Summary
原位颅内注射肿瘤细胞已用于癌症研究, 研究脑肿瘤生物学, 进展, 进化和治疗反应。本文提出了肿瘤移植的荧光分子层析成像技术, 为临床前的胶质瘤模型提供了实时活体成像和肿瘤质量定量。
Abstract
致瘤性是癌细胞形成肿瘤肿块的能力。一种广泛使用的方法来确定细胞是否是癌变是通过注射 immunodeficient 小鼠皮下肿瘤细胞和测量肿瘤肿块后, 它变得可见和明显。原位注射癌细胞的目的是在微环境中引入异种异体, 最接近于所研究的肿瘤起源组织。脑癌研究需要颅内注射癌细胞, 以使肿瘤形成和分析在独特的微环境中的大脑。颅内移植的体内成像能瞬间监测原位嫁接小鼠的肿瘤质量。在这里, 我们报告的使用荧光分子层析成像 (裂变材料) 的脑肿瘤移植。癌细胞首先转基因近红外荧光蛋白, 然后注入免疫缺陷小鼠的大脑。然后对这些动物进行扫描, 以便在较长的时间内获得肿瘤肿块的定量信息。细胞预标记允许对每只老鼠的肿瘤负担进行有效、可重复和可靠的定量。我们消除了注射成像基质的需要, 从而减少了对动物的压力。这种方法的局限性表现为无法检测到非常小的质量;但是, 它比其他技术更能解决较大的质量问题。可用于评价胶质瘤细胞系和患者源性样品的药物治疗或基因改变的疗效。
Introduction
癌症是工业化世界人类疾病相关死亡的主要原因之一。由于死亡人数极高, 迫切需要新的治疗方法。胶质瘤多形性 (肾小球) 是一种极其致命的脑癌类型, 由脑肿瘤、基质和免疫细胞的异质群组成。根据美国中央脑肿瘤登记处的数据, 原发性恶性和非恶性脑肿瘤的发病率约为 10万, 约为22例。大约1.1万新的案件预计将被诊断在美国在 2017年1。
前临床研究调查的可能性, 药物, 程序, 或治疗是有效的之前, 在人类的测试。临床前研究的最早的实验室步骤之一是通过植入宿主生物体中的癌细胞来确定药物治疗的潜在分子靶点, 定义为人移植模型。在此背景下, 利用患者源性异体移植 (PDXs) 的颅内脑肿瘤移植模型已被广泛应用于研究脑肿瘤生物学、进展、进化和治疗反应, 最近对生物标志物的开发、药物筛选和个性化医学2,3,4。
最负担得起和无侵入性的体内成像方法之一监测颅内移植是生物发光成像 (BLI)5,6,7,8。然而, 一些 BLI 限制包括基质的管理和可用性, 酶的稳定性, 和光淬火和散射在成像采集9。在这里, 我们报告红外裂变材料作为一种替代成像方法, 以监测前胶质瘤模型。在这种方法中, intracranially 植入 PDXs 的信号采集和量化, 表达近红外荧光蛋白 iRFP72010,11 (从今以后称为 FP720) 或 turboFP635 (从今以后称为 FP635),是用裂变材料成像系统执行的。使用裂变材料技术, 可以在治疗前、期间或之后以无创性、无基质和定量的方式监测原位肿瘤的体内。
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Protocol
使用实验研究动物和传染性药物, 如慢病毒北疆传感器癌细胞, 需要得到机构动物保育计划和机构生物安全委员会的事先批准。本议定书遵循加州大学圣地亚哥 (UCSD) 的动物保育指南。
1. FP635 或 FP720 结构对胶质瘤细胞的标记
- 根据 Tiscornia et描述的协议生成和纯化慢病毒北疆。12
- 培养大约 2.0 x 106细胞从人胶质瘤细胞线与 DMEM 加上10% 胎牛血清 (血清) 在 15 cm 盘;或文化 2.0 x 106人胶质瘤患者衍生 (肾小球-PDX) 球体与 DMEM/F12 1:1 培养基与 B27 补充和人类重组表皮生长因子 (EGF; 20 ng/毫升) 和在 T75 烧瓶 (10 ng/毫升)。
