Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Cancer Research

Fluorescens molekylær tomografi ved i Vivo avbildning av glioblastom Xenografts

doi: 10.3791/57448 Published: April 26, 2018
* These authors contributed equally

Summary

Orthotopic intrakranielt injeksjon av kreftceller har vært brukt i forskning til å studere hjernen svulst biologi, progresjon, utviklingen og terapeutiske svar. Her presenterer vi fluorescens molekylær tomografi av svulst xenografts, som gir sanntids intravital bildebehandling og kvantifisering av en svulst masse i preklinisk glioblastom modeller.

Abstract

Tumorigenicity er evnen av kreftceller å danne en svulst masse. En utbredt tilnærming til å avgjøre hvis cellene er tumorigenic er å injisere immunodeficient mus subcutaneously kreftceller og måle svulst massen når det blir synlig og håndgripelig. Orthotopic injeksjoner av kreftceller som mål å introdusere xenograft i microenvironment som ligner mest på det vev av opprinnelse av tumoren blir studert. Hjernen kreftforskning krever intrakranielt injeksjon av kreftceller tillate tumor dannelse og analyse i den unike microenvironment av hjernen. I vivo avbilding av intrakranielt xenografts overvåker umiddelbart svulst masse orthotopically engrafted mus. Her rapporterer vi bruk av fluorescens molekylær tomografi (FMT) av hjerne svulst xenografts. Kreftceller er første transduced med nær infrarød fluorescerende proteiner og deretter injisert i hjernen immunsupprimerte mus. Dyrene er så skannet for å få kvantitativ informasjon om svulsten massen over lengre tid. Cellen pre merking gir kostnadseffektive, reproduserbare og pålitelig kvantifisering av svulst byrden i hver musen. Vi eliminert behovet for sprøytebruk tenkelig underlag, og dermed redusert stress på dyrene. En begrensning av denne tilnærmingen er representert ved manglende evne til å oppdage svært små massene; men har det bedre oppløsning for større massene enn andre teknikker. Den kan brukes for å evaluere effekten av en behandling eller genetiske endringer av glioma linjer og pasient-avledede prøver.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Kreft er en av de viktigste årsakene til sykdom-relaterte dødsfall hos mennesker i den industrialiserte verden. Med en ekstremt høy dødstallene er nye behandlinger raskt behov. Glioblastom multiforme (GBM) er en svært dødelige hjernen kreft, består av heterogene bestander svulst stromal, og immunsystemet cellene. Ifølge sentrale hjerne svulst registret i USA er forekomsten av primære ondartet og ikke-ondartet hjernesvulster ca 22 tilfeller pr. 100 000. Ca 11 000 nye tilfeller forventes å bli diagnostisert i USA i 20171.

Prekliniske studier undersøke sannsynligheten av et stoff, prosedyre, eller behandling å være effektive før testing hos mennesker. En av de tidligste laboratorium trinnene i preklinisk studier er å identifisere potensielle molekylære mål for behandling ved hjelp av kreftceller implantert i en vert organisme, definert som menneskelige xenograft modeller. I denne sammenheng brukt intrakranielt hjerne svulst xenograft modeller med pasient-avledede xenografts (PDXs) mye til å studere hjerne svulst biologi, progresjon, utviklingen og terapeutiske svar, og mer nylig for biomarkers utvikling, narkotika sortering og personlig medisin2,3,4.

En av de mest rimelig og ikke-invasive i vivo imaging metoder for å overvåke intrakranielt xenografts er bioluminescens imaging (BLI)5,6,7,8. Men omfatter noen BLI begrensninger substrat administrasjon og tilgjengelighet, enzym stabilitet, og lett slukke og spredning under imaging oppkjøpet9. Her rapporterer vi den infrarøde FMT som et alternativ imaging metode for å overvåke prekliniske glioblastom modeller. I denne metoden, signalet vinningen og kvantifisering av intracranially implantert PDXs, uttrykke en nær-infrarøde fluorescerende protein iRFP72010,11 (heretter kalt som FP720) eller turboFP635 (heretter kalt som FP635), utføres med en FMT tenkelig system. Bruker FMT teknologi, overvåkes orthotopic svulster kan i vivo før, under eller etter behandling, i en ikke-invasiv, substrat-fri og kvantitative måte prekliniske observasjoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bruk av eksperimentell forskning dyr og smittsomme sykdommer, som lentivirus å transduce kreftceller, krever forhåndsgodkjenning av programmet dyr institusjon og institusjonelle biosafety utvalget. Denne protokollen følger retningslinjene dyr omsorg fra University of California, San Diego (UCSD).

