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Cancer Research

Fluorescência Molecular Tomography para a imagem latente na Vivo de Glioblastoma Xenografts

doi: 10.3791/57448 Published: April 26, 2018
* These authors contributed equally

Summary

Ortotópico intracraniana injeção de células de tumor tem sido usada na pesquisa do câncer para estudar a biologia do tumor de cérebro, progressão, evolução e resposta terapêutica. Aqui nós apresentamos fluorescência molecular tomografia computadorizada de xenografts tumor, que fornece em tempo real imagens intravital e quantificação de um tumor massa em modelos pré-clínicos glioblastoma.

Abstract

Tumorigenicidade é a capacidade das células cancerosas para formar um tumor massa. É uma abordagem amplamente utilizada para determinar se as células forem oncogenicidade camundongos imunodeficientes a injectar por via subcutânea com células cancerosas e medindo a massa tumoral, depois torna-se visível e palpável. Ortotópico injeções de células de câncer visam introduzir o enxerto heterólogo no microambiente que mais se assemelha ao tecido de origem do tumor a ser estudada. Pesquisa de cancer do cérebro requer intracraniana injeção de células cancerosas para permitir a formação de tumor e análise no microambiente exclusivo do cérebro. A imagem na vivo de xenografts intracranianas monitora instantaneamente a massa tumoral de ratos orthotopically incorporada. Aqui nós relatamos o uso da fluorescência molecular tomografia computadorizada (FMT) de xenografts do tumor de cérebro. As células cancerosas são primeiro transfectadas com perto de infravermelhas proteínas fluorescentes e então injetadas no cérebro de ratos imunodeprimidos. Os animais são então digitalizados para obter informações quantitativas sobre a massa tumoral durante um período prolongado de tempo. Célula pré-rotulagem permite custo efetiva, reprodutível e confiável quantificação dos encargos tumor dentro de cada rato. Nós eliminou a necessidade de injeção de substratos de imagem e assim reduzir o stress dos animais. Uma limitação dessa abordagem é representada pela incapacidade de detectar massas muito pequenas; Entretanto, tem a melhor resolução para massas maiores do que outras técnicas. Pode ser aplicado para avaliar a eficácia de um tratamento medicamentoso ou alterações genéticas de linhas de células de glioma e amostras de paciente-derivado.

Introduction

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Câncer é uma das principais causas de mortes relacionadas com a doença em seres humanos no mundo industrializado. Com um extremamente elevado número de mortes, novos tratamentos são urgentemente necessários. Glioblastoma multiforme (GBM) é um tipo extremamente letal de câncer no cérebro, composto de populações heterogêneas de células cerebrais tumor estromal e imune. De acordo com o registro de tumor cerebral Central dos EUA, a incidência de tumores cerebrais primários não-malignas e malignas é aproximadamente 22 casos por 100.000. Aproximadamente 11.000 novos casos são esperados para serem diagnosticados nos EUA em 20171.

Estudos pré-clínicos investigam a probabilidade de um medicamento, procedimento ou tratamento eficaz antes de serem testadas em seres humanos. Um dos primeiros passos laboratoriais em estudos pré-clínicos é identificar potenciais alvos moleculares para tratamento medicamentoso usando células cancerosas implantadas no organismo hospedeiro, definido como modelos de xenoenxertos humana. Dentro deste contexto, os modelos de enxerto de tumor cerebral intracraniana usando xenografts paciente-derivado (PDXs) têm sido amplamente utilizados para estudar a biologia do tumor de cérebro, progressão, evolução e resposta terapêutica e mais recentemente para o desenvolvimento de biomarcadores, drogas triagem e personalizada medicina2,3,4.

Um dos mais acessíveis e não-invasivo na vivo por imagens métodos para monitorar xenografts intracranianas é bioluminescência de imagem (BLI)5,6,7,8. No entanto, algumas limitações BLI incluem administração de substrato e disponibilidade, estabilidade da enzima e luz têmpera e Dispersando durante aquisição9de imagem. Aqui nós relatamos o FMT infravermelho como uma alternativa de imagem método para monitorar modelos pré-clínicos glioblastoma. Neste método, a aquisição do sinal e quantificação de PDXs intracraniano implantados, expressando uma proteína fluorescente de infravermelho próximo iRFP72010,11 (doravante denominado como FP720) ou turboFP635 (doravante denominado como FP635), é executada com um sistema de imagem de FMT. Usando a tecnologia FMT, o ortotópico tumores podem ser monitorado na vivo antes, durante ou após o tratamento, de forma não-invasiva, livre de substrato e quantitativa para observações pré-clínicas.

