Summary
قد استخدمت الحقن داخل الجمجمة أورثوتوبيك الخلايا السرطانية في أبحاث السرطان لدراسة البيولوجيا ورم الدماغ والتقدم والتطور والاستجابة العلاجية. نقدم هنا fluorescence الجزيئية التصوير المقطعي لتكثيفها الورم، الذي يوفر التصوير إينترافيتال في الوقت الحقيقي والتحديد الكمي للورم الشامل في نماذج جليوبلاستوما الإكلينيكية.
Abstract
توموريجينيسيتي هو قدرة الخلايا السرطانية على تكوين ورم الجماهيري. نهج مستخدمة على نطاق واسع لتحديد ما إذا كانت الخلايا الورمية بالفئران العوز بالحقن تحت الجلد مع الخلايا السرطانية وقياس كتلة الورم بعد أن تصبح مرئية وملموسة. حقن أورثوتوبيك الخلايا السرطانية تهدف إلى إدخال إكسينوجرافت في المكروية يشبه الأنسجة الأصلية للورم وتجري دراسة أوثق. ويتطلب أبحاث سرطان الدماغ داخل الجمجمة حقن الخلايا السرطانية للسماح بتشكيل الورم والتحليل في المكروية فريدة من نوعها للدماغ. التصوير في فيفو تكثيفها داخل الجمجمة يرصد على الفور كتلة الورم أورثوتوبيكالي انجرافتيد الفئران. هنا نحن تقرير استخدام fluorescence الجزيئية التصوير المقطعي (FMT) لتكثيفها ورم الدماغ. أولاً ترانسدوسيد بالقرب من البروتينات الفلورية الأشعة تحت الحمراء الخلايا السرطانية وحقن ثم في دماغ الفئران المناعة. ثم يتم فحص الحيوانات الحصول على معلومات كمية عن كتلة الورم على مدى فترة ممتدة من الوقت. خلية قبل وسم يسمح للقياس الكمي استنساخه، فعالة من حيث التكلفة وموثوق بها من عبء الورم داخل كل الماوس. علينا التخلص من الحاجة إلى حقن ركازات التصوير، وبالتالي تخفيض الضغط على الحيوانات. ويمثل حد من هذا النهج بعدم القدرة على الكشف عن الجماهير صغيرة جداً؛ ومع ذلك، فقد قرار أفضل للجماهير أكبر من غيرها من التقنيات. يمكن تطبيقها لتقييم فعالية العلاج من تعاطي المخدرات أو التعديلات الوراثية لخطوط الخلايا الدبقي والعينات المستمدة من المريض.
Introduction
السرطان واحد من الأسباب الرئيسية للوفيات الناجمة عن المرض في البشر في العالم الصناعي. مع الوفيات مرتفعة للغاية، علاجات جديدة مطلوبة على وجه الاستعجال. جليوبلاستوما عديدة الأشكال (GBM) نوع الغاية فتاكة سرطان الدماغ، تتألف من السكان غير المتجانسة للورم، اللحمية، ومحصنة من خلايا المخ. وفقا للتسجيل ورم "الدماغ المركزي" للولايات المتحدة الأمريكية، الإصابة بأورام الدماغ الخبيثة وغير الخبيثة الأولية حوالي 22 حالة كل 100 ألف. من المتوقع أن يتم تشخيصها في الولايات المتحدة الأمريكية في عام 20171حوالي 000 11 قضية جديدة.
الدراسات الإكلينيكية التحقيق في احتمال المخدرات أو الإجراء، أو العلاج أن يكون فعالاً قبل إجراء التجارب على البشر. واحدة من الخطوات مختبر أقرب في الدراسات الإكلينيكية على تحديد أهداف جزيئية المحتملة للعلاج من تعاطي المخدرات باستخدام الخلايا السرطانية التي زرعها في أحد الكائنات المضيفة، تعريفها كنماذج إكسينوجرافت البشرية. وفي هذا السياق، ورم الدماغ داخل الجمجمة xenograft نماذج استخدام تكثيفها المستمدة من المريض (بدكسس) قد استخدمت على نطاق واسع لدراسة البيولوجيا ورم الدماغ والتقدم والتطور والاستجابة العلاجية، وفي الآونة الأخيرة لتطوير المؤشرات الحيوية، المخدرات الفرز، وشخصية الطب2،،من34.
واحدة من أكثر بأسعار معقولة وغير الغازية في فيفو التصوير أساليب رصد تكثيفها داخل الجمجمة هو الإضاءة الحيوية التصوير (BLI)5،6،،من78. ومع ذلك، تتضمن بعض القيود BLI الإدارة الركيزة وتوافر واستقرار الإنزيم، وتبريد الخفيفة والتشتت أثناء التصوير اقتناء9. هنا نحن تقرير FMT الأشعة تحت الحمراء كبديل التصوير أسلوب رصد نماذج جليوبلاستوما الإكلينيكية. في هذا الأسلوب، والحصول على إشارة والتحديد الكمي بدكسس إينتراكرانيالي مزروع، معربا عن بروتين القريبة من الأشعة تحت الحمراء فلورسنت iRFP72010،11 (يطلق عليها من الآن فصاعدا ك FP720) أو turboFP635 (يطلق عليه من الآن فصاعدا ك FP635)، تتم مع معاهدة المواد الانشطارية نظام التصوير. استخدام تكنولوجيا إنتاج المواد الانشطارية، أورثوتوبيك الأورام يمكن رصدها في فيفو قبل أو أثناء أو بعد العلاج، بطريقة غير الغازية، وخالية من الركازة، والكمية للملاحظات الإكلينيكية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
استخدام الحيوانات في البحوث التجريبية والعوامل المعدية، مثل لينتيفيروس ترانسدوسي الخلايا السرطانية، تتطلب موافقة مسبقة قبل البرنامج مؤسسات الرعاية الحيوانية ولجنة السلامة المؤسسية. ويتبع هذا البروتوكول المبادئ التوجيهية رعاية الحيوان من جامعة كاليفورنيا سان دييغو (جامعة كاليفورنيا سان دييغو).