1. merking av glioblastom celler med FP635 eller FP720 konstruksjon

  1. Produsere og rense lentivirus i henhold til protokollen som Tiscornia et al. 12
  2. Kultur ca 2.0 x 106 celler fra en menneskelig glioma celle linje med DMEM pluss 10% fosterets bovin serum (FBS) i en 15 cm rett; eller kultur 2.0 x 106 menneskelige glioblastom pasient-avledede (GBM-PDX) kuler med DMEM/F12 1:1 medium med B27 supplement pluss menneskelige rekombinant epidermal vekstfaktor (EGF, 20 ng/mL) og FGF (10 ng/mL) i en MT75 bolle.
  3. Opprettholde alle celler på 37 ° C, 5% CO2og 100% relativ fuktighet.
  4. Distansere cellene.
    1. For de glioma cellene: fjerne nedbryting fra platene og legge til 3-5 mL av trypsin 1 X glioma cellene.
    2. For GBM kuler: samle inn cellene ved pipettering cellene i en 15-mL tube.
      1. Nedspinning GBM kulene på 200 x g i 5 minutter ved hjelp av en tabletop sentrifuge ved romtemperatur.
      2. Fjern nedbryting og legge 3-5 mL celle avdeling løsning.
    3. Inkuber alle cellene på 37 ° C i 10-15 min.
  5. Nøye distansere cellene av pipettering opp og ned flere ganger (sikre at kuler og glioma celler er fullført avstand) og Nedspinning 200 x g i 5 min.
  6. Fjern nedbryting og resuspend cellene med 5 mL av medium av pipettering opp og ned flere ganger. Bestemme cellen levedyktigheten ved trypan blå eksklusjon.
  7. Plate 1.0 x 106 av målcellene i 10 cm parabol med 5 mL av medium av pipettering.
  8. Transduce celler med lentivirus uttrykke fluorescerende proteiner på mangfoldet av infeksjon (MOI) 5 som er beskrevet av Tiscornia et al. 12 og Inkuber på 37 ° C.
  9. Etter 24 timer, fjerne mediet fra de transduced cellene, legge til 5 mL av fersk medium og ruge for ekstra 48t på 37 ° C.
  10. Distansere infiserte celler i en enkeltcelle suspensjon som beskrevet i trinn 1.4-1.6. Nedspinning cellene på 200 x g i 5 min og resuspend i 500 µL av sortering løsning (fosfat-bufret saltvann (PBS) med 1% FBS).
  11. Pipetter celle suspensjon i FACS rør. Co flekken cellene med 1 µL/mL av 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) dihydrochloride utelate døde celler. Negative kontroller må definere flyt cytometer portene (ikke-transduced cellene og ikke-transduced / DAPI farget).
  12. Sortere fluorescerende-positive/DAPI-negative cellene på sortering løsning, som beskrevet av Basu et al. 13, og samle de sorterte cellene i et 15-mL konisk rør.
  13. Nedspinning sorterte cellene på 200 x g i 5 min, fjerne nedbryting og resuspend i 5 mL av kultur medium. Ætt sorterte cellene i en 10 cm rett av pipettering. Inkuber ved 37 ° C i minst 48-72 h.
  14. Utvid sorterte cellene ved dissociating cellene følgende 1.4-1.6 og plating i flere retter for i vivo eksperimenter.
    Merk: For mer informasjon om cellen sortering forberedelse og rensing, se Basu et al. 13

2. intrakranielt injeksjon av iRFP-merket glioblastom celler i Immunodeficient mus

Merk: Før du starter operasjonen, pass på at kirurgisk rommet og verktøy er ren for prosedyren. Bruk immunodeficient athymic naken (Foxn1nu) mann eller kvinne mus, mellom 4-5 uker gamle og 17-19 g for intrakranielt injeksjoner. Dyr bør være plassert i minst 3 dager etter ankomst og før operasjonen.

