Summary
Внутричерепных инъекций ортотопическая опухолевых клеток был использован в исследовании рака учиться биология опухоли мозга, прогрессии, эволюция и терапевтические реакции. Здесь мы представляем флуоресценции молекулярной томография ксенотрасплантатов опухоль, которая обеспечивает реального времени прижизненной визуализации и количественная оценка опухоль массы в доклинических глиобластома модели.
Abstract
Tumorigenicity — это возможность раковых клеток сформировать опухоль массы. Широко используется подход, чтобы определить, если клетки онкогенной — путем инъекций иммунодефицитных мышей подкожно с раковые клетки и измерения массы опухоли после того, как она становится видна и ощутима. Инъекции ортотопическая раковых клеток цель представить ксенотрансплантата в микроокружения, который наиболее близко напоминает ткани происхождения опухоли изучается. Исследования рака мозга требует внутричерепных инъекции раковых клеток, чтобы позволить образования опухоли и анализа в уникальных микроокружения мозга. В естественных условиях изображений внутричерепных ксенотрасплантатов контролирует мгновенно масса опухоли orthotopically прижившимися мышей. Здесь мы приводим использование флуоресценции молекулярной томография (ДРМ) ксенотрасплантатов опухоль мозга. Раковые клетки сначала преобразованы с вблизи инфракрасного флуоресцентных белков и затем вводят в головном мозге мышей, с ослабленным иммунитетом. Животные, затем сканируются для получения количественной информации о опухоль массы течение длительного периода времени. Клетки предварительно маркировки позволяет экономически эффективной, воспроизводимые и надежной количественной оценки бремени опухоли в пределах каждой мыши. Мы устранить необходимость для инъекций изображений субстраты и таким образом сократить нагрузку на животных. Ограничение этого подхода представляет невозможность обнаружения очень малых масс; Однако она имеет лучшее разрешение для больших масс, чем другие методы. Он может применяться для оценки эффективности лечения наркомании или генетические изменения линий клеток глиомы и пациент, полученных образцов.
Introduction
Рак является одной из ведущих причин смертей, связанных с болезнью, в людей в промышленно развитых странах. С чрезвычайно высокой погибших срочно необходимы новые методы лечения. Глиобластомы мультиформной (GBM) является чрезвычайно смертоносного тип рака мозга, состоящий из разнородных популяций мозга опухоль, стромы и иммунных клеток. Согласно реестра Центральный мозг опухоль из США частота первичных злокачественных и доброкачественных опухолей головного мозга составляет около 22 случаев на 100 000 живорождений. Ожидается, что примерно 11 000 новых случаев диагностируется в США в 2017 году1.
Доклинические исследования изучить вероятность наркотиков, процедуры или лечение эффективным до начала испытаний на людях. Одним из первых шагов лаборатории в доклинических исследованиях является идентификация потенциальных молекулярных целей на лечение с помощью раковые клетки, имплантированные в организме хозяина, определяется как человека ксенотрансплантата модели. В этом контексте внутричерепной мозга опухоль ксенотрансплантата модели с помощью пациент производные ксенотрасплантатов (PDXs) широко использовались для изучения биология опухоли мозга, прогрессии, эволюция и терапевтического ответа и совсем недавно для развития биомаркеров, наркотиков скрининг и персональной медицины2,3,4.
Один из наиболее доступных и неинвазивные в vivo imaging методы мониторинга внутричерепных ксенотрасплантатов является биолюминесценции изображений (BLI)5,6,,78. Однако некоторые ограничения BLI включают субстрата администрации и доступности, стабильность фермента, закалки и рассеяния во время визуализации приобретение9. Здесь мы приводим инфракрасный ДРМ как альтернативу визуализации метод мониторинга доклинические глиобластома модели. В этот метод, приобретение сигналов и количественной оценки интракраниально имплантированных PDXs, выражая ближней ИК-области флуоресцентный белок iRFP72010,11 (отныне называются FP720) или turboFP635 (отныне называются FP635), выполняется с ДРМ изображений системы. Используя технологию FMT, ортотопическая, опухоли могут быть мониторинг в естественных условиях до, во время или после лечения, неинвазивный, субстрат бесплатно и количественные образом для доклинических наблюдений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Использование экспериментальных исследований животных и инфекционных агентов, таких как человека передавать раковые клетки, требует предварительного одобрения программой институционального ухода за животными и институциональных биобезопасности Комитета. Этот протокол следует правилам ухода за животными в университете Калифорнии Сан-Диего (UCSD).
1. Маркировка клеток глиобластомы с FP635 или FP720 конструкции
- Производить и очищают человека согласно протоколу, характеризуется Tiscornia и др. 12
- Культуры приблизительно 2.0 x 106 клеток от линии клеток глиомы человека с DMEM плюс 10% плода бычьим сывороточным (ФБС) в 15-см блюдо; или культуры 2.0 x 106 человека глиобластома пациента производные (GBM-PDX) сферах с DMEM/F12 средний 1:1 с B27 дополнение плюс человеческого рекомбинантного эпидермального фактора роста (EGF; 20 нг/мл) и ФБП (10 нг/мл) в колбе T75.
