Summary
Métodos simples são descritos para demonstrar a produção de amiloides citotóxicos após infecção do endotélio pulmonar por Pseudomonas aeruginosa.
Abstract
Pacientes que sobrevivem a pneumonia tem elevadas taxas de mortalidade nos meses após a alta hospitalar. Isso tem sido a hipótese de que a infecção do tecido pulmonar durante uma pneumonia resulta na produção de citotoxinas long-lived que podem levar ao fracasso subsequente fim órgão. Nós desenvolvemos em vitro ensaios para testar a hipótese que citotoxinas são produzidas durante a infecção pulmonar. As células endoteliais pulmonar isolado de rato e a bactéria Pseudomonas aeruginosa são usados como sistemas modelo, e a produção de cytoxins após a infecção das células endoteliais por bactérias é demonstrada usando cultura de células, seguida por quantificação directa utilizando ensaios de lactato desidrogenase e um novo método microscópico utilizando tecnologia ImageJ. A natureza amiloide destas citotoxinas foi demonstrada por ensaios de thioflavin T obrigatórios e immunoblotting e immunodepletion usando anticorpo antiamilóide de A11. Novas análises usando immunoblotting demonstraram que tau oligoméricas e Aβ foram produzidos e liberados por células endoteliais após infecção por p. aeruginosa. Esses métodos devem ser facilmente adaptávelas para análises de amostras clínicas humanas.
Introduction
Pacientes que sobrevivem a pneumonia tem elevadas taxas de mortalidade nos meses seguintes hospital descarga1,2,3,4,5,6. Na maioria dos casos, a morte ocorre por algum tipo de falha final-órgão, incluindo renais, pulmonares, cardíacas, ou eventos de fígado, bem como derrame5,6. A razão para a elevada taxa de mortalidade nesta população de pacientes nunca foi estabelecida.
Pneumonia é classificada como também sendo adquirida na Comunidade ou hospitalar (nosocomial) e agentes que podem causar pneumonia incluem bactérias, vírus, fungos e substâncias químicas. Uma das principais causas de pneumonia nosocomial é a bactéria Pseudomonas aeruginosa. P. aeruginosa é um organismo Gram-negativo que usa um sistema de secreção do tipo III para transferir várias moléculas efetoras, denominadas exoenzymes, diretamente para o citoplasma das células de destino7,8. Durante a infecção de células endoteliais pulmonares, os exoenzymes alvo várias proteínas intracelulares, incluindo um formulário endotelial do microtubule-associada da proteína tau9,10,11,12 , levando à desagregação de barreira endotelial, resultando em edema pulmonar grave, diminuição da função pulmonar e, muitas vezes, morte.
Como dito anteriormente, pacientes que sobrevivem a pneumonia inicial elevaram taxas de mortalidade nos primeiros 12 meses após a alta hospitalar. Um mecanismo potencial para explicar esse fenômeno é que algum tipo de toxina long-lived é gerado durante a infecção inicial que conduz ao pobre resultado a longo prazo. Duas observações suportam esta possibilidade. Em primeiro lugar, culturas pulmonares células endoteliais, que são tratadas inicialmente com p. aeruginosa falharem a proliferar por até uma semana depois que as bactérias são mortas por antibióticos13. Segundo, long-lived priões e agentes com características de príon foram demonstrados em várias doenças humanas e animais, particularmente doenças associadas com o sistema nervoso de14,15.
Nunca têm sido descritos métodos para analisar o potencial de produção de agentes citotóxicos long-lived durante a infecção pulmonar. Aqui uma série de ensaios simples em vitro são descritos que podem ser usados para investigar cytotoxin produção e actividade após infecção usando um comum agente causando uma pneumonia, p. aeruginosa. Estes ensaios devem ser facilmente adaptávelas para investigar indução cytotoxin possível após infecção usando outros agentes que causam a pneumonia, e os sobrenadantes são gerados também devem ser útil para investigar os efeitos dos citotoxinas no todo órgãos ou animais. Finalmente, os ensaios que são descritos aqui provavelmente será adaptávelas para testar os fluidos biológicos humanos e animais para a produção de citotoxinas durante uma pneumonia.