  1. Cellen forberedelse
    1. Høste og dissociate fluorescerende positive-glioma celler i en enkeltcelle suspensjon (trinn 1.4-1.6) og resuspend 0,5 eller 1.0 x 106 celler i 2-5 µL av PBS per injeksjon per dyr. Pipetter celle suspensjon i en 1.5-mL microcentrifuge og plasser på is.
  2. Anestesi tilberedning og administrasjon
    1. Forberede 200 µL av saltvann inneholder ketamin (100 mg/kg) og xylazine (10 mg/kg) per 20 gram musen kroppsvekt. Veie dyrene og beregne den passende dosen av anestesi.
    2. Gi en intraperitoneal injeksjon av anestesi og ophthalmica salve gjelder øynene for å hindre dehydrering. Mer informasjon om dette trinnet se Kathleen et al. 14 plass dyr på en forvarmes vann varmeplate på 37 ° C.
    3. Kontroller at dyrene er anesthetized ved å overvåke tå knipe svaret (pedal refleks), vanligvis innen 5-10 min.
  3. Intrakranielt injeksjon
    1. Laste inn en 5 µL Hamilton sprøyte (butt tupp p) med cellen suspensjon og montere i sonde holderen.
    2. Plasser musen i en liten dyr stereotactic ramme og fikse hodet øret barer og helikopteret kortet etter beskrives detaljene av Cetin et al. 15
    3. Desinfiser hodet med 70% etanol og betadine løsning. Kontroller at webområdet kirurgisk er komplett sterile. Utføre en midtre snitt med en liten skalpell og skille huden og bindevev.
    4. Plass Hamilton sprøyten bregma punktet ved hjelp av micromanipulator.
    5. Flytt sonde holderen 1.0 mm anteroposterior og 2.0 mm lateral fra bregma punkt. Merke denne posisjonen med en blyant.
    6. På dette stedet, nøye gjør et hull i skallen med en micromotor håndholdt drill ved å legge litt press nedover til blodårene blir synlig. Ikke avbryte den araknoide mater og hjernen parenchyma.
    7. Introdusere nålen i burr hullet og fremme 3.0 mm under pial overflaten.
    8. Sette opp volumet (2-5 µL) og strømningshastighet (1 µL/min) på injeksjon bruker et motorisert stereotaxic injektor eller manuelt utføre injeksjon.
    9. Etter injeksjon, Fjern nålen gradvis av stigende 1.0 mm hver 1 min og rengjør injeksjonsstedet med 70% etanol.
    10. Nær huden sår med kirurgisk kramper eller ved å gjøre kirurgisk suturer (ofte referert til som masker) og se Kathleen et al. 14 for mer informasjon.
  4. Dyr utvinning
    1. Overføre dyret til et vann varmeplate (37 ° C) og overvåke kroppstemperatur, pustefrekvens, og hjertefrekvens, til full gjenoppretting. Administrere analgesi per standardprotokoller.
      Merk: For mer informasjon om stereotactic prosedyren, kirurgi og koordinater, se andre rapporter5,14,15.

3. FMT Imaging

Merk: Ifølge eksperimentelle målet, iRFP-merket glioblastom celler kan overvåkes i vivo før, under eller etter behandling. Imaging formål, bedøve dyr med en isoflurane induksjon kammer, opprettholde i en tenkelig kassett under skanning, og bildet i forankringsstasjonen av FMT imager.

  1. Fjern dyret fra buret og sted i isoflurane induksjon kammeret. Lukk kammeret og slå på oksygen og fordamper til 3-5%.
  2. Overvåke dyret før det er helt anesthetized, vanligvis innen 1-2 min. bevisstløs dyr skal ikke svare på eksterne stimuli.
  3. Fjern bedøvet dyret fra kammeret og sette dyret i tenkelig kassetten ved å plassere hodet adapteren først, etterfulgt av å plassere dyret vender ned. Kontroller at hodet er plassert i midten av kassetten.
  4. Plasser topplaten av kassetten på og stram justering knotter før 17 mm.
  5. En gang det dyret er sikker i tenkelig kassetten, Fortsett til bildebehandling ved å sette kassetten på interne docking Station av FMT imager, hvor isoflurane pumpes for å holde dyr anesthetized.
  6. Kjøre imager og analyserer programvaren ved å dobbeltklikke ikonet programvare.
  7. I vinduet "Eksperimentelle tab" Velg "Database" og "Study group".
  8. Gå til vinduet "Kategorien Skann" og velg gjenstand for bildet ved å klikke "Velg emnet". Også velge laser kanalen i "Laser kanal"-panelet. For FP635-merket cellene, velger du "laser kanal 635 nm" og FP720-merket celler, velg "laser kanal 680 nm".
  9. Hent et bilde ved å klikke alternativet "Fange" i vinduet "Kategorien Skann". Deretter justere feltet søk ved å klikke og dra feltet Søk i bildet til et bestemt antall kildeplasseringer, vanligvis innen 20-25 kilder for ipsilateral side.
  10. Alternativet "Legg til gjenoppbygging kø" og trykk "Scan" i vinduet "Kategorien Skann".
  11. Vent til skanningen er fullført, og deretter fjerne tenkelig kassetten fra dokkingstasjonen.
  12. Fjerne topplaten av kassetten og plasser dyr baksiden i buret.
  13. Gjenta trinnene 3.1-3.12 for resten av dyrene.

