Summary
Orthotopique injection intracrânienne des cellules tumorales a été utilisée dans la recherche sur le cancer pour étudier la biologie de tumeur de cerveau, progression, évolution et réponse thérapeutique. Nous présentons ici la tomographie moléculaire de xénogreffes tumorales, à fluorescence qui fournit une imagerie intravitale en temps réel et la quantification d’une tumeur de masse dans des modèles précliniques de glioblastome.
Abstract
Tumorigénicité est la capacité des cellules cancéreuses pour former une tumeur masse. Une approche largement utilisée pour déterminer si les cellules sont tumorigènes est en injectant des souris immunodéficientes par voie sous-cutanée avec les cellules cancéreuses et de mesurer la masse de la tumeur, après qu’il devienne visible et palpable. Orthotopique injections de cellules cancéreuses visent à introduire la xénogreffe dans le microenvironnement qui ressemble le plus le tissu d’origine de la tumeur à l’étude. Recherche sur le cancer du cerveau nécessite une injection intracrânienne des cellules cancéreuses pour permettre la formation de tumeurs et d’analyse dans le microenvironnement unique du cerveau. L’imagerie in vivo des xénogreffes intracrâniennes surveille instantanément la masse de la tumeur de souris orthotopically greffée. Nous rapportons ici l’utilisation de la tomographie moléculaire de fluorescence (FMT) des xénogreffes de tumeurs de cerveau. Les cellules cancéreuses sont tout d’abord transduites avec près de protéines fluorescentes infrarouges et ensuite injectées dans le cerveau des souris immunodéficientes. Les animaux sont ensuite analysés pour obtenir des informations quantitatives sur la masse de la tumeur sur une longue période de temps. Cellule avant étiquetage permet de quantification rentable, fiable et reproductible de la charge tumorale au sein de chacune des souris. Nous avons éliminé la nécessité d’injecter des substrats d’imagerie et ainsi réduit le stress sur les animaux. Une limitation de cette approche est représentée par l’incapacité à détecter de très petites masses ; Toutefois, il a une meilleure résolution pour les plus grandes masses que les autres techniques. Il peut être appliqué afin d’évaluer l’efficacité d’un traitement médicamenteux ou des altérations génétiques des lignées de cellules de gliome et échantillons dérivés de patient.
Introduction
Le cancer est une des principales causes de décès par maladie chez l’homme dans le monde industrialisé. Avec un nombre extrêmement élevé de morts, les nouveaux traitements sont requis de toute urgence. Glioblastome multiforme (GBM) est un type extrêmement mortelle de cancer du cerveau, composé de populations hétérogènes tumeur stromale et immunitaire des cellules du cerveau. Selon le registre de tumeur de cerveau Central des Etats-Unis, l’incidence des tumeurs cérébrales malignes et bénignes primaires est environ 22 cas pour 100 000 habitants. Environ 11 000 nouveaux cas devraient être diagnostiqués aux Etats-Unis en 20171.
Les études précliniques enquêter sur la probabilité d’une drogue, procédure ou traitement efficace avant les essais chez l’homme. Parmi les premières étapes de laboratoire dans les études précliniques consiste à identifier des cibles moléculaires potentielles pour le traitement de la toxicomanie à l’aide de cellules cancéreuses implantées dans un organisme hôte, définis comme des modèles de xénogreffes humaines. Dans ce contexte, les modèles de xénogreffes de tumeurs intracrâniennes cerveau utilisant des xénogreffes dérivés de patient (PDXs) ont été largement utilisées pour étudier la biologie de tumeur de cerveau, progression, évolution et réponse thérapeutique et plus récemment pour le développement de biomarqueurs, de drogues dépistage et personnalisé médecine2,3,4.
Un des plus abordables et non invasif en vivo méthodes pour surveiller les xénogreffes intracrâniennes d’imagerie est bioluminescence d’imagerie (BLI)5,6,7,8. Toutefois, certaines limitations de BLI incluent administration de substrat et disponibilité, stabilité de l’enzyme et léger trempe et diffusion au cours de la formation image acquisition9. Nous rapportons ici le FMT infrarouge comme une alternative à l’imagerie méthode pour surveiller les modèles précliniques de glioblastome. Dans cette méthode, acquisition de signaux et quantification de données implantés PDXs, exprimant une protéine fluorescente proche infrarouge iRFP72010,11 (désormais appelé FP720) ou turboFP635 (désormais appelée FP635), est réalisée avec un FMT système d’imagerie. Utilisant la technologie FMT, l’orthotopic tumeurs peuvent être surveillés en vivo avant, pendant ou après le traitement, d’une manière non invasive, sans substrat et quantitative pour observations précliniques.