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Protocol

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O uso de animais de pesquisa experimental e agentes infecciosos, tais como lentivirus para transduce as células cancerosas, exigem aprovação prévia pelo programa institucional cuidados com animais e pelo Comitê institucional de biossegurança. Este protocolo segue as diretrizes de cuidado animal da Universidade da Califórnia em San Diego (UCSD).

1. rotulagem de células de Glioblastoma com FP635 ou FP720 construção

  1. Produzir e purificar lentivirus de acordo com o protocolo descrito por Tiscornia et al 12
  2. Células de cultura de aproximadamente 2,0 x 106 de uma linhagem de células de glioma humano com DMEM mais 10% soro bovino fetal (FBS) em um prato de 15 cm; ou cultura 2.0 x 106 glioblastoma humano paciente-derivado (GBM-PDX) esferas com DMEM/F12 médio de 1:1 com B27 suplemento mais humano recombinante fator de crescimento epidérmico (EGF; 20 ng/mL) e FGF (10 ng/mL) num balão T75.
  3. Manter todas as células em 37 ° C, umidade relativa de 100% e 5% de CO2.
  4. Dissocia as células.
    1. Para as células de glioma: Retire o sobrenadante as chapas e adicionando 3-5 mL de tripsina 1 X para as células de glioma.
    2. Para o GBM esferas: coletar as células pipetando as células para um tubo de 15 mL.
      1. Gire para baixo as esferas GBM a 200 x g por 5 min utilizando uma centrífuga de mesa à temperatura ambiente.
      2. Remover o sobrenadante e adicionar 3 a 5 mL de solução de desprendimento de células.
    3. Incube a todas as células a 37 ° C por 10-15 min.
  5. Cuidadosamente, dissociar as células pipetando subindo e descendo várias vezes (certifique-se de que as esferas e células de glioma são concluídas dissociada) e spin-down a 200 x g por 5 min.
  6. Remover o sobrenadante e ressuspender as células com 5 mL de meio pipetando subindo e descendo várias vezes. Determine a viabilidade celular por exclusão trypan azul.
  7. Placa de 1,0 x 106 das células-alvo em um prato de 10 cm com 5 mL de meio, de pipetagem.
  8. Transduce células com lentivirus expressando proteínas fluorescentes na multiplicidade de infecção (MOI) 5 como é descrito por Tiscornia et al 12 e incubar a 37 ° C.
  9. Após 24h, remover o meio das células transduzidas, adicionar 5 mL de meio fresco e incube por 48h adicional a 37 ° C.
  10. Dissocia as células infectadas em uma suspensão de célula única, conforme descrito nas etapas 1.4-1.6. Gire para baixo as células a 200 x g por 5 min e Resuspenda em 500 µ l de solução de classificação (tampão fosfato salino (PBS) com 1% FBS).
  11. Pipete a suspensão de eritrócitos para tubos de FACS. Co manche as células com 1 µ l/mL de 4', dicloridrato de 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) para excluir as células mortas. Controles negativos são necessárias para configurar as portas do citômetro de fluxo (não-transfectadas células e células não transfectadas / DAPI manchado).
  12. Classificar as células fluorescentes/DAPI-positivo-negativo em classificação de solução, conforme descrito por Brum et al . 13e coletar as células classificadas em um tubo cônico de 15 mL.
  13. Gire para baixo as células classificadas a 200 x g por 5 min, retire o sobrenadante e ressuspender em 5 mL de meio de cultura. As células classificadas em um prato de 10 cm por pipetagem de semente. Incube a 37 ° C, durante pelo menos 48-72 h.
  14. Expandir as células classificadas por dissociando as células seguintes etapas 1.4-1.6 e chapeamento em vários pratos para experiências na vivo .
    Nota: Para mais detalhes sobre a célula de triagem, preparação e purificação, consulte Brum et al . 13

2. intracraniana injeção de células de Glioblastoma iRFP-tag em camundongos imunodeficientes

Nota: Antes de iniciar a cirurgia certifique-se que a sala cirúrgica e ferramentas estejam limpas para o procedimento. Use o modelo imunodeficientes (Foxn1nu) masculinos ou femininos camundongos, entre 4-5 semanas de idade e 17-19 g para injeções intracranianas. Animais devem ser alojados pelo menos 3 dias após a chegada e antes da cirurgia.