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Protocol
Todos os procedimentos de animais foram revisados e aprovados pelo Comitê de cuidado Animal da Universidade do Sul do Alabama e institucional e foram realizados em conformidade com todas as regulamentações federais, estaduais e locais. Culturas primárias de rato pulmonar microvascular células endoteliais (PMVECs) foram obtidas da instalação de núcleo de cultura de célula Center da Universidade do Sul do Alabama para biologia do pulmão. As células foram preparadas usando os procedimentos descritos anteriormente16.
1. geração de sobrenadantes citotóxicos
Nota: Aqui, usamos dois diferentes cepas de p. aeruginosa: PA103, que tem um sistema de secreção do III tipo intacto capaz de transferir os exoenzymes ExoU e ExoT para células-alvo durante a infecção e ∆PcrV, que carece de um tipo sistema do secretion de III e é incapaz de transferir exoenzymes para células-alvo após a inoculação.
- Raia de bactérias para a de placas de ágar Vogel-Bonner (VB)17 e crescer durante a noite a 37 ° C.
- Para preparar pratos, faça a seguinte solução estoque (sais de Vogel-Bonner; estoque de x 10): medir 2 g MgSO4, ácido cítrico de 20g (ácido livre), 100 g K2PO4e 35 g NaH2PO4. Adicione ddH2O de 1L e autoclave por 15 min com escape lento.
- Coloque 7,5 g ágar-ágar em 450ml ddH2O e autoclave como acima.
- Após a autoclavagem, Coloque ambas as soluções em um banho de água de 50 ° C para esfriar.
- Adicione 50 mL da solução de sal estoque de 10 x VB a agar.
- Adicionar carbenicilina a 400 µ g/mL (para as cepas de p. aeruginosa sendo usado) e misturar bem, agitando o frasco.
- Lugar 5 mL da solução de ágar de VB em pratos individuais cultura estéril, permitir que o agar para solidificar e em seguida armazenar a 4 ° C até o dia da semeadura bacterianas.
- No dia da semeadura bacterianas, pré-aquecer uma placa a 37 ° C e em seguida marcam as bactérias na placa utilizando uma ansa estéril. Lugar a placa em uma incubadora de 37 ° C durante a noite.
- Verificar a pureza PMVEC pela coloração positiva com fluorescente Griffonia simplicifolia lectina e coloração negativa com fluorescentes Helix pomatia lectina (um marcador para células endoteliais arteriais). Alíquotas células e congelamento em nitrogênio líquido.
- Para experiências, manter as células em modificado águia de Dulbecco médio (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino e desenvolvem-se células em uma incubadora de 37 ° C, contendo 5% de CO2. Use células em passagens 5-15.
- Para geração de sobrenadantes citotóxicos, placa de 2 x 106 células em pratos individuais 150cm e crescer por 3-4 dias até alcançar a confluência. Use duas placas por experiência (veja abaixo).
- Para análise dos sobrenadantes citotóxicos, células de placa 1 x 105 em poços individuais de um poço-6 prato e crescerem durante quatro dias até alcançar a confluência.
- Para produzir o sobrenadante, lavar um dos pratos de PMVECs dois 150cm da etapa 1.3.1 com tampão fosfato salino, trypsinize e depois contar as células (use um contador de célula automatizada e seguir o protocolo do fabricante; ver Tabela de materiais). Lavar o outro prato de PMVECs com Hank está equilibrado sal solução (HBSS) e então infectar com qualquer estirpe de p. aeruginosa em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 20:1. Isto é conseguido da seguinte forma:
- Para p. aeruginosa, OD540 0,25 = 2 x 108 CFUs/mL. Para preparar esta diluição, adicione 1 mL HBSS para uma cubeta descartável de 1ml. Raspe bastante bactérias do prato que foi preparada no passo 1.1 até uma OD540 de 0,25 é alcançado quando medido utilizando um espectrofotômetro. O próximo passo irá fornecer um cálculo de quanto serão necessário bactérias.
- Uma vez que o número de PMVECs a placa de cultura é determinado (etapa 1.4 acima), determinar o número apropriado de bactérias a ser adicionado ao prato em segundo lugar, não-trypsinized de cultura contendo os PMVECs. Por exemplo, se for determinado que a placa de cultura de PMVECs contém 1,3 x 107 células e, em seguida, preparar a 1,3 x 107 células x 20 bactérias/celular x 1 mL/2 x 108 CFUs = bactérias 1,3 mL.
