Summary
Как генетические варианты, связанные с болезнью человека начинают стать обнаружили, она становится все более важным разработать системы, позволяющие быстро оценить биологическое значение этих выявленных вариантов. Этот протокол описывает методы для оценки функции человеческого гена во время женского мейоз, я с помощью мыши ооцитов.
Abstract
Эмбриональных анеуплоидия является основной причиной генетических бесплодия в организме человека. Большинство из этих событий происходят во время женского мейоз, и хотя положительно коррелирует с возрастом матери, возраст только не всегда прогнозировать риск возникновения анеуплоидных эмбриона. Таким образом варианты гена может приходится неправильные хромосома сегрегации при женских. Учитывая, что ограничен доступ к человеческой яйцеклетки для исследовательских целей, серия анализов были разработаны для изучения функции человеческого гена во время мейоза, я с помощью мыши ооцитов. Во-первых матричная РНК (мРНК) гена и вариант гена интереса являются microinjected в профазе I арестован мыши ооцитов. После предоставления времени для выражения, ооциты синхронно выпускаются в meiotic созревания для завершения мейоза я. Путем пометки мРНК с последовательностью флуоресцентные репортер, такие как Зеленый флуоресцентный белок (КГВ), локализация человеческий белок может быть оценена в дополнение к фенотипические изменения. Например, прибыль или потеря функции могут расследоваться путем создания экспериментальных условиях, которые бросают вызов продукт гена исправить meiotic ошибки. Хотя эта система является выгодным в расследовании человеческий белок функции во время женских, адекватной интерпретации результатов следует провести учитывая, что выражение протеина не на местных уровнях и, если не контролируется для (т.е. постучал out или вниз) мышиных гомолог также присутствуют в системе.
Introduction
Бесплодие является состоянием, которое влияет на 10-15% населения репродуктивного возраста 1, из которых почти половина искать лечение 2. Хотя этиология бесплодия разнообразны и во многих случаях многофакторного, наиболее распространенных генетических аномалий в организме человека является эмбриональных анеуплоидия 3. Анеуплоидия определяется как отклонение (прибыль или убыток) правильное количество хромосом в клетке. Феномен анеуплоидия в человеческих эмбрионов является общим и увеличивается с возрастом матери 4,5. Четыре рандомизированных контролируемых клинических испытания показали, на благо выбор только хромосомно нормальных (euploid) эмбрионов для передачи матки, потому что эта стратегия привела к увеличению имплантации ставки, низкими выкидыш и более короткое время для для достижения беременности- 6,-7,-8,-9. Таким образом понимание этиологии человека анеуплоидия может иметь важные последствия в репродукции.
Хотя предимплантационной генетическое тестирование для aneuploidies является полезным в лечении бесплодия, глубокое понимание как aneuploidies происходят по-прежнему отсутствует. Широко признается, что существует позитивная корреляция meiotic aneuploidies (родилась в ходе гамет производства) и возраст матери, однако, некоторые женщины настоящее эмбриональных анеуплоидия ставок, которые отклоняются от средней ставки для их возраста 4. Эти случаи показывают, что возраст только не всегда прогнозировать риск возникновения анеуплоидных эмбриона. Другие факторы могут играть свою роль в повышении риска эмбриональных анеуплоидии, например варианты гена.
Ключевым аспектом расследования потенциального вклада вариант гена к анеуплоидии во время мейоза ооцитов состоит в разработке системы быстро оценить ген петельной функция. Этические ограничения и ограниченный доступ нецелесообразно выполнять эти эксперименты с использованием человеческих яйцеклеток. Эти проблемы можно обойти с помощью мыши ооцитов, и здесь ряд анализов для оценки функции человеческого гена во время мейоза я описаны. По microinjecting, матричная РНК (мРНК) кодирования для вариант гена интереса, локализация человеческий белок в мыши яйцо можно визуализировать и используется для определения, если внематочная выражение дикого типа и мутировавших человеческого белка приводит к любой Фенотипические изменения, которые могут привести к анеуплоидии. Эти фенотипы включают увеличение микротрубочек, которые крепятся к неправильным сестре Кинетохор и невозможность поддержки выравнивание хромосомы в метафаза мейоз I. Главное, этот протокол может использоваться для изучения выгоды и потери функции генетических вариантов путем установления конкретных экспериментальных условий такие как оспорить ключевые события в яйцеклетку мейоз шпинделя здания и хромосомы выравнивание 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. молекулярное клонирование
- Получить полноценный кодирующая последовательность гена интереса и вектор плазмиды в vitro транскрипция (pIVT)11.
Примечание: Полнометражные cDNA клоны являются коммерчески доступными от различных поставщиков или могут быть получены через обратная транскрипция полимеразной цепной реакции (ПЦР). Национальный центр биотехнологии информации (NCBI) онлайн-ресурс предоставляет Стенограмма последовательностей генов из нуклеотидов и выразил последовательности отмеченных (EST) баз данных. Для удобства белка визуализации и анализа уровни выражения, fusion для зеленого флуоресцентного белка (ГФП) или другой подходящей флуоресцентные тег может быть пожеланным клонирования стратегии. - Используя проверенные стратегии клонирования, вставьте кодирующая последовательность гена интереса в регионе несколько клонирования pIVT. Подробное описание молекулярного клонирования и необходимые шаги были ранее описанных 12.
Примечание: Если продукт гена Фьюжн должна создаваться, быть уверены, что клонирование в рамках надлежащего чтения. - Последовательность конструкцию Глобин Праймеры для обеспечения правильного гена вставки, надлежащего фьюжн в кадр, и что не полимеразы индуцированной точечные мутации были созданы.
Примечание: Если не предоставляется оборудование секвенирования ДНК Сэнгер, многие компании предлагают недорогих вариантов секвенирования ДНК. - Mutagenize ДНК, если создание единичных нуклеотидных полиморфизмов (ОНП) или вставки/удаления (INDELS). Мутагенез ДНК описано в шагах 1.5-1.7 ниже. Для одичал тип конструкций перейдите к шагу Линеаризация 1.7.