  1. Preparação da pilha
    1. Colheita e dissociar fluorescentes positivo-glioma células em uma célula única suspensão (etapas 1.4-1.6) e ressuspender 0,5 ou 1,0 x 106 células em 2 a 5 µ l de PBS por injecção por animal. Pipete a suspensão de células para um tubo de 1,5 mL microcentrifuga e lugar no gelo.
  2. Administração e preparação de anestesia
    1. Prepare-se 200 µ l de solução salina contendo cetamina (100 mg/kg) e xilazina (10mg/kg) por 20 gramas de peso do corpo do mouse. Pesar os animais e calcular a dose adequada de anestesia.
    2. Fornecer uma injeção intraperitoneal de anestesia e aplique pomada oftálmica nos olhos para evitar a desidratação. Para mais detalhes sobre esta etapa ver Kathleen et al 14 Coloque o animal em uma almofada térmica de água previamente aquecida a 37 ° C.
    3. Verifica que os animais são anestesiados, monitorando a resposta de pitada de dedo do pé (pedal reflex), geralmente dentro de 5-10 min.
  3. Injeção intracraniana
    1. Carregar um 5 µ l seringa Hamilton (agulha de ponta romba) com suspensão de células e montar no porta-sonda.
    2. Coloque o mouse em uma armação estereotáxica animal pequena e consertar a cabeça usando as barras de orelha e o adaptador de incisivo seguindo os detalhes descritos por Carvalho et al . 15
    3. Desinfete com solução de 70% de etanol e betadine na cabeça. Certifique-se que o sítio cirúrgico está completo estéril. Executar uma média incisão com um bisturi pequeno e separar a pele e os tecidos conjuntivos.
    4. Coloque a seringa Hamilton sobre o ponto de bregma usando o micromanipulador.
    5. Mova a sonda titular ântero-posterior 1,0 mm e 2,0 mm lateral do ponto de bregma. Marque esta posição com um lápis.
    6. Neste local, cuidadosamente faça um buraco no crânio com uma broca Hand-Held do micromotor, aplicando leve pressão para baixo até que os vasos sanguíneos tornam-se visíveis. Não perturbem o parênquima aracnoide máter e o cérebro.
    7. Introduzir a agulha no orifício de trépano e avançar 3,0 mm abaixo da superfície pial.
    8. Configurar o volume (2-5 µ l) e a taxa de fluxo (1 µ l/min) de injeção usando um injector estereotáxica motorizado ou executar manualmente a injeção.
    9. Após a injeção, remova a agulha gradualmente por ascendente 1,0 mm cada 1 min e limpar o local da injeção com etanol a 70%.
    10. Perto da pele ferida com grampos cirúrgicos ou fazendo suturas cirúrgicas (muitas vezes referidas como pontos) e ver Kathleen et al 14 para mais detalhes.
  4. Recuperação de animais
    1. Transferir o animal para uma almofada térmica de água (37 ° C) e monitorar a temperatura corporal, taxa de respiração e batimentos cardíacos, até a recuperação completa. Administre analgesia por protocolos padrão.
      Nota: Para obter mais informações sobre o procedimento estereotáxica, cirurgia e coordenadas, consulte outros relatórios5,14,15.

3. FMT Imaging

Nota: De acordo com o objetivo experimental, o glioblastoma iRFP-tag células podem ser monitorado na vivo antes, durante ou após o tratamento. Para efeito de imagem, anestesiar animais utilizando uma câmara de indução de isoflurano, manter-se em uma gaveta de imagens durante a digitalização e imagem na estação de ancoragem do tonalizador a FMT.

  1. Retire o animal da gaiola e coloque na câmara de indução de isoflurano. Fechar a câmara e ligar o fluxo de oxigênio e vaporizador para 3-5%.
  2. Monitorar o animal até que ele é completamente anestesiado, geralmente dentro de 1-2 min inconsciente animais não devem responder a estímulos externos.
  3. Remover o animal anestesiado da câmara e colocar o animal na gaveta de imagem, colocando o adaptador cabeça primeiro, seguido por sujeitar o animal voltada para baixo. Certifique-se de que a cabeça está localizada no centro da fita.
  4. Coloque a placa superior da fita em cima e aperte os botões de ajuste até 17 mm.
  5. Uma vez que o animal está seguro na gaveta da imagem latente, proceder-se à imagem inserindo a gaveta interna docking station de Imageador a FMT, onde o isoflurano é bombeado para manter o animal anestesiado.
  6. Execute o software imager e analisador clicando duas vezes o ícone do software.
  7. Na janela "Guia Experimental", selecione o "Database" e "Grupo de estudo".
  8. Vá para a janela de "Guia de Scan" e selecione o assunto a imagem clicando em "selecionar o assunto". Também, selecione o canal do laser no painel "Canal de Laser". Para as células FP635-etiquetadas, selecione "laser canal 635 nm" e para as células FP720-etiquetadas, selecione "canal 680 nm a laser".
  9. Adquira uma imagem clicando na opção "Captura" na janela "Guia Scan". Em seguida, ajuste o campo de verificação clicando e arrastando o campo de verificação da imagem capturada para um determinado número de locais de origem, geralmente dentro de 20-25 fontes para o lado ipsilateral.
  10. Marque a opção "Adicionar a fila de reconstrução" e bateu o "Scan" na janela "Guia Scan".
  11. Esperar até que a varredura for concluída e em seguida, remova o cartucho da imagem latente da docking station.
  12. Remover a placa superior da fita e coloque a animal de volta para a jaula.
  13. Repita as etapas 3.1-3.12 para o resto dos animais.