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Protocol
L’utilisation des animaux de recherches expérimentales et des agents infectieux, tels que les lentivirus à transmettre les cellules cancéreuses, requièrent l’approbation préalable par le programme institutionnel de soins aux animaux et par le Comité institutionnel de biosécurité. Ce protocole suit les directives de protection des animaux de l’Université de Californie à San Diego (UCSD).
1. marquage des cellules de glioblastome avec FP635 ou FP720 Construct
- Produire et purifier les lentivirus selon le protocole décrit par Tiscornia et al. 12
- La culture environ 2,0 x 106 cellules d’une lignée de cellules de gliome humain avec DMEM plus 10 % de sérum bovin fœtal (SVF) dans un plat de 15 cm ; culture 2.0 x 106 glioblastome humain dérivé de patient (GBM-PDX) domaine avec DMEM ou F12 le milieu 1:1 avec B27 supplément plus humain facteur de croissance épidermique recombinant (EGF ; 20 ng/mL) et FGF (10 ng/mL) dans une fiole de T75.
- Maintenir toutes les cellules à 37 ° C, 5 % de CO2et 100 % d’humidité relative.
- Dissocier les cellules.
- Pour les cellules de gliome : Retirez le surnageant des plaques et l’ajout de 3 à 5 mL de trypsine 1 X pour les cellules de gliome.
- Pour le GBM sphères : recueillir les cellules en pipettant également, les cellules dans un tube de 15 mL.
- Tournez en bas les sphères GBM à 200 x g pendant 5 min à l’aide d’une centrifugeuse de table à la température ambiante.
- Retirez le surnageant et ajouter 3 à 5 mL de solution de détachement cellulaire.
- Incuber les cellules à 37 ° C pendant 10-15 min.
- Soigneusement se dissocient les cellules en pipettant également monter et descendre plusieurs fois (faire en sorte que soient remplis les sphères et les cellules de gliome dissocié) et centrifuger à 200 x g pendant 5 min.
- Retirez le surnageant et remettre en suspension les cellules avec 5 mL de milieu en pipettant également monter et descendre plusieurs fois. Déterminer la viabilité cellulaire exclusion bleu trypan.
- Plaque de 1,0 x 106 des cellules cibles dans un plat de 10 cm avec 5 mL de milieu de pipetage.
- Transduce cellules avec lentivirus exprimant des protéines fluorescentes à la multiplicité d’infection (MOI) 5 tel qu’il est décrit par Tiscornia et al. 12 et incuber à 37 ° C.
- Après 24h, retirer le support des cellules transduits, ajouter 5 mL de milieu frais et incuber pendant supplémentaire 48 h à 37 ° C.
- Se dissocient les cellules infectées en une suspension de cellules individuelles tel que décrit dans les étapes 1.4-1.6. Tournez en bas les cellules à 200 x g pendant 5 min et remettre en suspension dans 500 µL de solution de tri (solution saline tamponnée au phosphate (PBS) avec 1 % FBS).
- Distribuer la suspension cellulaire dans des tubes de FACS. Co, détachant les cellules 1 µL/ml de 4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) dihydrochlorure d’exclure les cellules mortes. Contrôles négatifs sont tenus de mettre en place les portes cytomètre de flux (cellules transduites non et non-transduites / DAPI colorées).
- Trier les cellules fluorescentes-positif/négatif DAPI dans tri solution, tel que décrit par Ben Ali et al. 13et de recueillir les cellules triées dans un tube conique de 15 mL.
- Tournez en bas les cellules triées à 200 x g pendant 5 min, retirez le surnageant et remettre en suspension dans 5 mL de milieu de culture. Ensemencez les cellules triées dans un plat de 10 cm de pipetage. Incuber à 37 ° C pendant au moins 48 à 72 heures.
- Développez les cellules triées en dissociant les cellules suivant étapes 1.4-1.6 et plaquant dans plusieurs plats pour des expériences in vivo .
Remarque : Pour plus de détails sur la cellule Tri préparation et purification, voir Ben et al. 13
2. intracrânienne Injection de cellules de glioblastome iRFP-tag dans des souris immunodéficientes
Remarque : Avant de commencer l’intervention, assurez-vous que la salle de chirurgie et outils sont propres pour la procédure. Utilisez immunodéficientes nue (Foxn1nu) mâles ou femelles souris athymiques, entre 4-5 semaines et g 17-19 pour les injections intracrâniennes. Animaux devrait être logés pendant au moins 3 jours après leur arrivée et avant la chirurgie.
- Préparation de cellules
- Récolter et dissocier les cellules fluorescentes de positif-gliome dans une suspension de cellules individuelles (1.4-1.6 étapes) et remettre en suspension 0,5 ou 1,0 x 106 cellules de 2 à 5 µL de PBS par injection par animal. Pipetter, la suspension de cellules dans un tube microtubes de 1,5 mL et le déposer sur la glace.
