Summary
Como as variantes genéticas associadas a doenças humanas começam a tornar-se descoberto, está se tornando cada vez mais importante desenvolver sistemas com os quais rapidamente avaliar o significado biológico dessas variantes identificadas. Este protocolo descreve métodos para avaliar a função do gene humano durante a meiose feminina eu usando oócitos de rato.
Abstract
Aneuploidia embrionária é a genética das principais causas de infertilidade em seres humanos. A maioria destes eventos se originam durante a meiose feminina, e embora positivamente correlacionada com a idade materna, idade sozinha nem sempre é preditiva do risco de gerar um embrião aneuploid. Portanto, variantes do gene podem contabilizar segregação do cromossomo incorreta durante a ovogênese. Dado que o acesso aos oócitos humanos é limitado para fins de pesquisa, uma série de ensaios foram desenvolvidos para estudar a função do gene humano durante a meiose I usando oócitos de rato. Primeiro, o RNA mensageiro (mRNA) do gene e variante do gene de interesse são injetadas em oócitos de rato prendi prófase. Após permitir tempo para expressão, oócitos sincronicamente são liberados na maturação meiose para completar a meiose eu. Marcando o mRNA com uma sequência de um repórter fluorescente, tais como a proteína verde fluorescente (Gfp), a localização da proteína humana pode ser avaliada para além das alterações fenotípicas. Por exemplo, ganho ou perda de função pode ser investigada através do estabelecimento de condições experimentais que desafiam o produto do gene para corrigir erros meióticos. Embora este sistema é vantajoso em investigar a função da proteína humana durante a ovogênese, adequada interpretação dos resultados deve ser realizada, dado que a expressão da proteína não está em níveis endógenos e, se não for controlada por (ou seja batido para fora ou para baixo), homologs murino também estão presentes no sistema.
Introduction
Infertilidade é uma condição que afeta 10-15% da população humana da idade reprodutiva 1, dos quais quase metade procura tratamento médico 2. Embora a etiologia da infertilidade é diversa e em muitos casos multifatoriais, a anomalia genética mais comum em seres humanos é embrionário aneuploidia 3. Aneuploidia é definida como o desvio (ganho ou perda) do número correto de cromossomos em uma célula. O fenômeno de aneuploidia em embriões humanos é comum e aumenta com a idade materna avançada, 4,5. Quatro ensaios controlados randomizados evidenciaram o benefício da seleção de embriões (euploid) apenas cromossomicamente normais para transferência uterina porque esta estratégia resultou na implantação de aumento de taxas, menores taxas de aborto e um menor tempo para alcançar a gravidez 6,7,8,9. Portanto, compreender a etiologia da aneuploidia humana pode ter implicações importantes na reprodução assistida.
Embora o teste genético pré-implantação para aneuploidies é benéfica em tratamentos de infertilidade, continua a faltar uma compreensão completa de como originou aneuploidies. É amplamente aceito que existe uma correlação positiva de aneuploidies meióticas (originou-se durante a produção de gametas) e a idade materna, no entanto, algumas taxas de aneuploidia embrionário presente mulheres que desviam a taxa média para sua idade determinada 4. Estes casos sugerem que idade sozinha nem sempre é preditiva do risco de gerar um embrião aneuploid. Outros fatores podem desempenhar um papel no aumento do risco de aneuploidia embrionária, tais como variantes do gene.
Um aspecto fundamental de investigar o potencial de contribuição de uma variante do gene de aneuploidia durante a meiose oócito é projetar um sistema para avaliar rapidamente a função do gene meiótica. Devido a restrições éticas e acesso limitado, é impraticável para realizar esses experimentos usando ovos humanos. Estas questões podem ser contornadas usando oócitos de rato, e aqui uma série de ensaios para avaliar a função do gene humano durante a meiose são descritos. Por microinjecting a codificação do RNA mensageiro (mRNA) para a variante do gene de interesse, a localização da proteína humana no ovo do mouse pode ser visualizada e usada para determinar se a expressão ectópica da proteína humana tipo selvagem e mutante resulta em qualquer alterações fenotípicas que poderiam levar à aneuploidia. Estes fenótipos incluem um aumento no microtúbulos que anexar para o inadequado à irmã cinetócoro e a incapacidade de apoiar o alinhamento de cromossomos em metáfase da meiose I. importante, este protocolo pode ser usado para investigar tanto ganho e perda de função variantes genéticas através do estabelecimento de condições experimentais específicas para desafiar os principais eventos na meiose oócito tais como eixo de alinhamento edifício e cromossomo 10.
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Protocol
1. molecular clonagem
- Obter a sequência de código completo do gene de interesse e o plasmídeo em vitro transcrição (pIVT) vetor11.
Nota: Clones de cDNA completos estão comercialmente disponíveis a partir de vários fornecedores ou podem ser gerados através da reação em cadeia da polimerase transcrição reversa (RT-PCR). Centro Nacional para recursos on-line Biotechnology Information (NCBI) fornece sequências de transcrição de genes do nucleotídeo e sequência expressa com a tag bancos de dados (EST). Para facilidade de proteína, visualização e análise dos níveis de expressão, fusão de proteína verde fluorescente (Gfp) ou outra marca fluorescente apropriada podem ser desejados na estratégia de clonagem. - Usando uma estratégia de clonagem validada, inserir a sequência de codificação do gene de interesse para a região de clonagem múltipla de pIVT. Uma descrição detalhada da clonagem molecular e as etapas necessárias foram anteriormente descrito 12.
Nota: Se um produto do gene de fusão é para ser gerado, certifique-se de que a clonagem é no quadro de leitura. - Sequenciar a construção usando primeiras demão de globina para garantir a inserção do gene correto, fusão de em-frame adequada, e que foram criadas sem mutações de ponto induzida pela polimerase.