- Dilua a 1,3 mL de bactérias em HBSS até um volume final de 20 mL, para que toda a superfície de um prato de 150 cm pode ser coberto com fluido e, em seguida, adicionar as bactérias diluídas para a placa de PMVECs.
- Incube as PMVECs inoculadas com as bactérias a 37 ° C numa incubadora 5% CO2 para 4-5 h, até que as lacunas podem ser vistas formando em monocamada a célula quando a placa é observada microscopicamente (ver Figura 1 para um nível adequado de formação de lacuna).
- Recolher o sobrenadante e, em seguida, centrifugar durante 10 min a 2.000 x g em uma centrífuga de mesa para remover restos celulares.
Nota: Qualquer centrífuga de mesa capaz de gerar suficiente g force para células unlysed e células grandes fragmentos podem ser usados para esta etapa de Pelotas. - Despeje o líquido sobrenadante em uma seringa que tem um filtro de 0,2 µm conectado à sua extremidade, então passar o sobrenadante através do filtro para remover as bactérias.
- Use uma alíquota do sobrenadante estéril para teste de citotoxicidade (ver 2.1) e congelar o resto do sobrenadante a-80 ° C para uso futuro.
2. análise de sobrenadantes citotóxicos
- Ensaio de citotoxicidade
- Cresce PMVECs em pratos 6-poços até a confluência. Poços de lavar uma vez com HBSS, em seguida, adicionar 1,5 mL do sobrenadante filtro esterilizado (colhido ou células inoculadas por PA103 ou ∆PcrV) para poços individuais. Adicione HBSS estéril para outro bem como controlo negativo.
- Coloque a placa para a incubadora de CO2 para 21-24 h e, em seguida, observar para matar a célula/citotoxidade (ver próximo passo). Use sobrenadantes que exibem citotoxicidade para novas experiências e descartar aqueles que não mostram a matança de célula.
- Quantificação de morte celular
- Liberação de lactato desidrogenase (LDH) medida de células mortas, usando Kits de ensaio disponíveis comercialmente LDH e do fabricante recomendado procedimentos.
- Alternativamente, quantificar a matança de célula ao microscópio utilizando o software ImageJ. Por isso, gravar imagens microscópicas e áreas da placa de cultura contendo células intactas e, em seguida, quantificar regiões faltam células (indicativas de morte celular em um monolayer) usando uma macro personalizada do ImageJ (National Institutes of Health) (ver arquivo de codificação complementar ). Se desejado, realize as etapas macro manualmente da seguinte forma:
- Imagens (formato RGB ou Tiff) de entrada para a macro e ajustar o contraste para 15% saturada pixels. Duplique o contraste ajustado imagens e executar o comando "subtrair o plano de fundo" para obter uma imagem de alto contraste da área tanto a célula e a lacuna dentro do campo de visão.
- Subtrair a esta imagem da imagem original e combinar com a imagem original, usando a calculadora de imagem "E" função, a imagem resultante. Converta a imagem resultante em preto (lacunas) e máscara branca (células) com a função de limite (mínimo de 0, máximo de 5) e usar a função "corroer a binário" para remover o ruído da imagem.
- Medir a proporção de preto para brancos pixels dentro da imagem resultante usando a medição de "fração de área". Plotar e expressar áreas fracionárias para cada ponto de tempo de tratamento como por cento da área de abertura máxima.
- Meios de calcular e comparar usando ANOVA One-Way com teste post hoc de Tukey, com valores de p inferior a 0,05 considerado significativo.
- Use a análise de immunoblot para estabelecer a presença de amiloide e tau oligoméricas Aβ em sobrenadantes de cultura. Realizar análise de immunoblot usando11,os procedimentos padrão10,12, exceto concentrando sobrenadantes de cultura pelo menos 10 vezes antes da electroforese.
- Para concentrar-se o sobrenadante, coloque 1 a 2 mL do sobrenadante para uma unidade de filtro de centrifugação cuja membrana tem um peso molecular de corte de 10 kDa. Em seguida, coloque a unidade de filtro em uma centrífuga de mesa superior e centrifugar x 2.000 g até o necessário grau de concentração é alcançado (geralmente de 45-60 min).