- 保持37°c、5% CO2和100% 相对湿度的所有单元格。
- 分离细胞。
- 对于胶质瘤细胞: 从盘子中取出上清, 并在胶质瘤细胞中加入3-5 毫升的胰蛋白酶1X。
- 对于肾小球球: 通过将细胞吹打成15毫升管来收集细胞。
- 在室温下使用台式离心机, 在 200 x g 处旋转球膜球体, 5 分钟。
- 取出上清液并添加3-5 毫升的细胞脱离溶液。
- 孵化所有细胞在37°c 10-15 分钟。
- 通过多次吹打, 仔细地分离细胞 (确保球体和胶质瘤细胞分离完成), 并在 200 x g 处旋转5分钟。
- 取出上清液, 用5毫升培养基并用重悬细胞, 吹打数次。用台盼蓝排除法确定细胞的生存能力。
- 板 1.0 x 106的目标细胞在 10 cm 盘与5毫升培养基由吹打。
- 传感器细胞与慢病毒北疆表达荧光蛋白在多重感染 (语言) 5 如所述的Tiscornia et。12并孵育37摄氏度。
- 24小时后, 将培养基从转基因细胞中取出, 加入5毫升新鲜培养基, 再孵育48小时37摄氏度。
- 将受感染细胞与步骤 1.4-1.6 所述的单细胞悬浮液分离。在500µL 的分类溶液 (磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 和1% 的血清) 下, 在 200 x g 的细胞上旋转5分钟和并用重悬。
- 将细胞悬浮液注入到外地管里。用1µL/毫升 4 ', 6-diamidino 2-苯基吲哚 (DAPI) 二盐酸盐对细胞进行染色, 排除死细胞。需要负控制来设置流式细胞仪门 (非转基因和非转基因细胞/DAPI 染色)。
- 将荧光阳性/DAPI 阴性细胞归类为排序解决方案, 如巴苏et所述。13, 并将已排序的单元格收集到15毫升圆锥管中。
- 以 200 x g 为5分钟, 将已排列的细胞向下旋转, 移除上清, 并在5毫升培养基中并用重悬。用吹打将10厘米的盘子中排列的细胞播种。孵育37摄氏度至少48-72 小时。
- 通过游离步骤 1.4-1.6 中的单元格并将其电镀到体内实验中的多个菜肴中, 展开已排序的单元格。
注: 有关细胞分类准备和纯化的详细信息, 请参阅巴苏et 。13
2. 颅内注射 iRFP 标记的胶质瘤细胞为 Immunodeficient 小鼠
注意: 在开始手术前, 要确保手术室和工具都是干净的。使用 immunodeficient 裸裸 (Foxn1女) 雄性或雌性小鼠, 介于4-5 周大和17-19 克颅内注射。动物应该被安置在至少3天在到达和在手术之前。
- 细胞制剂
- 将荧光阳性胶质瘤细胞分为单细胞悬浮 (步骤 1.4-1.6) 和并用重悬0.5 或 1.0 x10 6 细胞, 每个动物每次注射µL 的 PBS。将细胞悬浮液注入1.5 毫升的离心管并放置在冰上。
- 麻醉准备与管理
- 准备200µL 含氯胺酮 (100 毫克/千克) 和甲苯噻嗪 (10 毫克/千克) 每20克小鼠体重的盐水溶液。权衡动物, 计算适当的麻醉剂量。
- 提供腹腔注射麻醉, 并将眼膏应用于眼部, 以防止脱水。有关此步骤的详细信息, 请参阅凯瑟琳et 。14将动物放在预热的水热垫上37摄氏度。
- 检查动物是否被麻醉通过监测脚趾捏反应 (踏板反射), 通常在5-10 分钟以内。
- 颅内注射
- 加载一个5µL 汉密尔顿注射器 (钝尖针) 与细胞悬浮和安装在探头持有人。
- 将鼠标放在一个小动物立体定向的框架中, 并用耳棒和门牙适配器在描述的细节上塞金et . 来修复头部。15
- 用70% 乙醇和 betadine 溶液对头部进行消毒。确保手术部位完全不育。用小手术刀进行中间切口, 分离皮肤和结缔组织。