Nota: Se não houver equipamentos de sequenciamento de DNA de Sanger, muitas empresas oferecem baixo custos opções de sequenciamento de DNA. - Mutagenize DNA se gerando polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) ou inserções/exclusões (PUNTUAIS). Mutagênese do DNA é descrito em etapas 1.5-1.7 abaixo. Para construções de tipo selvagem, prossiga com a etapa de linearização 1.7.
- Projetar primers mutagênese e completar a reação de PCR de mutagênese para gerar mutante construção de acordo com o protocolo do fabricante. Mediada por PCR mutagenesis local-dirigido tem sido descrito anteriormente 13. Além disso, muitas empresas oferecem kits de mutagenesis local-dirigido que incluem protocolos.
- Transforme mutagenized DNA bacteriano hospedeiro. Isolar e purificar o plasmídeo.
Nota: Muitas empresas fazem kits que podem ser usados para isolar e purificar o Plasmídeo facilmente. Segui o protocolo de fabricantes em conformidade. Se usando uma estirpe bacteriana gram-negativa, tais como Escherichia coli, é recomendável usar um kit que remove endotoxinas. - Sequenciar o DNA isolado de transformants bacteriana usando sequenciamento de DNA de Sanger padrão para confirmar a introdução do SNP ou INDEL desejado.
- Linearizar produtos finais usando digestão única enzima de restrição do DNA purificado.
Nota: O vetor pIVT contém vários single-enzima cortar sites listados no mapa do plasmídeo na Addgene 14. - Certifique-se de que o produto é linear através de eletroforese em gel de agarose. A metodologia de eletroforese em gel de agarose foi anteriormente definido 14.
Nota: Para todas as etapas restantes, use materiais livre de RNase e pontas de pipeta de barreira (filtro) para garantir uma produção estável, de alta qualidade do RNA. - Purificar o produto digerido usando um protocolo de limpeza de DNA ou kit de validado e eluir em água de RNase/DNase-livre 30 µ l.
Nota: Rotação de sílica-matriz kits baseada na coluna são recomendados para a alta qualidade, purificado de DNA. Segui o protocolo de fabricantes em conformidade. - Em vitro transcrever DNA utilizando polymerase T7, seguindo o protocolo do fabricante.
- Purificar e eluir RNA em 30 µ l de água livre de RNase/DNase usando um kit de purificação baseada na coluna de ácidos nucleicos de rotação sílica-matriz seguindo o protocolo do fabricante.
- Execute a desnaturação electroforese do gel do agarose usando formaldeído para confirmar o tamanho do produto final do RNA. Ver etapas 1.13-1,22 abaixo 14. (Figura 1).
- Preparar o gel por aquecimento de 1 g agarose em 72 mL água até dissolver e, em seguida, fixe a 60 ° C.
- Prepare-se 10 X MOPS executando tampão adicionando MOPS 0,4 M (pH 7,0), acetato de sódio 0,1 M e 0,01 M EDTA.
- Adicione 10 mL de 10 X MOPS executando o buffer e 18 mL de formol 37% (12,3 M) para a solução de agarose refrigerado.
- O gel derramando a solução de agarose em um recipiente de formar gele de casta. Use um pente grande o suficiente para acomodar 10 µ l. Depois de gel tem conjunto e é firme ao toque, retire com cuidado o pente.
- Montar o gel no tanque de electroforese e adicionar suficiente 1 X MOPS executando reserva, garantindo que o gel está completamente coberto.
- Prepare a amostra de RNA adicionando 1 µ g de RNA para 0,5 volumes X de corante de carregamento que contenham formaldeído.
- Brometo de etídio adicione solução de RNA em uma concentração de 10 µ g/mL.
- Desnature a solução de amostra de RNA em 70 ° C por 5 min.
- Usando-se estéril, 10 µ l filtro dicas, carregar 5 µ l de marcador de peso molecular e 5 µ l de RNA amostra em separado poços do gel e electrophorese em 5 V/cm até que a tintura tem migrado pelo menos dois terços do comprimento do gel.
- Visualize o RNA no gel um iluminador de trans de UV. Certifique-se do que RNA é o tamanho correto, comparando com o marcador de peso molecular.
- Para medir a concentração e a pureza do RNA, transferi 1,2 µ l de RNA purified usando estéril 10 µ l filtro dicas em um espectrofotômetro UV.
Observe que o RNA de alta qualidade deve ter relações de absorvância de A260/280 (1.8-2.2) e 260/230 (> 1.7) respectivamente. - Usando o RNA purified restante de 10 µ l filtro dicas, alíquotas estéril 0,5 µ l centrifugar os tubos (3-5 µ l/tubo). Armazenar os tubos a-80 ° C até que esteja pronto para o microinjection.
Nota: Uma concentração final de injeção de 500 ng / µ l é um ponto de partida ideal. Recomenda-se diluir o RNA 1:2 em RNase H20 antes da microinjeção para reduzir a viscosidade do RNA em pipeta de microinjeção de grátis.
2. cinetócoro Microtubule-acessório de ensaio
- Divida oócitos em grupos iguais para o microinjection.
Nota: Coleção de oócito, transferência, microinjeção e maturação meiose tem sido descrito em detalhes em Júpiter anteriormente 15. - Microinjeção de um grupo com mRNA experimental e o outro grupo (s) com o controle WT e PBS ou Gfp mRNA.