- Сохранить все клетки при 37 ° C, 5% CO2и 100% относительной влажности.
- Разбить ячейки.
- Для клеток глиомы: удалить супернатант из пластин и добавление 3-5 мл трипсина 1 X клеток глиомы.
- Для GBM сфер: собирать клетки, закупорить клетки в 15 мл.
- Спин вниз GBM сферах на 200 x g 5 минут с помощью настольной центрифуги при комнатной температуре.
- Удалить супернатант и добавить 3-5 мл раствора отряд клеток.
- Инкубируйте все клетки при 37 ° C на 10-15 мин.
- Осторожно отделить клетки, закупорить вверх и вниз несколько раз (обеспечить завершение сферах и клеток глиомы отделить) и спином вниз на 200 x g за 5 мин.
- Удалить супернатант и Ресуспензируйте клетки с 5 мл среды, закупорить вверх и вниз несколько раз. Трипановый синий исключения определите жизнеспособность клеток.
- Пластина 1.0 x 106 клеток-мишеней в 10 см блюдо с 5 мл среды, закупорить.
- Передают клетки с человека, выражая флуоресцентных белков на обилие инфекции (МВД) 5, как это описано в Tiscornia et al. 12 и Инкубируйте на 37 ° C.
- После 24 часов извлеките носитель из transduced клеток, добавить 5 мл свежих средних и проинкубируйте дополнительных 48 ч при 37 ° C.
- Отделить инфицированных клеток в одну ячейку подвеска как описано в шагах 1.4-1.6. Спин вниз клетки на 200 x g 5 мин и Ресуспензируйте в 500 мкл сортировки решение (фосфат амортизированное saline (PBS) с 1% FBS).
- Пипетка суспензию клеток в СУИМ трубы. Совместное пятно клеток в 1 мкл/мл 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) дигидрохлорида исключить мертвые клетки. Негативный контроль требуются для настройки потока цитометр ворота (не преобразованы клетки и клетки, не преобразованы / DAPI stained).
- Сортировать люминесцентные положительная/DAPI-отрицательная клетки в сортировка решение, как описано на басу и др. 13и собирать сортировки клеток в 15 мл Конические трубки.
- Спин вниз отсортированный клетки на 200 x g 5 минут, удалить супернатант и Ресуспензируйте в 5 мл питательной среды. Семя сортировки клеток в 10 см блюдо, закупорить. Инкубируйте при 37 ° C в течение 48-72 часов.
- Разверните узел сортировки клеток путем отделения клетки следующие шаги 1.4-1.6 и покрытие в множественные тарелки для экспериментов в естественных условиях .
Примечание: Для более подробной информации о ячейке Сортировка водоподготовке и очистке, см. басу и др. 13
2. внутричерепная инъекции в иммунодефицитных мышей с меткой iRFP клеток глиобластомы
Примечание: Перед началом операции, убедитесь, что хирургическое обслуживание и инструменты являются чистыми для процедуры. Используйте иммунодефицитных Атинические ню (нюFoxn1) мужского или женского пола мышей, между 4-5 недель и 17-19 g для внутричерепных инъекции. Животные должны быть размещены по крайней мере 3 дней после прибытия и перед операцией.
- Подготовка клетки
- Урожай и разъединять флуоресцентные положительный глиомы клетки в одну ячейку подвеска (шаги 1.4-1.6) и Ресуспензируйте 0,5 или 1,0 x 106 клеток в 2-5 мкл PBS на инъекцию за животное. Пипетка суспензию клеток в 1,5 мл microcentrifuge трубки и место на льду.
- Подготовка анестезии и администрация
- Подготовка 200 мкл солевой раствор, содержащий кетамин (100 мг/кг) и ксилазина (10 мг/кг) на 20 грамм веса тела мыши. Вес животных и рассчитать соответствующие дозу наркоза.
- Предоставить внутрибрюшинной инъекции анестезии и применить глазной мази в глаза, чтобы избежать обезвоживания. Для более подробной информации об этом шаге см Кэтлин и др. 14 место животное на площадку тепловой подогретым воды 37 ° c.
- Проверьте, что животные находятся под наркозом путем наблюдения за мыс щепотку ответ (педаль рефлекс), обычно в течение 5-10 мин.
- Внутричерепных инъекций
- Загрузить 5 мкл Гамильтон шприца (тупой кончик иглы) с суспензию клеток и горе в держатель зонда.
- Поместите указатель мыши в небольших животных стереотаксической рамы и исправить головку с помощью уха баров и резца адаптер после описанных детали Четин et al. 15
- Лечить голову с 70% этанола и Бетадин решения. Убедитесь, что хирургическое сайта является стерильной. Выполните среднего разрез с небольшой скальпелем и отдельные кожи и соединительной ткани.