4. análise de imagens

  1. O software analisador e gerador de imagens, selecione a janela "Guia de análise".
  2. Carrega o dataset e o assunto para analisar clicando no botão "+" no painel "Seleção do conjunto de dados" da janela "Guia de análise".
  3. Uma vez que a imagem tenha sido carregada na janela "Guia de análises", realizar a região de análise de interesse (ROI), selecionando o ícone elipsoide, localizado no canto superior esquerdo da janela do "Guia de análise".
  4. Ajuste o limite como zero no painel "dados estatísticos" pelo botão direito coluna "limite" na janela "Guia de análise".
  5. O valor total no painel "Dados estatísticos" representa o sinal das células fluorescentes-tag glioblastoma implantadas no cérebro do rato.
  6. Repita as etapas 4.2-4.4 para o resto dos animais. Carregar ou remover um assunto novo, clicando no "+" ou "−" botão, respectivamente, no painel "Seleção do conjunto de dados" da janela "Guia de análise".
    Nota: Para obter mais informações sobre a imagem de FMT e operação de software, consulte20.

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Representative Results

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U87EGFRvIII de células de glioblastoma (u-87 células expressando over a variante do receptor de EGF III) foram cultivadas de acordo com a etapa 1.2. Lentivirus foi produzido e purificado conforme item 1.1. A concentração viral foi determinada pelo p24 análise de ELISA. As células foram transfectadas com lentivirus carregando infravermelhas proteínas fluorescentes conforme item 1.8. O plasmídeo codificação FP72010,11 foi gentilmente cedido pelo Dr. V.V. Verkhusha e o vetor de FP635 foi adquirido de um fornecedor comercial. Nas células-alvo foram FACS classificados para enriquecer para a top 10% mais fluorescente população celular (figura 1A). Aumentar o sinal fluorescente melhora a sensibilidade do sistema de tomografia computadorizada de fluorescência. Para validar a intensidade dos sinais de células fluorescente-etiquetadas antes da implantação ortotópico, usamos a fita fantasma do tonalizador a FMT. Especificamente, U87EGFRvIII-TurboFP635 e U87EGFRvIII-iRFP720 células foram dissociadas com tripsina e 1 x 105, 1 x 106, e 1 x 107 células foram resuspended em 100 µ l de PBS frio gelo, respectivamente e analisadas. O tonalizador FMT permite detecção em 4 canais: 635 nm, 680 nm, 750 nm e 780 nm. Infravermelho distante canais 750 nm e 780 nm não são adequados para esta análise porque não há nenhuma emissão em tais comprimentos de onda desde os infravermelho próximo proteínas fluorescentes usados (dados não mostrados). Portanto, foram analisados os sinais de emissão em 635 nm e 680 nm. Relatado na Figura 1, o fluorescente quantificação imagem e intensidade para ambos os FP635 de sinal (figura 1B, C) e FP720 (Figura 1, E), que aumenta proporcionalmente como os aumentos do números de celular. Digno de nota, a emissão de FP635 é visível no canal de 635 nm, mas não no canal 680 nm. Em contraste, a emissão para FP720 é visível no canal de 680 nm, mas não no canal 635 nm. Isto faz estas duas proteínas fluorescentes candidato adequadas para estudos onde duas populações de células podem ser rotuladas e monitorados simultaneamente, usando dois perto infravermelhas etiquetas fluorescentes.