4. bildeanalyser

  1. Imager og analyserer programvaren, velg "Analyse tab" vinduet.
  2. Last datasettet og analysere ved å klikke på "+" i "Datasett valg"-panelet i vinduet "Analyse tab".
  3. Når bildet er lastet i vinduet "Analyse tab", utføre regionen av interesse (ROI) analyse ved å velge ikonet ellipsoid, i øvre venstre hjørne av vinduet "Analyse tab".
  4. Justere terskelen til null i "flygninger data"-panelet ved å høyreklikke kolonnen "terskelen" i vinduet "Analyse tab".
  5. Den totale verdien i "Flygninger data" panelet representerer signalet fra fluorescerende-merket glioblastom cellene implantert i hjernen musen.
  6. Gjenta 4.2-4,4 for resten av dyrene. Laste inn eller fjerne en melding ved å klikke på "+" eller "−" knappen, henholdsvis i "Datasett valg"-panelet i vinduet "Analyse tab".
    Merk: Hvis du vil ha mer informasjon om FMT bildebehandling og programvarefunksjoner, se20.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Glioblastom celler U87EGFRvIII (U87 celler over uttrykke EGF reseptor varianten III) ble kultivert ifølge trinn 1.2. Lentivirus ble produsert og renset etter trinn 1.1. Viral konsentrasjonen ble bestemt av p24 ELISA analyse. Cellene ble transduced med lentivirus med infrarød fluorescerende proteiner etter trinn 1.8. Plasmider koding FP72010,11 ble vennlig levert av Dr. V.V. Verkhusha og FP635 vektoren ble kjøpt fra en kommersiell leverandør. Målcellene var FACS sortert for å berike for topp 10% mest fluorescerende celle befolkningen (figur 1A). Økende fluorescerende signalet forbedrer sensitiviteten av fluorescens tomografi systemet. For å validere intensiteten av signaler om fluorescently-merket cellene før orthotopic implantasjon, brukte vi den phantom kassetten med FMT imager. Spesielt U87EGFRvIII-TurboFP635 og U87EGFRvIII-iRFP720 celler var atskilt med trypsin og 1 x 105, 1 x 106, og 1 x 107 celler ble resuspended i 100 µL av is kaldt PBS, henholdsvis og analysert. FMT imager gir gjenkjenning i 4 kanaler: 635 nm, 680 nm, 750 nm og 780 nm. Langt infrarøde kanaler 750 nm og 780 nm er ikke egnet for denne analysen fordi det er ingen utslipp på slike bølgelengder fra nær-infrarøde fluorescerende proteiner brukes (data ikke vist). Derfor vi analyserte utslipp signaler på 635 nm og 680 nm. Rapportert i figur 1, den selvlysende fargen signal bilde og intensitet kvantifisering for både FP635 (figur 1B, C) og FP720 (figur 1 d, E), noe som øker proporsjonalt som celle nummer øker. Av notatet, utslipp for FP635 vises i 635 nm kanalen, men ikke i 680 nm kanalen. Derimot utslipp for FP720 vises i 680 nm kanalen, men ikke i 635 nm kanalen. Dette gjør disse to kandidat fluorescerende proteiner egnet for studier der to bestander av celler kan merkes og overvåket samtidig bruker to nær infrarød fluorescerende etiketter.

U87EGFRvIII celler merket med nær infrarød fluorescerende proteiner ble da brukt for orthotopic injeksjon og i vivo tumor vekst overvåking, som beskrevet i trinn 2.1-2,4. Vi brukte den samme celle linjen, i.e.U87EGFRvIII, merket med ulike fluorescerende koder, utelate tumor vekst forskjellen mellom forskjellige kreft celletyper. Musene ble injisert med U87EGFRvIII-TurboFP635 celler, U87EGFRvIII-iRFP720 celler eller en tilsvarende kombinasjon (1:1) av de to linjene. Totalt 5 x 105 celler i et 5 µL volum på PBS ble injisert intracranially i 4-5 uker gamle immunsupprimerte athymic naken mus ved hjelp av en stereotactic og en Hamilton sprøyte, følgende trinn 2.3-2,4. Anestesi ble oppnådd ved intraperitoneal injeksjon av ketamin/xylazine. Dyrene var holdt varmt hele injeksjon bruker en vann varmeplate og kontrollert for tegn på nød. Svulst engraftment og vekst ble deretter kontrollert av FMT tenkelig system. Under skanning økter, ble musene midlertidig anesthetized bruker en 3% isoflurane kammer (trinn 3.1-3.12). Mus ble så plassert i en tenkelig kassett og fotografert i laserskanning kameraet. Hver musen ble skannet med 635 nm og 680 nm kanaler. Signalet kvantifiseringen ble spilt inn over tid og mus var euthanized på utbruddet av nevrologiske symptomer, i henhold til institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) retningslinjer. Som vist i figur 2A, U87EGFRvIII-TurboFP635 utslipp signalet var tydelig i 635 nm kanalen og minimal bakgrunn signal ble innspilt i 680 nm kanalen (tall 2B, C). I kontrast, U87EGFRvIII-iRFP720 celler slippes ut i 680 nm kanalen viser lite bakgrunnsinformasjon i 635 nm kanalen (tall 2D-F). Til slutt, mus injisert med en 1:1 blanding av U87EGFRvIII-TurboFP635 cellene og U87EGFRvIII-iRFP720 viste økt signal i begge kanaler for varigheten av forsøket (tall 2 g-jeg). Disse dataene viser at det er mulig å bruke infrarød fluorescerende proteiner ved dobbelt i vivo avbildning av kreft celle populasjoner. Data tyder også på at ulike fluorescerende proteiner har en forskjellig intensitet i signal utslipp. Her var FP720 signal intensitet overlegen FP635, med økt følsomhet i å oppdage mindre bestander av kreftceller i en ikke-invasiv overvåking.