- Gestion et préparation de l’anesthésie
- Préparez 200 µL d’une solution saline contenant la kétamine (100 mg/kg) et xylazine (10 mg/kg) par 20 grammes de poids corporel de souris. Peser les animaux et on calcule la dose appropriée de l’anesthésie.
- Fournir une injection intrapéritonéale de l’anesthésie et pommade ophtalmique pour les yeux pour éviter la déshydratation. Pour plus d’informations sur cette étape, voir Kathleen et al. 14 Place l’animal sur un pad thermique de l’eau préchauffée à 37 ° C.
- Vérifier que les animaux sont anesthésiés par la surveillance de la réponse de pincée d’orteil (réflexe de pédale), généralement dans les 5-10 min.
- Injection intracrânienne
- Charger un µL 5 seringues Hamilton (aiguille pointe émoussée) avec suspension de cellules et de monter dans le support de sonde.
- Placez la souris dans un petit cadre stéréotaxique animaux et fixer la tête en utilisant les barres de l’oreille et l’adaptateur incisive après les détails décrits par Cetin et al. 15
- Désinfecter la tête avec 70 % d’éthanol et Bétadine solution. Assurez-vous que le champ opératoire est terminer stérile. Effectuer une incision médiane avec un petit scalpel et séparer la peau et les tissus conjonctifs.
- Placer la seringue de Hamilton sur le point de bregma utilisant le micromanipulateur.
- Eloignez la sonde titulaire 1,0 mm antéro-postérieure et 2.0 mm latérale du point de bregma. Marquer cette position avec un crayon.
- À cet endroit, soigneusement faire un trou dans le crâne avec une perceuse à main micromoteur en appliquant une légère pression vers le bas jusqu'à ce que les vaisseaux sanguins deviennent visibles. Ne pas interrompre le parenchyme arachnoïdien de mater et le cerveau.
- Introduire l’aiguille dans le trou de trépan et advance 3,0 mm au-dessous de la surface de la pie-mère.
- Mettre en place le volume (2 à 5 µL) et débit (1 µL/min) d’injection à l’aide d’un injecteur stéréotaxique motorisé ou effectuer manuellement l’injection.
- Après l’injection, retirer l’aiguille progressivement par ordre croissant de 1,0 mm toutes les 1 min et nettoyer le site d’injection avec l’éthanol à 70 %.
- Fermer la peau plaie avec agrafes chirurgicales ou en faisant des sutures chirurgicales (souvent dénommés "points") et voir Kathleen et al. 14 pour plus de détails.
- Récupération de l’animale
- Transférer l’animal à un pad thermique de l’eau (37 ° C) et de surveiller la température corporelle, rythme respiratoire et cardiaque, jusqu'à la guérison complète. Administrer une analgésie par des protocoles standard.
Remarque : Pour plus d’informations sur la procédure stéréotaxique, chirurgie et coordonnées, voir autres rapports5,14,15.
- Transférer l’animal à un pad thermique de l’eau (37 ° C) et de surveiller la température corporelle, rythme respiratoire et cardiaque, jusqu'à la guérison complète. Administrer une analgésie par des protocoles standard.
3. FMT imagerie
Remarque : Selon le but expérimental, le glioblastome iRFP-tag, les cellules peuvent être surveillés en vivo avant, pendant ou après le traitement. Pour le but de l’imagerie, anesthésier les animaux à l’aide d’une chambre à induction isoflurane, maintenir dans une cassette d’imagerie pendant le balayage et l’image dans le socle de l’imageur FMT.
- Retirer l’animal de la cage et le place dans la chambre de l’induction de l’isoflurane. Fermer la chambre et sur alimentation en oxygène et vaporisateur à 3-5 %.
- Surveiller l’animal jusqu'à ce qu’il est complètement anesthésié, généralement à 1-2 min. inconscient animaux ne doit pas répondre à des stimuli externes.
- Retirer l’animal anesthésié de la chambre et mettre l’animal dans la cassette d’imagerie en plaçant l’adaptateur de tête tout d’abord, puis en plaçant l’animal face vers le bas. Assurez-vous que la tête se trouve dans le centre de la cassette.
- Placer la platine supérieure de la cassette sur le dessus et serrer les boutons de réglage jusqu'à 17 mm.
- Une fois que l’animal est sûr dans la cassette d’imagerie, passez à l’imagerie en y insérant la cassette de la station d’accueil interne de l’imageur FMT, où l’isoflurane est pompée pour garder l’animal anesthésié.
- Lancez le logiciel imageur et analyseur en double-cliquant sur l’icône du logiciel.
- Dans la fenêtre de l’onglet « expérimental », sélectionner le « Database » et le « Groupe d’étude ».