- Поместите шприц Гамильтон на bregma точки с использованием микроманипулятор.
- Переместите зонд переднезаднем держатель 1,0 мм и 2.0 мм бокового от точки bregma. Марк эту позицию с карандашом.
- В этом месте тщательно сделайте отверстие в черепа ручной дрелью микромотор, применяя небольшое давление вниз до тех пор, пока кровеносные сосуды становятся видимыми. Не нарушать паутинной матер и мозг паренхимы.
- Ввести иглу в отверстие заусенцев и заранее 3,0 мм ниже поверхности сетчаточных.
- Настройка громкости (2-5 мкл) и скорость потока (1 мкл/мин) с использованием моторизованных стереотаксического инжектора впрыска или вручную выполнить инъекции.
- После инъекции удалите иглу постепенно по возрастанию 1,0 мм каждый 1 мин и очистить место инъекции с 70% этиловом спирте.
- Закройте кожи раны с хирургической скобы или делая хирургические нити (часто упоминается как швы) и увидеть Кэтлин и др. 14 для получения более подробной информации.
- Животных восстановления
- Передать животное воды теплопроводящая прокладка (37 ° C) и мониторинг температуры тела, частоты дыхания и пульса, до полного выздоровления. Администрировать анальгезии в стандартные протоколы.
Примечание: Дополнительные сведения о процедуре стереотаксической хирургии и координаты, увидеть другие доклады по5,14,15.
- Передать животное воды теплопроводящая прокладка (37 ° C) и мониторинг температуры тела, частоты дыхания и пульса, до полного выздоровления. Администрировать анальгезии в стандартные протоколы.
3. ДРМ изображений
Примечание: По данным экспериментальных целях, iRFP тегами глиобластома, что клетки могут быть мониторинг в естественных условиях до, во время или после лечения. Для визуализации цели, анестезировать животных, используя камеру индукции изофлюрановая, поддерживать в изображений кассету во время сканирования и изображение в док-станции ДРМ томографа.
- Удаление животное из клетки и место в зале индукции изофлюрановая. Закрыть камеру и включите потока кислорода и испарителя до 3-5%.
- Мониторинг животных до тех пор, пока он полностью под наркозом, обычно в течение 1-2 мин бессознательного животных следует не реагировать на внешние раздражители.
- Удаление наркотизированных животных из камеры и положить животное в изображений кассету, во-первых, поместив голову адаптер следуют размещения животное вниз. Убедитесь, что голова расположен в центре кассеты.
- Поместите верхнюю крышку кассеты на вершине и затяните регулировочные ручки до 17 мм.
- Однажды, что животное является безопасным в изображений кассету, переходите к томографии, вставив кассету в внутренней док-станции по ДРМ томографа, где изофлюрановая закачивается держать животное под наркозом.
- Запустите программное обеспечение тепловизор и анализатор, дважды щелкнув значок программного обеспечения.
- В окне «Экспериментальная вкладке» выберите «База данных» и «Исследовательская группа».
- Перейдите в окно «Закладка» и выберите тему для изображения, нажав кнопку «Выбрать тему». Кроме того выберите лазерный канал на панели «Лазерный канал». Для FP635-меченых ячеек выберите «лазерный канал 635 нм» и для FP720-меченых ячеек, выберите «лазерного канала 680 нм».
- Получить изображение, выбрав параметр «Захват» в окне «Закладка». Затем отрегулируйте поля сканирования, нажав и перетащив поля сканирования в образ на определенное количество расположения источника, обычно в течение 20-25 источников на ипсилатеральной стороне.
- Установите флажок «Добавить в очередь реконструкции» и нажмите «Сканировать» в окне «Закладка».
- Дождитесь завершения сканирования и затем удалите изображений кассету из док-станции.
- Снимите верхнюю крышку кассеты и место животных обратно в клетке.
- Повторите шаги 3.1-3.12 для остальных животных.
4. анализ
- Тепловизор и анализатор программного обеспечения выберите окно «Анализ вкладки».
- Загрузка набора данных и предметом анализа, нажав кнопку «+» в панели «Выбор набора данных» окна «Анализ вкладки».
- После загрузки изображения в окне «Анализ вкладка» выполните региона интерес (ROI) анализа, выбрав значок эллипсоид, расположенный в верхнем левом углу окна «Анализ вкладки».
- Отрегулируйте порог до нуля в панели «статистические данные», щелкнув правой кнопкой мыши столбец «порог» в окне «Анализ вкладка».
- Общая стоимость в панели «Статистические данные» представляет сигнал от клеток глиобластомы люминесцентной меткой, имплантированных в мозг мыши.
- Повторите шаги с 4.2-4.4 для остальных животных. Загрузить или удалить новый предмет, нажав кнопку «+» или кнопку «−», соответственно, на панели «Выбор набора данных» окна «Анализ вкладки».
