Summary
Orthotopic intrakraniel injektion af tumorceller har været anvendt i kræftforskning for at studere hjernen tumor biology, progression, evolution og terapeutisk respons. Her præsenterer vi fluorescens molekylære tomografi af tumor xenografts, der giver real-time intravital imaging og kvantificering af en tumor masse i prækliniske glioblastom modeller.
Abstract
Tumorigenisitetsforsøg er kræftceller evne til at danne en tumor masse. En udbredt tilgang til at afgøre, om cellerne er tumorfremkaldende er ved at indsprøjte immundefekte mus subkutant med kræftceller og måle tumor massen, når det bliver synlig og håndgribelig. Orthotopic injektioner af kræftceller har til formål at indføre xenograft i det mikromiljø, der mest ligner væv af oprindelsen af tumor undersøges. Hjernen kræftforskning kræver intrakraniel indsprøjtning af kræftceller til at tillade tumordannelse og analyse i den unikke mikromiljø i hjernen. I vivo billeddannelse af intrakranielle xenografts overvåger øjeblikkeligt tumor massen af orthotopically aflægger mus. Her rapporterer vi brugen af fluorescens molekylære tomografi (FMT) af hjernen tumor xenografts. Kræftcellerne er først transduced med nær infrarød fluorescerende proteiner og derefter injiceres i hjernen hos immunkompromitterede mus. Dyrene er derefter scannet for at få kvantitative oplysninger om tumor massen over en længere periode. Celle pre mærkning giver mulighed for omkostningseffektiv, reproducerbare og pålidelig kvantificering af tumor byrde inden for hver mus. Vi fjernede behovet for intravenøs imaging substrater, og således reduceret stress på dyrene. En begrænsning af denne tilgang er repræsenteret ved manglende evne til at detektere meget små masserne; Det har imidlertid bedre opløsning for større masse end andre teknikker. Det kan anvendes til at vurdere effekten af en behandling eller genetiske ændringer af gliom cellelinjer og patient-afledte prøver.
Introduction
Kræft er en af de førende årsager til sygdom-relaterede dødsfald blandt mennesker i den industrialiserede verden. Med en ekstremt høje dødstal er nye behandlinger tvingende nødvendigt. Glioblastom multiforme (GBM) er en ekstremt dødelige form for kræft i hjernen, sammensat af heterogene befolkninger af hjernen tumor, stromale og immun celler. Ifølge Central hjerne tumor registreringsdatabasen i USA er forekomsten af primære maligne og ikke-maligne hjernetumorer ca 22 tilfælde pr. 100.000. Ca 11.000 nye sager forventes at blive diagnosticeret i USA i 20171.
Prækliniske undersøgelser undersøge sandsynligheden for et stof, procedure eller behandling for at være effektiv inden prøvningen i mennesker. Et af de tidligste laboratorium skridt i prækliniske undersøgelser er at identificere potentielle molekylære mål for narkotikabehandling ved hjælp af kræftceller implanteret i en værtsorganisme, defineret som menneskelige xenograft modeller. I denne kontekst, har intrakraniel hjerne tumor xenograft modeller ved hjælp af patient-afledte xenografts (PDXs) været meget anvendt til at studere hjernen tumor biology, progression, evolution og terapeutiske reaktion, og for nylig for biomarkører udvikling, narkotika screening, og personlig medicin2,3,4.
En af de mest overkommelige og ikke-invasiv i vivo imaging metoder til at overvåge intrakranielle xenografts er bioluminescens imaging (BLI)5,6,7,8. Men nogle BLI begrænsninger omfatter substrat administration og tilgængelighed, enzym stabilitet, og lys dæmper og spredning under imaging erhvervelse9. Her rapporterer vi den infrarøde FMT som alternativ tænkelig metode til at overvåge prækliniske glioblastom modeller. I denne metode, signal erhvervelse og kvantificering af intracranially implanterede PDXs, udtrykker en nær-infrarødt fluorescerende protein iRFP72010,11 (herefter betegnet som FP720) eller turboFP635 (herefter benævnt som FP635), udføres med en FMT imaging system. Ved hjælp af FMT teknologi, overvåget orthotopic tumorer kan være i vivo før, under eller efter behandling, i en ikke-invasiv, substrat-fri og kvantitative måde for prækliniske observationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Anvendelsen af eksperimentel forskning dyr og smitsomme agenser, såsom lentivirus at transduce kræftceller, kræver forudgående godkendelse af programmet institutionelle dyrs pleje og institutionelle biosikkerhed udvalget. Denne protokol følger retningslinjerne dyrs pleje af University of California San Diego (UCSD).
1. mærkning af glioblastom celler med FP635 eller FP720 konstruktion
- Producere og rense lentivirus i henhold til protokollen, beskrevet af Tiscornia et al. 12
- Kultur omkring 2,0 x 106 celler fra en menneskelig gliom cellelinie med DMEM plus 10% føtal bovint serum (FBS) i en 15-cm parabol; eller kultur 2.0 x 106 menneskelige glioblastom patient-afledte (GBM-PDX) sfærer med DMEM/F12 1:1 medium med B27 supplere plus humane rekombinante epidermal vækstfaktor (EGF; 20 ng/mL) og FGF (10 ng/mL) i en T75 kolbe.