Nota: 500 ng / µ l é a concentração de injeção recomendada para começar com 10. Um picoinjector pode ser usado para controlar quantidades de injeção. Recomenda-se um volume de injeção de 5-10 pL 15. - Utilizando uma mão ou boca aparelho pipetagem operado, onde o vidro Pipetar abertura é ligeiramente maior que o diâmetro de um oócito (100-150 µm), oócitos de transferência em uma gota de 100 µ l do meio de cultura livre de milrinona em uma placa de Petri coberto de embrião óleo mineral de qualidade e incube-os oócitos para 7 h a 37 ° C em 5% C02 para permitir a maturação suficiente para metáfase da meiose eu (-se) 15.
- Após a incubação, usando o mesmo aparelho de pipeta como acima, transferência de oócitos em um prato de cultura do centro-bem órgão contendo 700 µ l de meio de coleção mídia essencial mínimo pre-refrigerados (MEM) no centro bem e 500 µ l H20 no anel exterior e Coloque o prato no gelo por 7 min.
Nota: É aconselhável pre-chill mídia MEM e centro bem pratos de cultura órgão a-20 ° C durante pelo menos 20 min antes do tratamento de ovócitos. - Corrigi os oócitos por transferi-los usando o aparato da pipeta em um poço de uma placa de vidro desobstruído local contendo 400 µ l de 2% paraformaldeído em 1X PBS por 20 min em temperatura ambiente.
- Mesmo usando Pipetar aparelhos, transferência de oócitos em outro poço num prato local contendo 400 solução de bloqueio µ l (PBS + 0,3% BSA + 0,01% Tween-20 + 0,02% NaN3) e loja a 4 ° C até que esteja pronto para processar por imunocoloração.
Nota: para armazenar oócitos a 4 ° C, tampa de vidro placa local com parafilm para evitar a evaporação. - Usando o mesmo aparelho de pipeta, oócitos de transferência para um novo poço em um ponto da placa contendo solução de permeabilização 400 µ l (PBS + 0,3% BSA + 0,1% TritonX-100 + 0,02% NaN3) e incubam a temperatura ambiente por 20 min. de oócitos de transferência rapidamente através de três gotas de 400 µ l obstrui a solução para remover os resíduos de detergente.
Nota: Uma placa de vidro desobstruído 9-poço local funciona bem para mover grupos através de vários tratamentos em um único prato (etapas 2.4-2.5). - Execute os demais procedimentos de imunocitoquímica em uma câmara umidificada, protegido da luz em temperatura ambiente. Uso um recipiente de plástico de tamanho médio forrada com toalhas de papel húmido e cubra com papel alumínio.
- Usando o aparelho de pipeta, transferência de oócitos para 30 µ l obstrui a solução sobre a tampa de uma placa de 96 poços e lugar dentro da câmara umidificada por 10 min.
Nota: Gotas são colocadas nos circulares recuos na placa. - Para rotular centrómeros e o eixo, usando o aparato de pipeta, transferência de oócitos para 30 µ l obstrui a solução contendo o antígeno anti-DNA (ACA, crista) (01:30) e antiacetilado tubulina (1: 1000) e incube pelo menos 1 h.
- Enxágue oócitos por transferência através de gotas de três 30 µ l de obstrui a solução durante 10 minutos cada.
- Usando o aparelho de pipeta, transferência de oócitos para um 30 µ l gota de solução de bloqueio contendo anticorpos secundários cortesia para os anticorpos usados acima (anti-humano IgG 1: 200, 1: 200 do anti-rato IgG) e incube por 1h.
- Repita as etapas de lavagem 3, 10-min em 30 µ l obstrui a solução conforme descrito na etapa 2.11.
- Transferência de oócitos, usando o aparelho de pipeta, em 3-5 µ l montagem médio contendo DAPI (5,9 µ g / µ l) sobre uma lâmina de vidro de microscópio.
- Coloque 4 gotas pequenas (tamanho de uma cabeça de alfinete) de vaselina nos cantos da lamínula para evitar o esmagamento de oócitos.
- Coloque delicadamente o lado de vaselina deslizamento da tampa para baixo para o slide.
- Selo da lamela bordas com esmalte transparente e deixe para secar por 5 min.
- Armazenar slides a 4 ° C, protegido da luz, até o processamento através de microscopia confocal.
Nota: Certifique-se o índice de refração do meio de montagem e lamela, correspondências os objectivos do microscópio a ser utilizados. Montagem de recomendados materiais anteriormente tem sido descrito 15. - Imagem de oócitos usando um objectivo de x 40-63 em um microscópio confocal, capturando pequenos passos (≤ 1 µm) no plano z, otimizado para o objetivo do trabalho e a imagem toda a região do fuso da metafase.
Nota: Certifique-se de todos os 3 canais com base em anticorpos secundários específicos utilizados na etapa 2.11 de imagem. Imagem média ≥ 4 e um zoom de 3 é ideal para a resolução adequada. Um tamanho de passo 1 µm fornece visualização clara dos microtúbulos e cinetócoros em oócitos de rato. O procedimento para a captura de imagem irá variar de microscópio para microscópio. Por favor, consulte o guia de usuário confocal de fabricantes para etapas específicas sobre como definir configurações de microscópio. - Identifica o status de acessório de cinetócoro-microtubule usando software de imagem seguindo passos 2.21-2,23 abaixo.
Nota: As seguintes etapas descrevem esse procedimento usando o software para download gratuito de imagem J (NIH), no entanto, o software alternativo de imagens pode ser usado. Status de acessório tipos anteriormente foram definidas 16 . - Abrir imagem arrastando o arquivo para a barra de ferramentas imagem J.
- O z-série aberto, certifique-se de todos os canais visíveis (DNA, cinetócoro e eixo), clicando em "mesclar canais", disponível no menu drop-down "imagem", "cor" na guia sub.
