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Cancer Research

Fluoreszenz Molekulare Computertomographie für die In-Vivo Bildgebung des Glioblastoms Xenotransplantate

doi: 10.3791/57448 Published: April 26, 2018
* These authors contributed equally

Summary

Orthotopen intrakraniellen Injektion von Tumorzellen wurde in der Krebsforschung zur Gehirn Tumorbiologie, Fortschreiten, Evolution und therapeutische Reaktion zu studieren. Hier präsentieren wir Ihnen Fluoreszenz Molekulare Tomographie der Tumor Xenografts vorsieht, dass Echtzeit-intravitalen Bildgebung und Quantifizierung eines Tumors in präklinischen Glioblastom Modelle Masse.

Abstract

Tumorigenität ist die Fähigkeit von Krebszellen, einen Tumor bilden Masse. Ein weit verbreiteter Ansatz um festzustellen, ob die Zellen tumorigenic sind wird durch Injektion immungeschwächte Mäuse subkutan mit Krebszellen und die Tumor-Masse zu messen, nachdem es sichtbar und fühlbar wird. Orthotopen Injektionen von Krebszellen sollen die Xenograft in der Mikroumgebung einzuführen, die am ehesten des Gewebes von Ursprung des Tumors untersucht. Gehirn-Krebs-Forschung erfordert intrakraniellen Krebszellen die Tumorbildung und Analyse in der einzigartigen Mikroumgebung des Gehirns zu ermöglichen. Die in-Vivo -Darstellung der intrakraniellen Xenotransplantate überwacht augenblicklich die Tumor-Masse des Orthotopically pfropfte Mäuse. Hier berichten wir über die Verwendung von Fluoreszenz Molekulare Computertomographie (FMT) von Gehirn Tumor Xenografts. Die Krebszellen sind zunächst mit ausgestrahlt, in der Nähe von Infrarot-fluoreszierende Proteine und dann in das Gehirn des immungeschwächte Mäuse injiziert. Die Tiere werden dann gescannt, um quantitative Informationen über die Tumor-Masse über einen längeren Zeitraum hinweg zu erhalten. Zelle vor Kennzeichnung ermöglicht eine kostengünstige, reproduzierbare und zuverlässige Quantifizierung der tumorlast innerhalb jeder Maus. Wir eliminiert die Notwendigkeit für die Injektion bildgebenden Substrate und reduziert den Stress auf die Tiere. Eine Einschränkung dieses Ansatzes wird durch die Unfähigkeit, sehr kleine Massen erkennen dargestellt; Allerdings hat es besseren Auflösung für größere Massen als andere Techniken. Es kann angewendet werden, um die Wirksamkeit einer medikamentösen Behandlung oder genetische Veränderungen von Gliom-Zell-Linien und Patienten stammenden Proben zu bewerten.

Introduction

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Krebs ist eine der führenden Ursachen für krankheitsbedingte Todesfälle beim Menschen in der industrialisierten Welt. Mit einer extrem hohen Todesopfer sind neue Behandlungen dringend erforderlich. Glioblastoma Multiforme (GBM) ist eine extrem tödliche Art von Hirntumoren, bestehend aus heterogenen Bevölkerung von Gehirn, Stromale und immun Tumorzellen. Laut der zentralen Gehirn Tumor Registrierung der USA ist die Inzidenz des primären malignen und nicht-malignen Hirntumoren etwa 22 Fälle pro 100.000. Rund 11.000 Neuerkrankungen werden voraussichtlich in den USA im Jahr 20171diagnostiziert werden.

Präklinische Studien untersuchen die Wahrscheinlichkeit, dass ein Medikament, Verfahren oder Behandlung vor der Prüfung beim Menschen wirksam sein. Einer der frühesten Labor Schritte in präklinischen Studien ist mögliche Molekulare Targets für medikamentöse Behandlung identifizieren, mithilfe von Krebszellen, die in einen Wirtsorganismus, definiert als menschliche Xenograft Modelle implantiert. In diesem Zusammenhang haben intrakraniellen Gehirn Tumor Xenograft Modelle mit Patienten abgeleitet Xenotransplantate (PDXs) weit verbreitet zu studieren Gehirn Tumorbiologie, Fortschreiten, Evolution und therapeutische Reaktion, und vor kurzem für die Entwicklung von Biomarkern, Drogen Screening und personalisierte Medizin2,3,4.

Die meisten erschwinglich und nicht-invasive in Vivo bildgebende Verfahren zur Überwachung der intrakraniellen Xenotransplantate gehört Biolumineszenz imaging (BLI)5,6,7,8. Jedoch enthalten einige BLI Einschränkungen Substrat Verwaltung und Verfügbarkeit, Enzymstabilität, abschrecken und Streuung während imaging Erwerb9. Hier berichten wir über die Infrarot-FMT als Alternative bildgebendes Verfahren zur Überwachung der präklinischen Glioblastom Modelle. In dieser Methode, Signalerfassung und Quantifizierung der intracranially implantierten PDXs, mit dem Ausdruck ein Nahinfrarot-fluoreszierende Protein iRFP72010,11 (fortan als FP720 bezeichnet) oder turboFP635 (fortan als FP635 bezeichnet), wird mit einer FMT imaging-System durchgeführt. Mit der FMT-Technologie überwacht der orthotopen können Tumoren sein in Vivo vor, während oder nach der Behandlung in einer nicht-invasiven, frei von Substrat und quantitative Weise für präklinische Beobachtungen.