- Opretholde alle celler ved 37 ° C, 5% CO2og 100% relativ luftfugtighed.
- Adskille cellerne.
- For gliom celler: Fjern supernatanten fra pladerne og tilføje 3-5 mL trypsin 1 X til gliom celler.
- GBM sfærer: indsamle cellerne af pipettering cellerne i en 15 mL tube.
- Spin ned GBM kugler på 200 x g i 5 min ved hjælp af en bordplade centrifuge ved stuetemperatur.
- Fjern supernatanten og tilsæt 3-5 mL af celle detachement løsning.
- Inkuber alle celler ved 37 ° C i 10-15 min.
- Forsigtigt adskille cellerne af pipettering op og ned flere gange (sikre at kugler og gliom celler er udfyldt dissocieres) og spin-ned på 200 x g i 5 min.
- Fjern supernatanten og resuspend celler med 5 mL af medium af pipettering op og ned flere gange. Bestemme cellernes levedygtighed af trypan blå udstødelse.
- Plade 1,0 x 106 af target-cellerne i en 10-cm parabol med 5 mL af medium af pipettering.
- Transduce celler med lentivirus udtrykker fluorescerende proteiner på mangfoldighed af infektion (MOI) 5 som er beskrevet af Tiscornia et al. 12 og der inkuberes ved 37 ° C.
- Efter 24 timer, fjerne medium fra de transduced celler, tilsættes 5 mL frisk medium, og der inkuberes i yderligere 48 timer ved 37 ° C.
- Adskille de inficerede celler ind i en enkelt celle suspension som beskrevet i trin 1.4-1,6. Spin ned celler på 200 x g i 5 min og resuspend i 500 µL af sortering løsning (fosfatbufferet saltopløsning (PBS) med 1% FBS).
- Der afpipetteres cellesuspension i FACS rør. Co pletten celler med 1 µL/mL af 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) dihydrochlorid at udelukke døde celler. Negative kontroller er forpligtet til at oprette flow forskellige porte (ikke-transduced celler og celler, ikke-transduced / DAPI farves).
- Sortere de fluorescerende-positive/DAPI-negative celler i sortering løsning, som beskrevet af Basu et al. 13, og indsamle de sorterede celler ind i en 15 mL konisk rør.
- Spin ned sorteres celler på 200 x g i 5 min og Fjern supernatanten resuspend i 5 mL af næringssubstratet. Frø af sorterede celler i en 10-cm parabol af pipettering. Der inkuberes ved 37 ° C i mindst 48-72 timer.
- Udvide de sorterede celler af miljøomkostningerne cellerne efter trin 1.4-1,6 og plating i flere retter for i vivo eksperimenter.
Bemærk: Yderligere oplysninger om cellen sortering forberedelse og rensning, se Basu et al. 13
2. intrakraniel injektion af iRFP-mærkede glioblastom celler i immundefekte mus
Bemærk: Før du starter operationen, Sørg for, at kirurgisk værelse og værktøjer er ren under proceduren. Bruge immundefekte athymiske nøgen (Foxn1nu) mandlige eller kvindelige mus, mellem 4-5 uger gamle og 17-19 g for intrakraniel injektioner. Dyr bør være anbragt i mindst 3 dage efter ankomst og før operationen.
- Celle forberedelse
- Høst og adskille fluorescerende positive-gliom celler ind i en enkelt celle suspension (trin 1.4-1.6) og resuspend 0,5 eller 1,0 x 106 celler i 2-5 µL af PBS pr. injektion pr. dyr. Der afpipetteres cellesuspension i en 1,5 mL microcentrifuge rør og sted på is.
- Anæstesi forberedelse og administration
- Forberede 200 µL af saltopløsning indeholdende ketamin (100 mg/kg) og xylazin (10 mg/kg) pr 20 gram mus kropsvægt. Vejes dyrene og beregne den passende dosis af anæstesi.
- Give en intraperitoneal injektion af anæstesi og anvende oftalmologiske salve til øjne at undgå dehydrering. Yderligere oplysninger om dette trin Se Kathleen et al. 14 placere dyret på en pre varmet vand termisk pad ved 37 ° C.
- Kontroller, at dyrene er bedøvede ved at overvåge tå knivspids svar (pedal refleks), normalt indenfor 5-10 min.
- Intrakraniel injektion
- Indlæse en 5 µL Hamilton sprøjte (stump spids nål) med cellesuspension og mount i indehaveren af sonden.
- Placere musen i et lille dyr stereotactic ramme og fastsætte hovedet ved hjælp af øret barer og chopper adapteren efter Cetin et al. beskrevet detaljerne 15
- Desinficere hovedet med 70% ethanol og betadine løsning. Sørg for, at operationsstedet er fuldstændig steril. Udføre en midterste snit med en lille skalpel og adskille huden og bindevævet.