Effekten av genet silencing av kreft relatert gener på tumorigenicity i preklinisk modeller kan også være studie med denne protokollen. For dette målet, GBM-kuler (GSC23 og GSC11) ble kultivert (trinn 1.2) og transduced med FP720-lentivirus (trinn 1.8). Celler som uttrykker FP720 var FACS sortert som beskrevet tidligere i trinn 1,11-1.13. FP720-merket cellene var co transduced med lentivirus-koding shRNA målretting DAXX (shDaxx) eller shRNA kontroll (shLuc) på MOI 516. Cellene ble kultivert for 5 dager, avstand til en enkeltcelle suspensjon og 1 x 106 celler ble resuspended i 3 µL av PBS for intrakranielt injeksjon. Effekten av shRNA målretting DAXX ble bekreftet av omvendt transkripsjon kvantitative polymerasekjedereaksjons (RT-qPCR) i GSC23 (figur 3A) og GSC11 (Figur 3 c). GBM-iRFP720/shRNA celler ble stereotactically injisert i striatum immunodeficient mus, ifølge trinn 2.3-2,4. Dyrene ble observert etter nevrologiske tegn og relativ fluorescens signalet fra xenografts ble analysert av FMT tenkelig system, kvantifisert bruker analyseprogramvare, ifølge trinn 3.1-4.6. Representant bilder av FMT viser en nedgang fluorescens signal i mus engrafted med shDAXX/GBM-kuler med dyr implantert med shControl (figur 3B og figur 2D) for begge GBM-kuler modeller, bekrefter vår tidligere finne16 at DAXX hemming represses tumor vekst i preklinisk glioblastom modeller.

Figure 1
Figur 1: Standard kurver ved hjelp av celler for phantom og FACS analyse. (A) representant FACS histogrammer av FP720 - og FP635-U87EGFRvIII uttrykke celler (venstre og høyre panel, henholdsvis). Glioma celler var infisert med lentivirus koding infrarød fluorescerende proteiner og FASC sortert for å berike for det høyeste uttrykket for FP720 eller FP635 proteiner. Representant bilder Hentet fra imager og analyserer programvaren til U87EGFRvIII-TurboFP635 (B) og U87EGFRvIII-iRFP720 (D) cellen suspensjoner bruker phantom kassetten. Øvre panelene representerer signalet i de 635 nm kanal og bunnen panelene i 680 nm kanalen. Økning i cellen nummer tilsvarte en økning i signal visualisering. Signalet kvantifisering av U87EGFRvIII-TurboFP635 (C) og U87EGFRvIII-iRFP720 (E) celler i 635 nm og 680 nm kanaler. Relativ fluorescens enheter vises i fargesøylen. Feilfelt representerer S.E.M. fra 3 forskjellige skanninger per celle suspensjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: hjerne svulst xenograft modellen ved hjelp av U87EGFRvIII celler skannet i ulike kanaler. Representant bilder av fluorescerende signal i 635 nm og 680 nm kanaler fra dyr intracranially implantert med U87EGFRvIII-turboFP635 (A), U87EGFRvIII-iRFP720 (D) og en mix kombinasjon (1:1) av U87EGFRvIII-iRFP720: U87EGFRvIII-turboFP635 celler (G). Bildene ble anskaffet på dag 5 etter første skanning. (B, E, H) Signalet intensitet overvåking for hver musen over en periode på 5 dager. Hver musen ble skannet 635 nm kanalen (blå barer) og 635 nm kanalen (røde stolper). Letteste skyggen av baren farge representerer dag 1 av skanning og den mørkeste skyggen representerer dag 5. (C, F, jeg) Relativ fluorescens kvantifisering viser en direkte sammenligning av signalet fra 635 nm kanal (blå) og 680 nm-kanal (rød) i hele kohort av mus. Relativ fluorescens enheter vises i fargesøylen. Dataene viser mener verdiene med standardavvik fra 3 forskjellige dyr. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Gene stanse i preklinisk glioblastom modeller bruker FMT. Gene expression analyse av DAXX av RT-qPCR i GSC23 (A) og GSC11 (C) glioma pasient-avledet celler transduced med lentivirus-kodede shRNAs målretting DAXX (shDaxx) eller shRNA kontroll (shLuc) og FP720. Representant bilder av fluorescerende signalet fra 680 nm kanalen i orthotopically engrafted mus implantert med GSC23-iRFP720 (B) og GSC11-iRFP720 (D) pasient-avledet celler. Sterk fluorescens signalet er observert i dyr implantert med shRNA Control (shLuc) (øverste delen av panelet) med mus implantert med shRNA-DAXX (shDaxx) (nederst i panelet), som angir at DAXX hemming undertrykker svulst veksten i preklinisk glioma modeller bestemmes av fluorescens molekylær tomografi. Relativ fluorescens enheter vises i fargesøylen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Svulst xenografts har vært mye brukt i forskning og en rekke veletablerte imaging teknikker er utviklet: BLI; magnetisk resonans imaging (MRI); fantes et positron utslipp tomografi (PET), beregnet tomografi (CT); FMT. Hver av disse metodene har fordeler og ulemper, men til slutt utfyller hverandre med typen informasjonen. En av de mest brukte i vivo imaging teknologi er BLI5,6,7,8. BLI og FMT krever begge celle engineering (med luciferase enzymer eller infrarød fluorescerende proteiner) som kan påvirke genuttrykk. BLI er mer følsomme for små svulst massene men krever intraperitoneal injeksjon av et substrat (luciferin), som når maksimal distribusjon i kroppen i 10-12 minutter; men lett slukke og spredning under imaging oppkjøp, og underlaget klaring oppstå ofte9. FMT, i stedet krever ikke noen ekstra substrat administrasjonen å dyrene og dekningen er stabil og uavhengig av tid eller enzym stabilitet. I tillegg tilbyr FMT, i samme eksperimentelle forhold, reproduserbare semi kvantitative data. BLI og FMT begge tilbyr ikke romlig oppløsning. imidlertid kopling metodene med CT scan adresser problemet.