- Ouvrez la fenêtre de l’onglet « Scan » et sélectionnez l’objet à l’image en cliquant sur « Sélectionner le sujet ». Aussi, sélectionnez le canal de laser dans le panneau « Canal de Laser ». Pour les cellules marquées FP635, sélectionnez « laser canal 635 nm » et pour marqué FP720 cellules, sélectionnez « laser canal 680 nm ».
- Acquérir une image en cliquant sur l’option « Capture » dans la fenêtre de l’onglet « Scan ». Ensuite, réglez le champ de balayage en faisant glisser le champ de balayage de l’image capturée à un nombre déterminé d’emplacements source, habituellement dans les sources de 20-25 pour le côté ipsilatéral.
- Cochez l’option « Ajouter à la file d’attente de la reconstruction » et cliquez sur « Scan » dans la fenêtre de l’onglet « Scan ».
- Attendez que le balayage est terminé et puis retirez la cassette d’imagerie de la station d’accueil.
- Enlever la plaque supérieure de la cassette et remettre l’animal dans la cage.
- Répétez les étapes 3.1-3.12 pour le reste des animaux.
4. image Analysis
- Dans le logiciel imageur et analyseur, sélectionnez la fenêtre de l’onglet « analyse ».
- Charger le dataset et l’objet à analyser en cliquant sur le bouton « + » dans le Dataset « jury » de la fenêtre de l’onglet « analyse ».
- Une fois que l’image a été chargé dans la fenêtre de l’onglet « analyse », effectuez la région de l’analyse de l’intérêt (ROI) en sélectionnant l’icône ellipsoïde, située dans le coin supérieur gauche de la fenêtre de l’onglet « analyse ».
- Ajustez le seuil à zéro dans le panneau « données statistiques » par clic droit sur la colonne « seuil » dans la fenêtre de l’onglet « analyse ».
- La valeur totale du panneau « Données statistiques » représente le signal provenant des cellules de glioblastome fluorescent-étiquetées implantés dans le cerveau de souris.
- Répétez les étapes 4.2-4.4 pour le reste des animaux. Charger ou supprimer un nouveau sujet en cliquant sur le « + » ou « − » bouton, respectivement, dans le Dataset « jury » de la fenêtre de l’onglet « analyse ».
Remarque : Pour plus d’informations sur l’imagerie FMT et le fonctionnement de logiciels, voir20.
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Representative Results
U87EGFRvIII de cellules de glioblastome (U87 cellules surexprimant la variante de récepteur de l’EGF III) ont été cultivés selon l’étape 1.2. Lentivirus a été produit et purifiée selon étape 1.1. La concentration virale était déterminée par p24 analyse ELISA. Les cellules étaient transduites avec lentivirus portant des protéines fluorescentes infrarouges selon étape 1.8. Le plasmide codant FP72010,11 a été aimablement fourni par Dr V.V. Verkhusha et le vecteur de FP635 a été acheté auprès d’un fournisseur commercial. Cellules cibles étaient FACS tri pour enrichir pour la population cellulaire plus fluorescente 10 % supérieure (Figure 1 a). Augmenter le signal fluorescent améliore la sensibilité du système de tomographie par fluorescence. Pour valider l’intensité des signaux des cellules marquées fluorescent avant l’implantation orthotopique, nous avons utilisé la cassette de fantôme de l’imageur FMT. Plus précisément, U87EGFRvIII-TurboFP635 et U87EGFRvIII-iRFP720 cellules sont dissociés par la trypsine et 1 x 105, 1 x 106, et 1 x 107 cellules ont été remis en suspension dans 100 µL de PBS froid glace, respectivement et analysées. L’imageur FMT permet une détection en 4 canaux : 635 nm, 680 nm, 750 nm et 780 nm. Canaux infrarouge lointain 750 nm et 780 nm ne sont pas adaptés pour cette analyse, car il n’y a aucune émission à ces longueurs d’onde des protéines fluorescentes proche infrarouge utilisés (données non présentées). Par conséquent, nous avons analysé les signaux d’émission à 635 nm et 680 nm. Indiqué dans la Figure 1, la fluorescence du signal image et l’intensité de quantification pour les deux FP635 (Figure 1 b, C) et FP720 (Figure 1, E), ce qui augmente proportionnellement comme le nombre croît de cellule. À noter, l’émission de FP635 est visible dans le canal de 635 nm, mais pas dans le canal de 680 nm. En revanche, l’émission de FP720 est visible dans le canal de 680 nm, mais pas dans le canal de 635 nm. Cela rend ces deux protéines fluorescentes candidat appropriés pour les études où les deux populations de cellules peuvent être étiquetées et surveillées simultanément à l’aide de deux près d’étiquettes fluorescentes infrarouges.
U87EGFRvIII cellules marquées avec la proximité des protéines fluorescentes infrarouges ont ensuite été utilisés pour l’injection de l’orthotopic et en vivo tumeur suivi de la croissance, tel que décrit dans les étapes 2.1 à 2.4. Nous avons utilisé la même lignée cellulaire, c'est-à-dire, U87EGFRvIII, étiquetée avec différentes balises fluorescentes, pour exclure la différence de croissance tumorale entre les types de cellules de cancer différents. Les souris ont été injectées avec des cellules U87EGFRvIII-TurboFP635, U87EGFRvIII-iRFP720 cellules ou une combinaison égale (1:1) les deux lignées de cellules. Un total de 5 x 105 cellules dans un volume de 5 µL de PBS ont été injectées données dans 4-5 semaines à vieille souris nude athymiques immunodéprimés utilisant un système stéréotaxique et une seringue de Hamilton, suivant étapes 2.3-2.4. L’anesthésie a été réalisée par injection intrapéritonéale de kétamine/xylazine. Les animaux ont été gardés au chauds tout au long de l’injection avec un tampon thermique de l’eau et vérifiées pour déceler tout signe de détresse. Croissance et prise de greffe tumorale a été ensuite suivie par l’ESF, système d’imagerie. Au cours des sessions de balayage, les souris ont été temporairement anesthésiés en utilisant une chambre d’isoflurane 3 % (étapes 3.1-3.12). Les souris ont été ensuite placés dans une cassette d’imagerie et imagés à l’intérieur de la caméra à balayage de laser. Chaque souris a été analysé à l’aide de la 635 nm et 680 nm canaux. La quantification du signal a été enregistrée au fil du temps et des souris ont été euthanasiés à l’apparition des symptômes neurologiques, selon les directives institutionnelles animalier et utilisation Comité (IACUC). Comme indiqué dans la Figure 2 a, U87EGFRvIII-TurboFP635 d’émission signal était évidente dans le canal de 635 nm et signal de fond minimal a été enregistré dans le chenal de nm 680 (Figures 2 b, C). En revanche, les cellules U87EGFRvIII-iRFP720 émis dans le chenal nm 680, montrant peu de fond dans le chenal de nm 635 (Figures 2D–F). Enfin, souris injectées avec un mélange de 1:1 des cellules U87EGFRvIII-TurboFP635 et U87EGFRvIII-iRFP720 a montré signal accrue dans les deux voies pendant la durée de l’expérience (Figures 2–j’ai). Ces données montrent qu’il est possible d’utiliser des protéines fluorescentes infrarouges double en vivo imagerie des populations de cellules de cancer. Les données indiquent également que les différentes protéines fluorescentes ont une intensité différente dans leur émission de signal. Ici, intensité du signal FP720 était supérieure à FP635, avec une sensibilité accrue dans la détection de petites populations de cellules cancéreuses dans un cadre de surveillance non invasive.
Les effets de silençage génique de gènes liés au cancer sur tumorigénicité dans les modèles précliniques peuvent également être étude avec ce protocole. Pour cet objectif, GBM-sphères (GSC23 et GSC11) ont été cultivée (étape 1.2) et transduites avec FP720-lentivirus (étape 1.8). Les cellules exprimant FP720 étaient FACS tri comme décrit plus haut dans les étapes 1.11-1.13. Cellules FP720 marquées ont été co transduits avec codage des lentivirus shARN ciblage DAXX (shDaxx), soit le contrôle de shARN (shLuc) au MOI 516. Les cellules ont été cultivés pendant 5 jours, dissocie en une suspension de cellules simples, et 1 x 106 cellules ont été resuspendues dans 3 µL de PBS pour injection intracrânienne. L’efficacité de la shARN ciblage DAXX a été confirmée par transcription inverse quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) en GSC23 (Figure 3 a) et GSC11 (Figure 3). GBM-iRFP720/shRNA cellules étaient stereotactically injectés dans le striatum de souris immunodéficientes, selon les étapes 2.3-2.4. Les animaux ont été aperçus des signes neurologiques et le signal de fluorescence relative de la xénogreffe ont été analysées par le système d’imagerie de la FMT, quantifié à l’aide de logiciels d’analyse, selon les étapes 3.1-4.6. Des images représentatives de FMT montrent un signal de fluorescence diminution chez les souris greffés avec shDAXX/GBM-sphères en comparaison avec des animaux porteurs de shControl (Figure 3 b et Figure 2D) pour les deux modèles de GBM-sphères, confirmant notre précédente conclusion16 que l’inhibition DAXX réprime la croissance tumorale dans des modèles précliniques de glioblastome.