- 使用机器人将哈密尔顿注射器放在 bregma 点上。
- 移动探头支架1.0 毫米前后和2.0 毫米侧面从 bregma 点。用铅笔标记这个位置。
- 在这个位置, 小心地用微电机手持钻头在头骨上打一个洞, 将轻微的压力向下, 直到血管变得可见。不要扰乱蛛网膜和脑实质。
- 将针引入毛刺孔中, 并在脑膜表面下向前3.0 毫米。
- 使用电动立体定向喷油器设置体积 (2-5 µL) 和流速 (1 µL/分钟), 或手动执行注射。
- 注射后, 用1.0 毫米每1分钟提升针, 并用70% 乙醇清洗注射部位。
- 用手术钉或做外科缝合 (通常称为针), 并看到凯瑟琳et 等, 关闭皮肤伤口。14了解更多详细信息。
- 动物恢复
- 将动物转移到水热垫 (37 °c), 并监测体温, 呼吸率和心率, 直到完全恢复。管理每标准协议的镇痛。
注: 有关立体定向过程、手术和坐标的详细信息, 请参阅其他报告5,14,15。
- 将动物转移到水热垫 (37 °c), 并监测体温, 呼吸率和心率, 直到完全恢复。管理每标准协议的镇痛。
3. 裂变材料成像
注: 根据实验目的, 在治疗之前、期间或之后, 可对 iRFP 标记的胶质瘤细胞进行体内监测。为了成像目的, 麻醉动物使用异氟醚感应腔, 在扫描过程中保持成像盒, 以及在裂变材料成像仪的坞站中的图像。
- 将动物从笼中移除并放置在异氟醚感应腔内。关闭会议厅, 并打开氧气流量和蒸发器到3-5%。
- 监视动物, 直到它完全被麻醉, 通常在1-2 分钟以内. 无意识的动物不应该对外部刺激做出反应。
- 把被麻醉的动物从房间里取出, 把动物放在成像盒里, 首先放置头部适配器, 然后将动物朝下。确保头部位于卡带中心。
- 将卡带的顶部板放在顶部, 拧紧调整旋钮直到17毫米。
- 一旦这种动物在成像盒中是安全的, 就进行成像, 将卡带插入到裂变材料成像仪的内部坞站, 在那里泵浦异氟醚, 以保持动物麻醉。
- 通过双击软件图标来运行成像器和分析器软件。
- 在 "实验选项卡" 窗口中, 选择 "数据库" 和 "学习组"。
- 转到 "扫描选项卡" 窗口, 然后单击 "选择主题", 选择要查看的主题。另外, 在 "激光通道" 面板中选择激光通道。对于 FP635-labeled 细胞, 选择 "激光通道 635 nm", 并为 FP720-labeled 细胞, 选择 "激光通道 680 nm"。
- 通过单击 "扫描选项卡" 窗口中的 "捕获" 选项获取图像。然后, 通过单击并将捕获图像中的扫描字段拖动到确定数量的源位置 (通常在同侧侧的20-25 个来源) 中, 调整扫描字段。
- 检查 "添加到重建队列" 选项并在 "扫描选项卡" 窗口中命中 "扫描"。
- 等待扫描完成, 然后从坞站中取出成像磁带。
- 取下卡带的顶部板, 把动物放回笼子里。
- 对其余的动物重复步骤 3.1-3.12。
4. 图像分析
- 从图像和分析器软件中, 选择 "分析选项卡" 窗口。
- 通过单击 "分析选项卡" 窗口中 "数据集选择" 面板中的 "+" 按钮, 加载数据集和要分析的主题。
- 在 "分析选项卡" 窗口中加载图像后, 通过选择位于 "分析选项卡" 窗口左上角的椭圆形图标来执行感兴趣区域 (ROI) 分析。
- 在 "统计数据" 面板中, 右键单击 "分析选项卡" 窗口中的 "阈值" 列, 将阈值调整为零。
- "统计数据" 面板中的总值代表了植入小鼠大脑的荧光标签胶质瘤细胞的信号。
- 对其余的动物重复步骤 4.2-4.4。在 "分析选项卡" 窗口的 "数据集选择" 面板中, 分别单击 "+" 或 "−" 按钮, 加载或删除新主题。
注: 有关裂变材料成像和软件操作的详细信息, 请参阅20.