- Determinar a quantidade de proteína na concentrada sobrenadante11 e carregar quantidades iguais de amostras em poços individuais do gel.
- Executar géis, transferir as proteínas para nitrocelulose e sondar os borrões com anticorpo antiamilóide de A11, anticorpo antioligoméricas tau de T22 ou anticorpo anti-Aβ de MOAB2 seguido por anticorpos secundários apropriados. Desenvolva os borrões usando procedimentos padrão de quimioluminescência.
- Para fazer um ensaio de T de thioflavin, use thioflavin T fluorescência (ThT) quantificar amiloides em sobrenadantes. Para as medições, use filtro esterilizado sobrenadantes.
- Prepare uma solução de stock (50x) de thioflavin T, suspendendo a 8 mg thioflavin T (ThT) em soro fisiológico 10ml tamponado fosfato (PBS). Após a mistura, filtre a solução através de um filtro de 0,22 µm para remover partículas.
- Para medições, adicione 20 µ l de estoque ThT a 1 mL de PBS em um fluorímetro de 1 mL. Coloca a amostra diluída em um spectrofluorimeter.
- Medir a emissão de fluorescência de base usando 425 excitação nm e a emissão de fluorescência de 450-575 nm em incrementos de 2 nm de digitalização.
- Executar uma verificação de lapso de tempo usando 425 excitação nm e emissão de 482 nm, com dados adquiridos a cada 0.2 s por 60 s.
- O inicial 20 s do scan Time-Lapse mede a fluorescência na célula em branco. A 20 s, pausar o scan e adicionar 10 µ l do sobrenadante filtro esterilizados para a cubeta. Misture a cubeta por inversão e coloque para o spectrofluorimeter.
- Retomar a verificação baseada em tempo, adquirindo o final 40 s de dados.
- Após a conclusão da digitalização lapso de tempo, execute uma varredura de espectro de emissão de fluorescência final usando configurações idênticas, conforme detalhado em 2.1.5.3.
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Representative Results
Um ensaio simples em vitro foi desenvolvido para ensaio para a presença de citotoxinas em sobrenadantes de células infectadas com a bactéria p. aeruginosa. Basicamente, meio de cultura de células infectadas é coletado 4 h após a adição de bactérias, as bactérias são removidas pela esterilização do filtro do sobrenadante da cultura, e em seguida o sobrenadante estéril é adicionado a uma nova população de células. As células são então observadas 21-24 h após a adição do sobrenadante e matança de célula é quantificada.
Adição de p. aeruginosa para camadas confluentes do PMVECs induz a formação de lacunas entre as células. In vivo, formação lacuna leva à diminuição da função pulmonar e edema pulmonar. No ensaio descrito, formação de abertura é usado como o ponto de vez para a seleção para libertação cytotoxin sobrenadantes de cultura celular e duração suficiente de incubação com PA103 é indicado pela presença de lacunas que começam a se formar em monocamada a célula, como mostrado na Figura 1. ΔPcrV bactérias não induza as lacunas de célula sob essas condições de incubação. Uma vez que as lacunas são detectadas, o sobrenadante é recolhidas, filtro esterilizado e em seguida adicionado à ingênua PMVECs para avaliar a atividade citotóxica. Os PMVECs em seus respectivos sobrenadantes depois são colocados em uma incubadora para 21-24 h, observados e fotografados. Conforme mostrado na Figura 2, o sobrenadante coletado de PMVECs que tinham sido infectados com p. aeruginosa estirpe PA103 contido citotoxinas que induziu a morte das células cultivadas por 21 h após a adição do líquido sobrenadante. Em contraste, nenhuma morte celular foi observado no controle de células tratadas com qualquer meio HBSS ou com sobrenadante coletado da estirpe ΔPcrV de Pseudomonas. Immunoblot análise demonstrou que moléculas de amiloide, incluindo tau oligoméricas e Aβ, são geradas durante a infecção com a estirpe de PA103, enquanto não amiloides são geradas pela tensão ΔPcrV após inoculação de PMVECs (Figura 2). O papel de amiloides como os citotoxinas neste ensaio foi confirmado por immunodepletion de amiloides do sobrenadante antes da adição de culturas de células12. Embora não mostrado aqui, immunodepletion de citotóxico sobrenadante usando anticorpo antiamilóide de A11 e anticorpo anti-tau oligómero de T22 completamente esgota a atividade citotóxica de sobrenadantes produzidos na sequência PA103 infecção (Balczon et al 2017 12 e Balczon et al, em preparação).