Примечание: Дополнительные сведения о ДРМ изображений и программного обеспечения операции, см20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Глиобластома клетки U87EGFRvIII (клетки U87 чрезмерно выражая EGF рецептор вариант III) были культивированный согласно шаг 1.2. Лентивирусы был подготовлен и очищенный согласно шагу 1.1. Вирусная концентрация определяется p24 анализа ELISA. Клетки были преобразованы с человека, перевозящих инфракрасный флуоресцентные белки согласно шаг 1.8. Плазмиды, кодирование FP72010,11 любезно предоставленных доктор в.в. Верхушей и FP635 вектор был приобретен у коммерческих поставщиков. Клетки-мишени были СУИМ, отсортированных по обогащению для топ 10% наиболее флуоресцентные популяции клеток (рис. 1A). Увеличение флуоресцентного сигнала повышает чувствительность КТ флюоресценции. Для проверки интенсивности сигналов дневно меченых клетки до ортотопическая имплантации, мы использовали Фантом кассеты ДРМ томографа. В частности U87EGFRvIII-TurboFP635 и U87EGFRvIII-iRFP720 клетки были отделены с трипсином и 1 х 105, 1 x 10-6, и 1 x 107 клетки были высокомобильна в 100 мкл лед холодной PBS, соответственно и проанализированы. ДРМ томографа позволяет для обнаружения в 4 каналах: 635 нм, 680 нм, 750 нм и 780 нм. Дальней инфракрасной каналы 750 нм и 780 нм, не подходят для этого анализа, потому что нет никаких выбросов на таких длинах волн от ближней ИК-области флуоресцентных белков используется (данные не показаны). Таким образом, мы проанализировали выбросов сигналов на 635 нм и 680 нм. Сообщалось на рисунке 1, люминесцентные сигнала изображения и интенсивности квантификации для обоих FP635 (рис. 1B, C) и FP720 (рис. 1 d, E), который увеличивает как ячейки номер увеличивается пропорционально. Следует отметить, выбросов за FP635 видно в канале 635 нм, но не в 680 нм канала. В отличие от выбросов для FP720 виден в канале 680 нм, но не в 635 нм канала. Это делает эти два кандидата флуоресцентные белки подходит для исследования, где две популяции клеток могут быть помечены и контролироваться одновременно с использованием двух вблизи инфракрасного флуоресцентные метки.
U87EGFRvIII клетки, помечены вблизи инфракрасного флуоресцентные белки затем использовались для инъекций ортотопическая и в естественных условиях мониторинга роста опухоли, как описано в шагах 2.1-2.4. Мы использовали же клеток линии, то есть, U87EGFRvIII, помечены разными флуоресцентные метки, чтобы исключить опухолевого роста разницы между типов различных раковых клеток. Мышей вводили с U87EGFRvIII-TurboFP635 клеток, клеток U87EGFRvIII-iRFP720 или равные комбинации (1:1) двух клеточных линий. В общей сложности 5 x 105 клеток в объеме 5 мкл PBS вводили интракраниально в 4-5 недель старых ослабленным Атинические обнаженной мышей с использованием стереотаксической системы и Гамильтон шприц, следующие шаги 2.3-2.4. Анестезии была выполнена внутрибрюшинной инъекцией кетамина/Ксилазина. Животные были теплым на протяжении инъекций с использованием воды термальная пусковая площадка и проверяется на наличие признаков бедствия. Опухоль приживления и рост затем контролируется ДРМ изображений системы. Во время сканирования сессий мышей были временно под наркозом с использованием изофлюрановая камеры 3% (шаги 3.1-3.12). Мышей были затем помещены в изображений кассету и образы внутри лазерного сканирования камеры. Каждая мышь был отсканирован с помощью 635 нм и 680 нм каналы. Количественная оценка сигнала был записан со временем и мышей были умерщвлены в появления неврологических симптомов, согласно руководящим принципам институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC). Как указано на рисунке 2A, U87EGFRvIII-TurboFP635 выбросов сигнал был очевидным в 635 нм канала и минимальный фоновый сигнал был записан в канале 680 Нм (цифры 2B, C). В отличие от U87EGFRvIII-iRFP720 клеток, испускаемого в 680 нм канале показаны меньшюю предпосылку на канале 635 нм (F2D фигур–). Наконец мышей, вводится с 1:1 смесь U87EGFRvIII-TurboFP635 клеток и клеток U87EGFRvIII-iRFP720 показало увеличение сигнала в обоих каналах в течение всего эксперимента (цифры 2 g–я). Эти данные показывают, что это возможно использовать инфракрасный флуоресцентных белков для двойной в vivo изображений рак клеточных популяций. Данные также показывают, что различные флуоресцентные белки имеют различную интенсивность в их излучение сигнала. Здесь FP720 интенсивность сигнала был выше FP635, с повышенной чувствительностью в обнаружении мелких популяций раковых клеток в условиях неинвазивного мониторинга.
