Summary
Ortotop intrakraniell injektion av tumörceller har använts inom cancerforskningen för att studera hjärnan tumörbiologi, progression, evolution och terapeutiskt svar. Här presenterar vi fluorescens molekylär tomografi av tumör xenograft, vilket ger realtid intravital avbildning och kvantifiering av en tumör massa i prekliniska glioblastoma modeller.
Abstract
Tumorigenicitetsprov är möjligheten av cancerceller att bilda en tumör massa. En allmänt använd metod att avgöra om cellerna är tumörframkallande är genom att injicera nedsatt immunförsvar möss subkutant med cancerceller och mäta tumör massan efter det blir synlig och påtaglig. Ortotop injektioner av cancerceller syftar till att införa xenograft i den närmiljön som mest liknar vävnaden av beskärningen av tumören som studeras. Brain cancerforskning kräver intrakraniell injektion av cancerceller för att tillåta den tumörbildning och analys i den unika närmiljön i hjärnan. Av in-vivo imaging av intrakraniell xenograft övervakar omedelbart tumör massa orthotopically rekonstituerades möss. Här rapporterar vi användningen av fluorescens molekylär tomografi (FMT) av hjärnan tumören xenograft. Cancercellerna är först sensorik med nära infraröd fluorescerande proteiner och injiceras sedan i hjärnan hos immunsupprimerade möss. Djuren är sedan skannas för kvantitativ information om tumören massan över en längre tidsperiod. Cell före märkning möjliggör kostnadseffektiva, reproducerbar och tillförlitlig kvantifiering av tumör bördan inom varje mus. Vi eliminerade behovet av injicera imaging substrat, och därmed minskat belastningen på djuren. En begränsning av detta synsätt är representerat av oförmåga att upptäcka mycket små massorna; Det har dock bättre upplösning för större samlas än andra tekniker. Det kan användas för att utvärdera effekten av en läkemedelsbehandling eller genetiska förändringar av gliom cellinjer och patientderiverade prover.
Introduction
Cancer är en av de ledande orsakerna till sjukdom-relaterade dödsfall hos människor i den industrialiserade världen. Med en extremt hög dödssiffran är nya behandlingar angeläget. Glioblastoma multiforme (GBM) är en extremt dödliga typ av hjärncancer, sammansatt av heterogena populationer av tumör, stromaceller och immun hjärnceller. Enligt centralhjärnan tumören registret av USA är förekomsten av primära maligna och icke-maligna hjärntumörer cirka 22 fall per 100 000. Cirka 11.000 nya fall förväntas diagnostiseras i USA i 20171.
Prekliniska studier undersöka sannolikheten för att en drog, förfarande eller behandling är effektiv före provning hos människor. En av de tidigaste laboratorium stegen i prekliniska studier är att identifiera potentiella molekylära mål för läkemedelsbehandling med hjälp av cancerceller som implanteras i en värdorganism, definieras som människors xenograft-modeller. I detta sammanhang har intrakraniell hjärnan tumören xenograft-modeller patientderiverade xenograft (PDXs) använts i stor utsträckning att studera hjärnan tumörbiologi, progression, evolution och terapeutiskt svar, och mer nyligen för biomarkörer utveckling, drog screening och personlig medicin2,3,4.
En av de mest prisvärda och icke-invasiv i vivo imaging metoder för att övervaka intrakraniell xenograft är Mareld imaging (BLI)5,6,7,8. Men inkluderar vissa BLI begränsningar substrat administration och tillgänglighet, enzym stabilitet, och ljus snabbkylning och spridning under imaging förvärv9. Här rapporterar vi det infraröda FMT alternativt imaging metod för att övervaka prekliniska glioblastoma modeller. I denna metod, signal förvärv och kvantifiering av intracranially implanterade PDXs, uttrycker en nära-infraröd fluorescerande protein iRFP72010,11 (som hädanefter kallas FP720) eller turboFP635 (hädanefter kallas FP635), utförs med en FMT imaging system. Använda tekniken för FMT, övervakade den ortotop tumörer kan vara i vivo före, under eller efter behandling, i en icke-invasiv, substrat-fri och kvantitativa sätt för prekliniska observationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Användning av experimentell forskning djur och smittämnen, såsom lentivirus till transduce cancercellerna, kräver förhandsgodkännande genom programmet animaliska institutionsvård och institutionella Biosäkerhetskommittén. Detta protokoll följer djurvård riktlinjer på University of California San Diego (UCSD).
1. märkning av Glioblastoma celler med FP635 eller FP720 konstruktion
- Producera och rena lentivirus enligt protokollet beskrivs av Tiscornia o.a. 12
- Kultur cirka 2,0 x 106 celler från en mänskliga glioma cell fodrar med DMEM plus 10% fetalt bovint serum (FBS) i ett 15 cm skål; eller kultur 2,0 x 106 mänskliga glioblastoma patientderiverade (GBM-PDX) sfärer med DMEM/F12 1:1 medium med B27 komplettera plus humant rekombinant epidermal tillväxtfaktor (EGF; 20 ng/mL) och FGF (10 ng/mL) i en T75 kolv.