- Sted i Hamilton sprøjten på det bregma punkt ved hjælp af micromanipulator.
- Flytte sonden indehaveren 1.0 mm anteroposterior og 2,0 mm lateral fra bregma punktet. Markere denne position med en blyant.
- På denne placering, omhyggeligt gør et hul i kraniet med en mikromotorer håndholdt boremaskine ved at anvende let tryk nedad indtil blodkarrene bliver synlige. Ikke forstyrre den arachnoid mater og hjernen parenkym.
- Indføre nålen ind i burr hullet og fremme 3,0 mm under pial overfladen.
- Indstilling af volumen (2-5 µL) og strømningshastighed (1 µL/min) af injektion ved hjælp af en motoriseret stereotaxisk injektor eller manuelt udføre injektionen.
- Efter injektionen, fjerne nålen gradvist ved stigende 1.0 mm hver 1 min og rense injektionsstedet med 70% ethanol.
- Tæt huden sår med kirurgisk hæfteklammer eller ved at foretage kirurgiske suturer (ofte omtalt som sting) og se Kathleen et al. 14 for flere detaljer.
- Animalske opsving
- Overføre dyret til en vand termisk pad (37 ° C) og overvåge kropstemperatur, åndedræt sats og puls, før fuld helbredelse. Administrere analgesi pr. standardprotokoller.
Bemærk: Yderligere oplysninger om den stereotactic procedure, kirurgi og koordinater, se andre rapporter5,14,15.
- Overføre dyret til en vand termisk pad (37 ° C) og overvåge kropstemperatur, åndedræt sats og puls, før fuld helbredelse. Administrere analgesi pr. standardprotokoller.
3. FMT Imaging
Bemærk: Ifølge den eksperimentelle formål, iRFP-tagged glioblastom celler kan være overvåget i vivo før, under eller efter behandling. Imaging formål, bedøver dyr ved hjælp af en isofluran induktion kammer, opretholde en billeddannelse kassette under scanning og image i FMT imager docking-stationen.
- Fjerne dyret fra buret og sted i isofluran induktion kammer. Luk kammeret og tænde ilt flow og vaporizer til 3-5%.
- Overvåge dyret indtil det er helt bedøvede, normalt inden for 1-2 min. ubevidste dyr bør ikke reagere på eksterne stimuli.
- Fjern de bedøvede dyr fra salen og sætte dyret i imaging kassetten ved at placere Overgangsstikket hovedet først, efterfulgt af placere dyret vender nedad. Kontroller, at hovedet er placeret i midten af kassetten.
- Placer den øverste plade af kassetten på toppen og stramme justeringsknapperne indtil 17 mm.
- Én gang, dyret er sikker i imaging kassetten, Fortsæt til billeddannelse ved at indsætte kassetten i den interne dockingstation i FMT imager, hvor isofluran pumpes for at holde dyret bedøvede.
- Køre imager og analyzer software ved at dobbeltklikke på ikonet software.
- Vælg "Database" og "Studiegruppe" i vinduet "eksperimentelle Tabâ€.
- Gå til vinduet "Fanen Scan" og Vælg emne til billede ved at klikke på "Vælg emne". Også vælge laser kanal i panelet "Laser kanal". Vælg "laser kanal 635 nm" celler FP635-mærket, og for FP720-mærket celler, skal du vælge "laser kanal 680 nm".
- Erhverve et billede ved at klikke på indstillingen "Capture" i vinduet "Scan fane". Derefter justere scanning felt ved at klikke på og trække feltet scan i billedet til en bestemt række kildeplaceringer, normalt inden for 20-25 kilder for den ipsilaterale side.
- Afmærk i indstillingen "Tilføj til genopbygning kø" og slå "Scan" i vinduet "Scan fane".
- Vente, indtil scanningen er afsluttet og derefter fjerne den billeddiagnostiske kassette fra docking-stationen.
- Fjern den øverste plade af kassetten og placere den animalske tilbage ind i buret.
- Gentag trin 3.1-3.12 for resten af dyrene.
4. billedanalyse
- Fra imager og analyzer software, skal du vælge "Analyse fanen" vindue.
- Indlæse datasættet og emne til at analysere ved at klikke på knappen "+" i panelet "Datasæt selection" i vinduet "analyse Tabâ€.
- Når billedet er blevet indlæst i vinduet "Analyse fanen", skal du udføre region af interesse (ROI) analyse ved at vælge ikonet ellipsoide, er placeret i øverste venstre hjørne af vinduet "analyse Tabâ€.
- Justere tærsklen til nul i panelet "statistik data" ved at højreklikke på kolonnen "threshold" i vinduet "analyse Tabâ€.
- Den samlede værdi i panelet "Statistik data" repræsenterer signalet fra de fluorescerende-tagged glioblastom celler implanteret i hjernen, mus.