- Utilizando o toggle na parte inferior da imagem, percorrer cada fatia-z e determinar a penhora de microtubule cinetócoro. Acessório de detalhadas descrições foram previamente descrito 16
3. ensaio de desafio de alinhamento de cromossomo
- Usando o aparelho de pipeta, conforme descrito na etapa 2.3, transferência de oócitos em uma gota de 100 µ l do meio de cultura livre de milrinona sob óleo e incubar oócitos para 7 h permitir a maturação suficiente para metáfase da meiose eu (-se) como descrito anteriormente na etapa 2.3 17 .
Nota: Procedimentos de coleção, microinjeção e maturação do oócito foram descritos anteriormente, 15. Consulte o protocolo de ensaio do apego em passos 2.1-2.2 para controles e para as concentrações de microinjeção de RNA. - Usando o mesmo aparelho de pipeta, transferência de oócitos para uma cultura de centro-bem órgão prato contendo meio de cultura de 700 µ l contendo monastrol [100 µM] no centro bem e 400 µ l H20 no anel circundante e incubam a 37 ° C por 2 h.
- Lavar monastrol pela transferência de oócitos, usando o aparato de pipeta como acima, através de três gotas de meio de cultura CZB de 100 µ l e depois transferir os oócitos para um prato de cultura centro-bem órgão novo contendo 700 µ l meio de cultura + MG132 [5 µM] para 3h no centro anel. Adicione 400 µ l H20 para o anel exterior.
- Corrigi os oócitos transferindo-os, usando o aparelho de pipeta, num poço de uma placa de ponto de vidro transparente contendo 400 paraformaldeído µ l 2% em PBS por 20 min em temperatura ambiente.
- Após a fixação, transferência de oócitos, usando o aparelho de pipeta, em um novo poço de uma placa de ponto de vidro transparente contendo 400 µ l solução de bloqueio e loja a 4 ° C até processados por imunocoloração.
Nota: para armazenar oócitos a 4 ° C, tampa de vidro placa local com parafilm para evitar a evaporação. - Permeabilize e rotular oócitos através de imunocitoquímica, conforme descrito nas etapas 2.6-2.16.
- Oócitos usando um objectivo de x 40-63 em um microscópio confocal, captura de imagem < 1 µm passos no plano z certificando-se de toda a região do fuso da metafase da imagem.
- Para identificar o alinhamento do cromossomo status de abrir arquivos de imagem usando o software de imagem.
Nota: As seguintes etapas descrevem esse procedimento usando o software para download gratuito de imagem J (NIH), no entanto, o software alternativo de imagens pode ser usado. - Arraste a imagem no painel de controle de imagem J.
- O z-série aberto, use a ferramenta de ponto (disponível clicando no ícone de ferramenta do ponto na barra de controle de imagem J) para marcar pontos no final de cada polo do fuso em seu respectivo z-fatia colocando a ferramenta sobre o polo do eixo da imagem e clicando na imagem. Adicione estes pontos para a região de Gerenciador de interesse (ROI) pressionando Command + t no teclado.
- Determine as coordenadas específicas para cada uma das posições definidas na etapa 3.10 destacando o ponto específico no Gerenciador de ROI e clicando no botão de medida. Isto proporcionará um resultados contendo a tabela x e y coordenadas para cada ponto. Estes serão os pontos X1, Y1 e X1, Y2, respectivamente.
- Em seguida, determine a coordenada Z de verdade. Isto é feito multiplicando o número de fatia da z-fatia específica na z-pilha na qual foi identificado o polo do eixo (ou seja, fatia #2 de 6) cada ponto individual está em, a espessura da pilha (ou seja, 1 µm) (exemplo: cortar 2 x 1 µm = 2). Estes serão os pontos Z1 e Z2, respectivamente.
- Determinar o comprimento do fuso, usando a equação do teorema de Pitágoras (a2 + b2 = c2) usando o definidos anteriormente x, y e z as coordenadas da escadaria 3.11-3.13. Para cada eixo, o comprimento final é igual a:
√((x1-x2)2+(Y1-Y2)2+(Z1-Z2)2) - Determine a midzone do eixo. Isto é calculado como a metade do comprimento do fuso. Usando a ferramenta de linha de imagem J, clicando no ícone de linha na barra de ferramentas imagem J, desenhe uma linha que vai de um polo do eixo do midzone do eixo. O comprimento será exibido na barra de ferramentas imagem J.
- Determine o status de alinhamento do cromossomo, avaliando a distância de cromossomo do midzone eixo usando a ferramenta de medição da linha. Usando a ferramenta de linha disponível clicando no ícone de linha na barra de ferramentas imagem J, desenhe uma linha de midzone do eixo para o cromossomo. O comprimento será exibido na barra de ferramentas imagem J. Maiores que 4 µm de midzone do eixo de cromossomos são considerados desalinhada 18.