- Дизайн праймеров мутагенеза и завершить реакции PCR мутагенеза для создания мутантных конструкции за производителя протокол. ПЦР опосредованной сайт Направленный мутагенез был ранее описанных 13. Кроме того многие компании предлагают сайт Направленный мутагенез комплекты, которые включают протоколы.
- Преобразование mutagenized ДНК в бактериальных хоста. Изолировать и очищения плазмиды.
Примечание: Многие компании делают наборы, которые можно использовать для легко изолировать и очистить плазмида ДНК. Следуйте производителей протокол соответственно. При использовании штамм грамотрицательных бактерий например E. coli, рекомендуется использовать комплект, который удаляет эндотоксинов. - Последовательность изолированной ДНК бактериальных трансформантов, используя стандартные секвенирования ДНК Сэнгер для подтверждения введения желаемого SNP или INDEL.
- Линеаризации конечных продуктов с использованием единого энзима ограничения пищеварение очищенная ДНК.
Примечание: PIVT вектор содержит несколько одно фермента, вырезать сайты, перечисленные в карте плазмида Addgene 14. - Убедитесь, что продукт является линейной через электрофорез геля агарозы. Методология для электрофореза геля агарозы ранее были определены 14.
Примечание: Для всех оставшихся шагов, используйте советы накапайте барьер (фильтр) и РНКазы бесплатные материалы для обеспечения производства стабильное, высокое качество РНК. - Очищают переваривается продукта с использованием проверенных ДНК очистки протокол или комплект, а элюировать в 30 мкл РНКазы/DNase свободной воды.
Примечание: Кремний матрица спина, на основе столбцов наборы рекомендуются для высокого качества, очищенная ДНК. Следуйте производителей протокол соответственно. - В пробирке транскрибировать ДНК полимеразы T7 после производителя протокол.
- Очищают и элюировать РНК в 30 мкл РНКазы/DNase свободной воды с использованием кремния матрица спина на основе столбцов нуклеиновой кислоты очистки комплекта после производителя протокол.
- Выполните с помощью формальдегида для подтверждения окончательный размер продукта РНК денатурируя геля агарозы. 1.13-1.22 ниже 14см. (Рис. 1).
- Подготовить гель нагреванием агарозы 1 g 72 мл воды пока растворится, а затем охладить до 60 ° C.
- Подготовка 10 X швабры работает буфер, добавляя MOPS 0,4 М (рН 7,0), ацетат натрия 0,1 М и 0,01 М ЭДТА.
- Добавьте 10 мл 10 X швабры работает буфер и 18 мл 37% формальдегида (12,3 М) в охлажденный агарозы решение.
- Каста гель, поливая агарозы решение в гелеобразующий контейнер. Расческой достаточно большим, чтобы вместить 10 мкл. После того, как гель поставила и твердой на ощупь, осторожно снимите гребень.
- Соберите геля в баке электрофореза, и добавить достаточно 1 X швабры идущий буфер, обеспечение гель покрыта полностью.
- Подготовьте образец РНК путем добавления 1 мкг РНК 0.5 X томов формальдегида содержащих загрузки красителя.
- Добавьте бромид ethidium решение РНК в концентрации 10 мкг/мл.
- Денатурируйте РНК образец решения при 70 ° C за 5 мин.
- С помощью стерильного, 10 мкл фильтр советы, нагрузка 5 мкл маркер молекулярного веса и 5 мкл РНК представленном(ых) в отдельной скважины геля и electrophorese на 5 V/см до тех пор, пока краска мигрировали по крайней мере две трети длины геля.
- Визуализируйте РНК в геле на осветитель транс УФ. Убедитесь, что РНК правильного размера, сравнивая маркер молекулярного веса.
- Чтобы измерить концентрацию и чистоту РНК, передачи 1.2 мкл очищенный РНК, используя стерильные 10 мкл фильтр советы на УФ спектрофотометр.
Обратите внимание, что РНК высокого качества должны иметь коэффициенты поглощения A260/280 (1,8-2,2) и 260/230 (> 1.7) соответственно. - Использование 10 мкл фильтр советы, аликвота оставшиеся очищенный РНК в стерильных 0.5 мкл пробирок (3-5 мкл/трубка). Хранить трубы-80 ° c до готовности для микроинъекции.
Примечание: Концентрация окончательный инъекции 500 нг/мкл является оптимальной отправной точкой. Рекомендуется для разбавления 1:2 в РНКазы бесплатно H20 до микроинъекции уменьшить липкость РНК в пипетку микроинъекции РНК.
2. Кинетохор микротрубочек насадку пробирного
- Ооциты делят на равные группы для микроинъекции.
Примечание: Ооцитов сбора, передачи, микроинъекции и meiotic созревания был описан подробно JoVE ранее 15. - Microinject одной группы с экспериментальной мРНК и другие группы с WT управления и PBS или Gfp мРНК.
Примечание: 500 нг/мкл является концентрация инъекции рекомендуется начать с 10. Picoinjector может использоваться для управления впрыска сумм. Объем впрыска 5-10 пл рекомендуется 15. - С помощью руки или рот, эксплуатируемых дозирования аппарат, где стекло Пипетка открытие это немного больше, чем диаметр ооцитов (100-150 мкм), ооциты передачи в 100 мкл капля milrinone свободной культуры среднего в чашке Петри охваченных эмбриона качество нефтепродуктов и инкубировать яйцеклеток для 7 ч при 37 ° C в 5% C02 позволяет достаточно созревания до метафазы мейоз и я (встретил я) 15.
- После инкубации, используя же аппарат пипетку выше, передачи яйцеклеток в центр ну орган культуры блюдо, содержащий 700 мкл предварительно охлажденные минимальных основных СМИ (MEM) коллекции среды в центре хорошо и 500 мкл H20 в внешнего кольца и Поместите блюдо на льду за 7 мин.
Примечание: Рекомендуется предварительно chill MEM СМИ и центр хорошо орган культуры блюда при-20 ° C для по крайней мере 20 минут до начала лечения яйцеклеток. - Исправьте яйцеклеток, передачи их с помощью пипетки аппарат в хорошо прозрачного стекла пятна пластины, содержащие 400 мкл параформальдегида 2% в ПБС втечение 20 мин при комнатной температуре.