En CT måler demping av fotoner når dekningen krysser kroppen av et dyr og er det ideelle identifisere strukturene kroppen. Bløtvev kontrast, som kan forstyrre deteksjon av en liten intrakranielt svulst, er imidlertid en begrensning for denne tilnærmingen17,18. En ytterligere ulempe av CT er bruk av stråling og kontrast media, som kan skape molekylær målcellene. En CT kan kombineres med PET som bruker radiolabeled tracers som glukose analog, fluorodeoxyglucose 18F-FDG; men dette kan også påvirke noen fysiologiske prosesser i liten dyrene. Derimot FMT trenger ikke injisert substrat måle svulsten masse og det er mulig å måle svulst metabolismen, betennelse, angiogenese, apoptose og andre markører bruker fluorescently merket biomarkers19.

Total er en av de mest nyttige og allsidig teknikker for i vivo imaging Mr. Mindre begrensninger av Mr kan bli funnet i lave anskaffelses-tiden, lavere følsomhet enn PET og noen instrument-relaterte variasjoner18,20.

Her rapporterer vi metoden FMT som en alternativ metode for prekliniske glioblastom modeller. Pre merking av målcellene med infrarød fluorescerende proteiner (figur 1A-E) og skanning etter implantasjon i immunsupprimerte dyr kan oppnås med en fluorescens tomografi tenkelig system. Vi rapporterte metoden FMT som en alternativ for prekliniske glioblastom modeller. Med denne metoden imaging brukes på en substrat-fri og ikke-invasiv måte dyr holdes i et lavt stress miljøet og dype vev kvantifisering kan være utført (figur 2A-jeg, figur 3A, B). Denne protokollen kan brukes for å studere effekten av kombinasjon behandlinger i preklinisk glioma modeller21, identifisere nye terapeutiske mål for hjernen svulster16, og undersøke nye druggable metabolske molekyler22, epigenetic veier23eller nye chemotherapeutic agenter i kombinasjon med strålebehandling (upubliserte data), og brukes på andre prekliniske studier. Vi foreslår her bruk av FMT som en dobbel i vivo imaging tilnærming, når to co-eksisterende, men forskjellig, svulst celle populasjoner er ment å bli analysert.

Noen begrensninger med FMT må tas i betraktning, som auto-fluorescens generert fra noen organer som kan forstyrre signalet. For eksempel murine milten og leveren avgir auto-fluorescens i 680 nm kanalen men ikke 635 nm. Derfor må FMT-relaterte eksperimentelle prosedyrer som involverer disse organene utføres med andre infrarød fluorescerende proteiner, som FP635. Vi brukte naken foxn1-mutert naken mus å unngå forstyrrelser i fluorescens signal opptaket; Hvis du må bruke en annen musemodell, anbefales det å barbere området av interesse av dyrene. I tillegg er denne tilnærmingen også begrenset i å oppdage svært liten svulst massene. I vår erfaring, signal-til-støy forholdet forbedrer som svulsten masse blir større, men før utbruddet av eventuelle nevrologiske symptom i mus. Faktisk i forrige eksperimenter utført på orthotopically injisert PDXs, var vi kjøpedyktig merker svulster under et medikament diett i minst 2 uker i mus uten alle kvittere av smerte på grunn av svulst byrde eller narkotika administrasjon21. Til slutt, aggressivitet av hver celle linje og antall injisert celler bestemmer lengden på hvert eksperiment. Dataene viser en lineær proporsjonale forholdet mellom celler og signal (figur 1B-E), og svulst masse og signal (figur 2); men en generell signal sammenheng mellom tumor masse og antall celler kan ikke brukes i ulike linjer og infrarød proteiner. Signalet for hver celle linje/infrarød fluorescerende protein kombinasjon må bestemmes empirisk. Videre tilsvarer signalet fra analysen av celler ved hjelp av phantom (figur 1B, D) ikke signalet fra intrakranielt xenografts som en demping i signal skyldes hodeskallen av musen.