1-تسمية الخلايا جليوبلاستوما مع FP635 أو بناء FP720
- إنتاج وتنقية lentivirus وفقا للبروتوكول، المذكورة تيسكورنيا et al. 12
- الثقافة نحو 2.0 × 106 خلايا من خط خلية الدبقي بشرية مع دميم بالإضافة إلى 10% مصل بقرى الجنين (FBS) في صحن 15 سم؛ أو مجالات الثقافة 2.0 × 106 جليوبلاستوما البشرية المستمدة من المريض (GBM-PDX) مع دميم F12 متوسطة 1:1 مع B27 الملحق بالإضافة إلى البشرية عامل النمو الماشوب البشرة (لو؛ 20 نانوغرام/مل) وصندوق الأجيال القادمة (10 نانوغرام/مل) في قارورة T75.
- الحفاظ على كافة الخلايا في 5% CO2, 37 درجة مئوية والرطوبة النسبية 100%.
- فصل الخلايا.
- للخلايا الدبقي: إزالة المادة طافية من اللوحات وإضافة 3-5 مل التربسين 1 X إلى الخلايا الدبقي.
- للخليج للحاسبات الآلية مجالات: جمع الخلايا من بيبيتينج الخلايا في أنبوب 15 مل.
- زيادة ونقصان لأسفل المجالات الخليج للحاسبات الآلية في 200 غ س لمدة 5 دقائق باستخدام أجهزة الطرد مركزي منضدية في درجة حرارة الغرفة.
- إزالة المادة طافية وإضافة 3-5 مل من محلول مفرزة الخلية.
- احتضان كافة الخلايا في 37 درجة مئوية لمدة 10-15 دقيقة.
- عناية فصل الخلايا من بيبيتينج صعودا وهبوطاً عدة مرات (ضمان أن يتم الانتهاء من المجالات وخلايا الدبقي نات) وزيادة ونقصان لأسفل في 200 غ س لمدة 5 دقائق.
- إزالة المادة طافية وريسوسبيند الخلايا مع 5 مل متوسطة من بيبيتينج صعودا وهبوطاً عدة مرات. تحديد صلاحية خلية باستبعاد تريبان الأزرق.
- لوحة 1.0 × 106 خلايا الهدف في صحن 10 سم مع 5 مل متوسطة من بيبيتينج.
- ترانسدوسي الخلايا مع lentivirus معربا عن البروتينات الفلورية في تعدد العدوى (وزارة الداخلية) 5 كما يصفها تيسكورنيا et al. 12 واحتضان عند 37 درجة مئوية.
- بعد 24 ساعة، إزالة الوسيطة من الخلايا ترانسدوسيد وإضافة 5 مل متوسطة طازجة واحتضانها ل 48 ساعة إضافية عند 37 درجة مئوية.
- فصل الخلايا المصابة في تعليق خلية واحدة كما هو موضح في الخطوات 1، 1، 4-6. زيادة ونقصان لأسفل الخلايا في 200 غ س لمدة 5 دقائق وريسوسبيند في 500 ميليلتر من الفرز الحل (مخزنة الفوسفات المالحة (PBS) مع 1% FBS).
- "الماصة؛" تعليق خلية في أنابيب نظام مراقبة الأصول الميدانية. شارك وصمة عار الخلايا مع 1 ميليلتر/مل من 4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI) هيدروكلوريد استبعاد الخلايا الميتة. عناصر سلبية مطلوبة لإنشاء بوابات تدفق سيتوميتير (غير ترانسدوسيد الخلايا والخلايا غير ترانسدوسيد/DAPI الملون).
- فرز الخلايا فلوري-الإيجابية/DAPI-السلبية في الفرز الحل، كما وصفها باسو et al. 13، وجمع الخلايا تم فرزها في أنبوب مخروطي 15 مل.
- تدور أسفل الخلايا تم فرزها في 200 غ س لمدة 5 دقائق وإزالة المادة طافية، وريسوسبيند في 5 مل من الثقافة المتوسطة. بذور الخلايا تم فرزها في صحن 10 سم من بيبيتينج. احتضان في 37 درجة مئوية لمالا يقل عن 48-72 ح.
- توسيع نطاق خلايا تم فرزها بفصل الخلايا اتباع الخطوات 1.4-1.6 والطلاء في أطباق متعددة لإجراء تجارب عليها في فيفو .
ملاحظة: لمزيد من التفاصيل حول الخلية فرز إعداد وتنقية، راجع باسو et al. 13
2-داخل الجمجمة حقن الخلايا جليوبلاستوما إيرفب معلم في "الفئران العوز"
ملاحظة: قبل البدء عملية جراحية، تأكد أن غرفة العمليات الجراحية وأدوات نظيفة لهذا الإجراء. استخدام athymic العوز عارية (Foxn1نو) ذكرا أو أنثى الفئران، بين 4-5 أسابيع من العمر و 17-19 ز للحقن داخل الجمجمة. وينبغي أن يضم الحيوانات لمدة 3 أيام على الأقل بعد وصولهم وقبل الجراحة.
- إعداد الخلية
- الحصاد وفصل الخلايا الدبقي إيجابية فلورسنت في تعليق خلية واحدة (خطوات 1.4-1.6) وريسوسبيند 0.5 أو 1.0 × 106 خلايا في 2-5 ميليلتر من برنامج تلفزيوني للحقنة الواحدة والحيوان. "الماصة؛" تعليق خلية في أنبوب 1.5 مل ميكروسينتريفوجي والمكان على الجليد.
- إعداد التخدير والإدارة
- إعداد 200 ميليلتر من المحلول الملحي الذي يتضمن الكيتامين (100 مغ/كغ) وإكسيلازيني (10 مغ/كغ) في ال 20 غرام من وزن الجسم الماوس. وزن الحيوانات وحساب الجرعة المناسبة من التخدير.
- توفر داخل حقن التخدير وتطبيق مرهم العيون إلى العيون لمنع الجفاف. للحصول على مزيد من التفاصيل حول هذه الخطوة راجع كاثلين et al. 14 وضع الحيوان على لوح قبل حرارة مياه حرارية في 37 درجة مئوية.
- تحقق من أن الحيوانات هي تخديره برصد استجابة قرصه تو (دواسة العاكسة)، عادة ما تكون ضمن 5-10 دقيقة.