- Behålla alla celler vid 37 ° C, 5% CO2, och 100% relativ fuktighet.
- Separera celler.
- För gliom cellerna: avlägsna supernatanten från plattorna och lägga till 3-5 mL av trypsin 1 X till glioma celler.
- För GBM sfärer: samla cellerna genom pipettering cellerna i en 15 mL tub.
- Snurra ner sfärernas GBM vid 200 x g i 5 min med en bordsskiva centrifug i rumstemperatur.
- Avlägsna supernatanten och tillsätt 3-5 mL cell avlossning lösning.
- Inkubera alla celler vid 37 ° C i 10-15 min.
- Försiktigt separera celler genom pipettering upp och ner flera gånger (kontrollera att sfärer och glioma celler är ifyllda dissocierade) och snurra ner vid 200 x g i 5 min.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellerna med 5 mL medium genom pipettering upp och ner flera gånger. Bestäm cellviabiliteten genom trypan blå utslagning.
- Plåt 1,0 x 106 av målceller i en 10-cm skålen med 5 mL medium genom pipettering.
- Transduce celler med lentivirus uttrycker fluorescerande proteiner vid multiplicity av infektion (MOI) 5 som beskrivs av Tiscornia o.a. 12 och inkubera vid 37 ° C.
- Efter 24 h, ta bort mediet från de transduced cellerna, tillsätt 5 mL av färskt medium och inkubera i ytterligare 48 timmar vid 37 ° C.
- Separera de infektera cellerna till en enskild cell suspension som beskrivs i steg 1.4-1.6. Snurra ner cellerna vid 200 x g i 5 min och resuspendera i 500 µL sortering lösning (fosfatbuffrad saltlösning (PBS) med 1% FBS).
- Pipettera cellsuspensionen i FACS rör. Co färga cellerna med 1 µL/mL 4', 6-diamidin-2-fenylindol (DAPI) dihydroklorid att utesluta döda celler. Negativa kontroller krävs för att ställa upp flödet cytometer grindarna (icke-Sensorik och icke-sensorik celler / DAPI målat).
- Sortera de fluorescerande-positiva/DAPI-negativa cellerna i sortering lösning, som beskrivs av Basu o.a. 13, och samla de sorterade cellerna in i en 15 mL koniska rör.
- Snurra ner sorterade cellerna vid 200 x g i 5 min, avlägsna supernatanten och återsuspendera i 5 mL odlingsmedium. Utsäde sorterade cellerna i en 10-cm maträtt av pipettering. Inkubera vid 37 ° C i minst 48-72 tim.
- Utöka sorterade cellerna genom att separera celler följande steg 1.4-1.6 och plätering i flera rätter för i vivo experiment.
Obs: För mer information om cellen sortera förberedelse och rening, se Basu o.a. 13
2. intrakraniell injektion av iRFP-märkta Glioblastoma celler i nedsatt immunförsvar möss
Obs: Innan du börjar operationen, se till att operationssal och verktyg är rena för förfarandet. Använd nedsatt immunförsvar atymiska naken (Foxn1nu) manliga eller kvinnliga möss, mellan 4-5 veckor gamla och 17-19 g för intrakraniell injektioner. Djur bör hållas i minst 3 dagar efter ankomst och före operation.
- Cell förberedelse
- Skörda och separera fluorescerande positiva-glioma celler till en enskild cell suspension (steg 1.4-1.6) och resuspendera 0,5 eller 1,0 x 106 celler i 2-5 µL av PBS per injektion per djur. Pipettera cellsuspensionen i en 1,5 mL mikrocentrifug rör och plats på is.
- Anestesi beredning och administrering
- Förbereda 200 µL koksaltlösning innehållande ketamin (100 mg/kg) och xylazin (10 mg/kg) per 20 gram mus kroppsvikt. Väga djuren och beräkna den lämpliga dosen av anestesi.
- Ge en intraperitoneal injektion av anestesi och applicera oftalmologiska salva i ögonen för att förhindra uttorkning. För mer detaljer om det här steget se Kathleen m.fl. 14 place djuret på en pre värmde vatten termisk pad vid 37 ° C.
- Kontrollera att djuren bedövas genom att övervaka tå nypa svaret (pedal reflex), vanligtvis inom 5-10 min.
- Intrakraniell injektion
- Fyll en 5 µL Hamilton spruta (trubbig spets nål) med cellsuspension och mount i sondhållaren.
- Placera musen i en liten djur stereotaktisk ram och fixa huvudet med örat barer och adapterns framtand efter de beskrivna detaljerna av Cetin et al. 15
- Desinficera huvudet med 70% etanol och betadine lösning. Kontrollera att operationsområdet är slutföra sterila. Utföra en mellersta snitt med en liten skalpell och separata hud och bindväv.