Imager og analyserer programvaren tillater terskelverdi. Selv om vi ikke brukte noen terskel her, gir skanning dyr uten implantert celler bakgrunnsstøy som gjerne elimineres ved gjenoppbygging i nærvær av et ekte signal. Noen faktorer påvirker signal intensiteten av xenograft og må holdes i betraktning: hver infrarød fluorescerende protein har forskjellige utslipp spektrum og intensitet, med FP720 være en av de mest fluorescerende proteinene brukt eksperimentelt10 ,11; hver celle linje gir en rikelig, men begrenset mengde protein produksjon, dermed påvirke den maksimale fluorescensen oppnåelig. Til slutt FMT imager er oppsett med interne standard kurver for bestemte forbindelser, derfor er det viktig å vurdere hvilke sammensatte har det nærmeste utslipp spektret til infrarød fluorescerende protein som merket cellene. Selv om godt tolerert, anbefales det å finne potensielle cytotoksiske effekter formidlet av overuttrykte av infrarød proteiner8,9. Videre anbefaler vi bruke kohorter mus minst 8 per forsøksgruppen, som tap av data og mus, på grunn av kirurgisk prosedyre eller variasjon i kreft celle engraftment, kan oppstå; Likevel, dette legger statistisk signifikans studien. Vi anbefaler også serielt skanne dyr kohort for mer enn en dag og analysere signal utslipp på samme tid, siden variasjoner i tenkelig kassett dybden og fluorescerende signal rekonstruksjon kan påvirke den endelige signal kvantifiseringen. For å løse dette problemet, gir analyserer programvaren mindre endringer i laser intensitet (fra normal til høy og høy), selv om vår erfaring det endelige utfallet ikke er forskjellig. Ettall final note om kostnadseffektivitet er at FMT tenkelig system lett kan deles som en kjerne instrument blant annet laboratorier, som hjelper dekke kostnadene vedlikeholdskostnader. Som konklusjon, er FMT en verdifull ressurs som gjør eksperimentelle og prekliniske evaluering av i vivo tumorveksten enkel og pålitelig.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ikke interessekonflikter.

Acknowledgments

Vi takker Dr. Frederick Lang, MD Anderson Cancer Center for GBM-PDX neurospheres. Dette arbeidet ble støttet av tap GBM forskning samarbeid, et datterselskap av National hjerne svulst Society (Frank Furnari), R01-NS080939 (Frank Furnari), James S. McDonnell Foundation (Frank Furnari); Jorge Benitez ble støttet av en pris fra amerikanske hjerne svulst Association (ABTA); Ciro Zanca ble delvis støttet av en amerikansk-italiensk Cancer Foundation postdoktor fellesskap. Frank Furnari mottar lønn og ytterligere støtte fra Ludwig Institute for Cancer Research.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM/High Glucose  HyClone/GE SH30022.1
DMEM/F12 1:1  Gibco 11320-082
FBS HyClone/GE SH30071.03
Accutase Innovative cell technologies AT-104
Trypsin HyClone/GE SH30236.01
B27 supplement Gibco 17504044
human recombinant EGF  Stemcell Technologies 2633
human recombinant FGF Stemcell Technologies 2634
DPBS Corning 21-031-00
FACS tubes Falcon 352235
DAPI ThermoFisher Scientific 62248
Blasticidin ThermoFisher Scientific A1113903
p24 ELISA  Clontech 632200
Xylazine Akorn NDC 59399-110-20
Ketamine Zoetis NADA 043-403 Controlled substance
Ointment Dechron NDC 17033-211-38
Absorbable suture CpMedical VQ392
5 ul syringe Hamilton 26200-U Catalog number as sold by Sigma-Aldrich
Cell Sorter Sony SH8007
Mouse stereotaxic frame  Stoelting 51730
Motorized stereotaxic injector Stoelting 53311
Micromotor hand-held drill Foredom K1070
Mouse warming pad  Ken Scientific Corporation TP-22G
Fluorescence Tomography System  PerkinElmer FMT 2500 XL
TrueQuant Imaging Software  Perkin Elmer  7005319
Ultra-centrifuge Optima L-80 XP Beckman Coulter 392049
Tissue Culture 100mm Dishes Olympus Plastics 25-202
Tissue Culture 150mm Dishes Olympus Plastics 25-203
Tissue Culture Flasks T75 Corning 430720U
50 mL conical tubes Corning 430290
15 mL conical tubes Olympus Plastics 28-101
Centrifuge Avanti J-20 Beckman Coulter J320XP-IM-5
Tube, Polypropylene, Thinwall, 5.0 mL Beckman Coulter 326819
Tube, Thinwall, Polypropylene, 38.5 mL, 25 x 89 mm Beckman Coulter 326823
Athymic nude mice Charles River Laboratories Strain Code  490 (Homozygous) Prior approval by the Institutional Animal Care Program and by the Institutional Biosafety Committee required.   