- الحقن داخل الجمجمة
- تحميل 5 ميليلتر هاملتون حقنه (إبرة نصيحة كليلة) مع تعليق خلية وجبل في صاحب التحقيق.
- ضع الماوس في إطار المناظير باستخدام الأشعة حيوانات صغيرة وإصلاح الرأس باستخدام أشرطة الإذن ومحول القاطعة بعد تفاصيل وصف جيتين et al. 15
- تطهير الرأس بمحلول الإيثانول وتدين 70%. تأكد من أن يتم إكمال موقع الجراحية المعقمة. تنفيذ شق الأوسط مع مشرط صغير وفصل في الجلد والأنسجة الضامة.
- مكان حقنه هاملتون على نقطة بريجما في ميكرومانيبولاتور باستخدام.
- تحريك الصورة 1.0 مم حامل التحقيق و 2.0 مم الأفقي من نقطة بريجما. وضع علامة على هذا الموقف مع قلم رصاص.
- في هذا الموقع، بدقة جعل ثقب في الجمجمة مع حفر باليد micromotor بتطبيق ضغط طفيف إلى الأسفل حتى الأوعية الدموية تصبح مرئية. إلا يخل لحمه ماطر والمخ العنكبوتي.
- إدخال الإبرة في ثقب لدغ ودفع 3.0 ملم تحت سطح بيل.
- قم بإعداد حجم (2-5 ميليلتر) ومعدل التدفق (1 ميليلتر/دقيقة) لحقن حاقن ستيريوتاكسيك إليه باستخدام أو تنفيذ يدوياً الحقن.
- بعد الحقن، إزالة الإبرة تدريجيا بترتيب تصاعدي 1.0 مم كل 1 دقيقة وتنظيف مكان الحقن مع الإيثانول 70%.
- إغلاق الجرح بدبابيس جراحية أو عن طريق خيوط الجراحة (غالباً ما يشار إلى غرز) الجلد وانظر كاثلين et al. 14 لمزيد من التفاصيل.
- استرداد الحيوان
- نقل الحيوانات إلى منصة حرارية المائية (37 درجة مئوية) ورصد درجة حرارة الجسم ومعدل التنفس، ومعدل ضربات القلب، حتى الشفاء التام. إدارة التسكين كل البروتوكولات القياسية.
ملاحظة: لمزيد من المعلومات حول إجراء المناظير باستخدام الأشعة، الجراحة، وينسق، راجع14،،من5تقارير أخرى15.
- نقل الحيوانات إلى منصة حرارية المائية (37 درجة مئوية) ورصد درجة حرارة الجسم ومعدل التنفس، ومعدل ضربات القلب، حتى الشفاء التام. إدارة التسكين كل البروتوكولات القياسية.
3-معاهدة المواد الانشطارية التصوير
ملاحظة: وفقا لهدف التجريبية، جليوبلاستوما إيرفب معلم خلايا يمكن رصدها في فيفو قبل أو أثناء أو بعد العلاج. للتصوير والغرض، تخدير الحيوانات باستخدام دائرة التعريفي isoflurane، الحفاظ على في كاسيت تصوير أثناء المسح الضوئي، والصورة في محطة الإرساء لتصوير معاهدة المواد الانشطارية.
- إزالة الحيوان من القفص والمكان في قاعة التعريفي إيسوفلوراني. إغلاق الدائرة وقم بتشغيل تدفق الأكسجين والمبخر إلى 3-5%.
- رصد هذا الحيوان حتى أنه تم تخديره تماما، عادة خلال 1-2 دقيقة حتى فقد الوعي الحيوانات ينبغي أن لا تستجيب للمؤثرات الخارجية.
- إزالة هذا الحيوان أنيسثيتيزيد من الدائرة ووضع الحيوان في الكاسيت التصوير عن طريق وضع محول الرأس أولاً، متبوعاً بوضع الحيوان إلى الأسفل. تأكد من أن الرأس يقع في وسط الكاسيت.
- ضع اللوحة العلوية للكاسيت على أعلى وتشديد المقابض التكيف حتى 17 ملم.
- مرة واحدة أن الحيوان أمنا في الكاسيت التصوير، والمضي قدما لتصوير عن طريق إدراج الكاسيت في محطة الإرساء الداخلي لتصوير معاهدة المواد الانشطارية، حيث يتم ضخها في إيسوفلوراني للحفاظ على الحيوان تخديره.
- تشغيل برنامج تصوير ومحلل بالنقر المزدوج على أيقونة البرنامج.
- في الإطار "التبويب التجريبي"، حدد "قاعدة البيانات" و "دراسة مجموعة".
- الانتقال إلى الإطار "تفحص التبويب" وحدد الموضوع إلى صورة بواسطة النقر فوق "حدد الموضوع". أيضا، حدد القناة الليزر في لوحة "الليزر القناة". للخلايا المسماة FP635، حدد "الليزر قناة 635 نانومتر"، والخلايا المسماة FP720، حدد "قناة 680 نانومتر الليزر".
- الحصول على صورة بواسطة النقر فوق الخيار "التقاط" في إطار "التبويب المسح الضوئي". ثم ضبط مجال المسح الضوئي بالنقر والسحب ميدان المسح الضوئي في الصورة التي تم التقاطها لعدد محدد من مواقع المصدر، عادة في غضون 20-25 مصادر الجانب عن.
- التحقق من الخيار "إضافة إلى قائمة انتظار إعادة الإعمار" وضرب "مسح" في إطار "التبويب المسح الضوئي".
- الانتظار حتى الانتهاء من المسح الضوئي ثم قم بإزالة شريط التصوير من محطة الإرساء.
- إزالة الصفيحة العلوية للكاسيت وظهره الحيوانات في القفص.
- كرر الخطوات من 3.1-3.12 لبقية الحيوانات.
4. تحليل الصورة
- من تصوير ومحلل البرامج، حدد الإطار "التبويب تحليل".
- تحميل dataset وهذا الموضوع لتحليل بالنقر على زر "+" في لوحة "اختيار Dataset" النافذة "التبويب تحليل".
- بمجرد تم تحميل الصورة في نافذة "التبويب تحليل"، أداء المنطقة لتحليل الفائدة (ROI) بتحديد الرمز الاهليلجي، الموجود في الزاوية العلوية اليسرى من إطار "التبويب تحليل".