- Используя же Пипетка аппарат, передачи яйцеклеток в еще один колодец на место пластину, содержащие 400 мкл блокирующие решение (PBS + 0,3% BSA + 0.01% Tween-20 + 0,02% НАН3) и хранить при 4 ° C до готовности для обработки иммуноокрашивания.
Примечание: для хранения яйцеклеток на 4 ° C, Стекло покровное пятно пластины с парафина для предотвращения испарения. - С помощью же пипеткой аппарат, ооциты передачи на новый колодец в месте пластины содержащие 400 мкл permeabilization раствора (PBS + 0,3% BSA + 0,1% TritonX-100 + 0,02% НАН3) и инкубации при комнатной температуре 20 мин переноса ооцитов быстро через три капель 400 мкл блокирование решение для удаления любых остатков моющего средства.
Примечание: 9-Ну прозрачного стекла пятна пластины хорошо работает для перемещения групп через несколько процедур на одной тарелке (шаги 2,4-2,5). - Выполните остальные процедуры immunocytochemistry в камере увлажненные, защищенный от света при комнатной температуре. Использование средних пластиковый контейнер выстроились с влажной салфетки и накрыть алюминиевой фольгой.
- С помощью пипетки аппарат, передачи ооциты 30 мкл преграждая разрешение на крышке 96-луночных пластины и место в зале увлажненные за 10 мин.
Примечание: Капли помещаются в круговой отступы на плите. - Ярлык центромеры и шпинделя, используя пипетку аппарат, передачи ооциты 30 мкл блокирование раствор, содержащий анти прицентромерного антигена (ACA, гребень) (1:30) и тубулин анти ацетилированные (1: 1000) и проинкубируйте по крайней мере 1 час.
- Промойте ооциты путем передачи через капли три 30 мкл преграждая разрешение для 10 мин.
- С помощью пипетки аппарат, переноса ооцитов 30 мкл падение блокирования решения, содержащие вторичные антитела бесплатными для антител, используемые выше (античеловеческие IgG 1: 200, анти мыши IgG 1: 200) и инкубировать в течение 1 ч.
- Повторить 3, 10-мин полоскания в 30 мкл преграждая разрешение, как описано в шаге 2.11.
- Переноса ооцитов, используя пипетку аппарат, в 3-5 мкл монтажа средних содержащие DAPI (5.9 мкг/мкл) на стекло микроскопа.
- 4 место небольшой капли (размер булавочную головку) вазелин на углах крышку выскальзования для предотвращения дробления яйцеклетки.
- Осторожно поместите крышку выскальзования-вазелин стороне вниз на слайд.
- Уплотнение coverslip края с очистить лак и дайте высохнуть на 5 мин.
- Хранить слайды на 4 ° C, в защищенном от света, до обработки через confocal микроскопии.
Примечание: Обеспечить преломления матчей монтажа средних и coverslip, Микроскоп целей используются. Рекомендуемые монтажные материалы ранее были описаны 15. - Изображение ооцитов, используя цель x 40-63 на конфокального микроскопа, захватив небольшие шаги (≤ 1 мкм) в плоскости z, оптимизированный для рабочих цель и изображения на весь регион метафаза шпинделя.
Примечание: Убедитесь, что изображение все 3 каналы, основанные на конкретных вторичные антитела, используемые на шаге 2.11. Изображения в среднем ≥ 4 и зум 3 идеальны для надлежащей резолюции. 1 Размер шага мкм обеспечивает четкие визуализации микротрубочек и kinetochores в ооцитов мыши. Процедура для захвата изображений будет варьироваться от Микроскоп Микроскоп. Обратитесь к руководству конфокальный пользователя производителей для конкретных шагов по настройке параметров микроскопа. - Определите статус вложений Кинетохор микротрубочек, с использованием изображений программное обеспечение, следуя шаги 2.21-2.23 ниже.
Примечание: Следующие шаги описывают эту процедуру с использованием изображений J (НИЗ) бесплатно загружаемое программное обеспечение, однако, может использоваться альтернативный изображений программное обеспечение. Статус вложений, типы ранее были определены 16 . - Открыть изображение, перетащив файл в J изображение панели инструментов.
- В открытом z серии сделайте все каналы видимым (ДНК, Кинетохор и шпинделя), нажав «объединить каналы», доступных в раскрывающемся меню «изображение» на вкладке «Цвет» sub.
- Используя переключатель в нижней части изображения, переместить через каждый z ломтик и определить Кинетохор микротрубочки вложение. Подробные вложение, которое ранее были описания описал 16
3. хромосомы выравнивание вызов Assay
- С помощью пипетки аппарат, как описано в шаге 2.3, переноса ооцитов в 100 мкл капля milrinone свободной культуры среднего по нефти и инкубировать яйцеклеток для 7 h позволяет достаточно созревания до метафазы мейоз и я (встретил я) как описано в шаге 2.3 17 .
Примечание: Процедуры сбора, микроинъекции и созревания ооцитов были изложены ранее 15. Обратитесь к протокол assay вложений в шагах 2.1-2.2 для элементов управления и концентрации РНК микроинъекции. - Использование же пипеткой аппарат, ооциты передачи в центр ну органной культуры блюдо содержащий 700 мкл питательной среды, содержащие monastrol [100 мкм] в центр хорошо и 400 мкл H20 в окружающих кольцо и инкубировать при 37 ° C на 2 ч.
- Промыть monastrol путем переноса ооцитов, используя пипетку аппарат как выше, через три капли 100 мкл CZB питательной среды и затем передать яйцеклеток в новый центр ну орган культуры блюдо содержащий 700 мкл культуры среднего + MG132 [5 мкм] за 3 ч в центре кольцо. Добавьте 400 мкл H20 внешнего кольца.
- Исправьте яйцеклеток путем передачи их, используя пипетку аппарат, в колодец прозрачного стекла пятна пластины, содержащие 400 мкл 2% параформальдегида в PBS для 20 мин при комнатной температуре.
- После фиксации, переноса ооцитов, используя пипетку аппарат, в новой скважины прозрачного стекла пятна пластины, содержащие 400 мкл блокирования решения и хранить при 4 ° C до обработки для иммуноокрашивания.