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ostrom, Q. T., et al. CBTRUS Statistical Report: Primary Brain and Other Central Nervous System Tumors Diagnosed in the United States in 2009-2013. Neuro-Oncology. 18, (suppl_5), v1-v75 (2016).
  2. Pauli, C., et al. Personalized In Vitro and In Vivo Cancer Models to Guide Precision Medicine. Cancer Discovery. 7, (5), 462-477 (2017).
  3. Stewart, E. L., et al. Clinical Utility of Patient-Derived Xenografts to Determine Biomarkers of Prognosis and Map Resistance Pathways in EGFR-Mutant Lung Adenocarcinoma. Journal of Clinical Oncology. 33, (22), 2472-2480 (2015).
  4. Gao, H., et al. High-throughput screening using patient-derived tumor xenografts to predict clinical trial drug response. Nat Med. 21, (11), 1318-1325 (2015).
  5. Ozawa, T., James, C. D. Establishing Intracranial Brain Tumor Xenografts With Subsequent Analysis of Tumor Growth and Response to Therapy using Bioluminescence Imaging. J. Vis. Exp. (41), e1986 (2010).
  6. Kondo, A., et al. An experimental brainstem tumor model using in vivo bioluminescence imaging in rat. Child's Nervous System. 25, (5), 527-533 (2009).
  7. Nyati, S., Young, G., Ross, B. D., Rehemtulla, A. ATM Kinase: Methods and Protocols. Kozlov, S. V. Springer. New York. 97-111 (2017).
  8. Kondo, A., et al. Longitudinal assessment of regional directed delivery in a rodent malignant glioma model. J Neurosurg Pediatr. 4, (6), 592-598 (2009).
  9. Badr, C. E. Bioluminescent Imaging: Methods and Protocols. Badr, C. E. Humana Press. 1-18 (2014).
  10. Shcherbakova, D. M., Verkhusha, V. V. Near-infrared fluorescent proteins for multicolor in vivo imaging. Nat Meth. 10, (8), 751-754 (2013).
  11. Filonov, G. S., et al. Bright and stable near-infrared fluorescent protein for in vivo imaging. Nat Biotech. 29, (8), 757-761 (2011).
  12. Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. Production and purification of lentiviral vectors. Nat. Protocols. 1, (1), 241-245 (2006).
  13. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). J. Vis. Exp. (41), e1546 (2010).
  14. Pritchett-Corning, K. R., Luo, Y., Mulder, G. B., White, W. J. Principles of rodent surgery for the new surgeon. J Vis Exp. (47), (2011).
  15. Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nat. Protocols. 1, (6), 3166-3173 (2007).
  16. Benitez, J. A., et al. PTEN regulates glioblastoma oncogenesis through chromatin-associated complexes of DAXX and histone H3.3. Nature Communications. 8, 15223 (2017).
  17. Kirschner, S., et al. Imaging of Orthotopic Glioblastoma Xenografts in Mice Using a Clinical CT Scanner: Comparison with Micro-CT and Histology. PLOS ONE. 11, (11), e0165994 (2016).
  18. Mannheim, J. G., et al. Standardization of Small Animal Imaging-Current Status and Future Prospects. Molecular Imaging and Biology. (2017).
  19. Engblom, C., et al. Osteoblasts remotely supply lung tumors with cancer-promoting SiglecFhigh neutrophils. Science. 358, (6367), (2017).
  20. Lauber, D. T., et al. State of the art in vivo imaging techniques for laboratory animals. Laboratory Animals. 51, (5), 465-478 (2017).
  21. Zanca, C., et al. Glioblastoma cellular cross-talk converges on NF-κB to attenuate EGFR inhibitor sensitivity. Genes & Development. 31, (12), 1212-1227 (2017).
  22. Villa, G. R., et al. An LXR-Cholesterol Axis Creates a Metabolic Co-Dependency for Brain Cancers. Cancer Cell. 30, (5), 683-693 (2016).
  23. Liu, F., et al. EGFR Mutation Promotes Glioblastoma through Epigenome and Transcription Factor Network Remodeling. Molecular Cell. 60, (2), 307-318 (2015).
Fluorescens molekylær tomografi ved <em>i Vivo</em> avbildning av glioblastom Xenografts
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Benitez, J. A., Zanca, C., Ma, J., Cavenee, W. K., Furnari, F. B. Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts. J. Vis. Exp. (134), e57448, doi:10.3791/57448 (2018).More

Benitez, J. A., Zanca, C., Ma, J., Cavenee, W. K., Furnari, F. B. Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts. J. Vis. Exp. (134), e57448, doi:10.3791/57448 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter