Summary
Ortotópico inyección intracraneal de células del tumor se ha utilizado en la investigación del cáncer para el estudio de la biología del tumor de cerebro, evolución, evolución y respuesta terapéutica. Presentamos la tomografía molecular fluorescencia de xenoinjertos tumorales, que proporciona en tiempo real imágenes intravital y cuantificación de un tumor masivo en modelos preclínicos de glioblastoma.
Abstract
Colonización es la capacidad de las células cancerosas forman un tumor masa. Un enfoque ampliamente utilizado para determinar si las células son tumorigenic es inyectando ratones inmunodeficientes por vía subcutánea con células de cáncer y midiendo la masa de tumor después de se vuelve visible y palpable. Orthotopic inyecciones de células de cáncer tienen como objetivo introducir el xenoinjerto en el microambiente que más se asemeja al tejido de origen del tumor en estudio. Investigación de cáncer del cerebro requiere inyección intracraneal de las células cancerosas para permitir la formación de tumores y el análisis en el microambiente único del cerebro. La proyección de imagen en vivo de xenoinjertos intracraneales monitorea instantáneamente la masa tumoral de orthotopically engrafted ratones. Aquí divulgamos el uso de la tomografía molecular de la fluorescencia (FMT) de xenoinjertos de tumor de cerebro. Las células cancerosas son transduced en primer lugar con cerca de proteínas fluorescentes infrarrojos y luego se inyecta en el cerebro de ratones inmunodeprimidos. Los animales se analizan a continuación para obtener información cuantitativa sobre la masa tumoral durante un periodo prolongado de tiempo. Células previamente etiquetado permite la cuantificación efectiva, reproducible y confiable de la carga del tumor dentro de cada ratón. Eliminó la necesidad de inyectar de sustratos y por lo tanto reduce el estrés en los animales. Una limitación de este enfoque está representada por la incapacidad para detectar masas muy pequeñas; sin embargo, tiene mejor resolución para masas más grandes que otras técnicas. Puede ser aplicado para evaluar la eficacia de un tratamiento farmacológico o alteraciones genéticas de líneas celulares de glioma y de muestras de paciente derivado.
Introduction
El cáncer es una de las principales causas de muertes relacionadas con la enfermedad en seres humanos en el mundo industrializado. Con un altísimo número de muertos, nuevos tratamientos son urgentemente necesarios. Glioblastoma multiforme (GBM) es un tipo muy letal de cáncer de cerebro, compuesto por poblaciones heterogéneas de células stromal e inmune del tumor de cerebro. Según el registro de tumores de cerebro Central de los Estados Unidos, la incidencia de tumores cerebrales primarios malignos y no malignos es aproximadamente 22 casos por cada 100.000 personas. Se espera que aproximadamente 11.000 nuevos casos diagnosticados en los E.e.u.u. en 20171.
Estudios preclínicos investigan la probabilidad de que un medicamento, procedimiento o tratamiento sea efectiva antes de la prueba en seres humanos. Uno de los primeros pasos de laboratorio en estudios preclínicos es identificar posibles dianas moleculares para el tratamiento de drogas mediante el uso de las células cancerosas implantadas en un organismo anfitrión, definido como modelos de xenoinjerto humana. En este contexto, modelos de xenoinjerto de tumores cerebral intracraneal con xenoinjertos derivados del paciente (PDXs) han sido ampliamente utilizados para estudiar la biología del tumor de cerebro, evolución, evolución y respuesta terapéutica y más recientemente para el desarrollo de biomarcadores, la droga screening y personalizada medicina2,3,4.