Figure 1 : courbes d’étalonnage à l’aide de cellules de fantôme et d’analyse de FACS. (A), FACS représentant histogrammes de FP720 - et de FP635-U87EGFRvIII exprimant des cellules (gauche et droite panneau, respectivement). Cellules de gliome abritaient des lentivirus codant des protéines fluorescentes infrarouges et FASC triés afin d’enrichir pour la plus grande expression des protéines FP720 ou FP635. Images représentatives obtient du logiciel imageur et analyseur de U87EGFRvIII-TurboFP635 (B) et U87EGFRvIII-iRFP720 (D) des suspensions de cellules à l’aide de la cassette de fantôme. Panneaux supérieurs représente le signal 635 nm canal bas panneaux dans le canal de 680 nm. Augmenter dans la cellule numéro correspondait à une augmentation dans la visualisation du signal. Quantification du signal de U87EGFRvIII-TurboFP635 (C) et U87EGFRvIII-iRFP720 (E) des cellules en 635 nm et 680 nm canaux. Unités de la fluorescence relative sont indiquées dans la barre de couleur. Barres d’erreur représentent les S.E.M. de 3 différents scans par suspension cellulaire. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : modèle de xénogreffe de tumeur de cerveau à l’aide de U87EGFRvIII cellules numérisée dans différents canaux. Des images représentatives de signal fluorescent en 635 nm et 680 nm canaux, provenant d’animaux données implanté avec une combinaison de mélange (1:1) de U87EGFRvIII-iRFP720 U87EGFRvIII-turboFP635 (A) et U87EGFRvIII-iRFP720 (D) : Cellules U87EGFRvIII-turboFP635 (G). Les images ont été acquises au jour 5 après la première numérisation. (B, E, H) Signal d’intensité surveille pour chaque souris pendant une période de 5 jours. Chaque souris a été analysé dans le chenal de nm 635 (barres bleues) et dans le canal du 635 nm (barres rouges). La nuance plus légère de la barre de couleur représente le jour 1 de la numérisation et la nuance plus foncée représente J5. (C, F, I) Quantification relative fluorescence montrant une comparaison directe de l’intensité du signal du canal 635 nm (bleu) et 680 canal nm (rouge) dans l’ensemble de la cohorte des souris. Unités de la fluorescence relative sont indiquées dans la barre de couleur. Les données montrent les valeurs moyennes avec écart de 3 animaux différents. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Gene silencing en préclinique glioblastome modèles utilisant FMT. Analyse de l’expression génique de DAXX par RT-qPCR en GSC23 (A) et GSC11 (C) cellules d’origine patient de gliome transduites avec codé lentivirus interférents ciblant DAXX (shDaxx) ou shARN contrôle (shLuc) et FP720. Des images représentatives de signal fluorescent du canal 680 nm d’orthotopically implanté souris implantés avec GSC23-iRFP720 (B) et GSC11-iRFP720 (D) les cellules dérivées de patient. Signal de fluorescence forte est observée chez les animaux porteurs de shARN contrôle (shLuc) (partie supérieure du panneau) par rapport aux souris implantés des shARN-DAXX (shDaxx) (partie inférieure du panneau), indiquant que l’inhibition DAXX supprime la tumeur croissance dans les modèles précliniques gliome déterminé par tomographie à fluorescence moléculaire. Unités de la fluorescence relative sont indiquées dans la barre de couleur. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Xénogreffes tumorales ont été largement utilisés dans la recherche sur le cancer et un certain nombre de techniques d’imagerie bien établis a été développé : BLI ; résonance magnétique imagerie (IRM) ; tomographie d’émission de positons (TEP), calculée (CT) ; FMT. Chacune de ces approches est livré avec les avantages et les inconvénients, mais finalement se complètent mutuellement avec le type de renseignements fournis. Un des plus couramment utilisés en vivo technologie d’imagerie est BLI5,6,7,8. BLI et FMT requièrent ingénierie cellulaire (avec luciférase enzymes ou protéines fluorescentes infrarouges) qui peut affecter l’expression des gènes. BLI est plus sensible pour les messes de petite tumeur mais nécessite une injection intrapéritonéale d’un substrat (luciférine), qu’il atteint une distribution maximale dans le corps en 10-12 min ; mais clair de trempe et diffusion au cours de l’acquisition d’imagerie et dégagement de substrat surviennent fréquemment9. FMT, au lieu de cela, ne nécessite pas de n’importe quelle administration supplémentaire de substrat aux animaux et son signal est stable et indépendante de stabilité temps ou d’une enzyme. En outre, FMT, lorsqu’il est utilisé dans les mêmes conditions expérimentales, offre des données semi-quantitatives reproductibles. BLI et FMT deux n’offrent pas de résolution spatiale ; Cependant, couplant ces méthodes avec CT scan adresses cette question.
