Summary
Orthotopic intracraniële injectie van tumorcellen wordt in kankeronderzoek te bestuderen hersenen tumor biologie, progressie en evolutie therapeutische respons uitgegaan. Hier presenteren we fluorescentie moleculaire tomografie van tumor xenografts, die biedt real-time intravital imaging en kwantificering van een tumor massa in preklinische glioblastoma modellen.
Abstract
Tumorigeniciteit is de mogelijkheid van kankercellen vormen een tumor massa. Een veel gebruikte aanpak om te bepalen of de cellen tumorigene is subcutaan injecteren van immunodeficiëntie muizen met kankercellen en het meten van de massa van de tumor na zichtbaar en voelbaar wordt. Orthotopic injecties van kankercellen streven naar de invoering van de xenograft in de communicatie dat het meest lijkt het weefsel van oorsprong van de tumor worden bestudeerd. Hersenen kankeronderzoek vereist intracraniële injectie van kankercellen om de vorming van de tumor en analyse in de unieke communicatie van de hersenen. De in vivo beeldvorming van intracraniële xenografts controleert onmiddellijk de tumor massa van orthotopically geaccepteerd muizen. Wij rapporteren hier het gebruik van fluorescentie moleculaire tomografie (FMT) van hersenen tumor xenografts. De kankercellen zijn eerste getransduceerde met in de buurt van infrarood fluorescente proteïnen en vervolgens geïnjecteerd in de hersenen van immuungecompromitteerde muizen. De dieren worden vervolgens gescand om kwantitatieve informatie over de tumor massa over een langere periode van tijd. Cel vooraf labeling zorgt voor betrouwbare, rendabele en reproduceerbare kwantificering van de tumor lasten binnen elke muis. Wij geëlimineerd de noodzaak voor het injecteren van imaging substraten en zo verminderd de stress bij de dieren. Een beperking van deze aanpak is vertegenwoordigd door het onvermogen om het detecteren van zeer kleine massa's; het heeft echter een betere resolutie voor grotere massa dan andere technieken. Het kan worden toegepast om te evalueren van de effectiviteit van een medicamenteuze behandeling of genetische wijzigingen van glioma cellijnen en patiënt afkomstige monsters.
Introduction
Kanker is één van de belangrijkste oorzaken van ziekte-gerelateerde sterfgevallen bij de mens in de geïndustrialiseerde wereld. Nieuwe behandelingen zijn met een extreem hoge dodental, dringend noodzakelijk. Glioblastoma multiforme (GBM) is een uiterst dodelijk soort hersenkanker, samengesteld uit heterogene populaties van tumor, stromale en immuun hersencellen. Volgens het register van de tumor centrale hersenen van de VS is de incidentie van primaire kwaadaardige en niet-kwaadaardige hersentumoren ongeveer 22 gevallen per 100.000. Ongeveer 11.000 nieuwe gevallen worden verwacht te worden gediagnosticeerd in de VS in 20171.
Preklinische studies onderzoeken de waarschijnlijkheid van een drug, procedure of behandeling effectief vóór de test bij de mens. Een van de vroegste stappen van het laboratorium in preklinische studies is het identificeren van potentiële moleculaire targets voor medicamenteuze behandeling met behulp van kankercellen ingeplant in een ontvangende organisme, gedefinieerd als menselijke xenograft modellen. Binnen deze context intracraniële hersenen tumor xenograft modellen met behulp van de patiënt-afgeleide xenografts (PDXs) hebben op grote schaal gebruikt om te bestuderen hersenen tumor biologie, progressie en evolutie therapeutische respons, en meer recentelijk voor biomarkers ontwikkeling, drug screening, en gepersonaliseerde geneeskunde2,3,4.
Een van de meest betaalbare en niet-invasieve in vivo imaging methoden voor het controleren van intracraniële xenografts is de Bioluminescentie imaging (BLI)5,6,7,8. Enkele BLI beperkingen omvatten echter substraat administratie en beschikbaarheid, enzym stabiliteit, en lichte blussen en verstrooiing tijdens imaging overname9. Hier melden we de infrarood FMT als alternatief imaging methode voor het controleren van preklinische glioblastoma modellen. Deze methode, signaal overname en kwantificering van intracranially geïmplanteerde PDXs geven uiting aan een nabij-infrarood fluorescent proteïne iRFP72010,11 (voortaan aangeduid als FP720) of turboFP635 (voortaan aangeduid als FP635), wordt uitgevoerd met een FMT imaging systeem. Met de technologie van FMT de orthotopic tumoren kunnen worden gecontroleerd in vivo vóór, tijdens of na de behandeling, in een niet-invasieve, substraat-vrije en kwantitatieve wijze voor preklinische waarnemingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het gebruik van experimenteel onderzoek dieren en infectieuze agentia, zoals lentivirus aan transduce van de kankercellen, vereisen voorafgaande toestemming door de institutionele dierenverzorgers programma en door de Commissie institutionele bioveiligheid. Dit protocol volgt de richtsnoeren van de verzorging van de dieren van de Universiteit van Californië-San Diego (UCSD).
1. etikettering van Glioblastoma cellen met FP635 of FP720 Construct
- Produceren en te zuiveren lentivirus volgens het protocol beschreven door Tiscornia et al. 12
- Cultuur ongeveer 2.0 x 106 cellen uit een menselijke glioma cel-lijn met DMEM plus 10% foetale runderserum (FBS) in een schotel 15 cm; of cultuur 2.0 x 106 menselijke glioblastoma patiënt afkomstige (GBM-PDX) gebieden met DMEM/F12 1:1 medium met B27 supplement plus menselijke recombinante epidermale groeifactor (EGF; 20 ng/mL) en FGF (10 ng/mL) in een maatkolf van T75.
- Behouden alle cellen bij 37 ° C, 5% CO2, en 100% relatieve vochtigheid.
- Distantiëren van de cellen.
- Voor de glioma cellen: Verwijder de bovendrijvende vloeistof uit de platen en 3-5 mL trypsine 1 X aan de glioma cellen toe te voegen.
- Voor de GBM gebieden: de cellen verzamelen door de cellen in een buis 15 mL pipetteren.
- Spin down de GBM sferen bij 200 x g gedurende 5 min met behulp van een tafelblad centrifuge bij kamertemperatuur.
- Verwijder het supernatant en voeg 3-5 mL cell detachement oplossing.
- Incubeer alle cellen bij 37 ° C gedurende 10-15 min.
- Zorgvuldig distantiëren van de cellen door pipetteren op en neer meerdere malen (zorgen dat bollen en glioma cellen zijn voltooid losgekoppeld) en spin down bij 200 x g gedurende 5 min.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen met 5 mL medium door pipetteren op en neer meerdere malen. Het bepalen van de levensvatbaarheid van de cellen door trypan blauwe uitsluiting.
- Plaat 1.0 x 106 van doelcellen in een 10-cm schotel met 5 mL medium door pipetteren.
- Cellen met lentivirus uiting van fluorescente proteïnen op de veelheid van infectie (MOI) 5 zoals is beschreven door Tiscornia et al. transduce 12 en Incubeer bij 37 ° C.
- Na 24u, verwijder het medium van de getransduceerde cellen, voeg 5 mL van verse medium en incubeer gedurende extra 48 uur bij 37 ° C.
- De geïnfecteerde cellen in een suspensie van eencellige zoals beschreven in stappen 1.4-1.6 distantiëren. Spin down de cellen bij 200 x g gedurende 5 min en resuspendeer in 500 µL van het sorteren van de oplossing (met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) met 1% FBS).
- Pipetteer de celsuspensie in FACS buizen. Co vlek de cellen met 1 µL/mL 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) dihydrochloride uit te sluiten van de dode cellen. Negatieve controles zijn vereist voor het instellen van de stroom cytometer poorten (niet-getransduceerde cellen en niet-getransduceerde cellen / DAPI gekleurd).
- De TL-positieve/DAPI-negatieve cellen in oplossing, sorteren sorteren, zoals beschreven door Basu et al. 13, en het verzamelen van de gesorteerde cellen in een conische buis 15 mL.
- Spin down de gesorteerde cellen bij 200 x g gedurende 5 minuten, verwijder het supernatant en resuspendeer in 5 mL gestolde voedingsbodem. Zaad de gesorteerde cellen in een 10-cm schotel door pipetteren. Incubeer bij 37 ° C gedurende ten minste 48-72 uur.
- Uitbreiden van de gesorteerde cellen door te distantiëren van de cellen als volgt 1.4-1.6 en plating in veelvoudige schotels voor in vivo experimenten.
Opmerking: Voor meer informatie over de cel sorteren van voorbereiding en zuivering, zie Basu et al. 13
2. intracraniële injectie van iRFP-gelabeld Glioblastoma cellen in immunodeficiëntie muizen
Opmerking: Voordat u begint de chirurgie, zorg ervoor dat de chirurgische kamer en hulpmiddelen schoon voor de procedure zijn. Gebruik immunodeficiëntie athymic naakt (Foxn1nu) mannelijk of vrouwelijk muizen, tussen 4-5 weken oud en 17-19 g voor intracraniële injecties. Dieren moeten worden gehuisvest gedurende ten minste 3 dagen na aankomst en voor de operatie.
- Voorbereiding van de cel
- Oogst en distantiëren van fluorescerende positief-glioma cellen in een suspensie van eencellige (stappen 1.4-1.6) en resuspendeer 0,5 of 1.0 x 106 cellen in 2-5 µL van PBS per injectie per dier. Pipetteer de celsuspensie in een 1.5-mL microcentrifuge buis en plaats op het ijs.
- Anesthesie-voorbereiding en toediening
- 200 µL van zoutoplossing met ketamine (100 mg/kg) en xylazine (10 mg/kg) per 20 gram lichaamsgewicht muis voor te bereiden. Weeg de dieren en het berekenen van de juiste dosis van de verdoving.
- Bieden een intraperitoneale injectie van anesthesie en oogheelkundige zalf van toepassing op de ogen om uitdroging te voorkomen. Zie voor meer informatie over deze stap Kathleen et al. 14 Place het dier op een voorverwarmde water thermische pad bij 37 ° C.
- Controleren dat de dieren door het toezicht van de teen snuifje reactie (pedaal reflex), meestal binnen 5-10 min zijn verdoofd.
- Intracraniële injectie
- Laden van een 5 µL Hamilton injectiespuit (naald botte uiteinde) met celsuspensie en houder van de houder van de sonde.
- Plaatst u de muisaanwijzer in een kleine dierlijke stereotactische frame en op te lossen het hoofd met behulp van de oor-balken en de adapter van de snijtand volgend op de beschreven details door Cetin et al. 15
- Desinfecteer het hoofd met 70% ethanol en betadine oplossing. Zorg ervoor dat de chirurgische site is volledig steriel. Het uitvoeren van een middelste incisie met een kleine scalpel en scheiden van de huid en bindweefsel.
- Plaats de injectiespuit Hamilton op het punt van de bregma met behulp van de micromanipulator.
- De sonde houder 1,0 mm anteroposterior en 2.0 mm laterale verplaatsen vanaf het punt van de bregma. Markeer deze plaats met een potlood.
- Op deze locatie, zorgvuldig Maak een gat in de schedel met een micromotor hand-held boor door lichte druk naar beneden toe te passen totdat de bloedvaten zichtbaar worden. De arachnoideavilli mater en hersenen parenchym niet verstoren.
- Breng de naald in het burr gat en vooraf 3.0 mm onder het pial oppervlak.
- Instellen van het volume (2-5 µL) en stroomsnelheid (1 µL/min) van injectie met behulp van een gemotoriseerde stereotaxic injector of handmatig uitvoeren van de injectie.
- Na de injectie, verwijder de naald geleidelijk door oplopend van 1,0 mm elke 1 min en reinig van de injectieplaats met 70% ethanol.
- Dicht de huid gewikkeld met chirurgische nietjes of door het maken van chirurgische hechtingen (vaak aangeduid als de hechtingen) en Kathleen et al. Zie 14 voor meer details.
- Dierlijke herstel
- Het dier overbrengen in een water thermische pad (37 ° C) en het controleren van de lichaamstemperatuur, ademhalingsfrequentie en hartslag, tot volledig herstel. Analgesia per standaardprotocollen beheren.
Opmerking: Zie voor meer informatie over de stereotactische procedure, chirurgie en coördinaten, andere verslagen5,14,15.
- Het dier overbrengen in een water thermische pad (37 ° C) en het controleren van de lichaamstemperatuur, ademhalingsfrequentie en hartslag, tot volledig herstel. Analgesia per standaardprotocollen beheren.
3. FMT Imaging
Opmerking: Volgens de experimentele doel, de iRFP-gelabeld glioblastoma cellen kunnen worden gecontroleerd in vivo vóór, tijdens of na de behandeling. Voor imaging-doel, anesthetize van dieren met behulp van een Isofluraan inductie kamer, onderhouden in een imaging cassette tijdens het scannen, en beeld in de dokkende post van de imager FMT.
- Het dier uit de kooi en de plaats in de zaal van de inductie Isofluraan verwijderen. Sluit de zaal en zuurstof stroom en vaporizer tot 3-5% inschakelen.
- Controleren van het dier totdat het volledig verdoofd is, meestal binnen 1-2 min. onbewuste dieren moeten niet reageren op externe prikkels.
- Verwijderen van de narcose dier uit de kamer en zet het dier in de beeldvorming cassette door het plaatsen van de hoofd adapter eerst, gevolgd door het plaatsen van het dier naar beneden gericht. Zorg ervoor dat het hoofd in het centrum van de cassette ligt.
- De bovenste plaat van de cassette plaats op bovenkant en draai de knoppen van de aanpassing tot 17 mm.
- Eens dat het dier is veilig in de beeldvorming cassette, gaat u verder met de beeldvorming door het invoegen van de cassette in de interne dokkende post van de FMT imager, waar de Isofluraan wordt gepompt om te houden van het dier verdoofd.
- Voer de imager en analyzer software door te dubbelklikken op het pictogram software.
- Selecteer in het venster "Experimental lusje", de "Database" en een "Studiegroep".
- Ga naar het "Scan lusje"-venster en selecteer het onderwerp naar afbeelding door te klikken op "Selecteer onderwerp". Ook, selecteer het laser-kanaal in het deelvenster 'Laser kanaal'. De FP635-geëtiketteerden cellen, selecteert u "laser kanaal 635 nm" en voor FP720-geëtiketteerden cellen, selecteert u "laser kanaal 680 nm".
- Het verwerven van een afbeelding door te klikken op de optie "Capture" in het "Scan lusje" venster. Pas vervolgens, de scan veld aan te klikken en de scan-veld in het opgenomen beeld naar een bepaald aantal locaties van de bron, meestal in 20-25 bronnen voor de ipsilaterale kant te slepen.
- Vink de optie "Toevoegen aan wederopbouw wachtrij" en druk op "Scannen" in het "Scan lusje" venster.
- Wacht totdat het aftasten wordt voltooid en vervolgens de imaging cassette verwijderen uit het docking-station.
- Verwijder de bovenste plaat van de cassette en plaats van de dierlijke terug in de kooi.
- Herhaal de stappen 3.1-3.12 voor de rest van de dieren.
4. de beeldanalyse
- Selecteer in het vak de imager en analyzer software, de "Analyse van het lusje" venster.
- De dataset en het onderwerp te analyseren door te klikken op de knop "+" in het "Dataset selectie"-paneel van de "Analyse van het lusje" venster geladen.
- Nadat de afbeelding is geladen in het venster "Analyse van het lusje", uitvoeren de regio van belang (ROI) analyse door het selecteren van de ellipsoïde icoon in de linker bovenhoek van het venster "Analyse van het lusje".
- Aanpassen van de drempel tot nul in het "statistische gegevens"-paneel door rechts te klikken op de "drempel" kolom in het venster "Analyse van het lusje".