Foi desenvolvido um método simples, barato e romance de quantificação de morte celular. Para este ensaio, ImageJ software tem sido adaptada para permitir a medição direta das áreas em um campo microscópico que não possuem células (indicativas de morte celular). A confiabilidade desse método foi verificada por comparação directa ao método bem estabelecido de célula matando, que é a liberação LDH de células de medição. Como mostrado na Figura 3, software ImageJ pode ser usado para converter de um campo microscópico que contêm as células em branco e regiões que não possuem células para preto. Então, uma simples relação de áreas de brancas para preto pode ser usada para medir a morte celular. Ao iniciar com uma monocamada confluente de células, todas as regiões do campo microscópico são brancas. No entanto, por 18 h após a adição de sobrenadantes contendo citotoxinas, lacunas a monocamada poderiam ser detectadas. A quantidade de área do prato cultura desprovida de células, em seguida, aumentada de forma linear até pós adição de 36h de sobrenadante citotóxico. Ao medir a liberação LDH, foram obtidos resultados idênticos, com liberação LDH sendo detectada pela primeira vez a 18 h após a adição do sobrenadante citotóxico. Liberação LDH, em seguida, aumentou de forma linear até matar célula máxima foi medido a 36 h após a adição do sobrenadante. Pequena morte celular foi medido em células tratadas com sobrenadante coletado ΔPcrV inoculada células (Figura 3) ou nas culturas tratadas com HBSS por 36h.
A quantidade de amiloide lançado de células tratadas com bactérias pode ser quantificada através da medição da fluorescência ThT. Vinculação de amiloides para ThT provoca uma mudança conformacional na molécula e um aumento na intensidade de fluorescência. Para este ensaio, thioflavin T é adicionado para uma cubeta e a fluorescência de base é medida. A gravação de fluorescência é então parou, enquanto uma pequena alíquota da amostra é adicionada. A cubeta, em seguida, é retornada para o fluorímetro e a mudança é a emissão de fluorescência é gravado. Como mostrado na Figura 4, o sobrenadante coletadas células que foram incubadas com tensão de PA103 de p. aeruginosa contido amiloide como indicado pelo aumento da emissão de fluorescência. Em contraste, sobrenadante do PMVECs inoculados com a cepa ΔPcrV carecia de amiloides, conforme indicado pela ausência de aumento da fluorescência.
Figura 1. Efeitos de inolculation de p. aeruginosa na morfologia PMVEC. Uma monocamada confluente do PMVECs antes (A) e quatro horas após a adição (B) da tensão de PA103 de p. aeruginosa. As lacunas podem ser claramente vistas na monocamada de célula em células infectadas. Barra de escala = 100 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Análises de citotóxicos sobrenadantes. Parte [I]. Imagens representativas de controle e células tratadas. PMVECs foram tratados por 21 h com sobrenadante obtido a partir de células inoculadas com qualquer PA103 bactérias (B) ou estirpe ΔPcrV (C). Células de controle também foram incubadas durante 21 h com HBSS amortecedor (A). Barra de escala = 100 µm. parte [II]. Immunoblots representante de sobrenadantes coletados de ΔPcrV (A) ou PA103 (B) infectado PMVECs. Os borrões foram analisados com anticorpos contra amiloide (A11) ou tau oligoméricas (T22). Mr em kDa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Quantificação de matar célula. (A) campos de microscópio representativa de tempo diferentes pontos (em h após adição de sobrenadante) em quais regiões do campo contendo e falta de células foram convertidos para branco ou preto, respectivamente, usando o software ImageJ. A mesmo contraste imagem da fase antes de conversão também é mostrado. Barra = 100 µm. (B) comparação de quantificação de célula matando usando padrão do ensaio de liberação LDH e o ensaio do ImageJ. N = 4, * *p < 0.05, * * *p < 0,01. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Dados de ensaio de fluorescência representante ThT. Cubetas em branco contendo ThT estavam animadas em 425 nm e emissão de fluorescência foi medida em 482 nm. Fluorescência de fundo foi coletada durante 20 segundos e então sobrenadante de qualquer PA103 - ou ΔPcrV-inoculados PMVECs foi adicionado para as cubetas. Emissão de fluorescência foi então gravado por 40 seg.