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Representative Results
根据步骤 1.2, 对胶质瘤细胞 U87EGFRvIII (U87 细胞表达表皮生长因子受体变体 III) 进行了培养。慢病毒北疆是根据步骤1.1 生产和纯化的。p24 ELISA 法测定病毒浓度。细胞转基因与慢病毒北疆携带红外荧光蛋白根据步骤1.8。俄罗斯联邦普京 Verkhusha 博士亲切地提供了 FP720 10、11的质粒编码, FP635 向量是从商业供应商那里购买的.目标单元格进行了分类, 以丰富最前10% 个荧光细胞的数量 (图 1A)。增加荧光信号可以提高荧光层析成像系统的灵敏度。为了验证原位植入前荧光标记细胞信号的强度, 我们使用了裂变材料成像仪的幻盒。具体地说, U87EGFRvIII-TurboFP635 和 U87EGFRvIII-iRFP720 细胞与胰蛋白酶分离, 1 x 105, 1 x 106, 1 x 107细胞分别悬浮在100µL 的冰寒 PBS 中, 并进行分析。该裂变材料成像仪允许在4通道中检测: 635 nm、680 nm、750 nm 和 780 nm。远红外线通道750毫微米和780毫微米不适合这个分析, 因为没有发射在这样波长从使用的近红外线荧光蛋白 (数据没有显示)。因此, 我们分析了 635 nm 和 680 nm 的发射信号。在图 1中报告, FP635 的荧光信号图像和强度量化 (图 1B, C) 和 FP720 (图 1D, E), 随着单元格数的增加, 比例会随之增加。值得注意的是, FP635 的发射是在 635 nm 通道中可见的, 而不是在 680 nm 通道中。与此相反, FP720 的发射是在 680 nm 通道中可见的, 而不是在 635 nm 通道中。这使得这两种候选荧光蛋白适合于研究两个细胞群可以同时使用两个近红外荧光标签进行标记和监测。
U87EGFRvIII 细胞用近红外荧光蛋白标记, 然后用于原位注射和体内肿瘤生长监测, 如步骤 2.1-2.4 所述。我们使用相同的细胞线,即, U87EGFRvIII, 标记不同的荧光标记, 以排除肿瘤生长差异不同的癌细胞类型。小鼠注射 U87EGFRvIII-TurboFP635 细胞, U87EGFRvIII-iRFP720 细胞, 或相同的组合 (1:1) 的两个细胞系。5 x 105细胞在一个5µL 容量的 PBS 被注射 intracranially 入4-5 星期老免疫缺陷裸裸鼠使用立体定向系统和哈密尔顿注射器, 在步骤 2.3-2.4 以后。麻醉是通过腹腔注射氯胺酮/甲苯噻嗪完成的。这些动物使用水热垫在注射过程中保持温暖, 并检查是否有任何遇险迹象。肿瘤植入和生长由裂变材料成像系统监测。在扫描期间, 小鼠被暂时麻醉使用3% 异氟醚室 (步骤 3.1-3.12)。这些小鼠被放置在成像盒中, 并在激光扫描相机内成像。每只老鼠使用 635 nm 和 680 nm 通道进行扫描。根据机构动物保育和使用委员会 (IACUC) 的指导方针, 随着时间的推移, 信号量化被记录下来, 在神经系统症状出现时, 老鼠被安乐死。如图 2A所示, U87EGFRvIII-TurboFP635 发射信号在 635 nm 通道中很明显, 在 680 nm 通道中记录了最小的背景信号 (图 2B, C)。相比之下, 在 680 nm 通道中发出的 U87EGFRvIII-iRFP720 单元格在 635 nm 通道中显示的背景很少 (图 2DF)。最后, 注射1:1 混合 U87EGFRvIII-TurboFP635 细胞和 U87EGFRvIII-iRFP720 细胞的小鼠在实验持续时间 (图 2GI) 中显示了两个通道中的信号增加。这些数据表明, 有可能利用红外荧光蛋白的双重在体内成像的癌细胞群。数据还表明, 不同的荧光蛋白在其信号发射中具有不同的强度。在这里, FP720 信号强度优于 FP635, 在非侵入性监测环境中, 在检测癌细胞的小种群方面具有更高的灵敏度。
本协议还可以研究癌症相关基因对致瘤性的基因沉默对临床前期模型的影响。为此目的, GSC23 和 GSC11 培养 (步骤 1.2) 和转基因与 FP720-lentivirus (步骤 1.8)。表达 FP720 的单元格将按照前面步骤 1.11-1. 13 中的描述进行分类。FP720-labeled 细胞转基因与慢病毒北疆编码 shRNA 目标 DAXX (shDaxx) 或 shRNA 控制 (shLuc) 在语言516。细胞培养5天, 分离成单个细胞悬浮, 1 x 106细胞被悬浮在3µL 的 PBS 用于颅内注射。GSC23 (图 3A) 和 GSC11 (图 3C) 中的反向转录定量聚合酶链反应 (RT-qPCR) 证实了 shRNA 靶向 DAXX 的有效性。GBM-iRFP720/shRNA 细胞被 stereotactically 注射到 immunodeficient 小鼠纹状体中, 根据步骤 2.3-2.4。根据步骤 3.1-4.6, 对动物进行了神经系统体征观察, 用裂变材料成像系统对移植物的相对荧光信号进行了定量分析。具有代表性的裂变材料图象显示了小鼠嫁接的荧光信号, shDAXX/肾小球与植入 shControl (图 3B和 图 2D) 的动物相比, 这两种方法都能证实我们的上一个查找16 , DAXX抑制压抑肿瘤生长的临床前胶质瘤模型。