Эффекты сайленсинга генов генов, связанных с раком, на tumorigenicity в доклинических моделях также может быть исследование с настоящим Протоколом. Для этой цели GBM-сферы (GSC23 и GSC11) были культивированный (шаг 1.2) и преобразованы с FP720-Лентивирусы (шаг 1,8). Клетки, выражая FP720 были СУИМ, сортировка, как описано ранее 1.11-1,13. FP720-меченых клетки были совместно transduced с человека кодирования индуцируемый DAXX (shDaxx), или управления (shLuc) индуцируемый MOI 516. Клетки были культивированный на 5 дней, отделить в одну ячейку подвеска, и 1 х 106 клеток были высокомобильна в 3 мкл PBS для внутричерепных инъекций. Эффективность таргетинга DAXX индуцируемый был подтвержден обратной транскрипции количественных полимеразной цепной реакции (RT-ПЦР) в GSC23 (Рисунок 3А) и GSC11 (рис. 3 c). GBM-iRFP720/индуцируемый клетки вентрикуло вводили в стриатума иммунодефицитных мышей, согласно шаги 2.3-2.4. Животных наблюдались неврологические признаки и относительной флуоресценции сигнал ксенотрасплантатов были проанализированы по ДРМ тепловизионной системы, количественно с помощью программного обеспечения для анализа, согласно шаги 3.1-4.6. Представитель изображения ДРМ показывают уменьшение флуоресценции сигнал в мышей, прижившимися с shDAXX/GBM-сферы по сравнению с животными, имплантируются с shControl (рисунок 3B и Рисунок 2D) для обеих моделей GBM-сферы, подтверждающие наши предыдущий вывод16 DAXX ингибирование подавляет рост опухоли в доклинических глиобластома модели.
Рисунок 1: стандартные кривые, с использованием клеток для Фантом и анализ СУИМ. (A) представитель СУИМ гистограммы из FP720 - и FP635-U87EGFRvIII, выражая клетки (левая и правая панель, соответственно). Клеток глиомы были заражены кодирования инфракрасный флуоресцентные белки человека и ТМПК сортируются для обогащения для высшим выражением протеинов FP720 или FP635. Представитель изображения получены из формирователя изображений и анализатор программного обеспечения U87EGFRvIII-TurboFP635 (B) и (D) U87EGFRvIII-iRFP720 клеточных суспензий, используя Фантом кассеты. Верхней панели представляют собой сигнал в 635 нм канала и нижней панели в канале 680 нм. Увеличение в ячейку число соответствует увеличению сигнала визуализации. Количественная оценка сигнала U87EGFRvIII-TurboFP635 (C) и U87EGFRvIII-iRFP720 (E) клетки в 635 нм и 680 нм каналы. Относительный флуоресценции единиц указаны в панели цвета. Планки погрешностей представляют S.E.M. от 3 различных сканирований в суспензию клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: опухоли мозга ксенотрансплантата модель с помощью U87EGFRvIII клетки отсканированные в разных каналов. Представитель изображения флуоресцентного сигнала в 635 нм и 680 нм каналы от животных интракраниально имплантируются с сочетанием смесь (1:1) U87EGFRvIII-iRFP720 U87EGFRvIII-turboFP635 (A) и U87EGFRvIII-iRFP720 (D): U87EGFRvIII-turboFP635 клетки (G). Изображения были приобретены на 5 день после первого сканирования. (B, E, H) Сигнал, интенсивности мониторинга для каждой мыши в течение 5 дней. Каждая мышь был отсканирован в 635 нм канал (синие столбики) и в 635 нм канале (красные столбики). Легкие тени бара цвет представляет день 1 сканирование и мрачные тени представляет день 5. (C, F, я) Количественная оценка относительной флуоресценции показаны прямое сравнение интенсивности сигнала от 635 нм канала (синий) и 680 нм канал (красный) в всей когорте мышей. Относительный флуоресценции единиц указаны в панели цвета. Данные показывают средние значения с стандартным отклонением от 3 различных животных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Джин, глушителей в доклинических глиобластома модели с помощью FMT. Анализ выражения гена DAXX по RT-ПЦР в GSC23 (A) и GSC11 пациента, полученных клеток глиомы (C) преобразованы с человека кодировке процессируются DAXX (shDaxx) или индуцируемый управления (shLuc) и FP720. Прижившимися представитель изображения флуоресцентного сигнала от 680 нм канала orthotopically мышей, имплантируются с GSC23-iRFP720 (B) и клеток пациента производные GSC11-iRFP720 (D). В животных, имплантируются с индуцируемый управления (shLuc) (верхняя часть панели) наблюдается сильная флуоресценция сигнал по сравнению с мышей, имплантируются с индуцируемый DAXX (shDaxx) (Нижняя часть панели), указав, что ингибирование DAXX подавляет опухоли рост в доклинических глиомы модели определяется молекулярной томография флуоресценции. Относительный флуоресценции единиц указаны в панели цвета. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Опухоль ксенотрасплантатов широко использовались в раковых исследований и разработан ряд устоявшихся методов обработки изображений: BLI; Магнитно-резонансная томография (МРТ); Позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ), компьютерная томография (КТ); ДРМ. Каждый из этих подходов поставляется с плюсы и минусы, но в конечном итоге дополняют друг друга с типом информации. Одним из наиболее часто используемых в vivo imaging технологии является BLI5,6,,78. BLI и ДРМ оба требуют клеточной инженерии (с Люцифераза ферментов или инфракрасный флуоресцентные белки), которые могут влиять на экспрессию генов. BLI является более чувствительным для небольших опухолевые массы, но требует внутрибрюшинной инъекции субстрата (люциферин), который достигает максимального распределения в организме в 10-12 мин.; но свет закалки и рассеяния во время визуализации приобретения, и субстрат Распродажа часто происходят9. ДРМ, вместо этого, не требует каких-либо дополнительных субстрата администрации для животных и его сигнал является стабильным и независимо от времени или фермента стабильности. Кроме того FMT, когда используется в тех же экспериментальных условиях, предлагает воспроизводимые полу количественных данных. BLI и ДРМ не предлагают пространственного разрешения; Однако муфта эти методы с КТ адреса этот вопрос.