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Protocol

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Experimentelle forschungstiere und Krankheitserreger, wie z. B. Lentivirus, die Krebszellen transduzieren benötigen Zustimmung vom institutionellen Tierbetreuung Programm und der institutionellen Biosafety-Ausschuss. Dieses Protokoll erfolgt nach den Richtlinien der Pflege der Tiere von der University of California San Diego (UCSD).

1. Kennzeichnung von Glioblastom-Zellen mit FP635 oder FP720 Konstrukt

  1. Zu produzieren Sie und zu reinigen Sie Lentivirus gemäß dem Protokoll von Tiscornia Et Al. beschrieben 12
  2. Kultur ca. 2,0 x 106 Zellen aus einer menschlichen Gliom-Zelllinie mit DMEM plus 10 % fetalen bovine Serum (FBS) in einem 15-cm-Schüssel; oder Kultur 2.0 x 106 menschlichen Glioblastom Patienten abgeleitet (GBM-PDX) Kugeln mit DMEM/F12 1:1 Medium mit B27 ergänzen plus human rekombinanten epidermalen Wachstumsfaktor (EGF; 20 ng/mL) und FGF (10 ng/mL) in ein Auffanggefäß T75.
  3. Alle Zellen bei 37 ° C, 5 % CO2und 100 % relativer Luftfeuchte zu erhalten.
  4. Die Zellen zu trennen.
    1. Für die Gliom-Zellen: den überstand von den Platten zu entfernen und das Gliom-Zellen 3-5 mL Trypsin 1 X hinzufügen.
    2. Für die GBM Sphären: die Zellen zu sammeln, indem Sie die Zellen in ein 15-mL-Röhrchen pipettieren.
      1. Spin-down der GBM-Kugeln 200 X g für 5 min mit einer Tischplatte Zentrifuge bei Raumtemperatur.
      2. Entfernen des Überstands und 3-5 mL Zelle Ablösung Lösung.
    3. Inkubieren Sie alle Zellen bei 37 ° C für 10-15 min.
  5. Sorgfältig trennen die Zellen durch pipettieren nach oben und unten mehrmals (sicherzustellen, dass die Kugeln und Gliom Zellen abgeschlossen sind getrennt) und Spin-down bei 200 X g für 5 min.
  6. Entfernen des Überstands und Aufschwemmen der Zellen mit 5 mL Medium durch nach oben und unten mehrmals pipettieren. Bestimmen Sie die Zellviabilität Trypan blau ausgeschlossen.
  7. Platte 1,0 x 106 der Zielzellen in einem 10-cm-Schüssel mit 5 mL Medium durch pipettieren.
  8. Transduzieren Sie Zellen mit Lentivirus auszudrücken fluoreszierende Proteine bei der Multiplizität der Infektion (MOI) 5 wie von Tiscornia Et Al. beschrieben wird 12 und bei 37 ° c inkubieren
  9. Entfernen Sie nach 24 h das Medium aus den transduced Zellen, 5 mL frisches Medium hinzufügen und weitere 48 h bei 37 ° c inkubieren
  10. Distanzieren Sie die infizierten Zellen in eine einzelne Zelle Suspension wie beschrieben in Schritten 1,4-1,6. Spin-down der Zellen bei 200 X g für 5 min und Aufschwemmen in 500 µL Lösung zu sortieren (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit 1 % FBS).
  11. Pipette die Zellsuspension in FACS Röhren. Co färben Sie die Zellen mit 1 µL/mL 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) Dihydrochloride, abgestorbenen Zellen auszuschließen. Negative Kontrollen sind erforderlich, um den Flow Cytometer Toren einzurichten (nicht ausgestrahlt und nicht ausgestrahlt Zellen / DAPI gefärbt).
  12. Sortieren Sie die Leuchtstoff-positiven/DAPI-negativen Zellen in Sortierung Lösung, wie von Basu Et Al. beschrieben 13, und sammeln Sie die sortierten Zellen in ein 15 mL konische Röhrchen.
  13. Spin-down der sortierten Zellen bei 200 X g für 5 min, den überstand zu entfernen und in 5 mL Kulturmedium aufzuwirbeln. Samen der sortierten Zellen in einer 10 cm Petrischale durch pipettieren. Inkubation bei 37 ° C für mindestens 48-72 h.
  14. Erweitern der sortierten Zellen durch Wehre die Zellen folgende Schritte 1,4-1,6 und Beschichtung in mehrere Gerichte für in Vivo Experimente.
    Hinweis: Näheres zur Zelle Sortierung, Aufbereitung und Reinigung siehe Basu Et al. 13

(2) intrakranielle Injektion von iRFP getaggt Glioblastom-Zellen in immungeschwächte Mäuse

Hinweis: Vor Beginn der Operation, stellen Sie sicher, dass die OP und Werkzeuge für die Prozedur sauber sind. Verwenden Sie immungeschwächte Athymic nackt (Foxn1Nu) männliche oder weibliche Mäuse, zwischen 4-5 Wochen alt und 17-19 g intrakraniellen Injektionen. Tiere sollten für mindestens 3 Tage nach Ankunft und vor der Operation untergebracht werden.