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Discussion
Aqui, simples em vitro métodos estão descritos que permitem a demonstração da geração de amiloides citotóxicas durante a infecção com uma organismo causador de pneumonia. Estes métodos incluem um ensaio de citotoxicidade de cultura de células, immunoblotting, quantificação de célula usando um novo método microscópico e ThT vinculação a matar. Análises dos agentes citotóxicos têm demonstrado que eles são amiloide na natureza (Figura 2 e Figura 4) e apresentam características de um prião12. A geração de moléculas citotóxicas prião durante uma pneumonia fornece uma explicação possível para as elevadas taxas de mortalidade observada em sobreviventes de uma pneumonia após sua alta hospitalar. Experimentos em andamento estão testando essa possibilidade.
O evento chave para todos os estudos descritos é a geração de sobrenadante citotóxico, e duas variáveis importantes que precisam ser considerados. Em primeiro lugar, no rato esboçado experimentos PMVECs foram usados para ambos a etapa de infecção e para o ensaio de citotoxicidade. Se outros tipos de células podem ser usados para a produção de citotoxinas não foi investigado em detalhe, e é possível que outras células podem ser capazes de gerar citotóxicos sobrenadantes após o tratamento com várias cepas de p. aeruginosa. Como mostrado, as citotoxinas são amiloide na natureza e incluem oligoméricas tau e Aβ. Talvez seja razoável esperar que outros tipos de células que expressam a proteína amiloide tau e/ou beta podem ser induzidos a gerar citotoxinas após inoculação bacteriana, embora esta possibilidade continua a ser testado. Os procedimentos descritos podem ser usados para examinar se outros tipos de células podem ser induzidos a produzir citotóxicos amiloides seguindo diferentes insultos.
A segunda variável importante na geração dos sobrenadantes citotóxicas é a duração do tratamento com bactérias. É essencial que a incubação das PMVECs poderão progredir até lacunas podem ser vistas na monocamada. A identificação de lacunas em monocamada a célula é exoenzymes uma indicação tem sido injetado pela bactéria Pseudomonas no citoplasma de célula do hospedeiro e que o exoenzymes são ativos, resultando em retração das bordas da célula (Figura 1). Nossa experiência é que o ponto de tempo de retração das bordas da célula é um indicador fiável de libertação cytotoxin o sobrenadante. É tentador especular que os dois eventos estão relacionados como dentre os amiloides citotóxicas sendo lançados oligoméricas tau, e interrupção de atividade de tau resulta na despolimerização de microtúbulos que contribui para mudanças de forma celular. Em experimentos onde tratamentos tem sido menor do que a quantidade de tempo necessária para induzir a formação de lacuna, detectou-se pouco maduro citotóxico amiloide.
O ensaio de citotoxicidade descrito neste manuscrito é simples e confiável. Morte celular pode ser facilmente observado por exame microscópico e quantificado diretamente de imagens microscópicas gravadas. Os métodos descritos aqui têm sido utilizados exclusivamente para avaliar a produção cytotoxin após infecção das células endoteliais pulmonares de ratos com p. aeruginosa. É bem provável que os procedimentos podem ser facilmente adaptados para avaliar se citotóxicos amiloides são produzidos após infecção com outra pneumonia causando agentes, incluindo tanto nosocomiais associadas bactérias e bactérias e vírus responsável adquirida na Comunidade tipos de pneumonia. Além disso, os procedimentos relatados apenas tem sido usados para examinar citotóxica amiloide geração durante a infecção de pilhas cultivadas. Cultura de pilha é um sistema artificial, e os procedimentos descritos aqui provavelmente poderiam ser adaptados para avaliar a geração de citotoxinas durante infecção pulmonar de modelos animais e pacientes humanos. Coleção de fluidos biológicos, tais como lavagem broncoalveolar, de animais infectados ou doentes pode ser usada nos mesmos tipos de ensaios relatados aqui avaliar se citotóxicos amiloides são gerados durante os processos de infecção in vivo. Obviamente, as durações de incubação com bactérias podem ser bastante diferentes quando inoculação em animais, e lavagem broncoalveolar teria que ser recolhidos em vários ponto de tempo para determinar a duração final do tratamento.