КТ меры ослабления фотонов при его сигнал пересекает тело животного и идеально подходит в определении структуры тела. Однако контраст мягких тканей, которые могли бы помешать обнаружения небольшой внутричерепной опухоли, является ограничением для этот подход17,18. Один дополнительный недостаток CT является использование радиации и контраст СМИ, которые могут вызвать молекулярные изменения в клетки-мишени. КТ может сочетаться с PET, который использует radiolabeled Трейсеры как глюкоза аналоговых, fluorodeoxyglucose 18F-ФДГ; но это также может помешать с некоторых физиологических процессов в мелких животных. В противоположность этому, ДРМ не нуждается в каких-либо вводили субстрат для измерения опухоль массы и его можно измерить опухоли метаболизма, воспаление, ангиогенезе, апоптозе и другие маркеры с помощью биомаркеров дневно обозначенные19.
В целом один из самых полезных и универсальных методов для обработки изображений в естественных условиях является МРТ. Незначительные ограничения МРТ можно найти в низкой приобретение время, более низкую чувствительность чем PET и некоторые вариации, связанные с инструментом18,20.
Здесь мы приводим метод ДРМ как альтернативный метод для доклинических глиобластома моделей. Предварительно маркировки целевых клеток с инфракрасным флуоресцентных белков (рис. 1A–E) и сканирование после имплантации в ослабленным животных может быть достигнуто с системой визуализации томография флуоресценции. Мы сообщали метод ДРМ как альтернативный метод для доклинических глиобластома моделей. С помощью этого метода томографии применяется в субстрат свободно и неинвазивным способом, животные находятся в среде с низким напряжением, и глубокие ткани количественная оценка может быть выполнена (рисунок 2A–я, Рисунок 3А, B). Этот протокол может применяться для изучения эффективности комбинаторного лечения в доклинических глиомы модели21, для выявления новых терапевтических целей для мозга опухоли16и исследовать новые druggable метаболических молекулы22, Эпигеномные пути23, или новых химиотерапевтических агентов в сочетании с лучевой терапии (неопубликованные данные) и применительно к другим доклинических исследований. Мы также предлагаем использование ДРМ как двойной в vivo imaging подход, когда два совместно существующих, но разные, популяции клеток опухоли предназначены для анализа.
Некоторые ограничения с ДРМ должен приниматься во внимание, таких как авто флуоресценции генерируется из некоторых органов, которые могут мешать сигнал. К примеру, мышиных селезенки и печени излучают auto флуоресценции в канале 680 нм, но не в 635 нм. Таким образом связанные с ДРМ экспериментальной процедуры с участием этих органов должны выполняться с помощью других инфракрасный флуоресцентных белков, как FP635. Мы использовали ню foxn1-мутировал обнаженной мышей, чтобы избежать вмешательства в записи сигнала флуоресценции; Если необходимо использовать модель другой мыши, рекомендуется бриться области интересов животных. Кроме того этот подход также ограничен в обнаружении масс очень небольшой опухоли. По нашему опыту, улучшает отношение сигнал шум как опухоль массы становится больше, еще до начала каких-либо неврологических симптомов в мышей. В действительности в предыдущих экспериментов, проведенных на orthotopically вводили PDXs, мы смогли обнаружить опухоли во время наркотики режим для по крайней мере 2 недель в мышей без каких-либо признаков бедствия из-за опухоли бремя или наркотиками администрации21. В конечном итоге агрессивность каждой ячейки строки и количество вводят клетки будут определять длину каждого эксперимента. Данные показывают линейной пропорциональной зависимости между количество клеток и сигнал (рис. 1B–E) и опухоль массы и сигнал (рис. 2); но общий сигнал корреляции между опухоль массы и количество клеток не может применяться через различных клеточных линий и инфракрасные белков. Сигнал для каждой ячейки строки/инфракрасного флуоресцентный белок комбинации должны быть определены эмпирически. Кроме того сигнал, полученные из анализа клеток, используя Фантом (рис. 1B, D) не соответствует сигнал от внутричерепной ксенотрасплантатов как затухание сигнала происходит из-за череп мыши.