Uno de lo más económico y no invasivo en vivo imágenes métodos para monitorear xenoinjertos intracraneales es bioluminiscencia imagen (BLI)5,6,7,8. Sin embargo, algunas limitaciones de BLI incluyen administración de sustrato y la disponibilidad, estabilidad de la enzima y luz apagando y dispersión durante la proyección de imagen de adquisición9. Aquí divulgamos el FMT infrarrojo como alternativa de método para monitorear modelos preclínicos de glioblastoma. En este método, adquisición de señal y cuantificación de PDXs intracranially implantados, expresan una proteína fluorescente infrarroja iRFP72010,11 (denominada en adelante como FP720) o turboFP635 (en adelante denominados como FP635), se realiza con un sistema de imagen de FMT. Usando la tecnología de la FMT, la ortotópica de tumores pueden ser monitoreado en vivo antes, durante o después del tratamiento, de una manera no invasiva, libre de sustrato y cuantitativa para las observaciones preclínicas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
El uso de animales de investigación experimental y agentes infecciosos, tales como lentivirus para transducir las células de cáncer, requiere previa aprobación por el programa de cuidado institucional de los animales y por el Comité de bioseguridad institucional. Este protocolo sigue las pautas de cuidado de los animales de la Universidad de California San Diego (UCSD).
1. etiquetado de células de Glioblastoma con FP635 o FP720 construcción
- Producir y purificar lentivirus según el protocolo descrito por Tiscornia et al. 12
- Células en cultivo aproximadamente 2.0 x 106 desde la línea de células de glioma humano con DMEM y 10% suero bovino fetal (FBS) en un plato de 15 cm; o cultura 2.0 x 106 glioblastoma humano derivados del paciente (GBM-PDX) esferas con DMEM/F12 1:1 mediano con B27 suplemento más humano factor de crecimiento epidérmico recombinante (EGF; 20 ng/mL) y FGF (10 ng/mL) en un matraz T75.
- Mantener todas las células a 37 ° C, 5% CO2y 100% de humedad relativa.
- Disociar las células.
- Para las células de glioma: Retire el sobrenadante de las placas y añadir 3-5 mL de tripsina 1 X para las células de glioma.
- Para el GBM esferas: recogen las células por pipetear las células en un tubo de 15 mL.
- Desactivación de las esferas GBM a 200 x g durante 5 minutos utilizando una centrífuga de mesa a temperatura ambiente.
- Quite el sobrenadante y agregar 3-5 mL de solución de separación celular.
- Incubar todas las células a 37 ° C durante 10-15 minutos.
- Cuidadosamente disociar las células mediante pipeteo arriba y abajo varias veces (asegurar que se lleven a las esferas y las células de glioma disociado) y a 200 x g durante 5 minutos.
- Quite el sobrenadante y resuspender las células con 5 mL de medio por pipeteo arriba y abajo varias veces. Determinar la viabilidad de las células por exclusión del azul tripán.
- Placa de 1.0 x 106 de las células de la blanco en un plato de 10 cm con 5 mL de medio por pipeteo.
- Transducir células con lentivirus expresión de proteínas fluorescentes en multiplicidad de infección (MOI) 5 como se describe por Tiscornia et al. 12 e incubar a 37 ° C.
- Después de 24 h, retire el medio de las células transduced, añadir 5 mL de medio fresco e incubar adicional 48 h a 37 ° C.
- Disociar las células infectadas en una suspensión unicelular como se describe en pasos 1.4-1.6. Desactivación de las células a 200 x g durante 5 min y resuspender en 500 μl de solución de clasificación (solución salina tamponada con fosfato (PBS) con 1% FBS).
- Pipetear la suspensión celular en tubos de FACS. Co se tiñen las células con 1 μl/mL de 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) diclorhidrato para excluir las células muertas. Controles negativos son necesarios para configurar las puertas de citómetro de flujo (células transduced no y no-transduced / tinción DAPI).
- Clasificar las células fluorescentes/DAPI positivo-negativo en clasificación de solución, según lo descrito por Basu et al. 13y recoger las células ordenadas en un tubo cónico de 15 mL.
- Girar por las células ordenadas a 200 x g durante 5 minutos, retirar el sobrenadante y resuspender en 5 mL de medio de cultivo. Las células ordenadas en un plato de 10 cm de la semilla mediante pipeteo. Incubar a 37 ° C durante al menos 48-72 h.
- Expandir las células clasificadas por disociar las células siguiendo pasos 1.4-1.6 y placas en varios platos para los experimentos en vivo .
Nota: Para más detalles sobre la clasificación de preparación y purificación de la célula, véase Basu et al. 13
2. intracraneal inyección de células de Glioblastoma iRFP etiquetadas en ratones inmunodeficientes
Nota: Antes de comenzar la cirugía, asegúrese de que el sitio quirúrgico y las herramientas estén limpios para el procedimiento. Utilice athymic inmunodeficientes (Foxn1nu) hombres o mujeres ratones desnudos, entre 4-5 semanas de edad y 17-19 g para inyección intracraneal. Animales deben ser ubicados durante al menos 3 días después de la llegada y antes de la cirugía.
- Preparación de la célula
- Cosecha y disocian fluorescentes positivo-glioma células en una suspensión unicelular (pasos 1.4-1.6) y resuspender en 0.5 o 1.0 x 106 células en 2-5 μl de PBS por inyección por animal. Pipetear la suspensión de células en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y coloque en hielo.
- Administración y preparación de la anestesia
- Preparar 200 μL de solución salina que contiene ketamina (100 mg/kg) y xilacina (10 mg/kg) por cada 20 gramos de peso corporal de ratón. Pesan los animales y calcular la dosis adecuada de anestesia.
- Proporcionar una inyección intraperitoneal de la anestesia y aplicar pomada oftálmica en los ojos para evitar la deshidratación. Para más detalles sobre este paso ver Kathleen et al. 14 colocar el animal sobre una almohadilla térmica de agua precalentada a 37 ° C.
- Compruebe que los animales son anestesiados mediante el control de la respuesta de pellizco del dedo del pie (reflejo pedal), generalmente dentro de 5-10 minutos.
- Inyección intracraneal
- 5 μl de carga jeringa Hamilton (aguja de punta Roma) con suspensión de la célula y montaje en el soporte de la sonda.
- Coloque el ratón en un marco estereotáctico animal pequeño y fijar la cabeza usando las barras de la oreja y el adaptador del incisivo tras los detalles descritos por Cetin et al. 15
- Desinfectar la cabeza con etanol y betadine solución al 70%. Asegúrese de que el sitio quirúrgico es completo estéril. Realizar una incisión media con un pequeño bisturí y separar la piel y los tejidos conectivos.
- Coloque la jeringa Hamilton en el punto de vértice con el micromanipulador.
- Mueva la sonda titular 1,0 mm anteroposterior y 2.0 mm lateral desde el punto de vértice. Marque esta posición con un lápiz.
- En este lugar, cuidadosamente haga un orificio en el cráneo con un taladro de mano de micromotor aplicando ligera presión hacia abajo hasta que los vasos sanguíneos se hacen visibles. No alterar el parénquima aracnoide de la mater y el cerebro.
- Introducir la aguja en el orificio de trépano y avance 3,0 mm debajo de la superficie pial.
- Configurar el volumen (2-5 μl) y caudal (1 μl/min) de la inyección usando un inyector estereotáxicas motorizado o manualmente realizar la inyección.
- Después de la inyección, retire la aguja poco a poco ascendiendo 1,0 mm cada 1 minuto y limpiar el sitio de la inyección con etanol al 70%.
- Cerca la piel de la herida con grapas quirúrgicas o haciendo suturas quirúrgicas (referidas a menudo como puntos de sutura) y ver Kathleen et al. 14 para más detalles.
- Recuperación de animales
- Traslado del animal a una almohadilla térmica del agua (37 ° C) y controlar la temperatura corporal, tasa de respiración y ritmo cardíaco, hasta la recuperación completa. Administrar analgesia por protocolos estándar.