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Representative Results
Após in vitro transcrição RNA de alta qualidade terão uma relação A260/A280 (1.8-2.2) e um ≥1.7 de relação A260/A230 quando medido utilizando um espectrofotômetro. A imagem na Figura 1 mostra a migração do in vitro-produzido RNA em um gel de agarose a desnaturação, após eletroforese. Uma banda que é manchada no padrão ou uma amostra que tem várias faixas de tamanhos pode indicar a contaminação ou degradação da amostra. Em alternativa, várias bandas podem indicar que o mRNA não é totalmente desnaturado, ou o plasmídeo inicial não foi completamente linearizado. O mRNA será executado maior do que o previsto por causa da cauda de poli-adenylated incorporada pIVT, que permite a expressão estável de mRNA em vitro. Depois da microinjeção é aconselhável assegurar volumes de injeção uniforme e os níveis de expressão através de microscopia fluorescente. A imagem na Figura 2 mostra a prófase-prendi oócitos injetados uniformemente com Gfp. Técnica de microinjeção consistente é fundamental para este protocolo. Software de análise de imagem, como o Image J, pode ser usado para validar os níveis de expressão para garantir uniformidade e domínio da técnica. Note que podem ser obtidas informações de Localização subcellular enquanto fazia a imagem para ambos os ensaios. Para todos os experimentos de microinjeção avaliar os efeitos de uma variante do gene, o gene selvagem-tipo deve ser injetado em um subconjunto de oócitos para servir como um controle. Isto permite que um controle para potenciais fenótipos superexpressão do gene humano em um oócito de rato. PBS, ou Gfp para construções de fluoróforo-etiquetadas, devem também ser injetado em um subgrupo de oócitos para controle de fenótipos induzida por microinjeção. Para construções sem uma etiqueta fluorescente, Gfp mRNA pode ser injetado co para garantir suficiente microinjeção. Se co injetando construções de dois ou mais simultaneamente certifique-se de aumentar a concentração de mRNA tal que a solução final contém 500 ng / µ l de cada mRNA.
O ensaio de frio-stable microtubule fornece uma ferramenta valiosa para avaliar o status de acessório de cinetócoros de microtúbulos. A Figura 3 é uma z-projeção de uma imagem de microscópio confocal de uma metáfase eu oócito. Este oócito foi submetido a tratamento criogênicos para depolymerize todos os microtúbulos que não tinham anexado a cinetócoros. Oócitos que foram tratados por um tempo insuficiente irá conter fibras de microtúbulos não ligadas a cromossomos (muito curto resulta em muitas fibras) ou falta de fibras todos juntos (resultados há muito tempo em nenhuma estrutura do eixo) e é recomendado que estes oócitos não ser utilizado na análise. Na metáfase da meiose é comum para oócitos conter lateralmente anexados ou desanexados cinetócoros, portanto é recomendável que um grupo de controle ser usado em qualquer estudo de penhora. Em média, selvagem-tipo oócitos conterão 5-10% dos cinetócoros na vontade de MI não ainda ser estàvel anexo 19. É essencial que todos os oócitos no mesmo estágio para análise do status de acessório de microtubule-cinetócoro. Para garantir que experimental e controlar grupos maduros com escalas de tempo semelhante é recomendável para avaliar a cinética do ciclo celular. Para executar este ensaio, um subconjunto de oócitos experimentais e de controle deve ser amadurecido e visualizado ao vivo sob microcopy lapso de tempo. O uso de milrinona permite oócitos a serem sincronizados na prófase da meiose I, tal que o lançamento em mídia falta milrinona com permitir a retomada da meiose nas mesma hora 20. Oócitos de controle e grupos experimentais devem expulsar um corpo polar, indicativo de chegar a metáfase da meiose II (conheci II), nos pontos de tempo semelhante. Se viver-pilha microscopia não estiver disponível, oócitos podem ser amadurecidos para Met eu (7h) e conheceu II (16 h), fixo e manchadas para detectar ADN e microtúbulos, conforme descrito anteriormente. Met I e II encontrou um eixo em forma de barril, bipolar deve ser visível. Em oócitos de controle, cromossomos devem ser alinhados na placa metafásica. O alinhamento dos cromossomos serão diferentes em grupos experimentais dependendo da variante afeta, no entanto, cromossomos devem ser condensados e anexados ao microtúbulos com a maioria dos cromossomos centralmente localizado no eixo. Um número semelhante de oócitos devíamos ter chegado a meiose II no controle e grupos experimentais. Para reduzir as dificuldades na determinação de penhora estatuto é recomendável imagem oócitos usando pequenos passos no plano z, otimizado para o objetivo específico de trabalho. Análise envolverá a visualização da z-fatias individualmente e em configurações mescladas para determinar qual polo que anexado microtúbulos emanam. Figura 3B ilustra exemplos de anexos cinetócoro-microtubule anormal. Um forma bivalente no qual apenas uma irmã par cinetócoro é anexado a um microtúbulo do eixo, definido como um anexo não é mostrado. Em seguida, um acessório de syntelic é mostrado no qual ambos irmã pares cinetócoro são anexados ao mesmo Polo do fuso. Finalmente, um acessório de merotelic é mostrado em qual uma irmã cinetócoro é ligado a ambos os polos do fuso, enquanto a outra irmã cinetócoro do par é anexado a um poste de eixo único.
As imagens na Figura 4 ilustram o DNA esperado progressiva e configurações do eixo como um move através dos passos do ensaio de desafio de alinhamento do cromossomo. Neste ensaio é fundamental que os diferentes grupos experimentais progridem através de meiose com cinética semelhante. Como descrito anteriormente é recomendo para completar as análises de cinética do ciclo celular antes da realização do ensaio de desafio. Neste ensaio, é avaliada a capacidade de oócitos corrigir com sucesso anexos cinetócoro-microtubule anormal. Para testar isso, oócitos são primeiro amadurecidos Met eu permitir anexos cinetócoro-microtubule seja estabelecida. Em seguida, oócitos são incubados em monastrol e inibidor da cinesina 5 (EG5), que recolhe o eixo bipolar em um eixo monopolar 21. A geração de um fuso de monopolar induz anexos do microtubule-cinetócoro incorreta de 100%. O inibidor de monastrol é então lavado para permitir a recuperação. Durante o período de recuperação os oócitos regeneram um eixo bipolar e tentam corrigir anexos de microtúbulos. Adição do inibidor de proteossomo MG132 impede o início da anáfase. Como um controle, um pequeno subconjunto de ovócitos de cada grupo experimental pode ser fixo em cada estágio do protocolo (eu, monastrol Tratado, pós recuperação) para garantir que todos os grupos estão respondendo aos tratamentos e na mesma medida. Metáfase eu oócitos devem conter um eixo bipolar em forma de barril com cromossomos alinhados na placa metafásica. Oócitos tratados com monastrol devem conter um eixo monopolar com cromossomos orientados em torno de Polo único. Oócitos recuperados mais uma vez devem conter um eixo bipolar em forma de barril. Alinhamento de cromossomo é definido como qualquer cromossomos mais de 4 μM do eixo midzone 22. É útil manchar oócitos para detectar ADN e cinetócoros para estabelecer se os dois cinetócoros são fora desta zona central como isto pode ser difícil de determinar usando apenas DNA detection.
Figura 1. Eletroforese em gel de RNA Denaturingagarose. Tamanho e qualidade do RNA podem ser avaliadas por eletroforese em um gel de agarose a desnaturação. Um gel de desnaturalização é recomendado para evitar a formação de estrutura secundária. Pista 1 contém um marcador de peso molecular de RNA. 2 Lane é uma amostra de RNA. Note-se que o RNA ficará maior do que o calculado por causa da cauda polyA built-in. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Validando a microinjeção de oócito. Microscopia fluorescente pode ser usada para validar a expressão e bem sucedida oócito microinjection. Oócitos prendi de prófase injetados com Gfp são mostrados depois de expressão durante a noite da construção. Esta imagem foi obtida usando o Auto de FL de EVOS Invitrogen sistema equipado com luz cubo GFP de imagem. Barra de escala é 100 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Avaliar os anexos cinetócoro-microtubule. (A), A representante z-projeção de um Tratado de frio eu conheci oócito. Eixo (verde), cinetócoros (vermelhos) e DNA (azul) são mostrados. A caixa indica a região do zoom óptico. Setas indicam fim-em anexos de cinetócoros de microtúbulos de um único forma bivalente. Barra de escala é de 10 µm para fuso, cinetócoro, DNA e mesclagem de canais. Barra de escala de zoom óptico é de 5 µm. (B) exemplos de tipos de anexos cinetócoro-microtubule anormal em oócitos de rato. As setas indicam sites de acessório do microtubule-cinetócoro. Barra de escala é 5 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Ensaio de desafio de alinhamento de cromossomo. Fluxograma do procedimento com z-projeções representativas de oócitos em cada etapa. Oócitos são primeiro amadureceu a metáfase da meiose eu (-se), em seguida transferido para um novo prato que contém monastrol por 2 h induzir a formação do fuso monopolar. Próximo oócitos poderão recuperar em meio de maturação suplementado com um inibidor de proteossomo (MG132) para evitar o aparecimento de anáfase para 3h. Oócitos recuperados uma vez fixas, rotulados por eixo (verde), cinetócoros (vermelhos) e DNA (azul) e cuja imagem através de microscopia confocal para determinar o status de alinhamento. As linhas indicam o comprimento do eixo (40 µm) e do eixo midzone (20 µm), determinado através da equação do teorema de Pitágoras. As setas indicam as posições de ferramenta de ponto em cada polo. Qualquer cinetócoros > 4 µm de midzone do eixo são considerados desalinhada. Asterisco indica cromossomo desalinhado (5,6 µm de midzone). Barra de escala é 10 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Devido a rápida e crescente identificação do humanas variantes genéticas associadas com a doença, é essencial que os sistemas são estabelecidos para avaliar seu significado biológico. Compreensão da função das proteínas na meiose humana coloca desafios específicos porque oócitos humanos são preciosos e raras e humana de esperma não é passíveis de manipulação genética. Oócitos mouse são um sistema de modelo mamíferos valioso para avaliar o gene humano meiótica função 10,23. Este modelo ignora os problemas de usar ovos humanos, proporcionando uma fonte prontamente disponível de oócitos manipuláveis, de baixo custo que passam por meiose semelhante de células germinativas humanas, enquanto sendo úteis para compreender como genéticas variantes pode impactar a fêmea fertilidade.
Porque estes métodos empregam a expressão ectópica da proteína humana em oócitos de rato através de microinjeção, é fundamental estabelecer primeiro uma concentração de controle, selvagem-tipo RNA que não altera maturação meiótica. É recomendável que a cinética de maturação meiose são monitorados (repartição do envelope nuclear, extrusão de corpo polar) em oócitos de controle para estabelecer parâmetros de linha de base e avaliar morfologia do eixo e cromossomo. Além disso, assegurar volumes microinjeção uniforme é fundamental para comparar grupos. Incluindo uma etiqueta fluorescente sobre o gene de interesse pode simplificar este desafio técnico. Técnicas para dominar a microinjeção de oócito têm sido demonstrado anteriormente 15. Visualização de ovócitos injetados sob um microscópio de fluorescência ou determinar a expressão da proteína através do borrão ocidental também são ferramentas valiosas para confirmar as concentrações de injeção consistente.
Porque erros na segregação de cromossomos em oócitos mamíferos são a principal causa da aneuploidia embrionária e de perda de gravidez5, análise de anexos cinetócoro-microtubule fornecem uma ferramenta valiosa para avaliar se um gene de interesse afeta segregação de cromossomos (ou seja, impróprio anexos causará segregação mis). Uma exposição de 10 min a mídia refrigeradas é suficiente para depolymerize microtúbulos que não fizeram um anexo do microtubule-cinetócoro, permitindo a visualização de anexos estáveis através de de microscopia confocal 24. Para este teste, é importante não excesso chill oócitos como isto levará para a despolimerização dos microtúbulos estáveis. Além disso, a otimização de procedimentos de coloração é chave para visualização das estruturas cinetócoro e o microtúbulo. Para garantir a resolução de imagem adequado para análise, pequenos passos (≤ 1 μm) no z-plano usando um x 40 x-63 objectivo deve ser capturado, e obtenção de imagens através da estrutura inteira do eixo para garantir a todos os anexos são visíveis. Observe que é comum ter desanexados cinetócoros durante a prometafase da meiose 25.