- Placera Hamilton sprutan på den bregma punkt med micromanipulator.
- Flytta den sonden innehavaren 1,0 mm anteroposterior och 2.0 mm laterala från bregma punkt. Markera denna position med en penna.
- På den här platsen, noggrant gör ett hål i skallen med en mikromotor handhållen borrmaskin genom att tillämpa lätt tryck nedåt tills blodkärl blir synliga. Inte stör spindelvävshinnan mater och hjärnan parenkymet.
- Införa nålen i burr hål och avancera 3,0 mm under pial ytan.
- Ställ in volymen (2-5 µL) och flödeshastighet (1 µL/min) av injektion med en motoriserad stereotaxic injektor eller manuellt utför injektionen.
- Efter injektionen, nålen gradvis stigande 1,0 mm varje 1 min och rengör injektionsstället med 70% etanol.
- Nära huden sår med kirurgiska häftklamrar eller genom att göra kirurgiska suturer (ofta kallad stygn) och se Kathleen m.fl. 14 för mer information.
- Djur återhämtning
- Överföra djuret till en termisk pad för vatten (37 ° C) och övervaka kroppstemperatur, respiration klassar och puls, tills full återhämtning. Administrera analgesi per standardprotokoll.
Obs: Mer information om förfarandet för stereotaktisk kirurgi och koordinater, se andra rapporter5,14,15.
- Överföra djuret till en termisk pad för vatten (37 ° C) och övervaka kroppstemperatur, respiration klassar och puls, tills full återhämtning. Administrera analgesi per standardprotokoll.
3. FMT Imaging
Obs: Enligt i experimentellt syfte, den iRFP-taggade glioblastoma celler kan vara övervakade i vivo före, under eller efter behandling. För imaging syfte, söva djur med en isofluran induktion kammare, upprätthålla i en tänkbar kassett under skanning och bild i dockningsstationen av FMT kameran.
- Ta bort djuret från buren och plats i isofluran induktion kammaren. Stäng kammaren och slå på syre flöde och spridare till 3-5%.
- Övervaka djuret tills det är helt sövda, oftast inom 1-2 min. omedvetna djur bör inte reagera på yttre stimuli.
- Ta bort den sövda djuren från kammaren och sätter djuret i imaging kassetten genom att placera huvudet adaptern först, följt av att placera djuret vänd nedåt. Kontrollera att huvudet ligger i mitten av kassetten.
- Placera den övre plattan av kassetten på toppen och åt justeringsreglagen tills 17 mm.
- En gång som djuret är säkert i imaging kassett, vidare till imaging genom att sätta in kassetten i inre dockningsstationen av FMT kameran, där isofluran pumpas för att hålla djuret bedövas.
- Kör programvaran imager och analyzer genom att dubbelklicka på ikonen för programvaran.
- Välj ”databas” och ”studiegrupp” i fönstret ”Experimental Tabâ€.
- Gå till fönstret ”fliken Skanna” och välj föremål att bilden genom att klicka på ”Välj ämne”. Välj också laser kanalen på panelen ”Laser-kanal”. För FP635-märkt cellerna, Välj ”laser kanal 635 nm” och för FP720-märkt celler, ”laser kanal 680 nm”.
- Skaffa en bild genom att klicka på alternativet ”fånga” i fönstret ”fliken Skanna”. Justera sedan fältet skanna genom att klicka och dra fältet scan i den tagna bilden till ett bestämt antal källplatser, vanligtvis inom 20-25 källor för den ipsilaterala sidan.
- Markera alternativet ”Lägg till återuppbyggnad kö” och hit ”Scan” i fönstret ”fliken Skanna”.
- Vänta tills skanningen är klar och sedan ta bort imaging kassetten från dockningsstationen.
- Avlägsna topplattan av kassetten och placera djur baksida in i buren.
- Upprepa steg 3.1-3.12 för resten av djuren.
4. bildanalys
- Imager och analyzer programvaran, Välj fönstret ”analys Tabâ€.
- Ladda datamängden och föremål för att analysera genom att klicka på knappen ”+” på panelen ”datamängd selection” i fönstret ”analys Tabâ€.
- När bilden har lästs in i fönstret ”analys Tabâ€, utföra regionen av intresse (ROI) analys genom att välja ikonen ellipsoid, ligger i det övre vänstra hörnet av fönstret” analys Tabâ€.
- Justera tröskeln till noll i panelen ”statistikdatan” genom att högerklicka på kolumnen ”tröskelvärde” i fönstret ”analys Tabâ€.
- Det totala värdet i panelen ”statistikdatan” representerar signalen från lysrör-taggade glioblastoma cellerna implanteras i mus hjärnan.