图 1: 使用单元格进行幻像和资产管制分析的标准曲线.(A) 代表 FP720 和 FP635-U87EGFRvIII 表达单元格 (分别为左和右面板) 的有代表性的流式图。胶质瘤细胞感染慢病毒北疆编码红外荧光蛋白和 FASC 排序, 以丰富的 FP720 或 FP635 蛋白的最高表达。由 U87EGFRvIII-TurboFP635 (B) 和 U87EGFRvIII-iRFP720 (D) 的图像和分析器软件获得的具有代表性的映像, 使用幻像盒。上部板代表信号在635毫微米渠道和底部板在680毫微米渠道。细胞数的增加对应于信号可视化的增加。635 nm 和 680 nm 通道中的 U87EGFRvIII-TurboFP635 (C) 和 U87EGFRvIII-iRFP720 (E) 单元的信号量化。在颜色条中指示相对荧光单位。误差线表示每个单元格悬浮3不同扫描的 S.E.M.。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 使用不同通道扫描的 U87EGFRvIII 细胞进行脑肿瘤移植模型.635 nm 和 680 nm 通道中的荧光信号的代表性图像 intracranially 植入 U87EGFRvIII-turboFP635 (A)、U87EGFRvIII-iRFP720 (D) 和 U87EGFRvIII-iRFP720 的混合组合 (1:1):U87EGFRvIII-turboFP635 单元格 (G)。图像是在5天第一次扫描后获得的。(B、 E、 H)5天内每只鼠标的信号强度监测。在 635 nm 通道 (蓝色条) 和 635 nm 通道 (红色条) 中扫描了每个鼠标。酒吧颜色的最轻的阴影代表扫描的天1和最黑暗的阴影代表天5。(C、 F、 I)相对荧光定量显示了从 635 nm 通道 (蓝色) 和 680 nm 通道 (红色) 的信号强度直接比较在整个队列的小鼠。在颜色条中指示相对荧光单位。数据显示的平均值与标准偏差从3种不同的动物。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 使用裂变材料的前胶质瘤模型中的基因沉默.DAXX的基因表达分析通过 RT qPCR 在 GSC23 (A) 和 GSC11 (C) 胶质瘤患者派生细胞转基因慢病毒北疆编码 shRNAs 目标 DAXX (shDaxx) 或 shRNA 控制 (shLuc) 和 FP720。由 GSC23-iRFP720 (B) 和 GSC11-iRFP720 (D) 患者派生的细胞中植入的原位嫁接小鼠 680 nm 通道中的荧光信号的代表性图像。在 shRNA 控制 (shLuc) (面板的顶部) 植入的动物与 shRNA DAXX (shDaxx) (面板的下部) 进行比较时, 观察到强荧光信号, 表明DAXX抑制抑制肿瘤用荧光分子层析法测定临床前胶质瘤模型的生长。在颜色条中指示相对荧光单位。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
肿瘤移植已被广泛应用于癌症研究中, 已经建立了一些成熟的成像技术: BLI;磁共振成像 (MRI);正电子发射层析成像 (PET), 计算机断层扫描 (CT);Fmt。每种方法都有利弊, 但最终会与提供的信息类型相辅相成。最常用的体内成像技术之一是 BLI5,6,7,8。BLI 和裂变材料条约都要求细胞工程 (与荧光素酶或红外荧光蛋白), 可以影响基因表达。BLI 对小肿瘤肿块更敏感, 但需要腹腔注射基质 (荧光素), 在10-12 分钟内达到体内最大分布;但在成像采集过程中的光淬火和散射, 以及衬底间隙经常发生9。相反, 禁产条约不要求对动物有任何额外的基质管理, 其信号稳定, 不依赖时间或酶的稳定性。此外, 在相同实验条件下使用的裂变材料, 提供可重现的半定量数据。BLI 和裂变材料不提供空间分辨率;然而, 将这些方法与 CT 扫描相结合解决了这个问题。