Un tomodensitogramme mesure l’atténuation des photons lorsque son signal traverse le corps d’un animal et il est idéal dans l’identification des structures du corps. Cependant, le contraste des tissus mous, qui risquent d’interférer avec la détection d’une petite tumeur intracrânienne, est une limitation de cette approche17,18. Un inconvénient supplémentaire de CT est l’utilisation du rayonnement et iodés, qui peut induire des changements moléculaires dans les cellules cibles. Un tomodensitogramme peut être combiné avec le PET, qui utilise des traceurs radioactifs comme le glucose analogue, fluorodésoxyglucose 18F-FDG ; mais cela peut aussi interférer avec certains processus physiologiques chez les petits animaux. En revanche, FMT n’a pas n’importe quel substrat injectée pour mesurer la tumeur masse et il est possible de mesurer le métabolisme de la tumeur, inflammation, angiogenèse, apoptose et d’autres marqueurs à l’aide des biomarqueurs fluorescent étiquetés19.
Dans l’ensemble, l’une des techniques les plus utiles et polyvalents pour l’imagerie in vivo est l’IRM. On trouvera des limitations mineures de l’IRM dans le temps d’acquisition faible, une sensibilité plus faible que le PET et quelques variations liées instrument18,20.
Nous rapportons ici la méthode FMT comme méthode alternative pour les modèles précliniques de glioblastome. Pré marquage de cellules cibles avec des protéines fluorescentes infrarouges (Figure 1 a–E) et balayage après l’implantation chez les animaux immunodéficients peuvent être réalisés avec un système d’imagerie de fluorescence tomographie. Nous avons signalé la méthode FMT comme méthode alternative pour les modèles précliniques de glioblastome. Avec cette méthode d’imagerie est appliquée de manière non invasive et sans substrat, animaux sont maintenus dans un environnement de faible contrainte et quantification de profondeur peut être réalisée (Figure 2 a–I, Figure 3 a, B). Ce protocole peut être appliqué pour étudier l’efficacité des traitements combinatoires en préclinique gliome modèles21, d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour les tumeurs de cerveau16et d’enquêter sur nouvelles molécules métaboliques thérapeutiques22, les voies épigénétiques23ou nouveaux agents chimiothérapeutiques en combinaison avec la radiothérapie (données non publiées) et appliquée à d’autres études précliniques. Nous proposons également ici l’utilisation de la FMT comme un double en vivo imagerie approche, lorsque deux coexistent, mais différent, populations de cellules de tumeur sont destinées à être analysés.
Certaines limitations avec FMT doivent prendre en considération, tels que l’auto-fluorescence produit de certains organes qui peuvent interférer avec le signal. Par exemple, murin rate et le foie émettent auto-fluorescence dans le canal de 680 nm, mais pas à 635 nm. Par conséquent, procédures expérimentales liées à FMT, ces organes doivent être effectuées à l’aide d’autres protéines fluorescentes infrarouges, comme FP635. Nous avons utilisé nu foxn1-muté souris Nudes pour éviter toute interférence dans l’enregistrement de signaux de fluorescence ; Si un modèle de souris différente doit être utilisé, il est recommandé de raser la zone d’intérêt des animaux. En outre, cette approche est également limitée à la détection des masses très petites tumeurs. Dans notre expérience, le rapport signal-bruit améliore tant que la tumeur masse devient plus grand, encore avant l’apparition de tout symptôme neurologique chez les souris. En fait, dans des expériences antérieures effectuées sur orthotopically injectée PDXs, nous avons été capables de détecter des tumeurs au cours d’un schéma thérapeutique pendant au moins 2 semaines chez des souris sans aucun signe de détresse à cause de la tumeur fardeau ou drogue administration21. En fin de compte, l’agressivité de chaque lignée cellulaire et le nombre de cellules injectées déterminera la longueur de chaque expérience. Les données montrent une relation proportionnelle linéaire entre le nombre de cellules et de signal (Figure 1 b–E) et la tumeur massive et signal (Figure 2) ; mais une corrélation générale signal entre tumeur massive et le nombre de cellules ne peut être appliquée à travers différentes lignées cellulaires et protéines infrarouges. Le signal pour chaque combinaison de protéine fluorescente de ligne/infrarouge cellule doit être déterminé empiriquement. En outre, le signal obtenu à partir de l’analyse des cellules à l’aide du fantôme (Figure 1 b, D) ne correspond pas au signal de xénogreffes intracrâniennes une atténuation du signal résultant d’un crâne de la souris.