  1. Handy-Vorbereitung
    1. Ernte und fluoreszierende positiv-Gliom Zellen in eine einzelne Zelle Suspension (Schritte 1,4-1,6) zu distanzieren und Aufschwemmen 0,5 oder 1,0 x 106 Zellen in 2 bis 5 µL PBS pro Injektion pro Tier. Pipette die Zellsuspension in einen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch und auf Eis.
  2. Anästhesie-Vorbereitung und Verwaltung
    1. Bereiten Sie 200 µL Kochsalzlösung mit Ketamin (100 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg) pro 20 Gramm Körpergewicht Maus vor. Wiegen Sie der Tiere und berechnen Sie die entsprechende Dosis der Narkose zu.
    2. Bieten Sie eine intraperitoneale Injektion von Anästhesie und gelten Sie ophthalmologischen Salbe für die Augen, um Austrocknung zu verhindern. Weitere Details zu diesem Schritt finden Sie unter Kathleen Et al. Legen Sie 14 das Tier auf einer vorgewärmten Wasser Wärmeleitpad bei 37 ° C.
    3. Überprüfen Sie, dass die Tiere betäubt sind durch die Überwachung der Zehe Prise Antwort (Pedal Reflex), in der Regel innerhalb von 5-10 Minuten.
  3. Intrakranielle Injektion
    1. Laden 5 µL Hamilton-Spritze (stumpfe Spitze Nadel) mit Zellsuspension und Berg in Sondenhalter.
    2. Platzieren Sie den Mauszeiger in einem kleinen Tier Stereotaktische Rahmen und fixieren Sie den Kopf mit der Ohr-Bars und den Schneidezahn-Adapter nach den beschriebenen Details von Cetin Et al. 15
    3. Desinfizieren Sie den Kopf mit 70 % Ethanol und Betadine Lösung. Stellen Sie sicher, dass der Operationsstelle ist komplett steril. Führen Sie einen mittleren Schnitt mit einem kleinen Skalpell und trennen Sie die Haut und Bindegewebe.
    4. Ort der Hamilton-Spritze am Bregma Punkt mit dem Mikromanipulator.
    5. Bewegen Sie die Sonde Halter 1,0 mm Anteroposterior und 2.0 mm seitliche vom Bregma Punkt. Markieren Sie diese Position mit einem Bleistift.
    6. Machen Sie an dieser Stelle aufmerksam ein Loch in den Schädel mit einem Mikromotor handgeführte Bohrer durch leichten Druck nach unten bis die Blutgefäße sichtbar werden. Stören Sie nicht die Arachnoidea Mater und Gehirn Parenchym.
    7. Führen Sie die Nadel in die Bohrlochs und 3,0 mm unterhalb der pial Oberfläche voraus.
    8. Richten Sie das Volumen (2 bis 5 µL) und die Durchflussmenge (1 µL/min) der Injektion mittels eines motorisierten stereotaktischen Injektors oder manuell durchführen der Injektion.
    9. Entfernen Sie nach der Injektion die Nadel langsam durch aufsteigende 1,0 mm alle 1 min und reinigen Sie die Injektionsstelle mit 70 % Ethanol.
    10. In der Nähe die Haut Wunde mit chirurgischen Klammern oder durch chirurgisches Nahtmaterial (oft als Stiche) und siehe Kathleen Et al. 14 für weitere Informationen.
  4. Tierische Erholung
    1. Übertragen Sie das Tier auf ein Wärmeleitpad Wasser (37 ° C) und überwachen Sie die Körpertemperatur, Atemfrequenz und Herzfrequenz, bis zur endgültigen Genesung. Verwalten Sie Analgesie pro standard-Protokolle.
      Hinweis: Weitere Informationen über die Stereotaktische Verfahren, Chirurgie und Koordinaten, siehe andere Berichte5,14,15.

(3) FMT Imaging

Hinweis: Nach der experimentellen Ziel überwacht die iRFP getaggt Glioblastom, die Zellen werden können in Vivo vor, während oder nach der Behandlung. Für imaging-Zweck, Tiere mit einer Isofluran Induktion Kammer zu betäuben, halten in einer bildgebenden Kassette beim Scannen und Bild in die Docking-Station von der FMT-Imager.

  1. Entfernen Sie das Tier aus dem Käfig und stellen in der Isofluran-Induktion-Kammer. Schließen Sie die Kammer und schalten Sie Sauerstoffzufuhr und Verdampfer auf ca. 3-5 %.
  2. Überwachen Sie das Tier bis es vollständig betäubt ist, in der Regel innerhalb von 1-2 min. unbewussten Tiere sollte nicht reagieren auf äußere Reize.
  3. Entfernen Sie das narkotisierten Tier aus der Kammer und setzen Sie das Tier in der bildgebenden Kassette indem man den Kopf Adapter zuerst, indem man das Tier nach unten gefolgt. Stellen Sie sicher, dass der Kopf in die Mitte der Kassette befindet.
  4. Legen Sie die obere Platte der Kassette auf und ziehen Sie die Einstellknöpfen bis 17 mm.
  5. Einmal, dass das Tier ist sicher in der bildgebenden Kassette, fahren Sie mit Bildgebung durch Einsetzen der Kassette in die interne docking-Station von der FMT-Imager, wo die Isofluran gepumpt wird, um das Tier betäubt zu halten.
  6. Führen Sie die Imager und Analyzer Software durch Doppelklick auf das Symbol Software.
  7. Wählen Sie im Fenster "experimentelle Registerkarte""die"Datenbank"und"Study Group".
  8. Gehen Sie zum Fenster "Registerkarte" Scannen "" und wählen Sie den Betreff Bild durch Klicken auf "Thema auswählen". Außerdem wählen Sie den Laser-Kanal im Bereich "Laser-Kanal". Für die FP635-markierte Zellen wählen Sie "Laser Kanal 635 nm" und für FP720-markierte Zellen, "laser-Kanal 680 nm".
  9. Erwerben Sie ein Bild, indem Sie auf die Option "Capture" im Fenster "Registerkarte" Scannen "". Passen Sie dann den Scan-Bereich durch Klicken und ziehen das Scan-Feld in das aufgenommene Bild auf eine bestimmte Anzahl von Quellspeicherorten, in der Regel innerhalb von 20-25 Quellen für die ipsilateralen Seite.
  10. Aktivieren Sie die Option "Zur Rekonstruktion Warteschlange hinzufügen" und getroffen Sie "Scan" im Fenster "Registerkarte" Scannen "".
  11. Warten Sie, bis der Scan abgeschlossen ist und entfernen Sie dann die bildgebende Kassette aus der Docking-Station.
  12. Entfernen Sie die obere Platte der Kassette und legen Sie das Tier zurück in den Käfig.
  13. Wiederholen Sie die Schritte 3.1-3.12 für den Rest der Tiere.