CT 扫描测量光子的衰减, 当它的信号穿过动物的身体, 它是理想的识别身体结构。然而, 软组织对比, 这可能会干扰检测小颅内肿瘤, 是一个限制此方法17,18。CT 的另一个缺点是使用辐射和造影剂, 这会诱发靶细胞的分子变化。CT 扫描可以与 PET 结合使用核素示踪剂, 如葡萄糖模拟剂, 氟脱氧葡萄糖18 F 葡萄糖;但这也会干扰小动物的一些生理过程。相比之下, 禁产裂变材料不需要任何注射基质来测量肿瘤肿块, 并且有可能用荧光标记的生物标记19来测量肿瘤的代谢、炎症、血管生成、凋亡和其他标记物。
总体而言,体内成像中最有用和最通用的技术之一是 MRI。MRI 的微小局限性可以在采集时间低、灵敏度比 PET 低、某些与仪器相关的变体18、20中找到。
在这里, 我们报告的裂变材料的方法作为一个替代方法的前胶质瘤模型。使用红外荧光蛋白 (图 1A-E) 对目标细胞进行预标记, 并通过荧光层析成像系统实现对免疫缺陷动物的扫描后植入。我们将裂变材料的方法作为临床前胶质瘤模型的替代方法。这种方法以无基底和非侵入性的方式应用, 动物被保存在低应力环境中, 可以进行深度组织量化 (图 2AI,图 3A, B)。本协议可用于研究临床前胶质瘤模型的组合治疗的有效性21, 以确定新的治疗靶点为脑肿瘤16, 并调查新的 druggable 代谢分子22,表观遗传学路径23, 或新的化疗药物结合放疗 (未发表的数据), 并应用于其他临床前研究。我们还建议在这里使用裂变材料条约作为一种双体内成像方法, 当两个共存的, 但不同的肿瘤细胞群体被用来分析。
一些限制与裂变材料条约必须考虑, 如自动荧光产生的一些器官, 可能干扰信号。例如, 小鼠脾脏和肝脏在 680 nm 通道中发出自动荧光, 但不在 635 nm。因此, 涉及这些器官的与裂变材料相关的实验程序必须使用其他红外荧光蛋白, 如 FP635。我们使用裸的foxn1突变裸鼠, 以避免干扰荧光信号记录;如果必须使用不同的鼠标模型, 建议将动物的兴趣区域剃去。此外, 这种方法也限制在检测非常小的肿瘤肿块。根据我们的经验, 信噪比随着肿瘤质量的增大而提高, 但在小鼠出现任何神经症状之前。事实上, 在先前对原位注射 PDXs 进行的实验中, 我们能够在药物治疗中检测出至少2周的小鼠肿瘤, 没有任何因肿瘤负担或药物管理而引起的窘迫迹象21。最终, 每个细胞线的攻击性和注入细胞的数量将决定每个实验的长度。数据显示单元数和信号之间的线性比例关系 (图 1BE), 以及肿瘤质量和信号 (图 2);但肿瘤质量与细胞数量之间的一般信号相关性不能应用于不同的细胞系和红外蛋白。每个细胞线/红外荧光蛋白组合的信号必须有经验的确定。此外, 使用幻像分析所获得的信号 (图 1B, D) 与颅内移植的信号不对应, 因为由于老鼠的头骨而导致信号的衰减。
成像仪和分析仪软件可以进行阈值化。虽然我们没有使用任何阈值在这里, 扫描动物没有任何植入细胞提供的背景噪音, 往往是消除重建在存在一个真正的信号。一些因素影响了异种异体的信号强度, 必须考虑到: 每种红外荧光蛋白具有不同的发射光谱和强度, FP720 是实验中使用最多的荧光蛋白之一10 ,11;每个细胞线允许大量的, 但有限的, 数量的蛋白质生产, 从而影响最大荧光可获得。最后, 裂变材料成像仪是为特定化合物的内部标准曲线设置的, 因此, 考虑哪个化合物与用于标记细胞的红外荧光蛋白具有最接近的发射光谱是很重要的。尽管耐受性良好, 但建议通过红外蛋白的过度表达8、9来确定潜在的细胞毒性效应。此外, 我们建议使用至少8个实验组的小鼠群, 因为由于手术过程或癌细胞植入的变异性, 数据和小鼠的丢失可能会发生;然而, 这增加了统计学意义的研究。我们还建议对动物队列连续扫描一天以上, 同时分析信号的发射, 因为成像盒深度和荧光信号重建的变化可能会干扰最终的信号量化。为了解决这个问题, 分析仪软件允许激光强度的轻微变化 (从正常到高和非常高), 虽然在我们的经验, 最终结果是没有显著的不同。关于成本效益的最后一个说明是, 裂变材料成像系统可以很容易地在不同实验室之间共享, 这有助于支付其购买和维护费用。总之, 裂变材料是一种宝贵的资源, 使实验和临床前评价的在体内肿瘤生长容易和可靠。
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Disclosures
作者声明没有利益冲突。
Acknowledgments
我们感谢弗雷德里克. 朗博士, PDX neurospheres 肿瘤中心。这项工作得到了失败的研究合作的支持, 美国脑肿瘤协会 (弗兰克 Furnari) 的子公司, R01-NS080939 (弗兰克 Furnari), 詹姆斯的麦基金会 (弗兰克 Furnari);贝尼特斯获得美国脑肿瘤协会 (ABTA) 奖的支持;Zanca 被美国-意大利癌症基金会博士后研究奖学金部分支持。弗兰克 Furnari 接受了来自路德维希癌症研究研究所的工资和额外支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/High Glucose | HyClone/GE | SH30022.1 | |