Примечание: для хранения яйцеклеток на 4 ° C, Стекло покровное пятно пластины с парафина для предотвращения испарения. - Разрушения и этикетки ооциты через immunocytochemistry, как описано в шагах 2.6-2.16.
- Изображение яйцеклеток с помощью цель x 40-63 на конфокального микроскопа, захватив < 1 мкм шаги в плоскости z, убедившись, что изображения на весь регион метафаза шпинделя.
- Определить выравнивание хромосомы статус открытия файлов изображений с помощью визуализации программного обеспечения.
Примечание: Следующие шаги описывают эту процедуру с использованием изображений J (НИЗ) бесплатно загружаемое программное обеспечение, однако, может использоваться альтернативный изображений программное обеспечение. - Перетащите изображение в изображении J Панель управления.
- В открытом z серии, используйте инструмент точка (доступен, нажав точку пиктограмму на панели управления изображения J) для обозначения точки в конце каждого шпинделя полюса в их соответствующих z ломтик, поместив инструмент над полюсом шпинделя в изображении и нажав на изображение. Добавьте эти точки региона интерес (ROI) менеджер, нажав Command + t на клавиатуре.
- Определите конкретные координаты для каждой позиции, набор в шаге 3.10, выделив конкретные точки в менеджере ROI и нажав кнопку измерения. Это даст результаты таблица, содержащая координат x и y для каждой точки. Это будут точки X1, Y1 и X1, Y2, соответственно.
- Далее определите значение true Z координата. Это делается путем умножения числа срез конкретных z-среза в z стека, в котором была определена полюс шпинделя (т.е. фрагмент #2 из 6) что каждой конкретной точке в стек толщиной (т.е. 1 мкм) (пример: фрагмент 2 x 1 мкм = 2). Это будут точки Z1 и Z2 соответственно.
- Определить длину шпинделя с помощью теоремы Пифагора уравнения (б2 +2 = c2) с использованием ранее определенных x, y и z координаты от шагов 3.11-3.13. Для каждого шпинделя конечной длины соотвествует:
√((x1-x2)2+(Y1-Y2)2+(Z1-Z2)2) - Определите midzone шпинделя. Рассчитывается как одна половина длины шпинделя. Используя инструмент «линия» в изображении J, нажав на значок линии на панели инструментов изображения J Нарисуйте линию, которая составляет от одного полюса шпинделя до midzone шпинделя. Длина будет отображаться на панели инструментов J изображения.
- Определите статус хромосомы выравнивание путем оценки хромосома расстояние от шпинделя midzone, используя средство измерения строки. Используя инструмент линия доступна, щелкнув значок линии на панели инструментов изображения J, нарисуйте линию от midzone шпиндель для хромосомы. Длина будет отображаться на панели инструментов J изображения. Хромосомы, больше, чем 4 мкм от шпинделя midzone считаются выровненными 18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
После в vitro транскрипция РНК высокого качества будет иметь отношение A260/A280 (1,8-2,2) и ≥1.7 отношение A260/A230 когда измеряется с помощью спектрофотометра. Изображение на рисунке 1 показана миграция в vitro-производится РНК на денатурируя геля агарозы после электрофореза. Группа, которая смазывается в шаблон или образец, который имеет несколько размеров полос может указывать загрязнение или деградации образца. Кроме того несколько полос может указывать мРНК не денатурированным полностью, или начиная плазмида не был полностью линеаризованных. МРНК будет работать больше, чем прогнозировалось за хвост поли adenylated, построенный в pIVT, который позволяет стабильной выражение mRNA в пробирке. После микроинъекции рекомендуется для обеспечения единообразного инъекции томов и уровнях выражения через флуоресцентной микроскопии. Изображение на рисунке 2 показана профаза я арестован ооцитов, равномерно вводится с Gfp. Метод последовательного микроинъекции имеет решающее значение для этого протокола. Программное обеспечение для анализа изображений, например изображение J, может использоваться для проверки выражения уровня для обеспечения единообразия и освоение техники. Обратите внимание, что локализация внутриклеточных информация может быть получена при выполнении визуализации для обоих анализов. Для всех экспериментов микроинъекции оценки последствий вариант гена одичал тип гена следует вводят в подмножество яйцеклеток в качестве элемента управления. Это позволяет для контроля потенциальных фенотипов Избыточная экспрессия гена человека в ооцитов мыши. PBS, или Gfp для Флюорофор меченых конструкций, должны быть также вводиться в подгруппу яйцеклеток для контроля микроинъекции индуцированной фенотипов. Для конструкций без флуоресцентные метки Gfp мРНК могут быть совместно вводят для обеспечения достаточной микроинъекции. Если совместно инъекционных одновременно два или более конструкции необходимо увеличить концентрацию мРНК, таким образом, что окончательное решение содержит 500 нг/мкл каждого мРНК.