Le logiciel imageur et analyseur permettant de seuillage. Même si on n’utilise pas ici de n’importe quel seuil, animaux sans n’importe quelle cellule implantée à balayage donne des bruits de fond qui tend à être éliminé par la reconstruction en présence d’un vrai signal. Plusieurs facteurs influencent l’intensité du signal de la xénogreffe et doit être conservés en contrepartie : chaque protéine fluorescente infrarouge a différentes fréquences d’émission et l’intensité, FP720 étant une des protéines fluorescentes plus utilisées à titre expérimental10 ,11; chaque lignée cellulaire permet une quantité abondante, encore limitée, de la production de protéines, influençant ainsi la fluorescence maximale obtenue. Enfin, l’imageur FMT est configuré avec des courbes standard internes pour des composés spécifiques, par conséquent, il est important de considérer quel composé possède le spectre d’émission plus proche de la protéine fluorescente infrarouge utilisée pour marquer les cellules. Bien qu’il est bien toléré, il est recommandé de déterminer les effets potentiels de cytotoxiques médiées par la surexpression de protéines infrarouge8,9. En outre, nous recommandons l’utilisation de cohortes de souris d’au moins 8 chacun des groupes expérimentaux, comme la perte de données et de la souris, en raison de la procédure chirurgicale ou de la variabilité dans la greffe de cellules de cancer, peut se produire ; Néanmoins, ce qui ajoute une signification statistique à l’étude. Nous vous recommandons également d’en série scan la cohorte animale pendant plus d’une journée et d’analyser l’émission de signaux en même temps, depuis les variations dans la profondeur d’imagerie de la cassette et la reconstruction du signal fluorescent risquent d’interférer avec la quantification du signal final. Pour résoudre ce problème, le logiciel de l’analyseur permet des changements mineurs dans l’intensité du laser (de normal à élevé et très élevé), bien que dans notre expérience, le résultat final n’est pas radicalement différent. Une dernière remarque concernant le rapport coût/efficacité, c’est que les matières fissiles, système d’imagerie peuvent être facilement partagés comme un instrument de base entre les différents laboratoires, qui aide à défrayer le coût d’achat et l’entretien. En conclusion, l’ESF est une ressource précieuse qui permet une évaluation expérimentale et préclinique in vivo la croissance tumorale facile et fiable.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Nous remercions le Dr Frederick Lang, MD Anderson Cancer Center pour GBM-PDX neurospheres. Ce travail a été soutenu par la défaite GBM recherche Collaborative, une filiale de la société nationale de cerveau tumeur (Frank Furnari), R01-NS080939 (Frank Furnari), le James S. McDonnell Foundation (Frank Furnari) ; Jorge Benitez a été soutenue par un prix de l’Association américaine de tumeur cerveau (ABTA) ; Ciro Zanca était partiellement soutenue par une bourse de recherche postdoctorale de Fondation américaine-italien d’un Cancer du sein. Frank Furnari reçoit des traitements et un soutien supplémentaire de Ludwig Institute for Cancer Research.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/High Glucose | HyClone/GE | SH30022.1 | |
| DMEM/F12 1:1 | Gibco | 11320-082 | |
| FBS | HyClone/GE | SH30071.03 | |
| Accutase | Innovative cell technologies | AT-104 | |
| Trypsin | HyClone/GE | SH30236.01 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504044 | |
| human recombinant EGF | Stemcell Technologies | 2633 | |
| human recombinant FGF | Stemcell Technologies | 2634 | |
| DPBS | Corning | 21-031-00 | |
| FACS tubes | Falcon | 352235 | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
| Blasticidin | ThermoFisher Scientific | A1113903 | |
| p24 ELISA | Clontech | 632200 | |
| Xylazine | Akorn | NDC 59399-110-20 | |
| Ketamine | Zoetis | NADA 043-403 | Controlled substance |
| Ointment | Dechron | NDC 17033-211-38 | |
| Absorbable suture | CpMedical | VQ392 | |
| 5 ul syringe | Hamilton | 26200-U | Catalog number as sold by Sigma-Aldrich |
| Cell Sorter | Sony | SH8007 | |
| Mouse stereotaxic frame | Stoelting | 51730 | |
| Motorized stereotaxic injector | Stoelting | 53311 | |
| Micromotor hand-held drill | Foredom | K1070 | |
| Mouse warming pad | Ken Scientific Corporation | TP-22G | |
| Fluorescence Tomography System | PerkinElmer | FMT 2500 XL | |
| TrueQuant Imaging Software | Perkin Elmer | 7005319 | |
| Ultra-centrifuge Optima L-80 XP | Beckman Coulter | 392049 | |
| Tissue Culture 100mm Dishes | Olympus Plastics | 25-202 | |
| Tissue Culture 150mm Dishes | Olympus Plastics | 25-203 | |
| Tissue Culture Flasks T75 | Corning | 430720U | |
| 50 mL conical tubes | Corning | 430290 | |
| 15 mL conical tubes | Olympus Plastics | 28-101 | |
| Centrifuge Avanti J-20 | Beckman Coulter | J320XP-IM-5 | |
| Tube, Polypropylene, Thinwall, 5.0 mL | Beckman Coulter | 326819 | |
| Tube, Thinwall, Polypropylene, 38.5 mL, 25 x 89 mm | Beckman Coulter | 326823 | |
| Athymic nude mice | Charles River Laboratories | Strain Code 490 (Homozygous) | Prior approval by the Institutional Animal Care Program and by the Institutional Biosafety Committee required. |
References
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