U87EGFRvIII células rotuladas com perto de infravermelhas proteínas fluorescentes foram então usados para injeção ortotópico e na vivo tumor crescimento monitoramento, conforme descrito em passos 2.1-2.4. Usamos a mesma linha celular, i.e., U87EGFRvIII, rotulada com diferentes etiquetas fluorescentes, para eliminar a diferença de crescimento de tumor entre tipos de células de câncer diferente. Os ratos foram injetados com células de U87EGFRvIII-TurboFP635, células de U87EGFRvIII-iRFP720 ou uma combinação igual (1:1) das linhas dois celulares. Um total de 5 x 105 células em um volume de 5 µ l de PBS foram injetadas intracraniano 4-5 semanas velho modelo imunocomprometidos camundongos usando um sistema estereotáxico e uma seringa Hamilton, seguir etapas 2.3-2.4. Anestesia foi realizada por injeção intraperitoneal de xilazina/cetamina. Os animais foram mantidos quentes em toda a injeção usando uma almofada térmica da água e marcados por sinais de aflição. Crescimento e enxertia de tumor então foi monitorada pelo sistema de imagem a FMT. Durante as sessões de digitalização, os ratos foram anestesiados temporariamente usando uma câmara 3% de isoflurano (passos 3.1-3.12). Os ratos foram então colocados em uma gaveta de imagem e fotografados dentro do câmara de exploração do laser. Cada rato foi digitalizado usando o 635 nm e 680 nm de canais. A quantificação do sinal foi gravada ao longo do tempo e os ratos foram sacrificados no início dos sintomas neurológicos, de acordo com as orientações institucionais Cuidado Animal e Comissão de utilização (IACUC). Como indicado na Figura 2A, U87EGFRvIII-TurboFP635 sinal de emissão era evidente no canal de 635 nm e sinal de fundo mínimo foi gravado no canal de 680 nm (figuras 2B, C). Em contraste, as células de U87EGFRvIII-iRFP720 emitidas no canal de 680 nm, mostrando pouco fundo no canal de 635 nm (figuras 2DF). Finalmente, ratos injetados com uma mistura 1:1 de células de U87EGFRvIII-TurboFP635 e U87EGFRvIII-iRFP720 células mostraram aumento de sinal em ambos os canais para a duração do experimento (figuras 2eu). Estes dados mostram que é possível utilizar infravermelhas proteínas fluorescentes para a imagem latente dupla na vivo de populações de células de câncer. Os dados também indicam que diferentes proteínas fluorescentes têm uma intensidade diferente em sua emissão do sinal. Aqui, intensidade de sinal FP720 era superior a FP635, com aumento da sensibilidade na detecção de pequenas populações de células cancerosas em uma configuração de monitoramento não-invasivo.

Os efeitos de silenciamento de genes relacionados ao câncer de tumorigenicidade em modelos pré-clínicos também podem ser o estudo com esse protocolo. Para este objectivo, o GBM-esferas (GSC23 e GSC11) foram cultivada (etapa 1.2) e transfectadas com FP720-lentivirus (passo 1.8). Células expressando FP720 foram FACS classificados conforme descrito anteriormente em etapas 1.11-1.13. Células FP720-etiquetadas foram co transduzidas com codificação de lentivirus shRNA alvo DAXX (shDaxx), ou controle de shRNA (shLuc) em MOI 516. As células foram cultivadas por 5 dias, dissociado em suspensão uma única célula, e 1 x 106 células foram resuspended em 3 µ l de PBS para injeção intracraniana. A eficácia do shRNA alvo DAXX foi confirmada pela transcrição reversa quantitativa cadeia da polimerase (RT-qPCR) em GSC23 (Figura 3A) e GSC11 (Figura 3). Células de GBM-iRFP720/shRNA Estereotaxia foram injetadas o corpo estriado de ratos imunodeficientes, de acordo com as etapas 2.3-2.4. Os animais foram observados por sinais neurológicos e o sinal de fluorescência relativo dos xenografts foram analisados pelo sistema da imagem latente FMT, quantificado usando software de análise, de acordo com passos 3.1-4.6. Imagens representativas de FMT mostram um sinal de fluorescência de diminuição em camundongos incorporados com shDAXX/GBM-esferas em comparação com animais implantados com shControl (Figura 3B e Figura 2D) para ambos os modelos de esferas-GBM, confirmando nossa anterior encontrar16 que inibição DAXX reprime o crescimento do tumor em modelos pré-clínicos glioblastoma.