Assay холодной стабильные микротрубочки обеспечивает ценный инструмент для оценки состояния вложение kinetochores микротрубочки. Рисунок 3 – z проекция Конфокальный микроскоп образа метафаза я ооцитов. Эта яйцеклетка был подвергнут обработке холодной СМИ для деполимеризуют все микротрубочек, которые не были присоединены к kinetochores. Ооциты, которые были обработаны для достаточного времени будет содержать микротрубочек волокна не присоединен к хромосом (слишком коротким приводит к слишком много волокна) или отсутствие волокна все вместе (слишком долго результаты в структуре не шпинделя) и это рекомендовал, чтобы эти ооцитов не использоваться в анализе. В метафаза мейоз я он является общим для ооциты содержат неприсоединенной или боково вложенных kinetochores, поэтому его рекомендуется использовать группу управления в любом исследовании вложений. В среднем ооциты одичал тип не будет содержать 5-10% kinetochores ми будет еще быть стабильно прилагаемый 19. Важно, что все ооциты быть на той же стадии, для анализа состояния Кинетохор микротрубочек вложений. Для обеспечения что экспериментальных и контрольных групп Зрелые с аналогичными шкалы времени рекомендуется оценить кинетику клеточного цикла. Выполнять этот assay, подмножество управления и экспериментальной ооциты следует созрел и визуализированы жить под покадровой микрофильм. Использование milrinone позволяет яйцеклеток для синхронизации в профазе мейоза, таким образом, что выпуск в СМИ не хватает milrinone с разрешить возобновление мейоз на же время 20. Ооциты от контроля и экспериментальных групп следует выдавливать полярного тельца, свидетельствует о достижении метафаза мейоз II (встретились II), в подобные моменты времени. Если не доступен микроскопия живой клетки, яйцеклеток может созрела для встретил я (7 h) и встретились II (16 ч), фиксированной и витражи для обнаружения ДНК и микротрубочек, как описано выше. В Met I и II встретился бочкообразных, биполярный шпинделя должны быть видны. В управления ооцитов хромосомы должны быть выровнены по метафаза пластины. Выравнивание хромосом будет отличаться в экспериментальных группах в зависимости от варианта влияет, однако, хромосомы должны конденсируется и придает микротрубочек с большинством хромосом, расположенный на шпинделе. Такое же количество яйцеклеток должны достигли мейоз II управления и экспериментальных групп. Для уменьшения трудностей в определении вложения статус, который рекомендуется изображений ооцитов, используя небольшие шаги в плоскости z, оптимизированный для конкретной цели рабочей. Анализ включает просмотр z ломтики индивидуально и в Объединенные параметры, чтобы определить какие полюса, что придает микротрубочек исходят от. Рисунок 3B иллюстрирует примеры аномальных Кинетохор микротрубочек вложений. Показана двухвалентной, в котором только одна сестра Кинетохор пара прилагается к шпинделя микротрубочек, определяется как без вложений. Далее вложение syntelic показано, в котором обе сестры Кинетохор пар прикреплены же полюс шпинделя. Наконец, вложение merotelic показано, в котором одна сестра Кинетохор прилагается к обоих полюсов шпинделя во время других сестра Кинетохор пары прилагается к полюсу один шпиндель.
Изображения в Рисунок 4 иллюстрируют прогрессивного ожидаемых ДНК и конфигураций шпинделя как один движется через шаги анализа проблемы выравнивания хромосомы. В этот assay важно, что различные экспериментальные группы прогресс через мейоз с аналогичными кинетики. Как описано ранее рекомендуется завершить анализ кинетики клеточного цикла до проведения пробирного вызов. В этот assay оценивается способность для ооцитов успешно исправить ненормальное Кинетохор микротрубочек вложения. Чтобы проверить это, ооциты сначала созрела для встретил я разрешить Кинетохор микротрубочек вложения должен быть создан. Далее ооциты инкубируют в monastrol и 5 кинезин (EG5) ингибитор, который сворачивает биполярного шпинделя в монополярной шпинделя 21. Поколение монополярной шпинделя индуцирует вложения неправильного микротрубочек Кинетохор 100%. Ингибитор monastrol затем вымываются, чтобы обеспечить возможность восстановления. Период восстановления яйцеклеток регенерировать биполярного шпинделя и попытаться исправить микротрубочек вложения. Ингибитор протеасом MG132 предотвращает остановку анафазы начала. Как элемент управления, небольшое подмножество ооциты от каждой экспериментальной группы может устанавливаться на каждом этапе в протоколе (встретил я, monastrol лечение, сообщение восстановления) для обеспечения всех групп отвечают на лечение и в той же степени. Метафаза я ооциты должен содержать бочкообразных биполярного шпинделя с хромосом, согласованы на пластину метафаза. Ооциты, относились с monastrol должна содержать монополярной шпинделя с хромосомами, ориентированная на одном полюсе. Восстановленные ооциты еще раз должен содержать бочкообразных биполярный шпинделя. Выравнивание хромосома определяется как любой хромосомы более 4 мкм от шпинделя midzone 22. Это полезно пятно яйцеклеток для обнаружения ДНК и kinetochores создать, если оба kinetochores находятся за пределами этой центральной зоны, как это может быть трудно определить, используя только обнаружение ДНК.
Рисунок 1. Denaturingagarose электрофорез геля RNA. Электрофорезом на денатурируя геля агарозы можно оценить качество РНК и размер. Денатурируя гель рекомендуется для предотвращения формирования вторичной структуры. Переулок 1 содержит маркер молекулярного веса РНК. Лейн 2 является образцом РНК. Обратите внимание, что РНК будет работать больше, чем рассчитывается за хвост встроенные поля. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Проверка ооцитов микроинъекции. Люминесцентная микроскопия может использоваться для проверки успешного ооцитов микроинъекции и выражения. Профаза я арестован ооцитов microinjected с Gfp показываются после ночи выражение конструкции. Это изображение было получено с помощью Invitrogen EVOS FL Auto визуализации система с GFP света куб. Шкалы бар-100 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Оценка вложений Кинетохор микротрубочек. (A) A представитель z проекция холодной лечение встретил я ооцитов. Показано шпинделя (зеленый), kinetochores (красный) и ДНК (синий). Поле показывает региона оптический зум. Стрелки обозначают конец на вложения kinetochores к микротрубочек одного двухвалентного. Линейки шкалы — 10 мкм для шпинделя, Кинетохор, ДНК и объединить каналы. Линейки для оптический зум — 5 мкм. (B) примеры типов вложений ненормальных Кинетохор микротрубочек в ооцитов мыши. Стрелки указывают Кинетохор микротрубочек вложение сайтов. Шкалы бар-5 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. Хромосома выравнивание вызов пробирного. Схема процедуры с представителем z прогнозы яйцеклеток на каждом шагу. Ооциты сначала созрела для метафаза мейоз я (встретил я), затем переведен в новое блюдо, содержащие monastrol 2 h побудить монополярной шпинделя формирования. Следующий ооциты разрешены для восстановления в среде созревания дополнена ингибитор протеасом (MG132), чтобы предотвратить остановку анафазы начала за 3 ч. После восстановления ооциты фиксированной, помечены для шпинделя (зеленый), kinetochores (красный) и ДНК (синий) и образы через confocal микроскопии для определения выравнивания статуса. Линии указывают длину шпинделя (40 мкм) и шпинделя midzone (20 мкм) определяется с помощью теоремы Пифагора уравнения. Стрелки указывают точки позиций инструмента на каждый полюс. Любой kinetochores > 4 мкм от шпинделя midzone считаются выровненными. Звездочка указывает невыровненных хромосомы (5,6 мкм от midzone). Шкалы бар-10 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Из-за быстрого и увеличение идентификации человеческих генетических вариантов, связанных с болезнью важно, что созданы системы для оценки их биологическое значение. Понимание функции протеина в человека мейоз создает особые проблемы, потому что человеческие яйцеклетки являются драгоценные и редкие и человеческой спермы не поддаются генетические манипуляции. Ооцитов мыши являются ценным для оценки человека ген петельной функции 10,23системы млекопитающих модель. Эта модель обходит практически нецелесообразные аспекты использования человеческих яйцеклеток обеспечивая доступный источник лоу кост, манипуляции яйцеклеток, которые проходят мейоз похож на человека зародышевые клетки, а полезные для понимания как генетические варианты могут повлиять девушки плодородия.
Поскольку эти методы используют внематочная выражение человеческого белка в ооцитов мыши через микроинъекции, важно сначала установить концентрацию управления, одичал тип РНК, которые не изменяют meiotic созревания. Рекомендуется, что кинетика meiotic созревания, контроль (ядерная оболочка разбивка, полярного тела выдавливания) управления яйцеклеток для установления базовых параметров и оценке шпинделя и хромосомы морфологии. Кроме того обеспечение единообразных микроинъекции тома имеет решающее значение для сравнения групп. Включая флуоресцентные метки на ген интереса можно упростить эту техническую проблему. Методы для освоения ооцитов микроинъекции были ранее показали 15. Визуализация вводят яйцеклеток под микроскопом флуоресценции или определения выражения протеина через западную помарку также являются ценными инструментами для подтверждения концентрации последовательного впрыска.
Потому что ошибки в хромосоме сегрегации в млекопитающих ооциты являются ведущей причиной эмбриональных анеуплоидии и беременность Потеря5, анализ Кинетохор микротрубочек вложений обеспечивают ценный инструмент для оценки ли ген интереса влияет на хромосома сегрегации (то есть неправильного вложения приведет к неправильной сегрегация). 10 мин, подверженности охлажденные СМИ достаточно деполимеризуют микротрубочек, которые не сделали Кинетохор микротрубочек вложения, позволяя визуализации стабильных вложений через confocal микроскопии 24. Для этого анализа важно не слишком холод яйцеклеток, как это приведет к деполимеризации стабильные микротрубочки. Кроме того оптимизация процедур окрашивания является ключевым для визуализации Кинетохор и микротрубочек структур. Чтобы обеспечить достаточное разрешение для анализа, малые шаги (≤ 1 мкм) в плоскости z, используя 40 x-63 x должен быть захвачен цели, и получение изображений через весь шпинделя структуры для обеспечения всех вложений являются видимыми. Обратите внимание, что это часто имеют неприсоединенной kinetochores во время Прометафаза мейоз я 25.
Хромосома выравнивание вызов пробирного полезен для оценки прибыли или потери функции вариантов. Усиление функции вариантов может быть трудно оценить, поскольку ооцитов мыши от молодых женщин имеют низкий уровень анеуплоидии. Этот assay преодолевает это препятствие, создавая ситуацию, в которой ооцитов необходимо исправить экспериментально индуцированных неправильный Кинетохор микротрубочек вложения. Создание точки времени, в котором управления ооциты содержат разрегулированные хромосомы 1-2 после восстановления обеспечивает количественной сценарий для определения, предоставляет ли мутант выравнивание повышение эффективности (т.е. лучше выравнивания возможностей будет защите euploidy). Для количественной оценки хромосома рассогласования, ранее установленного протокола, в котором хромосом больше чем 4 мкм от шпинделя midzone характеризуются как невыровненных может быть используемые 18.
Для изучения вариантов функция потерь, дополнительные экспериментальные условия необходимы вследствие эндогенного гомолога в системе обучения. Один из способов устранения этой проблемы — использовать или создать модель мыши нокаут варианта интерес. Появлением Crisper/Cas9 системы может обеспечить быстрый способ создания такой нокауты 26. Кроме того если модель нокаут не является вариант, классическая нокдаун методы, такие как совместное инъекций Морфолино Антисмысловые олигонуклеотиды или малые интерферирующие РНК могут быть использованы. Однако чтобы избежать любых возможных помех с microinjected вариант под исследования требуется уделять внимание последовательности дизайн. Например из мыши ген, который не входит в варианте мРНК человека, представил через микроинъекции Морфолино олигонуклеотида может быть разработана для привязки к 5' непереведенные региона (5' УТР). При использовании малых вмешательства RNAs один может целевой регион не гомологичной последовательностью или ввести немого точечные мутации в гене человека, который бы уклониться от ориентации. Однако имея еще присутствует на выражение варианта копирования эндогенного белка может быть информативным, как многие варианты находятся в состоянии гетерозиготных в геноме человека.
Наконец хотя не описана в настоящем Протоколе, оценки анеуплоидия хромосомы можно легко оценить в яйцах встретились II как окончательный анализ в конвейере для человека вариант анализа. Подробное описание этого на месте хромосомы распространения протокол ранее описал 15. Кратко microinjected ооцитов, созрел в vitro до тех пор, пока они достигают встретились II стадии, после лечения с агентом meiotic depolymerizing шпинделя до фиксации. Кинетохор и хромосомы окрашивание как описано здесь позволяют для оценки содержания хромосомы.