O ensaio de desafio de alinhamento de cromossomo é útil para a avaliação das variantes de ganho ou perda de função. Ganho-de-função variantes podem ser difícil avaliar porque oocytes do rato das fêmeas jovens têm baixos níveis de aneuploidia. Este ensaio supera este obstáculo, gerando uma situação na qual o oócito deve corrigir anexos experimentalmente induzida cinetócoro-microtubule incorreta. Estabelecer um ponto de tempo no qual controle oócitos contêm 1-2 cromossomos desalinhados após recuperação fornece um cenário quantificável para determinar se um mutante fornece eficiência maior alinhamento (ou seja, melhor alinhamento de recursos será protege euploidy). Para a quantificação de desalinhamento de cromossomos, um protocolo previamente estabelecido em quais cromossomos maiores que 4 μm do eixo midzone caracterizam-se como desalinhado pode ser usado 18.
Para estudar variantes de perda-de-função, condições experimentais adicionais são necessárias por causa do homólogo endógeno dentro do sistema de estudo. Uma maneira de aliviar esse problema é usar ou gerar um modelo de mouse nocaute da variante de interesse. O advento do sistema crispar/Cas9 poderia fornecer uma maneira rápida de gerar tais nocautes 26. Como alternativa, se um modelo de nocaute não é uma opção, técnicas clássicas de knockdown como co injetando oligonucleotides antisentido Morpholinos ou pequenos RNAs interferentes podem ser empregadas. No entanto, atenção para o projeto da sequência é necessária para evitar qualquer potencial interferência com a variante microinjected sob estudo. Por exemplo, o oligonucleotide Morpholinos poderia ser projetado para ligar a região 5' untranslated (5' UTR) do gene do rato que não está incluído na variante de mRNA humano introduzido através de microinjeção. Se usando interferindo pequenos RNAs um poderiam uma região não-homóloga sequência-alvo ou introduzir silenciosas mutações pontuais no gene humano que iria fugir de direcionamento. No entanto, ter a cópia da proteína endógena ainda presente na expressão da variante pode ser informativo como muitas variantes são encontradas no estado heterozigoto no genoma humano.
Finalmente, embora não descrito neste protocolo, avaliação de aneuploidia do cromossomo pode ser facilmente avaliada em ovos II conheceu como o ensaio final na calha para análise variante humana. Uma descrição detalhada este em situ cromossomo espalhar protocolo tem descrito anteriormente a 15. Brevemente, oócitos microinjected estão amadurecido em vitro até atingirem a fase II conheceu, após o tratamento com um agente do eixo-depolymerizing meiótica antes da fixação. Cinetócoro e cromossomo coloração conforme descrito aqui permitem avaliação do conteúdo do cromossomo.
Enquanto oocytes do rato fornecem uma ferramenta valiosa para o estudo de proteínas críticas para meiose feminina algumas limitações para o existe modelo. Superexpressão de proteínas pode perturbar meiótica maturação e, portanto, uma concentração de RNA pode não existir que não induz um fenótipo. Além disso, o homólogo do rato endógena pode interferir com a localização da proteína humana exógena. Geração de modelos de rato nocaute fornece uma solução para este problema; no entanto, isto pode não ser viável em todas as situações. Uma abordagem alternativa seria para esgotar a proteína do rato injectando co RNAi ou Morpholinos oligonucleotides projetaram para alvo não o RNA exógeno e proteína. Finalmente, é importante notar que, enquanto muitas proteínas são homólogas entre humano e do rato, podem existir diferenças, levando a diferenças na localização e função que poderia impedir esse tipo de análise entre espécies. Como ferramentas de manipulação genética como Cas9-genoma edição27 tornam-se mais barato e mais lugar-comum, este protocolo pode evoluir para bater-nos, humanizado do mouse linhas em vez de depender de microinjeção.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por uma bolsa de pesquisa da sociedade americana de medicina reprodutiva e do Charles e Johanna Busch Memorial Fund na Rutgers, Universidade do estado de NJ para Konzen A.L.N. foi apoiada por uma concessão do N.I.H (F31 HD0989597).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 mL Seal-Rite PCR tube | USA Scientific | 1602-4300 | |
| 1 kb DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0313 | |
| 100 bp DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0243 | |
| 6X DNA loading Dye | Thermo Scientific | R0611 | |
| 9-well glass spot plate | Thomas Scientific | 7812G17 | |
| Agarose | Sigma Aldrich | A9539 | |
| Albumin from bovine serum | Sigma-Aldrich | A3294 | |
| Alexa-fluor-568 conjugated anti-mouse IgG | Thermo Scientific | A21050 | 1:200 dilution |
| Alexa-fluor-633 conjugated anti-human IgG | Thermo Scientific | A21091 | 1:200 dilution |
| Ampicillin | VWR | AA0356 | |
| Anti-vibration table | Technical Manufacturing Corp | any standard model | |
| Anti-Acetylated Tubulin antibody | Sigma Aldrich | T7451 | 1:100 diution |
| Anti-centromeric (CREST) antibody | Antibodies Incorportated | 15-234 | 1:30 dilution |
| Barrier (Filter) Pipette tips | Thermo Scientific | AM12635 | Make sure compatable with your brand of pipettors. These are compatible with Eppendorf brand pipettors. |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Agar, Miller (Luria Bertani) | Fisher Scientific | DF0445-07-6 | |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria Bertani) | Fisher Scientific | DF0446-07-5 | |