- Upprepa steg 4.2-4.4 för resten av djuren. Ladda eller ta bort ett nytt ämne genom att klicka på ”+” eller ”−” knappen, respektive i panelen ”datamängd selection” i fönstret ”analys Tabâ€.
Obs: För mer information om FMT imaging och programvara drift, se20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Glioblastom celler U87EGFRvIII (U87 celler som uttrycker över den EGF-receptor varianten III) odlades enligt steg 1.2. Lentivirus producerades och renas enligt steg 1,1. Viral koncentrationen bestämdes av p24 ELISA analys. Cellerna var sensorik med lentivirus som transporterar infraröd fluorescerande proteiner enligt steg 1,8. Plasmiden kodning FP72010,11 var vänligen tillhandahållen av Dr V.V. Verkhusha och FP635 vector köptes från en kommersiell leverantör. Målceller var FACS sorterade för att berika för topp 10% mest fluorescerande cell befolkningen (figur 1A). Öka den fluorescerande signalen förbättrar känsligheten för fluorescens tomografi systemet. För att validera intensiteten av signalerar av fluorescently-märkta celler före ortotop implantation, använde vi phantom kassett av FMT kameran. Specifikt, U87EGFRvIII-TurboFP635 och U87EGFRvIII-iRFP720 celler var separerade med trypsin och 1 x 105, 1 x 106, och 1 x 107 celler var resuspended i 100 µL av is kallt PBS, respektive och analyseras. FMT kameran tillåter för identifiering i 4 kanaler: 635 nm, 680 nm, 750 nm och 780 nm. Infraröda kanaler 750 nm och 780 nm är inte lämpliga för denna analys eftersom det finns inget utsläpp vid dessa våglängder från infrarött fluorescerande proteiner används (inga data anges). Därför vi analyserat utsläpp signalerna på 635 nm och 680 nm. Fluorescerande redovisas i figur 1, och signalera bild och intensitet kvantifiering för båda FP635 (figur 1B, C) och FP720 (figur 1 d, E), vilket ökar proportionellt när cell nummer ökar. Notera, utsläpp för FP635 är synlig i kanalen 635 nm men inte i kanalen 680 nm. Däremot utsläpp för FP720 är synlig i kanalen 680 nm men inte i kanalen 635 nm. Detta gör dessa två kandidatländer fluorescerande proteiner passar studier där två populationer av celler kan märkas och övervakas samtidigt med hjälp av två nära infraröd fluorescerande etiketter.
U87EGFRvIII celler märkta med nära infraröd fluorescerande proteiner användes sedan för ortotop injektion och i vivo tumör tillväxt övervakning, som beskrivs i steg 2.1-2.4. Vi använde samma cell linje, dvsU87EGFRvIII, märkt med olika fluorescerande taggar, för att utesluta tumör tillväxt skillnaden mellan olika cancer celltyper. Möss injicerades med U87EGFRvIII-TurboFP635 celler, U87EGFRvIII-iRFP720 celler eller en lika kombination (1:1) av två cellinjer. Totalt 5 x 105 celler i en 5 µL volym av PBS skulle injiceras intracranially i 4-5 veckor gamla immunsupprimerade atymiska naken möss med en stereotaktisk system och en Hamilton spruta, följande steg 2,3-2.4. Anestesi var fulländat vid intraperitoneal injektion av ketamin/xylazin. Djuren hölls varm under hela injektionen med en vatten termisk pad och kontrolleras för tecken på ångest. Tumör engraftment och tillväxt var då övervakas av den FMT imaging system. Under avsökningen var mössen tillfälligt bedövas med en 3% isofluran kammare (steg 3.1-3.12). Mössen sedan placerades i en tänkbar kassett och avbildas inuti laser scanning kamera. Varje mus skannades med 635 nm och 680 nm kanaler. Signalen kvantifiering spelades över tiden och möss var euthanized vid uppkomsten av neurologiska symtom, enligt riktlinjerna som institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC). Som anges i figur 2A, U87EGFRvIII-TurboFP635 utsläpp signalen var tydlig i kanalen 635 nm och minimal bakgrund signal spelades i kanalen 680 nm (siffror 2B, C). I kontrast, U87EGFRvIII-iRFP720 celler som avges i 680 nm kanalen visar lite bakgrund i kanalen 635 nm (siffror 2D–F). Möss som injicerats med en 1:1 blandning av U87EGFRvIII-TurboFP635 och U87EGFRvIII-iRFP720 celler visade slutligen, ökad signal i båda kanalerna för varaktigheten av experimentet (siffror 2 g–jag). Dessa data visar att det är möjligt att utnyttja IR fluorescerande proteiner för dubbla i vivo imaging av cancer cellpopulationer. Data visar också att olika fluorescerande proteiner har en olika intensitet i sin signal utsläpp. Här, var FP720 signalintensitet överlägsen FP635, med ökad känslighet i att upptäcka mindre populationer av cancerceller i en icke-invasiv övervakning inställning.