В то время как ооцитов мыши обеспечивают ценный инструмент для изучения белков, решающее значение для женского мейоз некоторые ограничения существуют модели. Гиперэкспрессия белка может повлиять meiotic созревания и поэтому концентрации РНК может не существовать не побудить фенотип. Кроме того эндогенного мыши гомолога может помешать с локализацией экзогенных человеческий белок. Поколения модели мыши нокаут обеспечивает решение этой проблемы; Однако это не возможно во всех ситуациях. Альтернативный подход будет истощать мыши белка, совместно внедряя RNAi или Морфолино олигонуклеотиды для не целевой экзогенных РНК и белка. Наконец, важно отметить, что, хотя многие белки гомологичных между человека и мыши, могут существовать различия, ведущие к различиям в локализации и функции, которые могут исключать этот тип кросс видов анализа. Генетические манипуляции инструменты, такие как Cas9-геном редактирования27 становятся дешевле и более общей место, этот протокол может превратиться в делая забивные, гуманизированные мыши линии вместо того чтобы полагаться на микроинъекции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана исследовательский грант от американского общества репродуктивной медицины и Чарльз и Johanna Busch Мемориальный фонд по Rutgers, государственного университета NJ к A.L.N. к.с. был поддержан грант от N.I.H. (F31 HD0989597).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 mL Seal-Rite PCR tube | USA Scientific | 1602-4300 | |
| 1 kb DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0313 | |
| 100 bp DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0243 | |
| 6X DNA loading Dye | Thermo Scientific | R0611 | |
| 9-well glass spot plate | Thomas Scientific | 7812G17 | |
| Agarose | Sigma Aldrich | A9539 | |
| Albumin from bovine serum | Sigma-Aldrich | A3294 | |
| Alexa-fluor-568 conjugated anti-mouse IgG | Thermo Scientific | A21050 | 1:200 dilution |
| Alexa-fluor-633 conjugated anti-human IgG | Thermo Scientific | A21091 | 1:200 dilution |
| Ampicillin | VWR | AA0356 | |
| Anti-vibration table | Technical Manufacturing Corp | any standard model | |
| Anti-Acetylated Tubulin antibody | Sigma Aldrich | T7451 | 1:100 diution |
| Anti-centromeric (CREST) antibody | Antibodies Incorportated | 15-234 | 1:30 dilution |
| Barrier (Filter) Pipette tips | Thermo Scientific | AM12635 | Make sure compatable with your brand of pipettors. These are compatible with Eppendorf brand pipettors. |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Agar, Miller (Luria Bertani) | Fisher Scientific | DF0445-07-6 | |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria Bertani) | Fisher Scientific | DF0446-07-5 | |
| Capillary tubing | Sutter | B100-75-10 | |
| Center Well organ culture dish | VWR | 25381-141 | |
| CO2 tank | For incubator | ||
| Confocal microscope | Zeiss | any standard model | |
| Centrifuge (With cooling ability) | Thomas Scientific | any standard model | |
| Cover Glass 11 x 22 mm | Thomas Scientific | 6663F10 | |
| Coverslips | Thomas Scientific | 6663-F10 | thickness will vary for particular microscopes |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | |
| DEPC H20 | Life Technologies | AM9922 | |
| Digital Dry Bath | Thermo Scientific | 888700001 | |
| Easy A high fidelity cloning enzyme | Agilent | 600400 | For DNA cloning |
| Enzymes for linearizing pIVT | New England Biolabs | NdeI or KasI can be used | |
| Ethidium Bromide | Thermo Scientific | 155585011 | |
| Fluorescent Microscope | Any Fluorescent microscope may be used | ||
| Formaldehyde (37%) | Thermo Fisher Scientifc | 9311 | |
| Formaldehyde RNA loading dye | Ambion | 8552 | |
| Frosted Microscope Slides (Uncharged) 25X75 mm | Fisher Scientific | 12-544-3 | |
| Full Length cDNA Clones | Can be obtained from any vendor that supplies open reading frame clones | ||
| Gel electrophoresis apparatus | Bio-Rad | any standard model | |
| Glass Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-200 | |
| Globin Forward Primer for pIVT Construct | 5'- GAA GCT CAG AAT AAA CGC -3'. Can be purchased from any company that generates custom oligonucelotides | ||
| Globin Reverse Primer for pIVT Construct | 5'- ATT CGG GTG TTC TTG AGG CTG G -3' Can be purchased from any company that generates custom oligonucelotides | ||
| Holding pipettes | Eppendorf | 930001015 | Vacutip |
| Humidified Chamber | Tupperware can be used | ||
| Illustra Ready-To-Go RT-PCR beads | GE Life Sciences | 27925901 | |
| Incubator | any standard model with CO2 and water jacketed technology | ||
| Inverted Microscope | Nikon instruments | Any Standard model | |
| Image J (NIH) Software | NIH | Image Analysis software | |
| Lid of 96 well plate | Nalgene Nunc International | 263339 | |
| Low Adhesion 0.5 mL microcentrifgue tube | USA Scientific | 1405-2600 | |
| MacVector | MacVector | Sequence analysis software | |
| MG132 | Selleckchem | S2619 | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-3 | |
| Millenium RNA Markers-Formaldehyde | Ambion | AM7151 | |
| Milrinone | Sigma-Aldrich | M4659 | Resuspend in DMSO at 2.5mM |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M5310 | Only used embryo-tested, sterile-filtered |
| Monastrol | Sigma-Aldrich | M8515 | Resuspend in DMSO at 100 mM |
| Mouthpiece | Biodiseno | MP-001-Y | |
| N2 tank | for antivibration table | ||
| Nail Polish; Clear | Any clear nailpolish can be used | ||
| NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | any standard model | |
| NorthernMax 10X Denaturing Gel Buffer | Life Technologies | AM8676 | |
| NorthernMax 10X Running buffer | Life Technologies | AM8671 | |
| NuPAGE MOPS SDS Running buffer | Thermo Scnentific | NP0001 | |
| Organ Culture Dish 60x15mm | Life Technologies | 08-772-12 | |
| Paraformaldehyde | Polysciences, Inc. | 577773 | |
| PCR Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | 4484075 | |
| Petri Dish 139 mm | Thermo Fisher Scientifc | 501V | |
| Petri dish 35 mm | Thermo Fisher Scientifc | 121V | |
| Petri Dish 60 mm | Falcon BD | 351007 | |
| Picoinjector | XenoWorks Digital Microinjector | any standard model | |
| Pipette puller | Flaming-Brown Micropipette puller | Model P-1000 | |
| pIVT plasmid | AddGene | 32374 | Empty vector suitable for oocyte expression. |
| Pregnant Mare Serum Gonadotropin | Lee BioSolutions | 493-10 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | purification of up to 20 uL of plasmid DNA |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| Quikchange II site directed mutagenesis kit | Agilent | 200523 | mutagenesis kit for insertions and deletions |
| Quikchange lightning multi-site directed mutagenesis kit | Agilent | 210512 | mutagenesis kit for single site changes |
| Scissors (Fine point) | Fine science tools | 14393 | |
| Scissors (Medium point) | Fine science tools | WP114225 | |
| Seal-Rite 1.5 mL microcentrifuge tube | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Slide Warmer | any standard model | ||
| Spectrophotometer (Nanodrop) | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | |
| Stereomicroscope | any standard model | ||
| Subcloning Efficiency DH5a Competent Cells | Thermo Fisher Scientifc | 18265017 | |
| Syringe | BD Bioscienes | 309623 | 1 ml, 27G(1/2) |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202L | |
| T7 mMessage Machine high-yield capped RNA transcription kit | Life Technologies | AM1340 | |
| TritonX-100 | Sigma-Aldrich | x-100 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | 274348 | |
| Tweezer (Fine point- Size 5) | Fine science tools | SN.743.12.1 | |
| UltraPure Dnase/Rnase-Free Distilled Water | Thermo Fisher Scientifc | 10977015 | |
| UltraPure Ethidium Bromide 10mg/mL | Thermo Fisher Scientifc | 15585011 | |
| UVP UV/White lite transilluminator | Fisher Scientific | UV95041501 | |
| Vectashield Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 |
References
- Thoma, M. E., et al. Prevalence of infertility in the United States as estimated by the current duration approach and a traditional constructed approach. Fertil Steril. 99 (5), 1324-1331 (2013).