Figure 1
Figura 1: curvas padrão usando células de fantasma e análise de FACS. (A) representante FACS histogramas de FP720 - e FP635-U87EGFRvIII expressando células (esquerda e direita do painel, respectivamente). Células de glioma foram infectadas com lentivirus codificação infravermelhas proteínas fluorescentes e FASC classificados para enriquecer-se para a mais alta expressão das proteínas FP720 ou FP635. Representante imagens obtidas a partir do software imager e analisador de U87EGFRvIII-TurboFP635 (B) e U87EGFRvIII-iRFP720 (D) suspensões celulares usando a fita de fantasma. Os painéis superiores representam o sinal em 635 nm canal e fundo painéis no canal de 680 nm. Aumentar na cela número correspondia a um aumento na visualização do sinal. Quantificação do sinal de U87EGFRvIII-TurboFP635 (C) e U87EGFRvIII-iRFP720 (E) células em 635 nm e 680 nm de canais. Unidades de fluorescência relativo são indicadas na barra de cor. Barras de erro representam no MEV mostrou de 3 diferentes exames por suspensão de células. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: modelo de transplante de tumor cerebral usando U87EGFRvIII células digitalizados em diferentes canais. Imagens representativas do sinal fluorescente em 635 nm e 680 nm canais, de animais intracraniano implantados com uma combinação de mistura (1:1) de U87EGFRvIII-iRFP720, U87EGFRvIII-iRFP720 (D) e U87EGFRvIII-turboFP635 (A): Células de U87EGFRvIII-turboFP635 (G). Imagens foram adquiridas no dia 5 após a primeira varredura. (B, E, H) Sinal de monitoramento de intensidade para cada rato durante um período de 5 dias. Cada rato foi digitalizado no canal de 635 nm (barras azuis) e no canal de 635 nm (barras vermelhas). A mais leve sombra da barra de cor representa o dia 1 de digitalização e a sombra mais escura representa dia 5. (C, F, eu) Quantificação de fluorescência relativo, mostrando uma comparação direta da intensidade do sinal do canal de 635 nm (azul) e canal de 680 nm (vermelho) na coorte inteira de ratos. Unidades de fluorescência relativo são indicadas na barra de cor. Os dados mostram os valores médios com desvio padrão de 3 animais diferentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Gene silenciar em glioblastoma pré-clínicos modelos usando FMT. Análise da expressão de gene de DAXX por RT-qPCR em GSC23 (A) e GSC11 (C) células de paciente-derivado de glioma transfectadas com shRNAs de lentivirus codificado visando DAXX (shDaxx) ou shRNA controle (shLuc) e FP720. Imagens representativas do sinal fluorescente do canal 680 nm de orthotopically engrafted implantados com GSC23-iRFP720 (B) e GSC11-iRFP720 (D) paciente-derivado de células de ratos. Sinal forte fluorescência é observada em animais implantados com shRNA controle (shLuc) (parte superior do painel), em comparação com ratos implantados com shRNA-DAXX (shDaxx) (parte inferior do painel), indicando que a inibição de DAXX suprime tumor crescimento em modelos pré-clínicos glioma determinado pela tomografia computadorizada molecular de fluorescência. Unidades de fluorescência relativo são indicadas na barra de cor. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

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Xenografts tumor têm sido extensivamente usados em pesquisa de câncer e desenvolveu um número de técnicas de imagem bem estabelecidas: BLI; ressonância magnética (MRI); tomografia por emissão de positrões (PET), computado (CT); FMT. Cada uma dessas abordagens vem com prós e contras, mas no final se complementam com o tipo de informação fornecida. Um do mais comumente usado em vivo tecnologia de imagem é BLI5,6,7,8. BLI e FMT ambos requerem engenharia de célula (com luciferase enzimas ou proteínas fluorescentes infravermelhas) que pode afetar a expressão do gene. BLI é mais sensível para massas pequeno tumor mas exige injeção intraperitoneal de um substrato (luciferina), que atinge o máximo da distribuição no organismo em 10-12 min; Mas leve têmpera e dispersão durante a aquisição de imagem, e liberação de substrato frequentemente ocorrem9. FMT, em vez disso, não requer qualquer administração de substrato adicional para os animais e seu sinal é estável e independente de tempo ou enzima estabilidade. Além disso, FMT, quando utilizado nas mesmas condições experimentais, oferece dados semi-quantitativa reprodutíveis. BLI e FMT não oferecem resolução espacial; no entanto, acoplamento esses métodos com endereços de tomografia computadorizada esta questão.

A tomografia computadorizada mede a atenuação dos fótons quando seu sinal atravessa o corpo de um animal e é ideal na identificação de estruturas do corpo. No entanto, o contraste de tecidos moles, o que pode interferir com a detecção de um pequeno tumor intracraniano, é uma limitação para esta abordagem17,18. Uma desvantagem adicional do CT é o uso da radiação e meios de contraste, que pode induzir alterações moleculares nas células alvo. A tomografia computadorizada pode ser combinada com animal de estimação, que usa marcadores radiolabeled como a glicose análogo, fluorodeoxyglucose 18F-FDG; Mas isso também pode interferir com alguns processos fisiológicos em pequenos animais. Em contraste, FMT não necessita qualquer substrato injetado para medir o tumor massa e é possível medir o metabolismo do tumor, inflamação, angiogênese, apoptose e outros marcadores usando biomarcadores fluorescente etiquetadas19.