Effekterna av nedtystning av cancer-relaterade gener på tumorigenicitetsprov i prekliniska modeller kan också vara studie med detta protokoll. För detta mål, GBM-sfärer (GSC23 och GSC11) var odlade (steg 1.2) och sensorik med FP720-lentivirus (steg 1,8). Celler som uttrycker FP720 var FACS sorterade enligt beskrivningen tidigare i steg 1.11-1.13. FP720-märkt celler var samtidig transduced med lentivirus-encoding shRNA inriktning DAXX (shDaxx) eller shRNA kontroll (shLuc) MOI 516. Celler odlades för 5 dagar, separeras till en enda cellsuspension, och 1 x 106 celler var resuspended i 3 µL av PBS intrakraniell injektionsvätska. Effekten av den shRNA inriktning DAXX bekräftades av omvänd Transkription kvantitativa polymeras-kedjereaktion (RT-qPCR) i GSC23 (figur 3A) och GSC11 (figur 3 c). GBM-iRFP720/shRNA celler skulle stereotactically injiceras i striatum av nedsatt immunförsvar möss, enligt steg 2,3-2.4. Djur observerades för neurologiska tecken och relativa fluorescens signalen för xenograft analyserades av FMT imaging system, kvantifieras med hjälp av analysprogrammet, enligt steg 3.1-4.6. Representativa bilder av FMT visar en minskning fluorescens signal i möss rekonstituerades med shDAXX/GBM-sfärer jämfört med djur som implanteras med shControl (figur 3B och figur 2D) för båda GBM-sfärer modellerna, bekräftar vår tidigare konstaterande16 att DAXX hämning förtrycker tumörtillväxt i prekliniska glioblastoma modeller.
Figur 1: Standard kurvor med celler för phantom och FACS analys. (A), representativa FACS histogram av FP720 - och FP635-U87EGFRvIII uttrycker celler (vänster och höger panel, respektive). Glioma celler var infekterade med lentivirus kodning infraröd fluorescerande proteiner och FASC sorterade för att berika för det högsta uttrycket för de FP720 eller FP635 proteinerna. Representativa bilder erhålls från U87EGFRvIII-TurboFP635 (B) och U87EGFRvIII-iRFP720 (D) imager och analyzer programvara cellsuspensioner använder phantom kassett. Övre paneler representerar signalen i 635 nm kanal och nedre panelerna i kanalen 680 nm. Öka i cell nummer motsvarade en ökning av signal visualisering. Signalen kvantifiering av U87EGFRvIII-TurboFP635 (C) och U87EGFRvIII-iRFP720 (E) celler i 635 nm och 680 nm kanaler. Relativa fluorescens enheter anges i färgfältet. Felstaplar representera S.E.M. från 3 olika scanningar per cellsuspension. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: hjärnan tumören xenograft modell med U87EGFRvIII celler skannade i olika kanaler. Representativa bilder av fluorescerande signal i 635 nm och 680 nm kanaler från djur intracranially implanteras med U87EGFRvIII-turboFP635 (A), U87EGFRvIII-iRFP720 (D) och en blandning kombination (1:1) av U87EGFRvIII-iRFP720: U87EGFRvIII-turboFP635 celler (G). Bilder förvärvades dag 5 efter första skanningen. (B, E, H) Signalera intensitet övervakning för varje mus över en period om fem dagar. Varje mus skannades i kanalen 635 nm (blå staplar) och i kanalen 635 nm (röda staplar). Den ljusaste nyansen av baren färg representerar dag 1 av scanning och den mörkaste nyansen representerar dag 5. (C, F, jag) Relativa fluorescens kvantifiering visar en direkt jämförelse av signalintensitet från kanalen 635 nm (blå) och 680 nm kanal (röd) i hela kohorten av möss. Relativa fluorescens enheter anges i färgfältet. Data visar medelvärden med standardavvikelse från 3 olika djur. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: nedtystning i prekliniska glioblastoma modeller använder FMT. Gen uttryck analys av DAXX av RT-qPCR i GSC23 (A) och GSC11 (C) gliom patientderiverade celler sensorik med lentivirus-kodade shRNAs inriktning DAXX (shDaxx) eller shRNA kontroll (shLuc) och FP720. Representativa bilder av fluorescerande signal från 680 nm kanal av orthotopically rekonstituerades möss implanteras med GSC23-iRFP720 (B) och GSC11-iRFP720 (D) patientderiverade celler. Stark fluorescens signal har observerats hos djur som implanteras med shRNA kontroll (shLuc) (övre delen av panelen) jämfört med möss som implanteras med shRNA-DAXX (shDaxx) (nedre delen av panelen), vilket indikerar att DAXX hämning dämpar tumör tillväxt i prekliniska gliom modeller bestäms av fluorescens molekylär tomografi. Relativa fluorescens enheter anges i färgfältet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tumör xenograft har använts flitigt i cancerforskning och ett antal väletablerade bildgivande tekniker har utvecklats: BLI; magnetisk resonanstomografi (MRT); positron emissions tomografi (PET), beräknade datortomografi (CT); FMT. Alla dessa metoder kommer med för- och nackdelar, men i slutändan kompletterar varandra med typ av information som tillhandahålls. En av de vanligaste i vivo imaging teknik är BLI5,6,7,8. BLI och FMT kräver båda cell teknik (med luciferas enzymer eller infraröd fluorescerande proteiner) som kan påverka genuttryck. BLI känslig mer för liten tumör massorna men kräver intraperitoneal injektion av ett substrat (luciferin), som når maximal utdelning i kroppen i 10-12 min. men ljus snabbkylning och spridning under imaging förvärv och substrat clearance inträffar ofta9. FMT, istället, kräver inte någon ytterligare substrat administration till djuren och dess signal är stabil och oberoende av tid eller enzym stabilitet. Dessutom erbjuder FMT, när de används i samma experimentella förhållanden, reproducerbara semikvantitativt data. Både BLI och FMT erbjuder inte rumslig upplösning; koppling dock dessa metoder med datortomografi adresser problemet.