- ضبط عتبة الصفر في لوحة "البيانات الإحصائية" عن طريق النقر على الحق في العمود "العتبة" في إطار "التبويب تحليل".
- القيمة الإجمالية في لوحة "البيانات الإحصائية" يمثل الإشارة من الخلايا جليوبلاستوما معلم الفلورية مزروع في المخ الماوس.
- كرر الخطوات من 4، 4، 2-4 لبقية الحيوانات. تحميل أو إزالة موضوع جديد عن طريق النقر "+" أو الزر "−"، على التوالي، في لوحة "اختيار Dataset" النافذة "التبويب تحليل".
ملاحظة: لمزيد من المعلومات حول تصوير معاهدة المواد الانشطارية، وتشغيل البرامج، راجع20-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الخلايا جليوبلاستوما U87EGFRvIII كانت مثقف (الخلايا U87 الإفراط التعبير عن مستقبلات لو البديل الثالث) وفقا للخطوة 1.2. وأنتج lentivirus وتنقيتها طبقاً للخطوة 1، 1. تقرر تركيز الفيروسية التي p24 التحليل إليزا. وقد ترانسدوسيد الخلايا مع lentivirus تحمل البروتينات الفلورية الأشعة تحت الحمراء وفقا للخطوة 1.8. وقدم الدكتور ف. ف. فيرخوشا يرجى بلازميد ترميز FP72010،11 وناقلات FP635 تم شراؤها من مورد تجاري. الخلايا الهدف تم فرزها لإثراء لأعلى 10% نيون آخر خلية السكان (الشكل 1A) نظام مراقبة الأصول الميدانية. زيادة إشارة نيون يحسن حساسية نظام التصوير المقطعي الأسفار. للتحقق من صحة شدة إشارات الخلايا يسمى فلوريسسينتلي قبل غرس أورثوتوبيك، استخدمنا كاسيت الوهمية لتصوير معاهدة المواد الانشطارية. على وجه التحديد، تم فصل خلايا U87EGFRvIII-iRFP720 U87EGFRvIII-TurboFP635 ومع التربسين، و 1 × 105, 1 × 106، وحراكه في 100 ميليلتر من الجليد الباردة برنامج تلفزيوني، على التوالي 1 × 107 خلايا وتحليلها. تصوير FMT يسمح للكشف عن قنوات 4: 635 نانومتر، 680 نانومتر، 750 نانومتر، و 780 نانومتر. القنوات الأشعة تحت الحمراء الآن 750 نانومتر و 780 نانومتر ليست مناسبة لهذا التحليل لعدم وجود لا انبعاثات في هذه الأطوال الموجية من القرب من الأشعة تحت الحمراء الفلورسنت البروتينات المستخدمة (البيانات لا تظهر). ولذلك، قمنا بتحليل الإشارات الانبعاثات في 635 نانومتر و 680 نانومتر. ذكرت في الشكل 1، فلوري إشارة الصورة وكثافة التقدير الكمي لكلا FP635 (الشكل 1 باء، وجيم) و FP720 (الشكل 1، ﻫ)، مما يزيد من التناسب كما يزيد عدد الخلايا. مرئياً من المذكرة، الانبعاث ل FP635 في قناة 635 نانومتر ولكن ليس في القناة 680 نانومتر. على النقيض من ذلك، مرئياً الانبعاث ل FP720 في قناة 680 نانومتر ولكن ليس في القناة 635 نانومتر. وهذا يجعل هذه اثنين البروتينات الفلورية مرشح مناسب للدراسات حيث السكان اثنين من الخلايا يمكن أن توصف ومراقبتها في وقت واحد باستخدام اثنين قرب تسميات الفلورسنت الأشعة تحت الحمراء.
ثم استخدمت لحقن أورثوتوبيك و في فيفو رصد نمو ورم الخلايا U87EGFRvIII المسمى بالقرب من البروتينات الفلورية الأشعة تحت الحمراء، كما هو موضح في الخطوات 2.1-2.4. قمنا باستخدام الخلية السطر نفسه، أي، U87EGFRvIII، المسمى بواسطة العلامات الفلورية مختلفة، إلى استبعاد الورم النمو الفرق بين أنواع مختلفة من سرطان الخلية. تم حقن الفئران بخلايا U87EGFRvIII-TurboFP635، U87EGFRvIII-iRFP720 الخلايا أو مزيج متساو (1:1) لخطوط الخلية اثنين. إجمالي 5 × 105 خلايا بحجم 5 ميليلتر في برنامج تلفزيوني تم حقن إينتراكرانيالي 4-5 أسابيع القديمة الفئران athymic المناعة عارية باستخدام نظام المناظير باستخدام الأشعة وحقنه هاملتون، الخطوات التالية 2.3-2.4. وقد أنجز التخدير بالحقن داخل من الكيتامين/إكسيلازيني. كانت الحيوانات إبقاء الحارة في جميع أنحاء الحقن باستخدام لوحة حرارية المائية والتحقق من أي إشارات الاستغاثة. ثم راقب معاهدة المواد الانشطارية نظام تصوير الورم انجرافتمينت والنمو. خلال دورات المسح، تم مؤقتاً تخديره الفئران استخدام دائرة isoflurane 3% (خطوات 3.1 3.12). ثم توضع في كاسيت تصوير الفئران وتصويرها داخل ليزر المسح الكاميرا. كل الماوس تم مسحها ضوئياً باستخدام 635 نانومتر و 680 نانومتر القنوات. وسجلت إشارة التحديد الكمي على مر الزمن والفئران كانت euthanized في ظهور الأعراض العصبية، وفقا للمبادئ التوجيهية "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك). كما هو مبين في الشكل 2 أ، U87EGFRvIII-TurboFP635 الانبعاثات إشارة كان واضحا في القناة 635 نانومتر والإشارات الخلفية الحد الأدنى سجلت في قناة 680 نانومتر (الأرقام 2، ج). وفي المقابل، U87EGFRvIII-iRFP720 الخلايا تنبعث في قناة 680 نانومتر تظهر الخلفية قليلاً في قناة 635 نانومتر (2D الأرقام–و). وأخيراً، أظهرت الفئران حقن بخليط 1:1 U87EGFRvIII-TurboFP635 الخلايا والخلايا U87EGFRvIII-iRFP720 إشارة زيادة في كلتا القناتين طوال فترة التجربة (2 الأرقام–أنا). وتوضح هذه البيانات أن من الممكن الاستفادة من البروتينات الفلورية الأشعة تحت الحمراء للتصوير المزدوج في فيفو سرطان الخلية السكان. كما تشير البيانات إلى أن مختلف البروتينات الفلورية كثافة مختلفة في انبعاث إشارة. هنا، كانت كثافة إشارة FP720 متفوقة على FP635، مع زيادة الحساسية في الكشف عن السكان أصغر من الخلايا السرطانية في أجواء رصد غير الغازية.