Em geral, uma das técnicas mais úteis e versáteis para a imagem latente na vivo é o MRI. Menores limitações do MRI podem ser encontradas na época de baixa aquisição, sensibilidade mais baixa do que o PET e algumas variações relacionadas com instrumento18,20.

Aqui, nós relatamos o método FMT como um método alternativo para modelos pré-clínicos glioblastoma. Pré-marcação de células alvo com proteínas fluorescentes infravermelhas (figura 1AE) e digitalização após a implantação em animais imunocomprometidos podem ser conseguidos com um sistema de imagens de tomografia computadorizada de fluorescência. Nós relatamos o método FMT como um método alternativo para modelos pré-clínicos glioblastoma. Com este método imagem é aplicada de forma não-invasiva e livre de substrato, os animais são mantidos em um ambiente de baixa tensão e tecidos profundos quantificação pode ser realizada (Figura 2Aeu, Figura 3A, B). Este protocolo pode ser aplicado para estudar a eficácia de tratamentos combinatórios no glioma pré-clínicos modelos21, para identificar novos alvos terapêuticos para tumores de cérebro16e para investigar novas moléculas metabólicas druggable22, caminhos epigenéticas23, ou em combinação com radioterapia (dados não publicados), os novos agentes quimioterápicos e aplicado a outros estudos pré-clínicos. Também propomos aqui a utilização do FMT como uma dupla na vivo por imagens abordagem, quando dois co-existentes, mas diferente, populações de células do tumor são destinadas a ser analisado.

Algumas limitações com a FMT devem ser tomadas em consideração, tais como autofluorescência gerada a partir de alguns órgãos que possam interferir com o sinal. Por exemplo, fígado e baço murino emitem autofluorescência no canal de 680 nm, mas não em 635 nm. Portanto, FMT-relacionadas a procedimentos experimentais envolvendo estes órgãos devem ser executados usando outras proteínas fluorescentes infravermelhas, como FP635. Nós usamos nude foxn1-mutado camundongos para evitar a interferência da gravação do sinal de fluorescência; se um modelo de mouse diferente deve ser usado, é recomendável depilar a área de interesse dos animais. Além disso, esta abordagem também é limitada na detecção de massas muito pequeno tumor. Em nossa experiência, a relação sinal-ruído melhora como o tumor massa torna-se maior, ainda antes do início de qualquer sintoma neurológico nos ratos. De fato, em experimentos anteriores realizados na PDXs orthotopically injetado, fomos capazes de detectar tumores durante um regime de drogas pelo menos 2 semanas em ratos sem qualquer sinal de stress devido a tumor ónus ou drogas administração21. Em última análise, a agressividade de cada linha de celular e o número de células injetadas irá determinar o comprimento de cada experimento. Os dados mostram uma relação linear e proporcional entre o número de células e de sinal (figura 1BE) e o tumor em massa e sinal (Figura 2); Mas uma correlação de sinais em geral entre tumor em massa e número de células não pode ser aplicada em linhas de diferentes células e proteínas infravermelhas. O sinal para cada combinação de proteína fluorescente de linha/infravermelho de célula deve ser determinado empiricamente. Além disso, o sinal obtido a partir da análise das células usando o phantom (figura 1B, D) não corresponde ao sinal de xenografts intracranianas como uma atenuação de sinal ocorre devido a caveira do mouse.