En datortomografi mäter dämpningen av fotoner när dess signal passerar kroppen av ett djur och det är idealiskt att identifiera kroppens strukturer. Mjukvävnad kontrast, som kan störa detektion av en liten intrakraniell tumör, är dock en begränsning för denna strategi17,18. En ytterligare nackdel med CT är användningen av strålning och kontrastmedel, som kan framkalla molekylära förändringar i målceller. En datortomografi kan kombineras med husdjur, som använder radiomärkt spårämnen som glukos analog, fluorodeoxyglucose 18F-FDG; men detta kan också störa vissa fysiologiska processer i små djur. FMT behöver däremot inte någon injicerade substrat för att mäta tumören massan och det är möjligt att mäta tumör ämnesomsättningen, inflammation, angiogenes, apoptos och andra markörer med fluorescently märkta biomarkörer19.
Totalt sett är en av de mest användbara och mångsidiga tekniker för i vivo imaging MRI. Smärre begränsningar av MRI kan hittas i den låga förvärv tid, lägre känslighet än PET och vissa instrument-relaterade variationer18,20.
Här rapporterar vi FMT metoden som en alternativ metod för prekliniska glioblastoma modeller. Före märkning av målceller med infraröd fluorescerande proteiner (figur 1A–E) och skanning efter implantationen hos immunsupprimerade djur kan uppnås med ett fluorescens tomografi imaging system. Vi rapporterade den FMT-metoden som en alternativ metod för prekliniska glioblastoma modeller. Med denna metod imaging tillämpas på ett sätt som substrat-fri och icke-invasiv, djuren hålls i en miljö med låg stress och djup-vävnad kvantifiering kan vara utfört (figur 2A–jag, figur 3A, B). Detta protokoll kan användas för att studera effekten av kombinatoriska behandlingar i prekliniska gliom modeller21, att identifiera nya terapeutiska mål för hjärnan tumörer16och utreda nya druggable metabola molekyler22, epigenetiska vägar23eller nya kemoterapeutiska medel i kombination med strålbehandling (opublicerade data), och tillämpas på andra prekliniska studier. Vi föreslår också här användningen av FMT som en dubbel i vivo imaging strategi, när två samexisterande, men olika, tumör cellpopulationer är tänkt att analyseras.
Vissa begränsningar med FMT måste beaktas, såsom auto-fluorescens genereras från några organ som kan störa signalen. Till exempel murina mjält- och avger auto-fluorescens i kanalen 680 nm men inte på 635 nm. Därför måste FMT-relaterade experimentella rutiner som innefattar dessa organ utföras med andra infraröda fluorescerande proteiner, som FP635. Vi använde naken foxn1-muterat naken möss att undvika störningar i fluorescens signal inspelningen; om en annan musmodell måste användas, rekommenderas att raka området av intresse av djuren. Detta synsätt begränsas dessutom också att upptäcka mycket små tumör massorna. Vår erfarenhet förbättrar signal-brus-förhållandet som tumören samlas blir större, ännu före uppkomsten av eventuella neurologiska symptom hos mössen. I själva verket i tidigare experiment utförda på orthotopically injiceras PDXs, kunde vi upptäcka tumörer under en läkemedel regim i minst 2 veckor i möss utan några tecken på ångest på grund av tumör börda eller drug administration21. I slutändan avgör aggressivitet i varje cell fodrar och antalet injicerade cellerna längden på varje experiment. Uppgifterna visar ett linjärt proportionellt förhållande mellan antalet celler och signal (figur 1B–E) och tumör massa och signalen (figur 2). men en allmän signal korrelation mellan tumör massa och antal celler kan inte tillämpas över olika cellinjer och infraröd proteiner. Signalen för varje cell linje/infraröda fluorescerande protein kombination måste bestämmas empiriskt. Dessutom motsvarar den signal som erhålls från analysen av de celler som använder Fantomen (figur 1B, D) inte signalen från intrakraniell xenograft som en försvagning i signal uppstår på grund av skallen av musen.