- Gentag trin 4.2-4.4 for resten af dyrene. Indlæse eller fjerne et nyt emne ved at klikke på "+" eller "−" knappen, henholdsvis i panelet "Datasæt selection" i vinduet "analyse Tabâ€.
Bemærk: Yderligere oplysninger om FMT billedbehandling og software operation, se20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Glioblastom celler U87EGFRvIII (U87 celler over udtrykker EGF receptoren variant III) blev kulturperler ifølge trin 1.2. Lentivirus blev produceret og renset ifølge trin 1.1. Viral koncentrationen var bestemt af p24 ELISA analyse. Celler var transduced med lentivirus transporterer infrarød fluorescerende proteiner ifølge trin 1.8. Plasmid kodning FP72010,11 blev venligst leveret af Dr. V.V. Verkhusha og FP635 vektor blev købt fra en kommerciel leverandør. Target-cellerne var FACS sorteret for at berige for de øverste 10% mest fluorescerende celle befolkning (figur 1A). Øge den fluorescerende signal forbedrer følsomheden af fluorescens tomografi system. For at validere intensiteten af signalerne fra fluorescently mærket celler før orthotopic implantation, brugte vi den phantom kassette af FMT imager. Specifikt, U87EGFRvIII-TurboFP635 og U87EGFRvIII-iRFP720 celler blev dissocieres med trypsin, og 1 x 105, 1 x 106, og 1 x 107 celler blev genopslemmes i 100 µL af is kold PBS, henholdsvis og analyseres. FMT imager giver mulighed for påvisning i 4 kanaler: 635 nm, 680 nm, 750 nm og 780 nm. Langt infrarøde kanaler 750 nm og 780 nm er ikke egnet til denne analyse, fordi der ikke er nogen emissions sådan bølgelængder fra de nær-infrarødt fluorescerende proteiner anvendt (data ikke vist). Derfor, vi analyseret emission signaler på 635 nm og 680 nm. Rapporteret i figur 1, fluorescerende signal billede og intensitet kvantificering for begge FP635 (figur 1B, C) og FP720 (figur 1 d, E), som øger proportionalt som celle antallet stiger. Af note, emission for FP635 er synlige i 635 nm kanalen, men ikke i 680 nm kanalen. Derimod emission for FP720 er synlige i 680 nm kanalen, men ikke i 635 nm kanalen. Dette gør disse to kandidat fluorescerende proteiner velegnet til studier hvor to populationer af celler kan mærkes og overvåges samtidigt ved hjælp af to nær infrarød fluorescerende etiketter.
U87EGFRvIII celler mærket med nær infrarød fluorescerende proteiner blev derefter brugt til orthotopic injektion og i vivo tumor vækst overvågning, som beskrevet i trin 2.1-2.4. Vi brugte de samme cellelinje, dvs., U87EGFRvIII, mærket med forskellige fluorescerende tags, for at udelukke tumor vækst forskellen mellem forskellige kræft celletyper. Musene blev sprøjtet med U87EGFRvIII-TurboFP635 celler, U87EGFRvIII-iRFP720 celler eller en lige kombination (1:1) af to cellelinjer. Ialt 5 x 105 celler i en 5 µL volumen af PBS var injiceres intracranially i 4-5 uger gamle immunkompromitterede athymiske nøgen mus ved hjælp af et stereotactic system og en Hamilton sprøjte, følgende trin 2.3-2.4. Anæstesi var udført af intraperitoneal injektion af ketamin/xylazin. Dyrene blev holdt varm i hele injektion ved hjælp af en vand thermal afrivningsblok og kontrolleret for tegn på angst. Tumor engraftment og vækst blev derefter overvåges af FMT imaging system. Under scanning-sessioner blev musene midlertidigt bedøvede ved hjælp af en 3% isofluran kammer (trin 3.1-3.12). Musene blev derefter placeret i en billeddannelse kassette og afbildet inde laser scanning kamera. Hver mus blev scannet ved hjælp af 635 nm og 680 nm kanaler. Signal kvantificering blev indspillet over tid og mus blev aflivet i starten af neurologiske symptomer, ifølge retningslinjerne for institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC). Som anført i figur 2A, U87EGFRvIII-TurboFP635 emission signal var tydelig i 635 nm kanalen og minimal baggrund signal blev indspillet i 680 nm kanal (tal 2B, C). I kontrast, U87EGFRvIII-iRFP720 celler udsendes i 680 nm kanal viser lille baggrund i 635 nm kanal (tal 2D-F). Endelig musene injiceret med en 1:1 blanding af U87EGFRvIII-TurboFP635 celler og U87EGFRvIII-iRFP720 celler viste øget signal i begge kanaler for varigheden af forsøget (tal 2 g-jeg). Disse data viser, at det er muligt at udnytte infrarød fluorescerende proteiner for dobbelt i vivo billeddannelse af kræft cellepopulationer. Dataene viser også, at forskellige fluorescerende proteiner har en forskellig intensitet i deres signal emission. Her, var FP720 signal intensitet overlegen i forhold til FP635, med øget følsomhed i opdager mindre populationer af kræftceller i en ikke-invasiv overvågning indstilling.