يمكن أيضا أن تكون آثار إسكات الجينات الجينات المتصلة بالسرطان في توموريجينيسيتي في نماذج الإكلينيكية الدراسة مع هذا البروتوكول. لهذا الهدف، GBM-المجالات (GSC23 و GSC11) مثقف (الخطوة 1، 2) وترانسدوسيد مع FP720-لينتيفيروس (الخطوة 1.8). وكانت الزنزانات معربا عن FP720 نظام مراقبة الأصول الميدانية تم فرزها كما هو موضح مسبقاً في الخطوات 1، 1، 11-13. كانت الخلايا المسماة FP720 ترانسدوسيد المشترك مع ترميز lentivirus شرنا استهداف DAXX (شداكسكس)، أو مراقبة شرنا (شلوك) في وزارة الداخلية 516. كانت مثقف خلايا لمدة 5 أيام، فصل في تعليق خلية مفردة، وكانت حراكه 1 × 106 خلايا في 3 ميليلتر من برنامج تلفزيوني للحقن داخل الجمجمة. وأكد نجاعة شرنا استهداف DAXX النسخ العكسي الكمية تفاعل البوليميراز المتسلسل (RT-قبكر) في GSC23 (الشكل 3A) و GSC11 (الشكل 3). تم حقن الخلايا GBM-iRFP720/شرنا ستيريوتاكتيكالي المخطط للفئران العوز، وفقا للخطوات 2.3-2.4. الحيوانات لوحظت علامات عصبية وحللت إشارة fluorescence النسبي تكثيفها بنظام التصوير معاهدة المواد الانشطارية، كمياً باستخدام برمجيات التحليل، وفقا للخطوات 4، 3، 1-6. إظهار الصور التمثيلية لمعاهدة المواد الانشطارية إشارة fluorescence نقصان في الفئران انجرافتيد مع شداكسكس/GBM-المجالات بالمقارنة مع الحيوانات مزروع مع شكونترول (الشكل 3B و الشكل 2D) لكلا النموذجين ميادين الخليج للحاسبات الآلية، مما يؤكد لنا أن تقمع DAXX تثبيط نمو الورم في نماذج جليوبلاستوما الإكلينيكية الاستنتاج السابق16 .
رقم 1: المنحنيات القياسية باستخدام خلايا الوهمية ونظام مراقبة الأصول الميدانية التحليل. (أ) نظام مراقبة الأصول الميدانية الممثل رسوم بيانية من FP720--و FP635-U87EGFRvIII التعبير عن خلايا (اليسار واليمين الفريق، على التوالي). كانوا مصابين بالخلايا الدبقي lentivirus ترميز البروتينات الفلورية الأشعة تحت الحمراء وفرز فاسك لإثراء للتعبير أعلى من البروتينات FP720 أو FP635. الحصول على صور الممثل من تصوير ومحلل برامج U87EGFRvIII-TurboFP635 (ب) و U87EGFRvIII-iRFP720 (د) تعليق خلية استخدام الكاسيت الوهمية. لوحات العلوي تمثل الإشارة في لوحات القناة وأسفل نانومتر 635 في قناة 680 نانومتر. زيادة في الخلية عدد يساوي زيادة في التصور إشارة. إشارة التحديد الكمي ل U87EGFRvIII-TurboFP635 (ج) و (ه) U87EGFRvIII-iRFP720 الخلايا في 635 نانومتر و 680 نانومتر القنوات. تتم الإشارة إلى وحدات fluorescence النسبي في شريط اللون. تمثل أشرطة الخطأ S.E.M. من مسح مختلفة 3 كل تعليق خلية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: طراز xenograft ورم الدماغ باستخدام U87EGFRvIII الخلايا الملتقطة بالماسح الضوئي في قنوات مختلفة- صور الممثل لإشارة مضيئة في 635 نانومتر و 680 نانومتر القنوات من الحيوانات مزروع إينتراكرانيالي مع U87EGFRvIII-turboFP635 (A)، U87EGFRvIII-iRFP720 (د)، وتركيبة مزيج من U87EGFRvIII-iRFP720 (1:1): الخلايا U87EGFRvIII-turboFP635 (ز). الصور تم الحصول عليها في اليوم الخامس بعد المسح الأولى. (ب، ه، ح) إشارة كثافة الرصد لكل الماوس على مدى فترة 5 أيام. تم تفحص كل الماوس في قناة 635 نانومتر (أشرطة زرقاء) وفي قناة 635 نانومتر (أشرطة حمراء). لون الظل الأفتح من الشريط يمثل اليوم الأول من المسح الضوئي واحلك الظل يمثل يوم 5. (ج، و، أنا) الأسفار النسبي الكمي تظهر مقارنة مباشرة لكثافة إشارة من قناة 635 نانومتر (الأزرق) و 680 قناة نانومتر (أحمر) في فوج كامل من الفئران. تتم الإشارة إلى وحدات fluorescence النسبي في شريط اللون. إظهار بيانات القيم يعني باستخدام الانحراف المعياري من الحيوانات المختلفة 3. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: نماذج الجينات إسكات جليوبلاستوما السريرية في استخدام المواد الانشطارية- تحليل التعبير الجيني DAXX قبل RT-قبكر في GSC23 (A) و GSC11 (ج) الدبقي المستمدة من المريض خلايا ترانسدوسيد مع شرناس lentivirus ترميز استهداف DAXX (شداكسكس) أو شرنا التحكم (شلوك) و FP720. صور الممثل لإشارة الفلورسنت من 680 نانومتر قناة أورثوتوبيكالي انجرافتيد الفئران مزروع مع GSC23-iRFP720 (ب) والخلايا المستمدة من المريض GSC11-iRFP720 (د). ويلاحظ إشارة قوية fluorescence في الحيوانات مزروع مع شرنا التحكم (شلوك) (الجزء العلوي من لوحة) بالمقارنة مع الفئران مزروع مع شرنا-DAXX (شداكسكس) (الجزء السفلي من لوحة)، مما يشير إلى أن تثبيط DAXX يمنع الورم النمو في نماذج الدبقي الإكلينيكية يحدده fluorescence الجزيئية التصوير المقطعي. تتم الإشارة إلى وحدات fluorescence النسبي في شريط اللون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تكثيفها الورم وقد استخدمت على نطاق واسع في أبحاث السرطان، وقد تم وضع عدد من تقنيات التصوير الراسخة: BLI؛ الرنين المغناطيسي التصوير (التصوير بالرنين المغناطيسي)؛ بوزيترون التصوير المقطعي (PET)، حسبت التصوير المقطعي (CT)؛ معاهدة المواد الانشطارية. كل من هذه النهوج ويأتي مع إيجابيات وسلبيات، بل يكمل كل منهما الآخر في نهاية المطاف مع نوع المعلومات المقدمة. واحد الأكثر استخداماً في فيفو تكنولوجيا التصوير هو BLI5،6،،من78. BLI ومعاهدة المواد الانشطارية كلاهما يتطلب هندسة الخلية (مع لوسيفراس الإنزيمات أو البروتينات الفلورية الأشعة تحت الحمراء) التي يمكن أن تؤثر على التعبير الجيني. BLI هو أكثر حساسية للجماهير ورم صغير ولكن يتطلب الحقن داخل من الركازة (لوسيفرين)، الذي يصل إلى الحد الأقصى من التوزيع في الجسم في 10-12 دقيقة؛ ولكن الخفيفة تبريد ونثر أثناء التصوير اقتناء، وكثيراً ما تحدث إزالة الركيزة9. معاهدة المواد الانشطارية، وبدلاً من ذلك، لا تتطلب أي الإدارة الركيزة إضافية للحيوانات والإشارة به مستقرة ومستقلة عن الاستقرار الوقت أو الإنزيم. بالإضافة إلى ذلك، ومعاهدة المواد الانشطارية، عندما تستخدم في نفس الظروف التجريبية، يوفر البيانات شبه كمي استنساخه. BLI ومعاهدة المواد الانشطارية لا توفر القرار المكانية؛ ومع ذلك، اقتران هذه الأساليب مع الأشعة المقطعية عناوين هذه المسألة.
المقطعية تدابير التخفيف للفوتونات عند تقاطع الإشارة جسم الحيوان ومثالي في تحديد هياكل الجسم. ومع ذلك، قيد تباين الأنسجة اللينة، والتي قد تتداخل مع الكشف عن وجود ورم داخل الجمجمة الصغيرة، لهذا النهج17،18. عيب واحد إضافي للتصوير المقطعي هو استخدام الإشعاع ووسائل الإعلام على النقيض، التي يمكن أن تحفز التغيرات الجزيئية في الخلايا الهدف. المقطعية يمكن أن تكون جنبا إلى جنب مع الحيوانات الأليفة، التي تستخدم تتبع راديولابيليد مثل الجلوكوز التماثلية، فلوروديوكسيجلوكوسي 18وفدج؛ ولكن هذا أيضا يمكن أن تتداخل مع بعض العمليات الفسيولوجية في الحيوانات الصغيرة. وفي المقابل، معاهدة المواد الانشطارية لا تحتاج إلى أي حقن الركيزة لقياس الورم الجماهيري ومن الممكن قياس الأيض الورم والتهاب والأوعية، والمبرمج وعلامات أخرى باستخدام المؤشرات الحيوية المسماة فلوريسسينتلي19.
عموما هو أحد الأساليب الأكثر تنوعاً ومفيدة للتصوير في فيفو التصوير بالرنين المغناطيسي. يمكن الاطلاع على القيود البسيطة للتصوير بالرنين المغناطيسي في وقت اكتساب منخفض وأقل حساسية من الحيوانات الأليفة وبعض الاختلافات المتعلقة بالصك18،20.
هنا، نحن تقرير الأسلوب FMT كأسلوب بديل لنماذج جليوبلاستوما الإكلينيكية. يمكن وضع العلامات مسبقاً للخلايا المستهدفة بالبروتينات الفلورية الأشعة تحت الحمراء (الشكل 1A–ه) والمسح بعد زرع في الحيوانات المناعة مع نظام تصوير طبقي الأسفار. ونحن أفادت الأسلوب FMT كأسلوب بديل لنماذج جليوبلاستوما الإكلينيكية. مع هذا الأسلوب تصوير يتم تطبيقها بطريقة خالية من الركازة وغير الغازية وتربى الحيوانات في بيئة منخفضة إجهاد وأنسجة عميق التقدير الكمي يمكن أن يؤديها (الشكل 2A–أنا، الشكل 3 ألف، باء). يمكن تطبيق هذا البروتوكول على دراسة مدى فعالية العلاجات اندماجي في نماذج الدبقي الإكلينيكية21، لتحديد أهداف علاجية جديدة ل الأورام الدماغ16، والتحقيق الجديد جزيئات الأيض دروجابل22، مسارات جينية23، أو وكلاء العلاج الكيميائي الجديد في تركيبة مع العلاج الإشعاعي (بيانات غير منشورة)، وتطبق على غيرها من الدراسات الإكلينيكية. نقترح هنا أيضا الاستخدام لمعاهدة المواد الانشطارية مزدوج في فيفو التصوير النهج، عندما اثنين تتعايش، لكن مختلفة، ورم الخلايا السكان تهدف إلى تحليل.