- De totale waarde in het "Statistische gegevens"-deelvenster vertegenwoordigt het signaal uit de cellen van de TL-gelabeld glioblastoma geïmplanteerd in de hersenen van de muis.
- Herhaal stap 4.2-4.4 voor de rest van de dieren. Laden of een nieuw onderwerp verwijderen door te klikken op de "+" of "−" knop, respectievelijk in het deelvenster 'Dataset selection' van het venster "Analyse van het lusje".
Opmerking: Zie voor meer informatie over FMT beeldvorming en werking van de software,20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Glioblastoma U87EGFRvIII cellen (U87 cellen overdreven uiten het EGF receptor variant III) volgens de stap 1.2 werden gekweekt. Lentivirus werd geproduceerd en gezuiverd volgens stap 1.1. De virale concentratie werd bepaald door p24 ELISA analyse. Cellen werden getransduceerde met lentivirus infrarood fluorescente proteïnen volgens stap 1.8 uitvoering. Het plasmide codering FP72010,11 werd vriendelijk geleverd door Dr. V.V. Verkhusha en de vector FP635 werd gekocht van een commerciële leverancier. Doelcellen waren FACS gesorteerd om te verrijken voor de bovenste 10% meest fluorescerende celpopulatie (figuur 1A). Uitbreiding van het fluorescerende signaal verbetert de gevoeligheid van de fluorescentie tomografie systeem. Voor het valideren van de intensiteit van de signalen van fluorescently-geëtiketteerden cellen vóór orthotopic, gebruikten we de phantom cassette van de imager FMT. Specifiek, U87EGFRvIII-TurboFP635 en U87EGFRvIII-iRFP720 cellen werden losgekoppeld met trypsine en 1 x 105, 1 x 106, en 1 x 107 cellen werden geresuspendeerde in 100 µL van ijs koud PBS, respectievelijk en geanalyseerd. De FMT imager voorziet detectie in 4 kanalen: 635 nm, 680 nm, 750 nm en 780 nm. Ver infrarood kanalen 750 nm en 780 nm zijn niet geschikt voor deze analyse, omdat er geen emissie bij dergelijke golflengten van het nabij-infraroodspectrum fluorescerende eiwitten gebruikt (gegevens niet worden weergegeven). Daarom, geanalyseerd wij de signalen van de uitstoot op 635 nm en 680 nm. Gerapporteerd in Figuur 1, de fluorescent signaal beeld en intensiteit kwantificering voor beide FP635 (figuur 1B, C) en FP720 (Figuur 1 d, E), waarmee de proportioneel als de cel nummer verhogingen worden verhoogd. Van de nota, de emissie voor FP635 is zichtbaar in de 635 nm-kanaal, maar niet in de 680 nm-kanaal. In tegenstelling, de emissie voor FP720 is zichtbaar in de 680 nm-kanaal, maar niet in de 635 nm-kanaal. Dit maakt deze twee kandidaat-fluorescerende eiwitten geschikt voor studies waar twee populaties van cellen kunnen worden gelabeld en bewaakt tegelijkertijd met twee in de buurt van infrarood fluorescerende etiketten.
U87EGFRvIII cellen met het label in de buurt van infrarood fluorescente proteïnen werden vervolgens gebruikt voor orthotopic injectie en in vivo tumor groei toezicht, zoals beschreven in stappen 2.1-2.4. We dezelfde cellijn, dat wil zeggen, U87EGFRvIII, aangeduid met verschillende fluorescente markeringen, gebruikt om te sluiten van de tumor groei verschil tussen verschillende kanker celtypes. De muizen waren geïnjecteerd met cellen van de U87EGFRvIII-TurboFP635, U87EGFRvIII-iRFP720-cellen, of een gelijkwaardige combinatie (1:1) van de twee cellijnen. Een totaal van 5 x 105 cellen in een volume van 5 µL van PBS waren geïnjecteerd intracranially in 4-5 weken oude immuungecompromitteerde athymic naakt muizen met behulp van een stereotactische systeem en een spuit van Hamilton, volgende stappen 2.3-2.4. Anesthesie werd bereikt door intraperitoneale injectie van ketamine/xylazine. De dieren werden gehouden warm gedurende de injectie met behulp van een thermische pad van water en gecontroleerd op tekenen van nood. Engraftment van de tumor en groei werd vervolgens gecontroleerd door de FMT imaging systeem. Tijdens het scannen sessies, waren de muizen tijdelijk verdoofd met behulp van een 3% Isofluraan kamer (stappen 3.1-3.12). De muizen waren dan in een imaging cassette geplaatst en binnen de laser scannen camera beeld. Elke muis is gescand met behulp van de 635 nm en 680 nm kanalen. De kwantificering signaal werd opgenomen na verloop van tijd en muizen werden euthanized aan het begin van neurologische symptomen, volgens de richtlijnen van de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC). Zoals aangegeven in figuur 2A, U87EGFRvIII-TurboFP635 emissie signaal bleek in de 635 nm kanaal en minimale achtergrond signaal werd opgenomen in de 680 nm kanaal (cijfers 2B, C). In contrast, U87EGFRvIII-iRFP720 cellen uitgestoten in de 680 nm kanaal tonen wat achtergrond in de 635 nm kanaal (cijfers 2D--F). Tenslotte toonde muizen ingespoten met een mengeling van de 1:1 van de U87EGFRvIII-TurboFP635 cellen en U87EGFRvIII-iRFP720 cellen verhoogde signaal in beide kanalen voor de duur van het experiment (cijfers 2 g-ik). Deze gegevens laten zien dat het mogelijk is te gebruiken van infrarood fluorescente proteïnen voor dual in vivo imaging van kanker-cel populaties. De gegevens blijkt ook dat verschillende TL eiwitten een verschillende intensiteit in hun signaal emissie hebben. Hier, was FP720 signaal intensiteit superieur aan FP635, met verhoogde gevoeligheid voor het opsporen van kleinere bevolking van kankercellen in een niet-invasieve monitoring instelling.
Ook kan de effecten van gen tot zwijgen brengen van kanker-gerelateerde genen op tumorigeniciteit in preklinische modellen studie met dit protocol. Voor dit doel, GBM-bollen (GSC23 en GSC11) werden gekweekt (stap 1.2) en getransduceerde met FP720-lentivirus (stap 1.8). Cellen uiten van FP720 waren FACS gesorteerd zoals eerder is beschreven in stappen 1.11-1.13. FP720-geëtiketteerden cellen waren mede getransduceerde met lentivirus-encoding shRNA targeting DAXX (shDaxx), of shRNA controle (shLuc) op de MOI 516. Cellen werden gekweekt voor 5 dagen, in een enkele celsuspensie, losgekoppeld en 1 x 106 cellen werden geresuspendeerde in 3 µL van PBS voor intracraniële injectie. De werkzaamheid van de shRNA targeting DAXX werd bevestigd door omgekeerde transcriptie kwantitatieve polymerasekettingreactie (RT-qPCR) in GSC23 (Figuur 3 bis) en GSC11 (Figuur 3 c). GBM-iRFP720/shRNA cellen werden stereotactically in het striatum van immunodeficiëntie muizen, geïnjecteerd volgens stappen 2.3-2.4. Dieren werden waargenomen voor neurologische symptomen en het signaal van de relatieve fluorescentie van de xenografts werden geanalyseerd door de FMT imaging systeem, gekwantificeerd aan de hand van de software van de analyse, volgens stappen 3.1-4.6. Representatieve beelden van FMT tonen een daling van de fluorescentie signaal in muizen geaccepteerd met shDAXX/GBM-bollen in vergelijking met dieren geïmplanteerd met shControl (figuur 3B en figuur 2D) voor beide modellen van GBM-sferen, bevestigen onze eerdere bevinding16 dat DAXX remming tumorgroei in preklinische glioblastoma modellen onderdrukt.
Figuur 1: standaard curven cuvetten voor phantom en FACS analyse. (A) representatieve FACS histogrammen van FP720 - en FP635-U87EGFRvIII uiten van cellen (links en rechts paneel, respectievelijk). Glioma cellen besmet waren met lentivirus codering infrarood fluorescente proteïnen en FASC gesorteerd om te verrijken voor de hoogste expressie van de FP720 of FP635 eiwitten. Representatieve beelden verkregen de imager en analyzer software van U87EGFRvIII-TurboFP635 (B) en U87EGFRvIII-iRFP720 (D) cel suspensies met behulp van de phantom cassette. Bovenste panelen vertegenwoordigen het signaal in de 635 nm kanaal en onderste panelen in de 680 nm-kanaal. Toename van de cel nummer kwam overeen met een toename van de visualisatie van het signaal. Signaal kwantificering van U87EGFRvIII-TurboFP635 (C) en U87EGFRvIII-iRFP720 (E) cellen in 635 nm en 680 nm kanalen. Relatieve fluorescentie eenheden staan vermeld in de kleurenbalk. Foutbalken vertegenwoordigen S.E.M. uit 3 verschillende scans per celsuspensie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Brain tumor xenograft model met behulp van U87EGFRvIII cellen gescand in verschillende kanalen. Representatieve beelden van fluorescent signaal 635 nm en 680 nm kanalen van dieren intracranially geïmplanteerd met een mix combinatie (1:1) van U87EGFRvIII-iRFP720, U87EGFRvIII-turboFP635 (A) en U87EGFRvIII-iRFP720 (D): U87EGFRvIII-turboFP635 cellen (G). Beelden werden verworven op dag 5 na het eerste scannen. (B, E, H) Signaal intensiteit monitoring voor elke muis over een periode van 5 dagen. Elke muis werd gescand in het 635 nm kanaal (blauwe staven) en in de 635 nm kanaal (rode balken). De lichtste schaduw van de bar van de kleur vertegenwoordigt dag 1 scannen en de donkerste schaduw vertegenwoordigt dag 5. (C, F, I) Relatieve fluorescentie kwantificering waaruit blijkt dat een directe vergelijking van de signaalsterkte van de 635 nm kanaal (blauw) en 680 nm kanaal (rood) in de hele cohort van muizen. Relatieve fluorescentie eenheden staan vermeld in de kleurenbalk. Gegevens blijkt de gemiddelde waarden met standaardafwijking van 3 verschillende dieren. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Gene zwijgen in preklinische glioblastoma modellen met behulp van FMT. Gen expressie analyse van DAXX door RT-qPCR in GSC23 (A) en GSC11 (C) glioma patiënt-afgeleide cellen getransduceerde met lentivirus-gecodeerde shRNAs dat targeting DAXX (shDaxx) of shRNA controle (shLuc) en FP720. Representatieve beelden van fluorescent signaal uit de 680 nm kanaal van orthotopically geaccepteerd muizen geïmplanteerd met GSC23-iRFP720 (B) en (D) GSC11-iRFP720 patiënt-afgeleide cellen. Sterke fluorescentie signaal wordt waargenomen bij dieren geïmplanteerd met shRNA Control (shLuc) (bovenste gedeelte van het paneel) in vergelijking met muizen geïmplanteerd met shRNA-DAXX (shDaxx) (onderste gedeelte van het paneel), die aangeeft dat DAXX remming tumor onderdrukt groei in preklinische glioma modellen bepaald door fluorescentie moleculaire tomografie. Relatieve fluorescentie eenheden staan vermeld in de kleurenbalk. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tumor xenografts zijn uitgebreid gebruikt in kankeronderzoek en een aantal gevestigde beeldvormingstechnieken uitgewerkt: BLI; magnetische resonantie imaging (MRI); positron emissie tomografie (PET), berekend tomografie (CT); FMT. Elk van deze benaderingen komt met voors en tegens, maar uiteindelijk elkaar aanvullen met het type van de verstrekte informatie. Een van de meest gebruikte in vivo imaging technologie is BLI5,,6,,7,8. BLI FMT zowel vereist als in cel engineering (met luciferase enzymen of infrarood fluorescerende eiwitten) die genexpressie kan beïnvloeden. BLI is gevoeliger voor kleine tumor massa maar vereist intraperitoneale injectie van een substraat (luciferine), die maximale verdeling in het lichaam in 10-12 min bereikt; maar lichte blussen en verstrooiing tijdens imaging verwerving en substraat mijnen vaak optreden9. FMT, in plaats daarvan vereist geen eventuele extra substraat toediening aan de dieren en het signaal is stabiel en onafhankelijk van tijd of enzym stabiliteit. Daarnaast biedt FMT, wanneer gebruikt in dezelfde experimentele omstandigheden reproduceerbare semi-kwantitatieve gegevens. BLI en FMT beide bieden geen ruimtelijke resolutie; echter, koppeling deze methoden met adressen van de CT-scan deze kwestie.
Een CT-scan meet de demping van fotonen wanneer het signaal het kadaver van een dier doorkruist en het is ideaal bij het identificeren van lichaam structuren. Weke delen contrast, die met de opsporing van een kleine intracraniële tumor interfereren kan, is echter een beperking voor deze aanpak17,18. Een extra nadeel van CT is het gebruik van straling en contraststoffen, die ertoe van moleculaire veranderingen in de doelcellen bewegen kunnen. Een CT-scan kan worden gecombineerd met huisdier, die gebruik maakt van radiolabeled verklikstoffen als de glucose analoge, fluorodeoxyglucose 18F-FDG; maar dit kan ook een conflict veroorzaakt met bepaalde fysiologische processen in kleine dieren. In tegenstelling, FMT hoeft niet elke ingespoten substraat voor het meten van de tumor massa en het is mogelijk om te meten de tumor metabolisme, ontsteking angiogenese, apoptosis en andere markeringen met behulp van fluorescently geëtiketteerde biomarkers19.
Over het algemeen is een van de meest nuttige en veelzijdige technieken voor in vivo imaging de MRI. Kleine beperkingen van de MRI kunnen worden gevonden in de lage Acquisitietijd, lagere gevoeligheid dan huisdier en sommige variaties instrument-gerelateerde18,20.
Hier melden we de FMT-methode als een alternatieve methode voor preklinische glioblastoma modellen. Vooraf labeling van doelcellen met infrarood fluorescente proteïnen (figuur 1A--E) en scannen na implantatie bij immuungecompromitteerde dieren kunnen worden bereikt met een fluorescentie tomography imaging systeem. We gemeld de FMT-methode als een alternatieve methode voor preklinische glioblastoma modellen. Met deze methode beeldvorming is toegepast op een substraat-vrije en niet-invasieve wijze, dieren worden bewaard in een omgeving van lage stress en kwantificering van de diep-weefsel kan worden uitgevoerd (figuur 2A-ik, figuur 3A, B). Dit protocol kan worden toegepast om te bestuderen van de werkzaamheid van combinatoriële behandelingen in preklinische glioma modellen21, te identificeren van nieuwe therapeutische streefcijfers voor hersenen tumoren16, en te onderzoeken van nieuwe druggable metabole moleculen22, Epigenetische trajecten23, of nieuwe chemotherapeutische agenten in combinatie met radiotherapie (niet-gepubliceerde gegevens), en toegepast op andere Preklinische studies. We stellen ook hier het gebruik van de FMT als een dual in vivo imaging aanpak, wanneer twee mede bestaande, maar anders, tumor cel populaties zijn bedoeld om te worden geanalyseerd.