Virkningerne af genhæmning af cancer-relaterede gener på tumorigenisitetsforsøg i prækliniske modeller kan også være undersøgelse med denne protokol. I dette øjemed GBM-kugler (GSC23 og GSC11) var kulturperler (trin 1.2) og transduced med FP720-lentivirus (trin 1,8). Celler, der udtrykker FP720 var FACS sorteret som tidligere beskrevet i trin 1.11-1.13. FP720-mærket celler var Co transduced med lentivirus-kodning shRNA målretning DAXX (shDaxx), eller shRNA kontrol (shLuc) på MOI 516. Celler var kulturperler i 5 dage, adskilles i en enkelt cellesuspension, og 1 x 106 celler blev genopslemmes i 3 µL af PBS for intrakraniel injektion. Effekten af shRNA rettet mod DAXX blev bekræftet af reverse transkription kvantitative polymerase kæde reaktion (RT-qPCR) i GSC23 (figur 3A) og GSC11 (figur 3 c). GBM-iRFP720/shRNA celler blev stereotactically sprøjtet ind striatum immundefekte mus, ifølge trin 2.3-2.4. Dyrene blev observeret for neurologiske tegn og relative fluorescens signal af xenografts blev analyseret af FMT billedbehandlingssystem, kvantificeres ved hjælp af analysesoftwaren, ifølge trin 3.1-4.6. Repræsentative billeder af FMT viser et fald fluorescens signal i mus aflægger med shDAXX/GBM-kugler i forhold til dyr implanteret med shControl (figur 3B og figur 2D) for begge GBM-kugler modeller, bekræfter vores tidligere konstatering16 at DAXX hæmning undertrykker tumorvækst i prækliniske glioblastom modeller.
Figur 1: Standard kurver ved hjælp af celler for phantom og FACS analyse. (A) repræsentative FACS histogrammer af FP720 - og FP635-U87EGFRvIII udtrykker celler (venstre og højre panel, henholdsvis). Gliom celler blev smittet med lentivirus kodning infrarød fluorescerende proteiner og FASC sorteret for at berige for det højeste udtryk for FP720 eller FP635 proteinerne. Repræsentative billeder fremstillet af U87EGFRvIII-TurboFP635 (B) og U87EGFRvIII-iRFP720 (D) imager og analyzer software celle suspensioner ved hjælp af de fantom kassette. Øvre paneler repræsenterer signal i de 635 nm kanal og nederst bedømmelseskomite i 680 nm kanal. Stigning i cellen antallet svarede til en stigning i signalet visualisering. Signal kvantificering af U87EGFRvIII-TurboFP635 (C) og U87EGFRvIII-iRFP720 (E) celler i 635 nm og 680 nm kanaler. Relative fluorescens enheder er angivet i farvebjælken. Fejllinjer udgør S.E.M. fra 3 forskellige scanninger pr. cellesuspension. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: hjerne tumor xenograft model ved hjælp af U87EGFRvIII celler scannet i forskellige kanaler. Repræsentative billeder af fluorescerende signal i 635 nm og 680 nm kanaler fra dyr intracranially implanteret med U87EGFRvIII-turboFP635 (A), U87EGFRvIII-iRFP720 (D) og en blanding kombination (1:1) af U87EGFRvIII-iRFP720: U87EGFRvIII-turboFP635 celler (G). Billeder blev erhvervet på dag 5 efter første scanning. (B, E, H) Signal intensitet overvågning for hver musen over en periode på 5 dage. Hver mus blev scannet i 635 nm kanal (blå søjler) og i 635 nm kanal (røde søjler). Den letteste skygge af bar farve repræsenterer dag 1 af scanning og den mørkeste skygge repræsenterer dagen 5. (C, F, jeg) Relative fluorescens kvantificering viser en direkte sammenligning af signal intensitet fra 635 nm kanalen (blå) og 680 nm kanal (rød) i hele kohorten af mus. Relative fluorescens enheder er angivet i farvebjælken. Data viser middelværdier med standardafvigelse fra 3 forskellige dyr. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: genhæmning i prækliniske glioblastom modeller bruger FMT. Gen expression analyse af DAXX af RT-qPCR i GSC23 (A) og GSC11 (C) gliom patient-afledte celler transduced med lentivirus-kodet shRNAs målretning DAXX (shDaxx) eller shRNA kontrol (shLuc) og FP720. Aflægger repræsentative billeder af fluorescerende signal fra 680 nm kanalen af orthotopically mus implanteret med GSC23-iRFP720 (B) og GSC11-iRFP720 (D) patienten-afledte celler. Stærk fluorescens signal er observeret i dyr implanteret med shRNA kontrol (shLuc) (øverste del af panelet) i forhold til mus implanteret med shRNA-DAXX (shDaxx) (nederste del af panelet), der angiver, at DAXX hæmning undertrykker tumor vækst i prækliniske gliom modeller bestemmes af fluorescens molekylære tomografi. Relative fluorescens enheder er angivet i farvebjælken. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tumor xenografts har været flittigt brugt i kræftforskning og har udviklet en række veletablerede Billeddannende teknikker: BLI; magnetisk resonans imaging (MR); Positron emissions tomografi (PET), beregnet tomografi (CT); FMT. Hver af disse tilgange kommer med fordele og ulemper, men i sidste ende supplerer hinanden med typen af oplysningerne. En af de mest almindeligt anvendte i vivo imaging-teknologi er BLI5,6,7,8. BLI og FMT kræver begge celle engineering (med luciferase enzymer eller infrarød fluorescerende proteiner), der kan påvirke genekspression. BLI er mere følsomme for lille tumor masserne, men kræver intraperitoneal injektion af et substrat (luciferin), som når maksimale distribution i kroppen i 10-12 min. men lys dæmper og spredning under imaging erhvervelse og substrat clearance forekomme ofte9. FMT, kræver derimod ikke nogen yderligere substrat administration til dyr og signalet er stabil og uafhængige af tid eller enzym stabilitet. Derudover tilbyder FMT, når de anvendes i de samme forsøgsbetingelser, reproducerbare semi-kvantitative data. BLI og FMT tilbyder ikke rumlige opløsning; dog kobling disse metoder med CT-scanning adresser problemet.