O software de sistema de imagem e analisador permitem limiarização. Apesar de nós aqui não usamos qualquer limite, digitalização animais sem quaisquer células implantados dá ruído de fundo que tende a ser eliminada pela reconstrução na presença de um sinal verdadeiro. Alguns fatores influenciam a intensidade do sinal do transplante e deve ser mantidos em consideração: cada proteína fluorescente infravermelha tem diferentes de espectro de emissão e intensidade, com FP720 sendo uma das proteínas mais fluorescentes usadas experimentalmente10 ,11; cada linha de celular permite uma quantidade abundante, ainda que limitada, de produção de proteína, influenciando assim a fluorescência máxima obtenível. Finalmente, o tonalizador FMT está configurado com curvas padrão internos para compostos específicos, portanto, é importante considerar qual composto tem o espectro de emissão mais próximo à proteína fluorescente infravermelha usada para rotular as células. Embora bem tolerada, é recomendável para determinar potenciais efeitos citotóxicos mediados pela superexpressão do infravermelho proteínas8,9. Além disso, recomendamos o uso de coortes de ratos pelo menos 8 por grupo experimental, como perda de dados e os ratos, devido ao procedimento cirúrgico ou variabilidade em enxertia de célula do câncer, podem ocorrer; no entanto, isso adiciona significância estatística ao estudo. Também recomendamos serialmente digitalizar a coorte de animais por mais de um dia e analisar a emissão de sinal ao mesmo tempo, desde as variações na profundidade de imagem gaveta e reconstrução do sinal fluorescente pode interferir com a quantificação do sinal final. Para resolver esse problema, o software analyzer permite a pequenas alterações na intensidade do laser (do normal para alta e muito alta), embora em nossa experiência, o resultado final não é dramaticamente diferente. Uma observação final sobre a relação custo-eficácia é que a FMT, sistema de imagem pode ser facilmente compartilhado como um instrumento de núcleo entre diferentes laboratórios, que ajuda diminuir seu custo de aquisição e manutenção. Em conclusão, a FMT é um valioso recurso que torna fácil e confiável, avaliação experimental e pré-clínicos do crescimento do tumor na vivo .

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Disclosures

Os autores declaram não há conflitos de interesses.

Acknowledgments

Agradecemos o Dr. Frederick Lang, MD Anderson Cancer Center para GBM-PDX neurospheres. Este trabalho foi apoiado pela derrota GBM pesquisa colaborativa, uma subsidiária da sociedade nacional de cérebro Tumor (Frank Furnari), R01-NS080939 (Frank Furnari), James S. McDonnell Foundation (Frank Furnari); Jorge Benitez foi apoiado por um prêmio de americana cérebro Tumor Association (ABTA); Ciro Zanca foi parcialmente apoiado por uma bolsa de pesquisa postdoctoral do americano-italiano Cancer Foundation. Frank Furnari recebe salário e suporte adicional do Instituto Ludwig para pesquisa do câncer.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM/High Glucose  HyClone/GE SH30022.1
DMEM/F12 1:1  Gibco 11320-082
FBS HyClone/GE SH30071.03
Accutase Innovative cell technologies AT-104
Trypsin HyClone/GE SH30236.01
B27 supplement Gibco 17504044
human recombinant EGF  Stemcell Technologies 2633
human recombinant FGF Stemcell Technologies 2634
DPBS Corning 21-031-00
FACS tubes Falcon 352235
DAPI ThermoFisher Scientific 62248
Blasticidin ThermoFisher Scientific A1113903
p24 ELISA  Clontech 632200
Xylazine Akorn NDC 59399-110-20
Ketamine Zoetis NADA 043-403 Controlled substance
Ointment Dechron NDC 17033-211-38
Absorbable suture CpMedical VQ392
5 ul syringe Hamilton 26200-U Catalog number as sold by Sigma-Aldrich
Cell Sorter Sony SH8007
Mouse stereotaxic frame  Stoelting 51730
Motorized stereotaxic injector Stoelting 53311
Micromotor hand-held drill Foredom K1070
Mouse warming pad  Ken Scientific Corporation TP-22G
Fluorescence Tomography System  PerkinElmer FMT 2500 XL
TrueQuant Imaging Software  Perkin Elmer  7005319
Ultra-centrifuge Optima L-80 XP Beckman Coulter 392049
Tissue Culture 100mm Dishes Olympus Plastics 25-202
Tissue Culture 150mm Dishes Olympus Plastics 25-203
Tissue Culture Flasks T75 Corning 430720U
50 mL conical tubes Corning 430290
15 mL conical tubes Olympus Plastics 28-101
Centrifuge Avanti J-20 Beckman Coulter J320XP-IM-5
Tube, Polypropylene, Thinwall, 5.0 mL Beckman Coulter 326819
Tube, Thinwall, Polypropylene, 38.5 mL, 25 x 89 mm Beckman Coulter 326823
Athymic nude mice Charles River Laboratories Strain Code  490 (Homozygous) Prior approval by the Institutional Animal Care Program and by the Institutional Biosafety Committee required.   

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References

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Fluorescência Molecular Tomography para a imagem latente <em>na Vivo</em> de Glioblastoma Xenografts
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Benitez, J. A., Zanca, C., Ma, J., Cavenee, W. K., Furnari, F. B. Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts. J. Vis. Exp. (134), e57448, doi:10.3791/57448 (2018).More

Benitez, J. A., Zanca, C., Ma, J., Cavenee, W. K., Furnari, F. B. Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts. J. Vis. Exp. (134), e57448, doi:10.3791/57448 (2018).

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