Sommige beperkingen met FMT moeten worden rekening gehouden, zoals auto-fluorescentie gegenereerd op basis van sommige organen die het signaal kunnen verstoren. Bijvoorbeeld lymfkliertest milt en lever het uitstoten van auto-fluorescentie in de 680 nm-kanaal, maar niet op 635 nm. Daarom moeten FMT-gerelateerde experimentele procedures die betrekking hebben deze organen worden uitgevoerd met behulp van andere infrarood fluorescente proteïnen, zoals FP635. We gebruikten naakt foxn1-gemuteerd naakt muizen om te voorkomen dat inmenging in de fluorescentie signaal opname; Als een verschillende muismodel moet worden gebruikt, is het raadzaam te scheren het interessegebied van de dieren. Bovendien is deze benadering ook beperkt bij de opsporing van zeer kleine tumor massa's. In onze ervaring, de signaal-/ ruisverhouding verbetert als de tumor massa wordt groter, nog vóór het intreden van geen neurologische symptomen in de muizen. In feite, in eerdere experimenten uitgevoerd op orthotopically geïnjecteerd PDXs, konden we tumoren tijdens het regime van een drug voor ten minste 2 weken in muizen zonder enig teken van nood als gevolg van de tumor last of drug administration21detecteren. Uiteindelijk zal de agressiviteit van de cellijn van elke en het aantal ingespoten cellen bepalen de lengte van elk experiment. Uit de gegevens blijkt een lineaire evenredige relatie tussen aantal cellen en signaal (figuur 1B--E) en tumor massa en signaal (Figuur 2); maar een algemene signaal correlatie tussen tumor massa en aantal cellen kan niet worden toegepast op verschillende cellijnen en infrarood eiwitten. Het signaal voor elke cel lijn/infrarood fluorescerende eiwit combinatie moet empirisch worden bepaald. Bovendien, het signaal verkregen uit de analyse van de cellen met behulp van de phantom (figuur 1B, D) niet overeenkomt met het signaal van intracraniële xenografts zoals een demping in signaal als gevolg van de schedel van de muis optreedt.
De imager en analyzer software is voorzien van drempelmethode. Hoewel we hier niet een drempel gebruikten, geeft scannen van dieren zonder een geïmplanteerde cellen achtergrondgeluiden die neigt te worden opgeheven door wederopbouw in aanwezigheid van een ware signaal. Een paar factoren beïnvloeden de signaalsterkte van de xenograft en in rekening moet worden gehouden: elke infrarood fluorescent proteïne heeft verschillende emissiespectrum en intensiteit, met FP720 is een van de meest fluorescerende eiwitten gebruikt experimenteel10 ,11; elke cel regel zorgt voor een overvloedige echter beperkt, hoeveelheid van de eiwitproductie, dus beïnvloeden de maximale fluorescentie verkrijgbaar. Tot slot de FMT imager is setup met interne standaard curven voor specifieke verbindingen, daarom is het belangrijk om te overwegen welke compound is de dichtstbijzijnde emissiespectrum aan de infrarood fluorescent proteïne gebruikt om de cellen te labelen. Hoewel goed verdragen, is het raadzaam om te bepalen potentiële cytotoxische effecten gemedieerd door de overexpressie van het infrarood eiwitten8,9. Bovendien raden we cohorten van muizen van ten minste 8 per experimentele groep, zoals verlies van gegevens en muizen, als gevolg van chirurgische ingreep of variabiliteit in de engraftment van de cel kanker zou kunnen voorkomen; echter voegt dit statistische significantie aan de studie. Wij raden ook aan serieel scannen de dierlijke cohort voor meer dan één dag en analyseren van de signaal-emissie op hetzelfde moment, sinds variaties in de beeldvorming cassette diepte en fluorescent signaal wederopbouw kan interfereren met de kwantificering van de uiteindelijke signaal. Om dit probleem op te lossen, staat de analyzer software voor kleine wijzigingen in laser intensiteit (van normaal tot hoge en zeer hoge), hoewel in onze ervaring het uiteindelijke resultaat niet dramatisch anders is. Een laatste opmerking over de kosteneffectiviteit ervan is dat de FMT imaging systeem kan gemakkelijk worden gedeeld als een instrument van de kern onder verschillende laboratoria, waardoor de aankoop en het onderhoud kosten dekken. Kortom, is de FMT een waardevolle bron waardoor experimentele en preklinische evaluatie van in vivo tumorgroei eenvoudig en betrouwbaar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflicten.
Acknowledgments
Wij danken Dr. Frederick Lang, MD Anderson Cancer Center voor GBM-PDX-neurospheres. Dit werk werd gesteund door de nederlaag GBM onderzoek samenwerking, een dochteronderneming van National Brain Tumor Society (Frank Furnari), R01-NS080939 (Frank Furnari), de James S. McDonnell Foundation (Frank Furnari); Jorge Benitez werd ondersteund door een award van de American Brain Tumor Association (ABTA); Ciro Zanca werd gedeeltelijk ondersteund door een Amerikaans-Italiaanse Cancer Foundation postdoc fellowship. Frank Furnari ontvangt salaris en extra ondersteuning van het Ludwig-Instituut voor kankeronderzoek.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/High Glucose | HyClone/GE | SH30022.1 | |
| DMEM/F12 1:1 | Gibco | 11320-082 | |
| FBS | HyClone/GE | SH30071.03 | |
| Accutase | Innovative cell technologies | AT-104 | |
| Trypsin | HyClone/GE | SH30236.01 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504044 | |