| DMEM/F12 1:1 | Gibco | 11320-082 | |
| FBS | HyClone/GE | SH30071.03 | |
| Accutase | Innovative cell technologies | AT-104 | |
| Trypsin | HyClone/GE | SH30236.01 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504044 | |
| human recombinant EGF | Stemcell Technologies | 2633 | |
| human recombinant FGF | Stemcell Technologies | 2634 | |
| DPBS | Corning | 21-031-00 | |
| FACS tubes | Falcon | 352235 | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
| Blasticidin | ThermoFisher Scientific | A1113903 | |
| p24 ELISA | Clontech | 632200 | |
| Xylazine | Akorn | NDC 59399-110-20 | |
| Ketamine | Zoetis | NADA 043-403 | Controlled substance |
| Ointment | Dechron | NDC 17033-211-38 | |
| Absorbable suture | CpMedical | VQ392 | |
| 5 ul syringe | Hamilton | 26200-U | Catalog number as sold by Sigma-Aldrich |
| Cell Sorter | Sony | SH8007 | |
| Mouse stereotaxic frame | Stoelting | 51730 | |
| Motorized stereotaxic injector | Stoelting | 53311 | |
| Micromotor hand-held drill | Foredom | K1070 | |
| Mouse warming pad | Ken Scientific Corporation | TP-22G | |
| Fluorescence Tomography System | PerkinElmer | FMT 2500 XL | |
| TrueQuant Imaging Software | Perkin Elmer | 7005319 | |
| Ultra-centrifuge Optima L-80 XP | Beckman Coulter | 392049 | |
| Tissue Culture 100mm Dishes | Olympus Plastics | 25-202 | |
| Tissue Culture 150mm Dishes | Olympus Plastics | 25-203 | |
| Tissue Culture Flasks T75 | Corning | 430720U | |
| 50 mL conical tubes | Corning | 430290 | |
| 15 mL conical tubes | Olympus Plastics | 28-101 | |
| Centrifuge Avanti J-20 | Beckman Coulter | J320XP-IM-5 | |
| Tube, Polypropylene, Thinwall, 5.0 mL | Beckman Coulter | 326819 | |
| Tube, Thinwall, Polypropylene, 38.5 mL, 25 x 89 mm | Beckman Coulter | 326823 | |
| Athymic nude mice | Charles River Laboratories | Strain Code 490 (Homozygous) | Prior approval by the Institutional Animal Care Program and by the Institutional Biosafety Committee required. |
References
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