Immunoblot análises demonstraram que amiloides estão presentes nos sobrenadantes, incluindo tau oligoméricas e Aβ (Figura 3). Embora os procedimentos de immunoblot são padrão, há uma etapa-chave que deve ser executada antes de iniciar as análises immunoblot. Especificamente, é essencial que os sobrenadantes esteja concentrado pelo menos dez vezes antes de immunoblotting como a quantidade de amiloide no sobrenadante un-concentrado é abaixo do limite de detecção por análise de immunoblot. Como relatado aqui, centrifugação utilizando tubos equipados com um filtro é o método rotineiramente usado para esta etapa de concentração, mas parece razoável que outros métodos, tais como precipitação de TCA, seria igualmente como útil para esta etapa.
A quantificação da célula matando usando imagens representa um importante avanço. Atualmente os procedimentos disponíveis para quantificar a morte celular dependem a compra de kits razoavelmente caros que permitem a medição da liberação LDH de células mortas. O ensaio descrito aqui não envolve nenhum custo como ImageJ programas são livres para fazer o download do site do NIH. A simples adaptação de programas ImageJ permite a medição bastante precisa da morte celular. No entanto, Vale salientar que um par de pequenos artefatos encontrados durante a execução do referido protocolo. A questão principal é que os fragmentos de células, tais como áreas de contato focal, podem permanecer associados com o prato de cultura como células morrem. Estes fragmentos de célula residual podem ser detectados pela câmera e dão uma indicação artificial que as células permanecem sobre o prato. Como tal, é raro que um valor de matança de célula de 100% é obtido usando este procedimento.
Uma fraqueza do sistema de ensaio relatado é que o amiloides cytotoxin na preparação nunca tenham sido completamente definidos. Como tal, a quantificação é difícil. Ensaios de ELISA podem ser usados para fornecer níveis totais de amiloides diferentes, sem fornecer nenhuma informação detalhada sobre as espécies individuais em cada preparação. Até ensaios mais precisos, tais como eletrificada ou em vitro sintetizado amiloides oligómeros, podem ser desenvolvidos, o melhor que se pode fazer neste momento é para iniciar cada experimento com o mesmo número de células, incubar durante a mesma duração e verificar que citotoxicidade ocorre às mesmas taxas como preparações anteriores que foram usadas. Variação de qualquer uma das normas bem estabelecidas introduz a incerteza adicional.
Em resumo, simples em vitro métodos são descritos para demonstrar a produção de moléculas tóxicas de amiloide por células endoteliais pulmonares após infecção com um agente causadores de pneumonia. Os ensaios são confiáveis e provavelmente podem ser adaptados para outros organismos e para uso usando fluidos biológicos obtidos de animais infectados e doentes. Esses métodos serão úteis para estudos investigando as consequências a longo prazo de pneumonia e para estabelecer os mecanismos, levando à insuficiência do extremidade-órgão em pacientes após a alta hospitalar.