En CT-scanning foranstaltninger dæmpning af fotoner, når signalet krydser dyrs krop og det er ideelt at identificere organ strukturer. Blødt væv kontrast, som kan interferere med påvisning af en lille intrakraniel tumor, er imidlertid en begrænsning for denne tilgang17,18. En yderligere ulempe ved CT er brugen af stråling og kontrast medier, som kan fremkalde molekylære ændringer i target-cellerne. En CT-scanning kan kombineres med PET, som bruger radiolabeled røbestoffer som den glucose analoge, fluorodeoxyglucose 18F-FDG; men dette kan også påvirke nogle fysiologiske processer i små dyr. Derimod FMT behøver ikke nogen injiceres substrat til at måle tumor masse og det er muligt at måle tumor metabolisme, betændelse, angiogenese, apoptose og andre markører ved hjælp af fluorescently mærket biomarkører19.
Samlet set er en af de mest nyttige og alsidig teknikker til i vivo billeddannelse Mr. Mindre begrænsninger af Mr kan findes i lav erhvervelse tid, lavere følsomhed end PET og nogle instrument-relaterede variationer18,20.
Her, rapportere vi metoden FMT som en alternativ metode til prækliniske glioblastom modeller. Pre-mærkning af target-cellerne med infrarød fluorescerende proteiner (figur 1A-E) og scanning efter implantation i immunkompromitterede dyr kan opnås med et fluorescens tomografi imaging system. Vi rapporterede metoden FMT som en alternativ metode til prækliniske glioblastom modeller. Med denne metode billeddannelse anvendes på et substrat-fri og ikke-invasiv måde, dyrene holdes i et miljø med lav stress og dyb-væv kvantificering kan være udført (figur 2A-jeg, figur 3A, B). Denne protokol kan anvendes til at studere effekten af kombinatorisk behandlinger i prækliniske gliom modeller21, at identificere nye terapeutiske mål for hjerne tumorer16og undersøge nye druggable metaboliske molekyler22, Epigenetiske veje23eller ny kemoterapeutika i kombination med strålebehandling (ikke-offentliggjorte data), og anvendes til andre prækliniske undersøgelser. Vi foreslår også her brug for FMT som en dobbelt i vivo billeddannelse tilgang, når to co-eksisterende, men anderledes, tumor cellepopulationer er beregnet til at blive analyseret.
Nogle begrænsninger med FMT skal tages i betragtning, såsom auto-fluorescens genereret fra nogle organer, der kan interferere med signalet. For eksempel, murine milten og leveren afgiver auto-fluorescens i 680 nm kanal, men ikke på 635 nm. FMT-relaterede eksperimentelle procedurer, der involverer disse organer skal derfor udføres ved hjælp af andre infrarøde fluorescerende proteiner, som FP635. Vi brugte nøgen foxn1-muteret nøgen musene at undgå indblanding i fluorescens signal optagelse; Hvis en anden musemodel skal bruges, anbefales det at barbere området af interesse i dyr. Derudover er denne tilgang også begrænset til at opdage meget lille tumor masserne. Vores erfaring, forbedrer signal-støj-forhold som tumor massen bliver større, endnu inden fremkomsten af eventuelle neurologisk symptom i mus. I virkeligheden, i tidligere eksperimenter udført på orthotopically indsprøjtet PDXs, var vi købedygtig opdager tumorer under en stof regime i mindst 2 uger i mus uden nogen tegn på angst på grund af tumor byrde eller drug administration21. I sidste ende, aggressivitet af hver cellelinje og antallet af injicerede celler vil bestemme længden af hvert forsøg. Dataene viser en lineær proportional forholdet mellem antallet af celler og signal (figur 1B-E), og tumor masse og signal (figur 2); men en generel signal sammenhæng mellem tumor masse og antallet af celler kan ikke anvendes på tværs af forskellige cellelinjer og infrarød proteiner. Signal for hver celle linje/infrarød fluorescerende proteiner kombination skal bestemmes empirisk. Derudover svarer signalet af analysen af celler ved hjælp af phantom (figur 1B, D) ikke til signalet fra intrakranielle xenografts som en dæmpning i signal opstår på grund af kraniet af musen.