(4) Bildanalyse

  1. Wählen Sie aus dem Imager und Analyzer Software das "Registerkarte Analyse"-Fenster.
  2. Laden Sie das Dataset und das Thema, indem Sie auf die Taste "+" im Bereich "Dataset Auswahl" des Fensters "Registerkarte Analyse" zu analysieren.
  3. Sobald das Bild im Fenster "Registerkarte Analyse" geladen wurde, Ausführen der Region of Interest (ROI) Analyse durch das Ellipsoid-Symbol in der oberen linken Ecke des Fensters "Registerkarte Analyse" auswählen.
  4. Passen Sie den Schwellenwert auf NULL mit der rechten Maustaste die "Schwelle" Spalte im Fenster "Registerkarte" Analysis "" im Bereich "Statistik".
  5. Der Gesamtwert im Bereich "Statistik" stellt das Signal aus den Leuchtstoff-Tags Glioblastom-Zellen in das Gehirn der Maus implantiert.
  6. Wiederholen Sie die Schritte 4.2-4.4 für den Rest der Tiere. Laden oder ein neues Thema zu entfernen, indem Sie auf das "+" oder "−"-Taste, bzw. in "Dataset" Auswahljury des Fensters "Registerkarte Analyse".
    Hinweis: Weitere Informationen über die FMT Bildgebung und Betrieb der Software finden Sie unter20.

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Representative Results

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Glioblastom-Zellen U87EGFRvIII (U87 Zellen zum Ausdruck über der EGF-Rezeptor-Variante III) wurden nach dem Schritt 1.2 kultiviert. Lentivirus wurde produziert und gemäß Schritt 1.1 gereinigt. Die virale Konzentration von p24 bestimmt war ELISA Analyse. Zellen wurden mit Lentivirus mit Infrarot-fluoreszierende Proteine nach Schritt 1,8 ausgestrahlt. Das Plasmid FP72010,11 -Codierung wurde freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. V.V. Verkhusha und der FP635-Vektor wurde von einem gewerblichen Verkäufer gekauft. Ziel-Zellen wurden FACS sortiert, um für die oberen 10 % am meisten fluoreszierenden Zellpopulation (Abbildung 1A) bereichern. Erhöht das Fluoreszenzsignal verbessert die Empfindlichkeit des Systems der Fluoreszenz-Tomographie. Um die Intensität der Signale von eindringmittel-markierten Zellen vor der orthotopen Implantation zu überprüfen, haben wir die phantom Kassette der FMT-Imager verwendet. Insbesondere U87EGFRvIII-TurboFP635 und U87EGFRvIII-iRFP720-Zellen wurden mit Trypsin und 1 x 105, 1 x 106, dissoziiert und 1 x 107 Zellen wurden jeweils in 100 µL Eis kaltem PBS, Nukleinsäuretablette und analysiert. Der FMT-Imager ermöglicht die Erkennung in 4 Kanäle: 635 nm, 680 nm, 750 nm und 780 nm. Fern-Infrarot-Kanäle 750 nm und 780 nm sind nicht geeignet für diese Analyse, denn es gibt keine Emission bei solchen Wellenlängen aus dem Nah-Infrarot-fluoreszierende Proteine verwendet (Daten nicht gezeigt). Daher analysierten wir die Emission Signale bei 635 nm und 680 nm. In Abbildung 1berichtet, die fluoreszierenden signal Bild und Intensität Quantifizierung für beide FP635 (Abbildung 1 b, C) und FP720 (Abbildung 1, E), die steigt proportional mit zunehmender Zelle Nummer. Der Hinweis, die Emission für FP635 ist sichtbar in der 635 nm-Kanal aber nicht in den 680 nm-Kanal. Im Gegensatz dazu ist die Emission für FP720 sichtbar in den 680 nm Kanal aber nicht in der 635 nm-Kanal. Dies macht diese beiden Kandidaten fluoreszierende Proteine geeignet für Studien, wo zwei Populationen von Zellen können beschriftet werden und gleichzeitig mit zwei in der Nähe von Infrarot-Fluoreszenzmarkierungen überwacht.

