinesin, Eg5. Eg5. J Cell Biol. 150 (5), 975-988 (2000).
- Jones, K. T., Lane, S. I. Molecular causes of aneuploidy in mammalian eggs. Development. 140 (18), 3719-3730 (2013).
- Fellmeth, J. E., et al. Expression and characterization of three Aurora kinase C splice variants found in human oocytes. Mol Hum Reprod. 21 (8), 633-644 (2015).
- Rieder, C. L. The structure of the cold-stable kinetochore fiber in metaphase PtK1 cells. Chromosoma. 84 (1), 145-158 (1981).
- Brunet, S., et al. Kinetochore fibers are not involved in the formation of the first meiotic spindle in mouse oocytes, but control the exit from the first meiotic M phase. J Cell Biol. 146 (1), 1-12 (1999).
- Joung, J., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening. Nat Protoc. 12 (4), 828-863 (2017).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