بعض القيود مع معاهدة المواد الانشطارية يجب أن تؤخذ في الاعتبار، مثل السيارات-الأسفار المتولدة من بعض الأجهزة التي يمكن أن تتداخل مع الإشارات. على سبيل المثال، مورين الطحال والكبد تنبعث منها السيارات-الأسفار في قناة 680 نانومتر ولكن ليس على 635 نانومتر. ولذلك، يجب إجراء الإجراءات التجريبية ذات الصلة بمعاهدة المواد الانشطارية التي تنطوي على هذه الأجهزة باستخدام البروتينات الفلورية الأشعة تحت الحمراء الأخرى، مثل FP635. كنا عارية foxn1-تحور الفئران عارية لتجنب التدخل في تسجيل إشارة الأسفار؛ إذا كان يجب استخدام نموذج ماوس مختلفة، من المستحسن أن يحلق في مجال الاهتمام بالحيوانات. بالإضافة إلى ذلك، يقتصر هذا النهج أيضا في الكشف عن الجماهير ورم صغير جداً. في تجربتنا، يحسن نسبة الإشارة إلى الضوضاء كالورم كتلة يصبح أكبر، بعد قبل ظهور أي أعراض عصبية في الفئران. في الواقع، في التجارب السابقة التي أجريت على بدكسس أورثوتوبيكالي حقن، كنا قادرين على اكتشاف الأورام خلال نظام المخدرات لمدة أسبوعين على الأقل في الفئران دون أي بادرة للكرب بسبب ورم عبء أو المخدرات الإدارة21. في نهاية المطاف، سوف تحدد العدوانية لكل خط الخلية وعدد الخلايا حقن طول كل تجربة. وتظهر البيانات يتناسب مع علاقة خطية بين عدد من الخلايا والإشارات (الشكل 1B–ه)، والورم الشامل والإشارات (الشكل 2)؛ ولكن لا يمكن تطبيق ارتباط إشارات عامة بين الورم الشامل وعدد من الخلايا عبر خطوط الخلايا المختلفة والبروتينات الأشعة تحت الحمراء. يجب أن تحدد إشارة لكل تركيبة بروتين فلوري خط/الأشعة تحت الحمراء الخلية تجريبيا. وعلاوة على ذلك، الإشارات التي تم الحصول عليها من تحليل الخلايا باستخدام فانتوم (الشكل 1 باء، دال) لا تتوافق مع الإشارة من تكثيفها داخل الجمجمة كما يحدث توهين في إشارة سبب جمجمة الفأرة.
السماح تصوير ومحلل البرامج للعتبة. على الرغم من أننا لم تستخدم أي عتبة هنا، تفحص الحيوانات دون أي خلايا مزروع يعطي الضوضاء الخلفية التي تميل إلى القضاء بإعادة الإعمار في وجود إشارة حقيقية. عدد قليل من العوامل تؤثر على كثافة الإشارات إكسينوجرافت ويجب أن يوضع في الاعتبار: كل بروتين فلوري الأشعة تحت الحمراء بمختلف الانبعاثات الطيف وكثافة، مع FP720 كونها واحدة من البروتينات الفلورية الأكثر استخدامها تجريبيا10 ،11؛ كل خط الخلية يسمح بكمية وفيرة، ولكن محدودة، من إنتاج البروتين، وبالتالي التأثير على الأسفار القصوى التي يمكن الحصول عليها. وأخيراً، تصوير FMT هو الإعداد باستخدام المنحنيات القياسية الداخلية لمركبات محددة، ولذلك، من المهم النظر في المجمع الذي قد طيف انبعاث الأقرب للبروتين الفلورسنت الأشعة تحت الحمراء التي تستخدم لتسمية الخلايا. على الرغم من أن يسمح بشكل جيد، من المستحسن لتحديد الآثار السامة للخلايا توسط overexpression من8،البروتينات الأشعة تحت الحمراء9. وعلاوة على ذلك، نوصي باستخدام مجموعات فئران 8 على الأقل من كل مجموعة تجريبية، كما قد يحدث فقدان البيانات والفئران، بسبب العملية الجراحية أو تقلب في انجرافتمينت خلايا السرطان،؛ ومع ذلك، يضيف هذا دلالة إحصائية للدراسة. كما نوصي متسلسل تفحص الفوج الحيوان لأكثر من يوم واحد وتحليل الانبعاثات إشارة، في الوقت نفسه، منذ الاختلافات في عمق كاسيت التصوير والتعمير إشارة الفلورية قد تتداخل مع التقدير الكمي إشارة نهائية. لحل هذه المشكلة، البرنامج محلل يسمح لتغييرات طفيفة في كثافة الليزر (من الطبيعي أن عالية وعالية جداً)، على الرغم من أن النتيجة النهائية في تجربتنا ليست مختلفة إلى حد كبير. ملاحظة أخيرة واحدة فيما يتعلق بالفعالية من حيث التكلفة هو أن معاهدة المواد الانشطارية نظام التصوير يمكن تقاسمها بسهولة كأداة أساسية من بين المختبرات المختلفة، مما يساعد على تحمل تكاليفه شراء وصيانة. وفي الختام، هو معاهدة المواد الانشطارية موردا قيماً يجعل التقييم التجريبي والسريري في فيفو نمو الورم سهلة ويمكن الاعتماد عليها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب يعلن لا تضارب المصالح.