U87EGFRvIII Zellen in der Nähe von Infrarot-fluoreszierende Proteine mit beschriftet wurden dann zur orthotopen Injektion und in Vivo Tumor Wachstum Überwachung verwendet, wie in beschrieben Schritte 2.1-2.4. Wir verwendet die gleichen Zell-Linie, d. h., U87EGFRvIII, mit verschiedenen fluoreszierenden Tags gekennzeichnet, Tumor-Wachstum-Unterschied zwischen verschiedenen Krebsarten Zelle auszuschließen. Die Mäuse wurden mit U87EGFRvIII-TurboFP635 Zellen, U87EGFRvIII-iRFP720 Zellen oder eine gleiche Kombination (1:1) von den beiden Zelllinien injiziert. Insgesamt 5 x 105 Zellen in einem Volumen von 5 µL PBS wurden intracranially in 4-5 Wochen alten immungeschwächten Athymic nackten Mäusen mit einem stereotaktischen System und eine Hamilton-Spritze, folgende Schritte 2,3-2,4 injiziert. Narkose wurde durch intraperitoneale Injektion von Ketamin/Xylazin erreicht. Die Tiere wurden während der Injektion mit einem Wärmeleitpad Wasser warm gehalten und für alle Zeichen der Bedrängnisses überprüft. Tumor Engraftment und Wachstum wurde dann von der FMT imaging-System überwacht. Während der Scan Sitzungen wurden die Mäuse vorübergehend betäubt mit einer 3 % Isofluran Kammer (Schritte 3.1-3.12). Die Mäuse wurden dann in einer bildgebenden Kassette gelegt und in der Laser-scanning-Kamera abgebildet. Jede Maus wurde gescannt, mit den 635 nm und 680 nm Kanäle. Die Signal-Quantifizierung wurde im Laufe der Zeit aufgenommen und Mäuse wurden nach den Leitlinien institutionelle Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) zu Beginn der neurologischen Symptome eingeschläfert. Wie in Abbildung 2A, U87EGFRvIII-TurboFP635 Emission Signal zeigte sich in der 635 nm-Kanal und minimale Hintergrundsignal verzeichnete die 680 nm-Kanal (2 Zahlen b, C). Im Gegensatz dazu, U87EGFRvIII-iRFP720 Zellen in die 680 nm-Kanal mit wenig Hintergrundwissen in den 635 nm-Kanal (Figuren 2DF) emittiert. Schließlich zeigten Mäuse injiziert mit einer 1:1 Mischung aus U87EGFRvIII-TurboFP635 und U87EGFRvIII-iRFP720 Zellen erhöhte Signal in beiden Kanälen für die Dauer des Experiments (Abbildungen 2ich). Diese Daten zeigen, dass es möglich ist, Infrarot-fluoreszierende Proteine für dual in-Vivo Bildgebung des Krebs-Zell-Populationen zu nutzen. Die Daten zeigen auch, dass verschiedene fluoreszierende Proteine unterschiedlichen Intensität in ihrem Signal haben. Hier war FP720 Signalintensität überlegen FP635, mit erhöhter Empfindlichkeit bei der Aufdeckung von kleineren Populationen von Krebszellen in eine nicht-invasive Überwachung Einstellung.

Die Auswirkungen der Gen-silencing von Krebs-Genen auf tumorigenität in präklinischen Modellen kann auch Studie mit diesem Protokoll. Zu diesem Zweck GBM-Sphären (GSC23 und GSC11) wurden kultiviert (Schritt 1.2) und mit FP720-Lentivirus (Schritt 1,8) ausgestrahlt. Mit dem Ausdruck FP720 Zellen wurden FACS sortiert wie zuvor in 1.11-1.13 beschrieben. FP720-markierte Zellen wurden mit Lentivirus Codierung ShRNA Ausrichtung auf DAXX (ShDaxx) oder ShRNA Control (ShLuc) bei MOI 516Co transduced. Zellen waren für 5 Tage, getrennt in eine einzelne Zelle Aufhängung, kultiviert und 1 x 106 Zellen wurden in 3 µL PBS intrakraniellen Injektionslösung Nukleinsäuretablette. Die Wirksamkeit der ShRNA targeting DAXX wurde durch reverse Transkription quantitative Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR) in GSC23 bestätigt (Abbildung 3A) und GSC11 (Abbildung 3). GBM-iRFP720/ShRNA Zellen wurden hierbei in das Striatum immungeschwächte Mäuse nach Schritte 2,3-2,4 injiziert. Tiere für neurologische Symptome beobachtet wurden und die relative Fluoreszenzsignal die Xenotransplantate analysiert wurden durch die FMT-imaging-System, quantifiziert mit Analyse-Software, entsprechend der Schritte 3.1-4.6. Repräsentative Bilder von FMT zeigen eine Abnahme Fluoreszenzsignal in Mäusen pfropfte mit ShDAXX/GBM-Kugeln im Vergleich zu Tieren mit ShControl implantiert (Abb. 3 b und Figur 2D) für beide Modelle von GBM-Kugeln, bestätigen unsere vorherige Feststellung16 , dass DAXX Hemmung Tumorwachstum in präklinischen Glioblastom Modellen verdrängt.