Тепловизор и анализатор программного обеспечения позволяют порога. Хотя мы не использовать любой порог здесь, сканирование животных без каких-либо имплантированные клетки дает фоновый шум, который стремится быть устранены путем реконструкции в присутствии истинный сигнала. Несколько факторов влияют на интенсивность сигнала ксенотрансплантата и должны храниться в рассмотрении: каждый инфракрасный флуоресцентный белок имеет различные спектра излучения и интенсивности, с FP720 является одним из самых флуоресцентных белков использованы экспериментально10 ,11; Каждая линия клетки позволяет обильные, но ограниченный, количество производства белка, таким образом влияющих на максимальный доступный флуоресценции. Наконец, тепловизор ДРМ является установка с внутренней стандартных кривых для конкретных соединений, поэтому, важно рассмотреть, какие соединение имеет ближайший спектра излучения для инфракрасной флуоресцентный белок, используется для обозначения клетки. Хотя хорошо переносится, рекомендуется определить потенциальных цитотоксических эффектов, при посредничестве гиперэкспрессия инфракрасный белки8,9. Кроме того мы рекомендуем использовать когорты мышей, по крайней мере 8 каждой экспериментальной группы, как может произойти потеря данных и мышей, из-за хирургические процедуры или изменчивость в приживления клеток рака, Тем не менее это добавляет статистическую значимость исследования. Мы также рекомендуем последовательно сканировать животных когорты для более чем один день и проанализировать излучение сигнала в то же время, с вариациями в глубине изображений кассету и реконструкции флуоресцентного сигнала может помешать с квантификацией окончательный сигнал. Для решения этой проблемы, анализатор программное обеспечение позволяет для незначительных изменений в интенсивности лазера (от нормальных до высокого и очень высокого), хотя наш опыт окончательный результат не резко отличается. Одно замечание относительно экономической эффективности является, что ДРМ, система может быть легко поделиться как основной инструмент между различными лабораториями, который помогает покрыть его стоимость покупки и обслуживания. В заключение ДРМ является ценным ресурсом, который делает оценки экспериментальных и доклинические в естественных условиях роста опухоли, легко и надежно.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют не конфликты интересов.
Acknowledgments
Мы благодарим д-р Фредерик Lang, MD Anderson Cancer Center для GBM-PDX-neurospheres. Эта работа была поддержана поражение GBM исследований совместное, филиал Национального мозга опухоль общества (Frank Furnari), R01-NS080939 (Frank Furnari), Джеймс S. McDonnell фонд (Frank Furnari); Хорхе Бенитес был поддержан награду от Американской ассоциации опухоли мозга (ABTA); Ciro Zanca частично поддерживается докторантура стипендий американский-итальянский фонд рака. Фрэнк Furnari получает зарплату и дополнительную поддержку от Института Людвига для исследований рака.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/High Glucose | HyClone/GE | SH30022.1 | |
| DMEM/F12 1:1 | Gibco | 11320-082 | |
| FBS | HyClone/GE | SH30071.03 | |
| Accutase | Innovative cell technologies | AT-104 | |
| Trypsin | HyClone/GE | SH30236.01 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504044 | |
| human recombinant EGF | Stemcell Technologies | 2633 | |
| human recombinant FGF | Stemcell Technologies | 2634 | |
| DPBS | Corning | 21-031-00 | |
| FACS tubes | Falcon | 352235 | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
| Blasticidin | ThermoFisher Scientific | A1113903 | |
| p24 ELISA | Clontech | 632200 | |
| Xylazine | Akorn | NDC 59399-110-20 | |
| Ketamine | Zoetis | NADA 043-403 | Controlled substance |
| Ointment | Dechron | NDC 17033-211-38 | |
| Absorbable suture | CpMedical | VQ392 | |
| 5 ul syringe | Hamilton | 26200-U | Catalog number as sold by Sigma-Aldrich |
| Cell Sorter | Sony | SH8007 | |
| Mouse stereotaxic frame | Stoelting | 51730 | |
| Motorized stereotaxic injector | Stoelting | 53311 | |
| Micromotor hand-held drill | Foredom | K1070 | |
| Mouse warming pad | Ken Scientific Corporation | TP-22G | |
| Fluorescence Tomography System | PerkinElmer | FMT 2500 XL | |
| TrueQuant Imaging Software | Perkin Elmer | 7005319 | |
| Ultra-centrifuge Optima L-80 XP | Beckman Coulter | 392049 | |
| Tissue Culture 100mm Dishes | Olympus Plastics | 25-202 | |
| Tissue Culture 150mm Dishes | Olympus Plastics | 25-203 | |
| Tissue Culture Flasks T75 | Corning | 430720U | |
| 50 mL conical tubes | Corning | 430290 | |
| 15 mL conical tubes | Olympus Plastics | 28-101 | |
| Centrifuge Avanti J-20 | Beckman Coulter | J320XP-IM-5 | |
| Tube, Polypropylene, Thinwall, 5.0 mL | Beckman Coulter | 326819 | |
| Tube, Thinwall, Polypropylene, 38.5 mL, 25 x 89 mm | Beckman Coulter | 326823 | |
| Athymic nude mice | Charles River Laboratories | Strain Code 490 (Homozygous) | Prior approval by the Institutional Animal Care Program and by the Institutional Biosafety Committee required. |
References
- Ostrom, Q. T., et al. CBTRUS Statistical Report: Primary Brain and Other Central Nervous System Tumors Diagnosed in the United States in 2009-2013. Neuro-Oncology. 18 (suppl_5), v1-v75 (2016).