Programvaran imager och analyzer möjliggör tröskelvärde. Även om vi inte använder någon tröskel här, ger Skanna djur utan någon implanterade cellerna bakgrundsljud som tenderar att elimineras genom återuppbyggnad i närvaro av en äkta signal. Några faktorer påverka signal intensiteten av xenograft och måste hållas i övervägande: varje infraröd fluorescerande protein har olika emissionsspektrum och intensitet, med FP720 att vara en av de mest fluorescerande proteiner används experimentellt10 ,11. varje cellinje möjliggör en riklig, men begränsad, mängden proteinproduktion, således påverka den maximala fluorescensen kan erhållas. Slutligen, FMT kameran är setup med intern standard kurvor för specifika föreningar, därför är det viktigt att tänka på vilken förening har den närmaste emissionsspektrum till den infraröda fluorescerande protein som används för att märka cellerna. Även om tolereras väl, rekommenderas att fastställa potentiella cytotoxiska effekter som medieras av överuttryck av infraröd proteiner8,9. Dessutom rekommenderar vi använder kohorter av möss av minst 8 per experimentella gruppen, som förlust av data och möss, på grund av kirurgiskt ingrepp eller variabilitet i de cancer cell engraftment, uppstå; ändå läggs statistisk signifikans till studien. Vi rekommenderar också att seriellt Skanna djur kohorten för mer än en dag och analysera signal utsläpp samtidigt, eftersom variationer i imaging kassett djupet och fluorescerande signal rekonstruktion kan störa finalen signalerar kvantifiering. För att lösa problemet, tillåter analyzer programvaran mindre ändringar i laser intensitet (från normal till hög och mycket hög), även om vår erfarenhet slutresultatet inte är dramatiskt annorlunda. En sista anmärkning angående kostnadseffektivitet är att den FMT imaging system kanna bli lätt delat som ett grundläggande instrument bland olika laboratorier, vilket hjälper täcka dess inköp och underhåll kostnad. Sammanfattningsvis, är FMT en värdefull resurs som gör experimentell och preklinisk utvärdering av i vivo tumörtillväxt lätt och pålitlig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Vi tackar Dr. Frederick Lang, MD Anderson Cancercenter för GBM-PDX neurospheres. Detta arbete stöds av de nederlag GBM forskning Collaborative, ett dotterbolag till National hjärnan tumören Society (Frank Furnari), R01-NS080939 (Frank Furnari), James S. McDonnell Foundation (Frank Furnari); Jorge Benitez stöddes av en utmärkelse från den amerikanska hjärnan tumören Association (ABTA); Ciro Zanca stöddes delvis av ett amerikansk-italienska Cancer Foundation postdoc-stipendium. Frank Furnari får lön och ytterligare stöd från Ludwiginstitutet för cancerforskning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/High Glucose | HyClone/GE | SH30022.1 | |
| DMEM/F12 1:1 | Gibco | 11320-082 | |
| FBS | HyClone/GE | SH30071.03 | |
| Accutase | Innovative cell technologies | AT-104 | |
| Trypsin | HyClone/GE | SH30236.01 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504044 | |
| human recombinant EGF | Stemcell Technologies | 2633 | |
| human recombinant FGF | Stemcell Technologies | 2634 | |
| DPBS | Corning | 21-031-00 | |
| FACS tubes | Falcon | 352235 | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
| Blasticidin | ThermoFisher Scientific | A1113903 | |
| p24 ELISA | Clontech | 632200 | |
| Xylazine | Akorn | NDC 59399-110-20 | |
| Ketamine | Zoetis | NADA 043-403 | Controlled substance |
| Ointment | Dechron | NDC 17033-211-38 | |
| Absorbable suture | CpMedical | VQ392 | |
| 5 ul syringe | Hamilton | 26200-U | Catalog number as sold by Sigma-Aldrich |
| Cell Sorter | Sony | SH8007 | |
| Mouse stereotaxic frame | Stoelting | 51730 | |
| Motorized stereotaxic injector | Stoelting | 53311 | |
| Micromotor hand-held drill | Foredom | K1070 | |
| Mouse warming pad | Ken Scientific Corporation | TP-22G | |
| Fluorescence Tomography System | PerkinElmer | FMT 2500 XL | |
| TrueQuant Imaging Software | Perkin Elmer | 7005319 | |
| Ultra-centrifuge Optima L-80 XP | Beckman Coulter | 392049 | |
| Tissue Culture 100mm Dishes | Olympus Plastics | 25-202 | |
| Tissue Culture 150mm Dishes | Olympus Plastics | 25-203 | |
| Tissue Culture Flasks T75 | Corning | 430720U | |
| 50 mL conical tubes | Corning | 430290 | |
| 15 mL conical tubes | Olympus Plastics | 28-101 | |
| Centrifuge Avanti J-20 | Beckman Coulter | J320XP-IM-5 | |
| Tube, Polypropylene, Thinwall, 5.0 mL | Beckman Coulter | 326819 | |
| Tube, Thinwall, Polypropylene, 38.5 mL, 25 x 89 mm | Beckman Coulter | 326823 | |
| Athymic nude mice | Charles River Laboratories | Strain Code 490 (Homozygous) | Prior approval by the Institutional Animal Care Program and by the Institutional Biosafety Committee required. |
References
- Ostrom, Q. T., et al. CBTRUS Statistical Report: Primary Brain and Other Central Nervous System Tumors Diagnosed in the United States in 2009-2013. Neuro-Oncology. 18 (suppl_5), v1-v75 (2016).