Figure 1
Abbildung 1: Standardkurven mit Zellen für Phantom und FACS Analyse. (A) repräsentative FACS Histogramme der FP720 - und FP635-U87EGFRvIII mit dem Ausdruck Zellen (linkes und rechtes Panel, beziehungsweise). Gliom-Zellen wurden mit Lentivirus Infrarot-fluoreszierende Proteine codieren infiziert und FASC sortiert werden, um für den höchsten Ausdruck der FP720 oder FP635 Proteine zu bereichern. Repräsentative Bilder entnommen die Imager und Analyzer Software von U87EGFRvIII-TurboFP635 (B) und U87EGFRvIII-iRFP720 (D) mit der phantom Kassette Zellsuspensionen. Obere Platten repräsentieren das Signal in den 635 nm Kanal und unten in den 680 nm-Kanal. In der Zelle zu erhöhen Anzahl entsprach einem Anstieg Signal Visualisierung. Signal-Quantifizierung der U87EGFRvIII-TurboFP635 (C) und U87EGFRvIII-iRFP720 (E) Zellen in 635 nm und 680 nm Kanäle. Relative Fluoreszenz Einheiten entnehmen Sie bitte der Farbleiste. Fehlerbalken darzustellen S.E.M aus 3 verschiedenen Scans pro Zellsuspension. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Gehirn-Tumor-Xenograft-Modell mit U87EGFRvIII Zellen gescannte in verschiedene Kanälen. Repräsentative Bilder von Fluoreszenzsignal in 635 nm und 680 nm-Kanäle von Tieren implantiert intracranially mit U87EGFRvIII-turboFP635 (A), U87EGFRvIII-iRFP720 (D) und eine Mischung aus (1:1) U87EGFRvIII-iRFP720: U87EGFRvIII-turboFP635 Zellen (G). Bilder wurden am 5. Tag nach dem ersten Scannen erworben. (B, E, H) Signal-Intensität Überwachung für jede Maus über einen Zeitraum von 5 Tagen. Jede Maus wurde in der 635 nm-Kanal (blaue Balken) und 635 nm-Kanal (roter Balken) gescannt. Der hellsten Farbe des Balkens Farbe stellt Tag 1 des Scannens und dunkelsten Schatten Tag 5 darstellt. (C, F, ich) Quantifizierung der relativen Fluoreszenz zeigt einen direkten Vergleich der Signalintensität von 635 nm-Kanal (blau) und 680 nm-Kanal (rot) in der gesamten Kohorte von Mäusen. Relative Fluoreszenz Einheiten entnehmen Sie bitte der Farbleiste. Die Daten zeigen die Mittelwerte mit Standardabweichung von 3 verschiedenen Tieren. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Gen-silencing in präklinischen Glioblastom Modelle mit FMT. Gen Expressionsanalyse von DAXX durch RT-qPCR in GSC23 (A) und GSC11 (C) Gliom Patienten gewonnenen Zellen ausgestrahlt mit Lentivirus-codierte ShRNAs Ausrichtung auf DAXX (ShDaxx) oder ShRNA Kontrolle (ShLuc) und FP720. Repräsentative Bilder von Fluoreszenzsignal von 680 nm-Kanal des Orthotopically pfropfte Mäuse mit GSC23-iRFP720 (B) und GSC11-iRFP720 (D) Patienten gewonnenen Zellen implantiert. Starke Fluoreszenz-Signal wird bei Tieren mit ShRNA Kontrolle (ShLuc) (oberer Teil des Panels) implantiert beobachtet, im Vergleich zu Mäusen implantiert mit ShRNA-DAXX (ShDaxx) (Unterteil des Fensters), darauf hinweist, dass DAXX Hemmung Tumor unterdrückt Wachstum in präklinischen Gliom Modelle durch molekulare Computertomographie Fluoreszenz bestimmt. Relative Fluoreszenz Einheiten entnehmen Sie bitte der Farbleiste. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

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Tumor Xenografts haben ausgiebig in der Krebsforschung verwendet worden und eine Reihe von etablierten bildgebenden Verfahren entwickelt: BLI; Magnetresonanztomographie (MRT); Positronen-Emissions-Tomographie (PET), berechnet Computertomographie (CT); FMT. Jeder dieser Ansätze kommt mit vor- und Nachteile, aber letztlich ergänzen sich mit der Art der bereitgestellten Informationen. Eines der am häufigsten verwendeten in-Vivo imaging-Technologie ist BLI5,6,7,8. BLI und FMT erfordern beide Zelle Engineering (mit Luciferase Enzyme oder Infrarot-fluoreszierende Proteine), die Genexpression beeinflussen können. BLI ist empfindlicher für kleine Tumormassen aber erfordert intraperitoneale Injektion eines Substrates (Luciferin), die maximale Verteilung im Körper in 10-12 min. erreicht; aber leichte abschrecken und Streuung während imaging Erwerb und Substrat Abstand häufig vorkommende9. FMT, stattdessen erfordert keinen Benutzereingriff zusätzliche Substrat für die Tiere und das Signal ist stabil und unabhängig von Zeit oder Enzym Stabilität. Darüber hinaus bietet FMT, wenn in der gleichen Versuchsbedingungen verwendet reproduzierbare semi-quantitativen Daten. BLI und FMT bieten keine räumlichen Auflösung; aber Kupplung diese Methoden mit CT-Scan Adressen dieses Problem.