| Capillary tubing | Sutter | B100-75-10 | |
| Center Well organ culture dish | VWR | 25381-141 | |
| CO2 tank | For incubator | ||
| Confocal microscope | Zeiss | any standard model | |
| Centrifuge (With cooling ability) | Thomas Scientific | any standard model | |
| Cover Glass 11 x 22 mm | Thomas Scientific | 6663F10 | |
| Coverslips | Thomas Scientific | 6663-F10 | thickness will vary for particular microscopes |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | |
| DEPC H20 | Life Technologies | AM9922 | |
| Digital Dry Bath | Thermo Scientific | 888700001 | |
| Easy A high fidelity cloning enzyme | Agilent | 600400 | For DNA cloning |
| Enzymes for linearizing pIVT | New England Biolabs | NdeI or KasI can be used | |
| Ethidium Bromide | Thermo Scientific | 155585011 | |
| Fluorescent Microscope | Any Fluorescent microscope may be used | ||
| Formaldehyde (37%) | Thermo Fisher Scientifc | 9311 | |
| Formaldehyde RNA loading dye | Ambion | 8552 | |
| Frosted Microscope Slides (Uncharged) 25X75 mm | Fisher Scientific | 12-544-3 | |
| Full Length cDNA Clones | Can be obtained from any vendor that supplies open reading frame clones | ||
| Gel electrophoresis apparatus | Bio-Rad | any standard model | |
| Glass Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-200 | |
| Globin Forward Primer for pIVT Construct | 5'- GAA GCT CAG AAT AAA CGC -3'. Can be purchased from any company that generates custom oligonucelotides | ||
| Globin Reverse Primer for pIVT Construct | 5'- ATT CGG GTG TTC TTG AGG CTG G -3' Can be purchased from any company that generates custom oligonucelotides | ||
| Holding pipettes | Eppendorf | 930001015 | Vacutip |
| Humidified Chamber | Tupperware can be used | ||
| Illustra Ready-To-Go RT-PCR beads | GE Life Sciences | 27925901 | |
| Incubator | any standard model with CO2 and water jacketed technology | ||
| Inverted Microscope | Nikon instruments | Any Standard model | |
| Image J (NIH) Software | NIH | Image Analysis software | |
| Lid of 96 well plate | Nalgene Nunc International | 263339 | |
| Low Adhesion 0.5 mL microcentrifgue tube | USA Scientific | 1405-2600 | |
| MacVector | MacVector | Sequence analysis software | |
| MG132 | Selleckchem | S2619 | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-3 | |
| Millenium RNA Markers-Formaldehyde | Ambion | AM7151 | |
| Milrinone | Sigma-Aldrich | M4659 | Resuspend in DMSO at 2.5mM |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M5310 | Only used embryo-tested, sterile-filtered |
| Monastrol | Sigma-Aldrich | M8515 | Resuspend in DMSO at 100 mM |
| Mouthpiece | Biodiseno | MP-001-Y | |
| N2 tank | for antivibration table | ||
| Nail Polish; Clear | Any clear nailpolish can be used | ||
| NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | any standard model | |
| NorthernMax 10X Denaturing Gel Buffer | Life Technologies | AM8676 | |
| NorthernMax 10X Running buffer | Life Technologies | AM8671 | |
| NuPAGE MOPS SDS Running buffer | Thermo Scnentific | NP0001 | |
| Organ Culture Dish 60x15mm | Life Technologies | 08-772-12 | |
| Paraformaldehyde | Polysciences, Inc. | 577773 | |
| PCR Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | 4484075 | |
| Petri Dish 139 mm | Thermo Fisher Scientifc | 501V | |
| Petri dish 35 mm | Thermo Fisher Scientifc | 121V | |
| Petri Dish 60 mm | Falcon BD | 351007 | |
| Picoinjector | XenoWorks Digital Microinjector | any standard model | |
| Pipette puller | Flaming-Brown Micropipette puller | Model P-1000 | |
| pIVT plasmid | AddGene | 32374 | Empty vector suitable for oocyte expression. |
| Pregnant Mare Serum Gonadotropin | Lee BioSolutions | 493-10 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | purification of up to 20 uL of plasmid DNA |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| Quikchange II site directed mutagenesis kit | Agilent | 200523 | mutagenesis kit for insertions and deletions |
| Quikchange lightning multi-site directed mutagenesis kit | Agilent | 210512 | mutagenesis kit for single site changes |
| Scissors (Fine point) | Fine science tools | 14393 | |
| Scissors (Medium point) | Fine science tools | WP114225 | |
| Seal-Rite 1.5 mL microcentrifuge tube | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Slide Warmer | any standard model | ||
| Spectrophotometer (Nanodrop) | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | |
| Stereomicroscope | any standard model | ||
| Subcloning Efficiency DH5a Competent Cells | Thermo Fisher Scientifc | 18265017 | |
| Syringe | BD Bioscienes | 309623 | 1 ml, 27G(1/2) |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202L | |
| T7 mMessage Machine high-yield capped RNA transcription kit | Life Technologies | AM1340 | |
| TritonX-100 | Sigma-Aldrich | x-100 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | 274348 | |
| Tweezer (Fine point- Size 5) | Fine science tools | SN.743.12.1 | |
| UltraPure Dnase/Rnase-Free Distilled Water | Thermo Fisher Scientifc | 10977015 | |
| UltraPure Ethidium Bromide 10mg/mL | Thermo Fisher Scientifc | 15585011 | |
| UVP UV/White lite transilluminator | Fisher Scientific | UV95041501 | |
| Vectashield Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 |
References
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