| human recombinant EGF | Stemcell Technologies | 2633 | |
| human recombinant FGF | Stemcell Technologies | 2634 | |
| DPBS | Corning | 21-031-00 | |
| FACS tubes | Falcon | 352235 | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
| Blasticidin | ThermoFisher Scientific | A1113903 | |
| p24 ELISA | Clontech | 632200 | |
| Xylazine | Akorn | NDC 59399-110-20 | |
| Ketamine | Zoetis | NADA 043-403 | Controlled substance |
| Ointment | Dechron | NDC 17033-211-38 | |
| Absorbable suture | CpMedical | VQ392 | |
| 5 ul syringe | Hamilton | 26200-U | Catalog number as sold by Sigma-Aldrich |
| Cell Sorter | Sony | SH8007 | |
| Mouse stereotaxic frame | Stoelting | 51730 | |
| Motorized stereotaxic injector | Stoelting | 53311 | |
| Micromotor hand-held drill | Foredom | K1070 | |
| Mouse warming pad | Ken Scientific Corporation | TP-22G | |
| Fluorescence Tomography System | PerkinElmer | FMT 2500 XL | |
| TrueQuant Imaging Software | Perkin Elmer | 7005319 | |
| Ultra-centrifuge Optima L-80 XP | Beckman Coulter | 392049 | |
| Tissue Culture 100mm Dishes | Olympus Plastics | 25-202 | |
| Tissue Culture 150mm Dishes | Olympus Plastics | 25-203 | |
| Tissue Culture Flasks T75 | Corning | 430720U | |
| 50 mL conical tubes | Corning | 430290 | |
| 15 mL conical tubes | Olympus Plastics | 28-101 | |
| Centrifuge Avanti J-20 | Beckman Coulter | J320XP-IM-5 | |
| Tube, Polypropylene, Thinwall, 5.0 mL | Beckman Coulter | 326819 | |
| Tube, Thinwall, Polypropylene, 38.5 mL, 25 x 89 mm | Beckman Coulter | 326823 | |
| Athymic nude mice | Charles River Laboratories | Strain Code 490 (Homozygous) | Prior approval by the Institutional Animal Care Program and by the Institutional Biosafety Committee required. |
References
- Ostrom, Q. T., et al. CBTRUS Statistical Report: Primary Brain and Other Central Nervous System Tumors Diagnosed in the United States in 2009-2013. Neuro-Oncology. 18 (suppl_5), v1-v75 (2016).
- Pauli, C., et al. Personalized In Vitro and In Vivo Cancer Models to Guide Precision Medicine. Cancer Discovery. 7 (5), 462-477 (2017).
- Stewart, E. L., et al. Clinical Utility of Patient-Derived Xenografts to Determine Biomarkers of Prognosis and Map Resistance Pathways in EGFR-Mutant Lung Adenocarcinoma. Journal of Clinical Oncology. 33 (22), 2472-2480 (2015).
- Gao, H., et al. High-throughput screening using patient-derived tumor xenografts to predict clinical trial drug response. Nat Med. 21 (11), 1318-1325 (2015).
- Ozawa, T., James, C. D. Establishing Intracranial Brain Tumor Xenografts With Subsequent Analysis of Tumor Growth and Response to Therapy using Bioluminescence Imaging. J. Vis. Exp. (41), e1986 (2010).
- Kondo, A., et al. An experimental brainstem tumor model using in vivo bioluminescence imaging in rat. Child's Nervous System. 25 (5), 527-533 (2009).
- Nyati, S., Young, G., Ross, B. D., Rehemtulla, A. ATM Kinase: Methods and Protocols. Kozlov, S. V. , Springer. New York. 97-111 (2017).
- Kondo, A., et al. Longitudinal assessment of regional directed delivery in a rodent malignant glioma model. J Neurosurg Pediatr. 4 (6), 592-598 (2009).
- Badr, C. E. Bioluminescent Imaging: Methods and Protocols. Badr, C. E. , Humana Press. 1-18 (2014).
- Shcherbakova, D. M., Verkhusha, V. V. Near-infrared fluorescent proteins for multicolor in vivo imaging. Nat Meth. 10 (8), 751-754 (2013).
- Filonov, G. S., et al. Bright and stable near-infrared fluorescent protein for in vivo imaging. Nat Biotech. 29 (8), 757-761 (2011).
- Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. Production and purification of lentiviral vectors. Nat. Protocols. 1 (1), 241-245 (2006).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). J. Vis. Exp. (41), e1546 (2010).
- Pritchett-Corning, K. R., Luo, Y., Mulder, G. B., White, W. J. Principles of rodent surgery for the new surgeon. J Vis Exp. (47), (2011).
- Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nat. Protocols. 1 (6), 3166-3173 (2007).
- Benitez, J. A., et al. PTEN regulates glioblastoma oncogenesis through chromatin-associated complexes of DAXX and histone H3.3. Nature Communications. 8, 15223 (2017).
- Kirschner, S., et al. Imaging of Orthotopic Glioblastoma Xenografts in Mice Using a Clinical CT Scanner: Comparison with Micro-CT and Histology. PLOS ONE. 11 (11), e0165994 (2016).
- Mannheim, J. G., et al. Standardization of Small Animal Imaging-Current Status and Future Prospects. Molecular Imaging and Biology. , (2017).
- Engblom, C., et al. Osteoblasts remotely supply lung tumors with cancer-promoting SiglecFhigh neutrophils. Science. 358 (6367), (2017).
- Lauber, D. T., et al. State of the art in vivo imaging techniques for laboratory animals. Laboratory Animals. 51 (5), 465-478 (2017).
- Zanca, C., et al. Glioblastoma cellular cross-talk converges on NF-κB to attenuate EGFR inhibitor sensitivity. Genes & Development. 31 (12), 1212-1227 (2017).
- Villa, G. R., et al. An LXR-Cholesterol Axis Creates a Metabolic Co-Dependency for Brain Cancers. Cancer Cell. 30 (5), 683-693 (2016).
- Liu, F., et al. EGFR Mutation Promotes Glioblastoma through Epigenome and Transcription Factor Network Remodeling. Molecular Cell. 60 (2), 307-318 (2015).