Ein CT-Scan misst die Dämpfung der Photonen, wenn sein Signal den Körper des Tieres kreuzt und ideal ist bei der Identifizierung von Körperstrukturen. Weichgewebe Kontrast, der die Erkennung eines kleinen intrakraniellen Tumors stören könnte, ist jedoch eine Einschränkung für diesen Ansatz17,18. Ein weiterer Nachteil der CT ist der Einsatz von Strahlung und Kontrastmittel, die molekulare Veränderungen in den Zielzellen auslösen können. Ein CT-Scan ist kombinierbar mit PET, die radioaktiven Tracern wie die Glukose analoge, Desoxyglukose 18F-FDG verwendet; aber dies kann auch mit einigen physiologischen Prozessen bei Kleintieren stören. Im Gegensatz dazu FMT braucht nicht injizierten Substrat um den Tumor zu messen Masse und es ist möglich, den Tumor-Stoffwechsel, Entzündungen, Angiogenese, Apoptose und andere Marker mit Gewebekulturen beschrifteten Biomarker19messen.

Insgesamt ist eine nützlichen und vielseitigen Techniken zur in-Vivo Bildgebung MRT. Geringfügige Einschränkungen des MRT finden in der niedrigen Erfassungszeit, geringere Empfindlichkeit als Haustier und einige Variationen Instrument im Zusammenhang mit18,20.

Hier berichten wir die FMT-Methode als alternative Methode für präklinische Glioblastom-Modelle. Pre-Kennzeichnung von Zielzellen mit Infrarot-fluoreszierende Proteine (Abbildung 1AE) und Scannen nach der Implantation bei immungeschwächten Tieren können mit einem Fluoreszenz-Tomographie bildgebendes System erreicht werden. Wir berichteten die FMT-Methode als alternative Methode für präklinische Glioblastom-Modelle. Mit dieser Methode Bildgebung in Substrat frei und nicht-invasive Weise angewandt, Tiere in einem spannungsarmen Umfeld gehalten werden, und tiefen Gewebe Quantifizierung kann (Abbildung 2Aich, Abb. 3A, B) durchgeführt. Dieses Protokoll kann angewendet werden, um die Wirksamkeit von kombinatorischen Behandlungen in präklinischen Gliom Modelle21, um neue therapeutische Zielstrukturen für Gehirn Tumoren16zu identifizieren und zu untersuchen, neue druggable metabolische Moleküle22zu studieren, epigenetische Wege23oder neue Chemotherapeutika in Kombination mit Strahlentherapie (unveröffentlichte Daten), und auf anderen präklinischen Studien angewendet. Wir schlagen auch hier die Verwendung von FMT als dual in-Vivo imaging Ansatz, wenn zwei nebeneinander existieren, aber anders, Tumor-Zell-Populationen sollen analysiert werden.

Einige Einschränkungen mit FMT müssen berücksichtigt werden, wie z. B. Auto-Fluoreszenz erzeugt aus einige Organe, die das Signal stören können. Z. B. murinen Milz und Leber emittieren Auto-Fluoreszenz in den 680 nm Kanal aber nicht um 635 nm. Daher müssen FMT-im Zusammenhang mit experimentellen Verfahren, die diese Organe mit anderen Infrarot-fluoreszierende Proteine, wie FP635 durchgeführt werden. Wir haben nackt in foxn1-mutiert nackte Mäusen zur Vermeidung von Interferenzen in der Fluoreszenz-Signal-Aufnahme; Wenn eine andere Maus-Modell verwendet werden muss, empfiehlt es sich, den gewünschten Bereich der Tiere zu rasieren. Darüber hinaus ist dieser Ansatz auch bei der Aufdeckung von sehr kleinen Tumormassen begrenzt. Nach unserer Erfahrung verbessert das Signal-Rausch-Verhältnis als der Tumor Masse wird größer, noch vor dem Beginn jedes neurologische Symptom in den Mäusen. In der Tat konnten wir in früheren Experimenten auf PDXs Orthotopically injiziert, Tumoren während eine Drogen-Therapie für mindestens 2 Wochen bei Mäusen ohne Anzeichen von Distress durch Tumor Belastung oder Medikament Verwaltung21zu erkennen. Letztlich wird die Aggressivität der jede Zelllinie und die Anzahl der injizierten Zellen die Länge jedes Experiment bestimmen. Die Daten zeigen eine lineare proportionale Beziehung zwischen Anzahl der Zellen und Signal (Abb. 1 bE) und Tumor Masse und Signal (Abbildung 2). aber eine Allgemeines Signal Korrelation zwischen Tumor Masse und Anzahl der Zellen kann nicht über andere Zell-Linien und Infrarot-Proteine angewendet werden. Das Signal für jede Zelle Zeile/Infrarot fluoreszierendes Protein Kombination muss empirisch ermittelt werden. Darüber hinaus entspricht das Signal aus der Analyse der Zellen mit dem Phantom (Abbildung 1 b, D) das Signal von intrakraniellen Xenotransplantate nicht wie eine Dämpfung im Signal aufgrund der Schädel der Maus auftritt.