- Boivin, J., Bunting, L., Collins, J. A., Nygren, K. G. International estimates of infertility prevalence and treatment-seeking: potential need and demand for infertility medical care. Human Reproduction. 22 (6), 1506-1512 (2007).
- Treff, N. R., Zimmerman, R. S. Advances in Preimplantation Genetic Testing for Monogenic Disease and Aneuploidy. Annu Rev Genomics Hum Genet. , (2017).
- Franasiak, J. M., et al. The nature of aneuploidy with increasing age of the female partner: a review of 15,169 consecutive trophectoderm biopsies evaluated with comprehensive chromosomal screening. Fertil Steril. 101 (3), 656-663 (2014).
- Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).
- Scott, R. T. Jr Blastocyst biopsy with comprehensive chromosome screening and fresh embryo transfer significantly increases in vitro fertilization implantation and delivery rates: a randomized controlled trial. Fertil Steril. 100 (3), 697-703 (2013).
- Scott, R. T. Jr, Upham, K. M., Forman, E. J., Zhao, T., Treff, N. R. Cleavage-stage biopsy significantly impairs human embryonic implantation potential while blastocyst biopsy does not: a randomized and paired clinical trial. Fertil Steril. 100 (3), 624-630 (2013).
- Yang, Z., et al. Selection of single blastocysts for fresh transfer via standard morphology assessment alone and with array CGH for good prognosis IVF patients: results from a randomized pilot study. Mol Cytogenet. 5 (1), 24 (2012).
- Rubio, C., et al. In vitro fertilization with preimplantation genetic diagnosis for aneuploidies in advanced maternal age: a randomized, controlled study. Fertil Steril. 107 (5), 1122-1129 (2017).
- Nguyen, A. L., et al. Identification and characterization of Aurora Kinase B and C variants associated with maternal aneuploidy. Mol Hum Reprod. , (2017).
- Igarashi, H., Knott, J. G., Schultz, R. M., Williams, C. J. Alterations of PLCbeta1 in mouse eggs change calcium oscillatory behavior following fertilization. Dev Biol. 312 (1), 321-330 (2007).
- Database, J. S. E. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. JoVE. , (2017).
- Carey, M. F., Peterson, C. L., Smale, S. T. PCR-mediated site-directed mutagenesis. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (8), 738-742 (2013).
- Armstrong, J. A., Schulz, J. R. Current Protocols Essential Laboratory Techniques. , John Wiley & Sons, Inc. (2008).
- Stein, P., Schindler, K. Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment. J Vis Exp. (53), (2011).
- Watanabe, Y. Geometry and force behind kinetochore orientation: lessons from meiosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (6), 370-382 (2012).
- Shuda, K., Schindler, K., Ma, J., Schultz, R. M., Donovan, P. J. Aurora kinase B modulates chromosome alignment in mouse oocytes. Mol Reprod Dev. 76 (11), 1094-1105 (2009).
- Lane, S. I., Yun, Y., Jones, K. T. Timing of anaphase-promoting complex activation in mouse oocytes is predicted by microtubule-kinetochore attachment but not by bivalent alignment or tension. Development. 139 (11), 1947-1955 (2012).
- Nguyen, A. L., et al. Phosphorylation of threonine 3 on histone H3 by haspin kinase is required for meiosis I in mouse oocytes. J Cell Sci. 127 (Pt 23), 5066-5078 (2014).
- Tsafriri, A., Chun, S. Y., Zhang, R., Hsueh, A. J., Conti, M. Oocyte maturation involves compartmentalization and opposing changes of cAMP levels in follicular somatic and germ cells: studies using selective phosphodiesterase inhibitors. Dev Biol. 178 (2), 393-402 (1996).
- Kapoor, T. M., Mayer, T. U., Coughlin, M. L., Mitchison, T. J. Probing spindle assembly mechanisms with monastrol, a small molecule inhibitor of the mitotic kinesin, Eg5. Eg5. J Cell Biol. 150 (5), 975-988 (2000).
- Jones, K. T., Lane, S. I. Molecular causes of aneuploidy in mammalian eggs. Development. 140 (18), 3719-3730 (2013).
- Fellmeth, J. E., et al. Expression and characterization of three Aurora kinase C splice variants found in human oocytes. Mol Hum Reprod. 21 (8), 633-644 (2015).
- Rieder, C. L. The structure of the cold-stable kinetochore fiber in metaphase PtK1 cells. Chromosoma. 84 (1), 145-158 (1981).
- Brunet, S., et al. Kinetochore fibers are not involved in the formation of the first meiotic spindle in mouse oocytes, but control the exit from the first meiotic M phase. J Cell Biol. 146 (1), 1-12 (1999).
- Joung, J., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening. Nat Protoc. 12 (4), 828-863 (2017).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