- Pauli, C., et al. Personalized In Vitro and In Vivo Cancer Models to Guide Precision Medicine. Cancer Discovery. 7 (5), 462-477 (2017).
- Stewart, E. L., et al. Clinical Utility of Patient-Derived Xenografts to Determine Biomarkers of Prognosis and Map Resistance Pathways in EGFR-Mutant Lung Adenocarcinoma. Journal of Clinical Oncology. 33 (22), 2472-2480 (2015).
- Gao, H., et al. High-throughput screening using patient-derived tumor xenografts to predict clinical trial drug response. Nat Med. 21 (11), 1318-1325 (2015).
- Ozawa, T., James, C. D. Establishing Intracranial Brain Tumor Xenografts With Subsequent Analysis of Tumor Growth and Response to Therapy using Bioluminescence Imaging. J. Vis. Exp. (41), e1986 (2010).
- Kondo, A., et al. An experimental brainstem tumor model using in vivo bioluminescence imaging in rat. Child's Nervous System. 25 (5), 527-533 (2009).
- Nyati, S., Young, G., Ross, B. D., Rehemtulla, A. ATM Kinase: Methods and Protocols. Kozlov, S. V. , Springer. New York. 97-111 (2017).
- Kondo, A., et al. Longitudinal assessment of regional directed delivery in a rodent malignant glioma model. J Neurosurg Pediatr. 4 (6), 592-598 (2009).
- Badr, C. E. Bioluminescent Imaging: Methods and Protocols. Badr, C. E. , Humana Press. 1-18 (2014).
- Shcherbakova, D. M., Verkhusha, V. V. Near-infrared fluorescent proteins for multicolor in vivo imaging. Nat Meth. 10 (8), 751-754 (2013).
- Filonov, G. S., et al. Bright and stable near-infrared fluorescent protein for in vivo imaging. Nat Biotech. 29 (8), 757-761 (2011).
- Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. Production and purification of lentiviral vectors. Nat. Protocols. 1 (1), 241-245 (2006).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). J. Vis. Exp. (41), e1546 (2010).
- Pritchett-Corning, K. R., Luo, Y., Mulder, G. B., White, W. J. Principles of rodent surgery for the new surgeon. J Vis Exp. (47), (2011).
- Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nat. Protocols. 1 (6), 3166-3173 (2007).
- Benitez, J. A., et al. PTEN regulates glioblastoma oncogenesis through chromatin-associated complexes of DAXX and histone H3.3. Nature Communications. 8, 15223 (2017).
- Kirschner, S., et al. Imaging of Orthotopic Glioblastoma Xenografts in Mice Using a Clinical CT Scanner: Comparison with Micro-CT and Histology. PLOS ONE. 11 (11), e0165994 (2016).
- Mannheim, J. G., et al. Standardization of Small Animal Imaging-Current Status and Future Prospects. Molecular Imaging and Biology. , (2017).
- Engblom, C., et al. Osteoblasts remotely supply lung tumors with cancer-promoting SiglecFhigh neutrophils. Science. 358 (6367), (2017).
- Lauber, D. T., et al. State of the art in vivo imaging techniques for laboratory animals. Laboratory Animals. 51 (5), 465-478 (2017).
- Zanca, C., et al. Glioblastoma cellular cross-talk converges on NF-κB to attenuate EGFR inhibitor sensitivity. Genes & Development. 31 (12), 1212-1227 (2017).
- Villa, G. R., et al. An LXR-Cholesterol Axis Creates a Metabolic Co-Dependency for Brain Cancers. Cancer Cell. 30 (5), 683-693 (2016).
- Liu, F., et al. EGFR Mutation Promotes Glioblastoma through Epigenome and Transcription Factor Network Remodeling. Molecular Cell. 60 (2), 307-318 (2015).