Der Imager und Analyzer Software können für Schwellwerte. Obwohl wir hier keine Schwelle genutzt haben, gibt das Scannen Tiere ohne jede implantierten Zellen Hintergrundgeräusche, die dazu neigt, durch den Umbau in ein wahres Signal beseitigt werden. Einige Faktoren beeinflussen die Signalintensität der Xenograft und muss gehalten werden, in Betracht ziehen: jedes Infrarot-fluoreszierendes Protein hat verschiedene Emissionsspektrum und Intensität, mit FP720 als eines der am meisten fluoreszierende Proteine verwendet experimentell10 ,11; jede Zelllinie ermöglicht eine reichlich, aber begrenzt, Menge an Protein-Produktion, so beeinflussen die maximale Fluoreszenz erhältlich. Schließlich der FMT-Imager ist Setup mit internen Standardkurven für bestimmte Verbindungen, daher ist es wichtig zu überlegen, welche Verbindung die nächstgelegene Emissionsspektrum hat mit dem Infrarot-fluoreszierende Protein verwendet, um die Zellen zu beschriften. Obwohl gut vertragen, empfiehlt es sich, mögliche zytotoxische Effekte vermittelt durch die Überexpression von Infrarot-Proteine8,9bestimmen. Darüber hinaus empfehlen wir Kohorten von Mäusen von mindestens 8 pro Versuchsgruppe, wie Datenverlust und Mäuse durch chirurgischen Eingriff oder Variabilität in der Krebs Zelle Engraftment auftreten kann; Dennoch fügt das statistischen Signifikanz der Studie. Wir empfehlen auch seriell die tierische Kohorte für mehrere Tage Scannen und analysieren die Signalausgabe zur gleichen Zeit, da Schwankungen in der bildgebenden Kassette Tiefe und Fluoreszenzsignal Wiederaufbau könnte Schlusssignal Quantifizierung stören. Um dieses Problem zu lösen, ermöglicht die Analyzer-Software für geringfügige Änderungen in Laserintensität (von normal bis hoch und sehr hoch), obwohl das Endergebnis erfahrungsgemäß nicht völlig anders ist. Ein letzter Hinweis bezüglich Wirtschaftlichkeit ist, dass das FMT imaging-System leicht als ein zentrales Instrument unter verschiedenen Labors geteilt werden kann, wodurch die Anschaffung und Wartung Kosten bestreiten. Das FMT ist eine wertvolle Ressource, die experimentelle und präklinische Bewertung der in Vivo Tumorwachstum einfach und zuverlässig macht.

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Disclosures

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Acknowledgments

Wir danken Dr. Frederick Lang, MD Anderson Cancer Center für GBM-PDX neurosphären. Diese Arbeit wurde unterstützt durch die Niederlage GBM Forschung Collaborative, eine Tochtergesellschaft von National Brain Tumor Society (Frank Furnari), R01-NS080939 (Frank Furnari), James S. McDonnell Foundation (Frank Furnari); Jorge Benitez wurde durch eine Auszeichnung von American Brain Tumor Association (ABTA) unterstützt; Ciro Zanca wurde teilweise durch eine amerikanisch-italienischen Cancer Foundation Postdoc Fellowship unterstützt. Frank Furnari erhält Gehalt und zusätzliche Unterstützung von Ludwig Institute for Cancer Research.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM/High Glucose  HyClone/GE SH30022.1
DMEM/F12 1:1  Gibco 11320-082
FBS HyClone/GE SH30071.03
Accutase Innovative cell technologies AT-104
Trypsin HyClone/GE SH30236.01
B27 supplement Gibco 17504044
human recombinant EGF  Stemcell Technologies 2633
human recombinant FGF Stemcell Technologies 2634
DPBS Corning 21-031-00
FACS tubes Falcon 352235
DAPI ThermoFisher Scientific 62248
Blasticidin ThermoFisher Scientific A1113903
p24 ELISA  Clontech 632200
Xylazine Akorn NDC 59399-110-20
Ketamine Zoetis NADA 043-403 Controlled substance
Ointment Dechron NDC 17033-211-38
Absorbable suture CpMedical VQ392
5 ul syringe Hamilton 26200-U Catalog number as sold by Sigma-Aldrich
Cell Sorter Sony SH8007
Mouse stereotaxic frame  Stoelting 51730
Motorized stereotaxic injector Stoelting 53311
Micromotor hand-held drill Foredom K1070
Mouse warming pad  Ken Scientific Corporation TP-22G
Fluorescence Tomography System  PerkinElmer FMT 2500 XL
TrueQuant Imaging Software  Perkin Elmer  7005319
Ultra-centrifuge Optima L-80 XP Beckman Coulter 392049
Tissue Culture 100mm Dishes Olympus Plastics 25-202
Tissue Culture 150mm Dishes Olympus Plastics 25-203
Tissue Culture Flasks T75 Corning 430720U
50 mL conical tubes Corning 430290
15 mL conical tubes Olympus Plastics 28-101
Centrifuge Avanti J-20 Beckman Coulter J320XP-IM-5
Tube, Polypropylene, Thinwall, 5.0 mL Beckman Coulter 326819
Tube, Thinwall, Polypropylene, 38.5 mL, 25 x 89 mm Beckman Coulter 326823
Athymic nude mice Charles River Laboratories Strain Code  490 (Homozygous) Prior approval by the Institutional Animal Care Program and by the Institutional Biosafety Committee required.   

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References

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Fluoreszenz Molekulare Computertomographie für die <em>In-Vivo</em> Bildgebung des Glioblastoms Xenotransplantate
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Benitez, J. A., Zanca, C., Ma, J., Cavenee, W. K., Furnari, F. B. Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts. J. Vis. Exp. (134), e57448, doi:10.3791/57448 (2018).More

Benitez, J. A., Zanca, C., Ma, J., Cavenee, W. K., Furnari, F. B. Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts. J. Vis. Exp. (134), e57448, doi:10.3791/57448 (2018).

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