Imager og analyzer softwaren giver mulighed for tærskel. Selv om vi ikke bruge nogen tærskel her, giver scanning dyr uden nogen implanterede celler baggrundsstøj, som har tendens til at blive elimineret af genopbygning i tilstedeværelsen af et rigtigt signal. Et par faktorer påvirke signalet intensiteten af xenograft og skal holdes i betragtning: hvert infrarød fluorescerende proteiner har forskellige emission spektrum og intensitet, med FP720 at være en af de mest fluorescerende proteiner anvendes eksperimentelt10 ,11; hver cellelinje giver mulighed for en rigelige, men begrænset, mængden af protein produktion, således påvirke den maksimale fluorescens opnåelige. Endelig FMT imager er setup med intern standard kurver for specifikke stoffer, derfor er det vigtigt at overveje hvilken stof har det tætteste emission spektrum til infrarød fluorescerende protein bruges til at mærke cellerne. Selvom veltolereret, anbefales det at bestemme potentielle cytotoksiske virkninger medieret af overekspression af infrarød proteiner8,9. Desuden, vi anbefaler at bruge kohorter af mus af mindst 8 pr. eksperimentelle gruppe, som kan opstå tab af data og mus, kirurgiske indgreb eller variation i kræft celle engraftment, ikke desto mindre tilføjer dette Statistisk signifikans til undersøgelsen. Vi anbefaler også seriefremstillede scanne den dyrs kohorte for mere end én dag og analysere signal emission på samme tid, siden variationer i imaging kassette dybden og fluorescerende signal rekonstruktion kan interferere med den endelige signal kvantificering. For at løse dette problem, analyzer software giver mulighed for mindre ændringer i laser intensitet (fra normal til høj og meget høj), selv om vores erfaring det endelige resultat ikke er dramatisk anderledes. En sidste bemærkning vedrørende omkostningseffektivitet er, at FMT imaging system nemt kan deles som en kerne instrument blandt forskellige laboratorier, som hjælper med at afholde sine indkøb og vedligeholdelse omkostninger. Afslutningsvis, er at FMT en værdifuld ressource, der gør eksperimentelle og præklinisk evaluering af i vivo tumorvækst nem og pålidelig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Frederick Lang, MD Anderson Cancer Center for GBM-PDX neurospheres. Dette arbejde blev støttet af nederlag GBM forskning Collaborative, et datterselskab af National hjerne Tumor Society (Frank Furnari), R01-NS080939 (Frank Furnari), James S. McDonnell Foundation (Frank Furnari); Jorge Benitez blev støttet af en award fra den amerikanske hjerne Tumor Association (ABTA); Ciro Zanca blev delvist støttet af en amerikansk-italienske Cancer Foundation postdoc research fellowship. Frank Furnari modtager løn og supplerende støtte fra Ludwig Institut for kræftforskning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/High Glucose | HyClone/GE | SH30022.1 | |
| DMEM/F12 1:1 | Gibco | 11320-082 | |
| FBS | HyClone/GE | SH30071.03 | |
| Accutase | Innovative cell technologies | AT-104 | |
| Trypsin | HyClone/GE | SH30236.01 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504044 | |
| human recombinant EGF | Stemcell Technologies | 2633 | |
| human recombinant FGF | Stemcell Technologies | 2634 | |
| DPBS | Corning | 21-031-00 | |
| FACS tubes | Falcon | 352235 | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
| Blasticidin | ThermoFisher Scientific | A1113903 | |
| p24 ELISA | Clontech | 632200 | |
| Xylazine | Akorn | NDC 59399-110-20 | |
| Ketamine | Zoetis | NADA 043-403 | Controlled substance |
| Ointment | Dechron | NDC 17033-211-38 | |
| Absorbable suture | CpMedical | VQ392 | |
| 5 ul syringe | Hamilton | 26200-U | Catalog number as sold by Sigma-Aldrich |
| Cell Sorter | Sony | SH8007 | |
| Mouse stereotaxic frame | Stoelting | 51730 | |
| Motorized stereotaxic injector | Stoelting | 53311 | |
| Micromotor hand-held drill | Foredom | K1070 | |
| Mouse warming pad | Ken Scientific Corporation | TP-22G | |
| Fluorescence Tomography System | PerkinElmer | FMT 2500 XL | |
| TrueQuant Imaging Software | Perkin Elmer | 7005319 | |
| Ultra-centrifuge Optima L-80 XP | Beckman Coulter | 392049 | |
| Tissue Culture 100mm Dishes | Olympus Plastics | 25-202 | |
| Tissue Culture 150mm Dishes | Olympus Plastics | 25-203 | |
| Tissue Culture Flasks T75 | Corning | 430720U | |
| 50 mL conical tubes | Corning | 430290 | |
| 15 mL conical tubes | Olympus Plastics | 28-101 | |
| Centrifuge Avanti J-20 | Beckman Coulter | J320XP-IM-5 | |
| Tube, Polypropylene, Thinwall, 5.0 mL | Beckman Coulter | 326819 | |
| Tube, Thinwall, Polypropylene, 38.5 mL, 25 x 89 mm | Beckman Coulter | 326823 | |
| Athymic nude mice | Charles River Laboratories | Strain Code 490 (Homozygous) | Prior approval by the Institutional Animal Care Program and by the Institutional Biosafety Committee required. |
References
- Ostrom, Q. T., et al. CBTRUS Statistical Report: Primary Brain and Other Central Nervous System Tumors Diagnosed in the United States in 2009-2013. Neuro-Oncology. 18 (suppl_5), v1-v75 (2016).