Acknowledgments
ونحن نشكر الدكتور فريدريك لانغ، MD مركز أندرسون للسرطان للخليج للحاسبات الآلية-PDX نيوروسفيريس. وأيده هذا العمل "هزيمة GBM البحوث التعاونية"، تابعة "الدماغ ورم في المجتمع الوطني" (فرانك فورناري)، R01-NS080939 (فرانك فورناري)، مؤسسة ماكدونيل. س. جيمس (فرانك فورناري)؛ وأيده خورخي بينيتيز تحكيم من أمريكا الدماغ ورم رابطة (حلقات)؛ وأيد زانكا سيرو جزئيا زمالة بحثية ما بعد الدكتوراه "مؤسسة مكافحة السرطان" الأمريكية-الإيطالية. فرانك فورناري يتلقى المرتبات وتوفير دعم إضافي من معهد لودفيج "أبحاث السرطان".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/High Glucose | HyClone/GE | SH30022.1 | |
| DMEM/F12 1:1 | Gibco | 11320-082 | |
| FBS | HyClone/GE | SH30071.03 | |
| Accutase | Innovative cell technologies | AT-104 | |
| Trypsin | HyClone/GE | SH30236.01 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504044 | |
| human recombinant EGF | Stemcell Technologies | 2633 | |
| human recombinant FGF | Stemcell Technologies | 2634 | |
| DPBS | Corning | 21-031-00 | |
| FACS tubes | Falcon | 352235 | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
| Blasticidin | ThermoFisher Scientific | A1113903 | |
| p24 ELISA | Clontech | 632200 | |
| Xylazine | Akorn | NDC 59399-110-20 | |
| Ketamine | Zoetis | NADA 043-403 | Controlled substance |
| Ointment | Dechron | NDC 17033-211-38 | |
| Absorbable suture | CpMedical | VQ392 | |
| 5 ul syringe | Hamilton | 26200-U | Catalog number as sold by Sigma-Aldrich |
| Cell Sorter | Sony | SH8007 | |
| Mouse stereotaxic frame | Stoelting | 51730 | |
| Motorized stereotaxic injector | Stoelting | 53311 | |
| Micromotor hand-held drill | Foredom | K1070 | |
| Mouse warming pad | Ken Scientific Corporation | TP-22G | |
| Fluorescence Tomography System | PerkinElmer | FMT 2500 XL | |
| TrueQuant Imaging Software | Perkin Elmer | 7005319 | |
| Ultra-centrifuge Optima L-80 XP | Beckman Coulter | 392049 | |
| Tissue Culture 100mm Dishes | Olympus Plastics | 25-202 | |
| Tissue Culture 150mm Dishes | Olympus Plastics | 25-203 | |
| Tissue Culture Flasks T75 | Corning | 430720U | |
| 50 mL conical tubes | Corning | 430290 | |
| 15 mL conical tubes | Olympus Plastics | 28-101 | |
| Centrifuge Avanti J-20 | Beckman Coulter | J320XP-IM-5 | |
| Tube, Polypropylene, Thinwall, 5.0 mL | Beckman Coulter | 326819 | |
| Tube, Thinwall, Polypropylene, 38.5 mL, 25 x 89 mm | Beckman Coulter | 326823 | |
| Athymic nude mice | Charles River Laboratories | Strain Code 490 (Homozygous) | Prior approval by the Institutional Animal Care Program and by the Institutional Biosafety Committee required. |
References
- Ostrom, Q. T., et al. CBTRUS Statistical Report: Primary Brain and Other Central Nervous System Tumors Diagnosed in the United States in 2009-2013. Neuro-Oncology. 18 (suppl_5), v1-v75 (2016).
- Pauli, C., et al. Personalized In Vitro and In Vivo Cancer Models to Guide Precision Medicine. Cancer Discovery. 7 (5), 462-477 (2017).
- Stewart, E. L., et al. Clinical Utility of Patient-Derived Xenografts to Determine Biomarkers of Prognosis and Map Resistance Pathways in EGFR-Mutant Lung Adenocarcinoma. Journal of Clinical Oncology. 33 (22), 2472-2480 (2015).
- Gao, H., et al. High-throughput screening using patient-derived tumor xenografts to predict clinical trial drug response. Nat Med. 21 (11), 1318-1325 (2015).
- Ozawa, T., James, C. D. Establishing Intracranial Brain Tumor Xenografts With Subsequent Analysis of Tumor Growth and Response to Therapy using Bioluminescence Imaging. J. Vis. Exp. (41), e1986 (2010).
- Kondo, A., et al. An experimental brainstem tumor model using in vivo bioluminescence imaging in rat. Child's Nervous System. 25 (5), 527-533 (2009).
- Nyati, S., Young, G., Ross, B. D., Rehemtulla, A. ATM Kinase: Methods and Protocols. Kozlov, S. V. , Springer. New York. 97-111 (2017).
- Kondo, A., et al. Longitudinal assessment of regional directed delivery in a rodent malignant glioma model. J Neurosurg Pediatr. 4 (6), 592-598 (2009).
- Badr, C. E. Bioluminescent Imaging: Methods and Protocols. Badr, C. E. , Humana Press. 1-18 (2014).
- Shcherbakova, D. M., Verkhusha, V. V. Near-infrared fluorescent proteins for multicolor in vivo imaging. Nat Meth. 10 (8), 751-754 (2013).
- Filonov, G. S., et al. Bright and stable near-infrared fluorescent protein for in vivo imaging. Nat Biotech. 29 (8), 757-761 (2011).
- Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. Production and purification of lentiviral vectors. Nat. Protocols. 1 (1), 241-245 (2006).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). J. Vis. Exp. (41), e1546 (2010).
- Pritchett-Corning, K. R., Luo, Y., Mulder, G. B., White, W. J. Principles of rodent surgery for the new surgeon. J Vis Exp. (47), (2011).
- Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nat. Protocols. 1 (6), 3166-3173 (2007).
- Benitez, J. A., et al. PTEN regulates glioblastoma oncogenesis through chromatin-associated complexes of DAXX and histone H3.3. Nature Communications. 8, 15223 (2017).
- Kirschner, S., et al. Imaging of Orthotopic Glioblastoma Xenografts in Mice Using a Clinical CT Scanner: Comparison with Micro-CT and Histology. PLOS ONE. 11 (11), e0165994 (2016).
- Mannheim, J. G., et al. Standardization of Small Animal Imaging-Current Status and Future Prospects. Molecular Imaging and Biology. , (2017).
- Engblom, C., et al. Osteoblasts remotely supply lung tumors with cancer-promoting SiglecFhigh neutrophils. Science. 358 (6367), (2017).
- Lauber, D. T., et al. State of the art in vivo imaging techniques for laboratory animals. Laboratory Animals. 51 (5), 465-478 (2017).
- Zanca, C., et al. Glioblastoma cellular cross-talk converges on NF-κB to attenuate EGFR inhibitor sensitivity. Genes & Development. 31 (12), 1212-1227 (2017).
- Villa, G. R., et al. An LXR-Cholesterol Axis Creates a Metabolic Co-Dependency for Brain Cancers. Cancer Cell. 30 (5), 683-693 (2016).
- Liu, F., et al. EGFR Mutation Promotes Glioblastoma through Epigenome and Transcription Factor Network Remodeling. Molecular Cell. 60 (2), 307-318 (2015).