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Disclosures
Nenhum relatório.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi financiada em partes por subvenções de NIH HL66299 TS, RB e SL, HL60024 de TS e HL136869 para MF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rabbit anti beta amyloid | Thermo | 71-5800 | |
| A11 amyloid oligomer antibody | StressMarq | SPC-506D | |
| T22 anti-tau oligomer antibody | EMD Millipore | ABN454 | |
| Thioflavin T | Sigma Aldrich | T3516 | |
| HBSS | Gibco | 14025-092 | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| 0.22 micron syringe filters | Millipore | SLGP033RS | |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| HRP Goat antirabbit IgG | Abcam | ab6721-1 | |
| Strains PA103 and ΔPcrV | These strains of P. aeruginosa were obtained from Dr. Dara Frank, University of Wisconsin Medical College, Milwaukee, WI | ||
| FITC Griffonia lectin | Sigma Aldrich | L9381 | |
| TRITC Helix pomatia lectin | Sigma Aldrich | L1261 | |
| Agar | Fisher | BP1423-500 | |
| 0.22 micron nitrocellulose | BioRad | 162-0112 | |
| Type 2 collagenase | Worthington | LS004176 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30898.03IH | |
| PenStrep | Gibco | 15070063 | |
| Carbenicillin Disodium salt | Sigma | C1389 | |
| Microcetrifugation concentrators- 10,000 MW cut-off | Millipore | UFC801008 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma | 795496-500G | |
| Magnesium phosphate heptahydrate | MP Biomedicals | MP021914221 | |
| Citric Acid | G Biosciences | 50-103-5801 | |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Sigma | S9506-500G | |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10277 |
References
- Brancati, F. L., Chow, J. W., Wagener, M. M., Vacarello, S. J., Yu, V. L. Is pneumonia really the old man's friend? Two-year prognosis after community-acquired pneumonia. Lancet. 342 (8862), 30-33 (1993).
- Hedlund, J. U., Ortqvist, A. B., Kalin, M. E., Granath, F. Factors of importance for the long-term prognosis after hospital treated pneumonia. Thorax. 48 (8), 785-789 (1993).
- Meier, C. R., Jick, S. S., Derby, L. E., Vasilakis, C., Jick, H. Acute respiratory tract infections and risk of first-time acute myocardial infarction. Lancet. 351 (9114), 1467-1471 (1998).
- Waterer, G. W., Kessler, L. A., Wunderink, R. G. Medium-term survival after hospitalization with community-acquired pneumonia. Am J Resp Crit Care Med. 169 (8), 910-914 (2003).
- Yende, S., et al. Inflammatory markers at hospital discharge predict subsequent mortality after pneumonia and sepsis. Am J Resp Crit Care Med. 177 (11), 1242-1247 (2008).
- Corrales-Medina, V. F., et al. Association between hospitalization for pneumonia and subsequent risk of cardiovascular disease. J Am Med Assoc. 313 (3), 264-274 (2015).
- Frank, D. W. The exoenzyme S regulon of Pseudomonas aeruginosa. Mol Microbiol. 26 (4), 621-629 (1997).
- Engel, J., Balachandran, P. Role of Pseudomonas aeruginosa type III effectors in disease. Curr Opin Microbiol. 12 (1), 61-66 (2009).
- Ochoa, C. D., Alexeyev, M., Pastukh, V., Balczon, R., Stevens, T. Pseudomonas aeruginosa exotoxin Y is a promiscuous cyclase that increases endothelial tau phosphorylation and permeability. J. Biol. Chem. 287 (30), 25407-25418 (2012).
- Balczon, R., et al. Pseudomonas aeruginosa exotoxin Y-mediated tau hyperphosphorylation impairs microtubule assembly in pulmonary microvascular endothelial cells. PLoS One. 8, e74343 (2013).
- Morrow, K. A., et al. Pseudomonas aeruginosa exoenzymes U and Y induce a transmissible endothelial proteinopathy. Am J Physiol Lung Cell Molec Physiol. 310 (4), L337-L353 (2016).
- Balczon, R., et al. Pseudomonas aeruginosa infection liberates transmissible, cytotoxic prion amyloids. FASEB Journal. 31 (7), 2785-2796 (2017).
- Stevens, T. C., et al. The Pseudomonas aeruginosa exoenzyme Y impairs endothelial cell proliferation and vascular repair following lung injury. Am J Physiol Lung Cell Molec Physiol. 306 (10), L915-L924 (2014).
- Prusiner, S. B. Creutzfeldt-Jakob disease and scrapie prions. Alzheimer Dis Assoc Disord. 3 (1-2), 52-78 (1989).
- Hunter, N. Scrapie: Uncertainties, biology, and molecular approaches. Biochem. Biophys. Acta. 1772 (6), 619-629 (2007).
- King, J., et al. Structural and functional characteristics of lung macro- and microvascular endothelial cell phenotypes. Microvasc Res. 67 (2), 139-151 (2004).
- Marmont, L. S., et al. Oligomeric lipoprotein PelC guides Pel polysaccharide export across the outer membrane of Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci USA. 114 (11), 2892-2897 (2017).