- Pauli, C., et al. Personalized In Vitro and In Vivo Cancer Models to Guide Precision Medicine. Cancer Discovery. 7 (5), 462-477 (2017).
- Stewart, E. L., et al. Clinical Utility of Patient-Derived Xenografts to Determine Biomarkers of Prognosis and Map Resistance Pathways in EGFR-Mutant Lung Adenocarcinoma. Journal of Clinical Oncology. 33 (22), 2472-2480 (2015).
- Gao, H., et al. High-throughput screening using patient-derived tumor xenografts to predict clinical trial drug response. Nat Med. 21 (11), 1318-1325 (2015).
- Ozawa, T., James, C. D. Establishing Intracranial Brain Tumor Xenografts With Subsequent Analysis of Tumor Growth and Response to Therapy using Bioluminescence Imaging. J. Vis. Exp. (41), e1986 (2010).
- Kondo, A., et al. An experimental brainstem tumor model using in vivo bioluminescence imaging in rat. Child's Nervous System. 25 (5), 527-533 (2009).
- Nyati, S., Young, G., Ross, B. D., Rehemtulla, A. ATM Kinase: Methods and Protocols. Kozlov, S. V. , Springer. New York. 97-111 (2017).
- Kondo, A., et al. Longitudinal assessment of regional directed delivery in a rodent malignant glioma model. J Neurosurg Pediatr. 4 (6), 592-598 (2009).
- Badr, C. E. Bioluminescent Imaging: Methods and Protocols. Badr, C. E. , Humana Press. 1-18 (2014).
- Shcherbakova, D. M., Verkhusha, V. V. Near-infrared fluorescent proteins for multicolor in vivo imaging. Nat Meth. 10 (8), 751-754 (2013).
- Filonov, G. S., et al. Bright and stable near-infrared fluorescent protein for in vivo imaging. Nat Biotech. 29 (8), 757-761 (2011).
- Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. Production and purification of lentiviral vectors. Nat. Protocols. 1 (1), 241-245 (2006).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). J. Vis. Exp. (41), e1546 (2010).
- Pritchett-Corning, K. R., Luo, Y., Mulder, G. B., White, W. J. Principles of rodent surgery for the new surgeon. J Vis Exp. (47), (2011).
- Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nat. Protocols. 1 (6), 3166-3173 (2007).
- Benitez, J. A., et al. PTEN regulates glioblastoma oncogenesis through chromatin-associated complexes of DAXX and histone H3.3. Nature Communications. 8, 15223 (2017).
- Kirschner, S., et al. Imaging of Orthotopic Glioblastoma Xenografts in Mice Using a Clinical CT Scanner: Comparison with Micro-CT and Histology. PLOS ONE. 11 (11), e0165994 (2016).
- Mannheim, J. G., et al. Standardization of Small Animal Imaging-Current Status and Future Prospects. Molecular Imaging and Biology. , (2017).
- Engblom, C., et al. Osteoblasts remotely supply lung tumors with cancer-promoting SiglecFhigh neutrophils. Science. 358 (6367), (2017).
- Lauber, D. T., et al. State of the art in vivo imaging techniques for laboratory animals. Laboratory Animals. 51 (5), 465-478 (2017).
- Zanca, C., et al. Glioblastoma cellular cross-talk converges on NF-κB to attenuate EGFR inhibitor sensitivity. Genes & Development. 31 (12), 1212-1227 (2017).
- Villa, G. R., et al. An LXR-Cholesterol Axis Creates a Metabolic Co-Dependency for Brain Cancers. Cancer Cell. 30 (5), 683-693 (2016).
- Liu, F., et al. EGFR Mutation Promotes Glioblastoma through Epigenome and Transcription Factor Network Remodeling. Molecular Cell. 60 (2), 307-318 (2015).