- Pauli, C., et al. Personalized In Vitro and In Vivo Cancer Models to Guide Precision Medicine. Cancer Discovery. 7 (5), 462-477 (2017).
- Stewart, E. L., et al. Clinical Utility of Patient-Derived Xenografts to Determine Biomarkers of Prognosis and Map Resistance Pathways in EGFR-Mutant Lung Adenocarcinoma. Journal of Clinical Oncology. 33 (22), 2472-2480 (2015).
- Gao, H., et al. High-throughput screening using patient-derived tumor xenografts to predict clinical trial drug response. Nat Med. 21 (11), 1318-1325 (2015).
- Ozawa, T., James, C. D. Establishing Intracranial Brain Tumor Xenografts With Subsequent Analysis of Tumor Growth and Response to Therapy using Bioluminescence Imaging. J. Vis. Exp. (41), e1986 (2010).
- Kondo, A., et al. An experimental brainstem tumor model using in vivo bioluminescence imaging in rat. Child's Nervous System. 25 (5), 527-533 (2009).
- Nyati, S., Young, G., Ross, B. D., Rehemtulla, A. ATM Kinase: Methods and Protocols. Kozlov, S. V. , Springer. New York. 97-111 (2017).
- Kondo, A., et al. Longitudinal assessment of regional directed delivery in a rodent malignant glioma model. J Neurosurg Pediatr. 4 (6), 592-598 (2009).
- Badr, C. E. Bioluminescent Imaging: Methods and Protocols. Badr, C. E. , Humana Press. 1-18 (2014).
- Shcherbakova, D. M., Verkhusha, V. V. Near-infrared fluorescent proteins for multicolor in vivo imaging. Nat Meth. 10 (8), 751-754 (2013).
- Filonov, G. S., et al. Bright and stable near-infrared fluorescent protein for in vivo imaging. Nat Biotech. 29 (8), 757-761 (2011).
- Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. Production and purification of lentiviral vectors. Nat. Protocols. 1 (1), 241-245 (2006).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). J. Vis. Exp. (41), e1546 (2010).
- Pritchett-Corning, K. R., Luo, Y., Mulder, G. B., White, W. J. Principles of rodent surgery for the new surgeon. J Vis Exp. (47), (2011).
- Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nat. Protocols. 1 (6), 3166-3173 (2007).
- Benitez, J. A., et al. PTEN regulates glioblastoma oncogenesis through chromatin-associated complexes of DAXX and histone H3.3. Nature Communications. 8, 15223 (2017).
- Kirschner, S., et al. Imaging of Orthotopic Glioblastoma Xenografts in Mice Using a Clinical CT Scanner: Comparison with Micro-CT and Histology. PLOS ONE. 11 (11), e0165994 (2016).
- Mannheim, J. G., et al. Standardization of Small Animal Imaging-Current Status and Future Prospects. Molecular Imaging and Biology. , (2017).
- Engblom, C., et al. Osteoblasts remotely supply lung tumors with cancer-promoting SiglecFhigh neutrophils. Science. 358 (6367), (2017).
- Lauber, D. T., et al. State of the art in vivo imaging techniques for laboratory animals. Laboratory Animals. 51 (5), 465-478 (2017).
- Zanca, C., et al. Glioblastoma cellular cross-talk converges on NF-κB to attenuate EGFR inhibitor sensitivity. Genes & Development. 31 (12), 1212-1227 (2017).
- Villa, G. R., et al. An LXR-Cholesterol Axis Creates a Metabolic Co-Dependency for Brain Cancers. Cancer Cell. 30 (5), 683-693 (2016).
- Liu, F., et al. EGFR Mutation Promotes Glioblastoma through Epigenome and Transcription Factor Network Remodeling. Molecular Cell. 60 (2), 307-318 (2015).