Nota: Para obtener más información sobre el procedimiento stereotactic, cirugía y coordenadas, ver otros informes5,14,15.
- Traslado del animal a una almohadilla térmica del agua (37 ° C) y controlar la temperatura corporal, tasa de respiración y ritmo cardíaco, hasta la recuperación completa. Administrar analgesia por protocolos estándar.
3. la proyección de imagen FMT
Nota: Según el objetivo experimental, el glioblastoma iRFP tagged células pueden ser monitoreado en vivo antes, durante o después del tratamiento. Para propósito de la proyección de imagen, anestesiar animales usando una cámara de inducción de isoflurano, mantener en una cinta de proyección de imagen durante la exploración y la imagen en la estación de acoplamiento de lo toner de la FMT.
- Quitar el animal de la jaula y el lugar en la sala de inducción del isoflurano. Cerrar la cámara y activar el flujo de oxígeno y vaporizador para 3-5%.
- Seguimiento del animal hasta que está completamente anestesiado, generalmente dentro de 1-2 minutos inconsciente animales deben no responden a los estímulos externos.
- Retire el animal anestesiado de la cámara y poner el animal en el cartucho de proyección de imagen colocando el adaptador de cabeza primero, seguido por colocar el animal hacia abajo. Asegúrese de que la cabeza se encuentra en el centro de la cinta.
- Coloque la placa superior de la cinta en la parte superior y apriete los pomos de ajuste hasta 17 mm.
- Una vez que el animal está seguro en el cartucho de proyección de imagen, proceder a la proyección de imagen al insertar el cassette en la estación de acoplamiento interna del sensor de la FMT, de donde el isoflurano se bombea para mantener el animal anestesiado.
- Ejecutar el sensor y analizador de software haciendo doble clic en el icono del software.
- En la ventana de "Pestaña Experimental", seleccione la "Base" y "Grupo de estudio".
- Vaya a la ventana de "Ficha de análisis" y seleccione al tema a la imagen haciendo clic en "seleccionar tema". Además, seleccionar el canal de láser en el panel de "Canal de láser". Las células FP635 marcado, seleccione "láser canal 635 nm" y para las células FP720 marcado, seleccione "canal 680 nm láser".
- Adquirir una imagen haciendo clic en la opción de "Capturar" en la ventana de "Ficha de análisis". Luego, ajuste el campo de exploración haciendo clic y arrastrando el campo de exploración de la imagen capturada a un número determinado de lugares de origen, generalmente dentro de las fuentes 20-25 para el lado ipsolateral.
- Marque la opción "Agregar a cola de reconstrucción" y "Scan" del golpe en la ventana de "Ficha de análisis".
- Espere hasta que el escaneo se completa y retire el cartucho de proyección de imagen de la docking station.
- Retire la placa superior del cassette y coloque el dorso del animal en la jaula.
- Repita los pasos 3.1 3.12 para el resto de los animales.
4. Análisis de la imagen
- Desde el software del imager y analizador, seleccione la ventana de "Ficha de análisis".
- Cargar el dataset y el objeto a analizar haciendo clic en el botón "+" en el panel de "Selección de conjunto de datos" de la ventana de "Ficha de análisis".
- Una vez que la imagen se ha cargado en la ventana de "Ficha de análisis", realizar la región de análisis de interés (ROI) seleccionando el icono elipsoide, situado en la esquina superior izquierda de la ventana de "Ficha de análisis".
- Ajuste el umbral a cero en el panel de "datos de la estadística" a la derecha haga clic en la columna de "umbral" en la ventana de "Ficha de análisis".
- El valor total en el panel de "Datos de la estadística" representa la señal de las células de glioblastoma con etiquetas fluorescentes implantadas en el cerebro de ratón.
- Repita los pasos del 4.2-4.4 para el resto de los animales. Cargar o eliminar un nuevo tema haciendo clic en el "+" o "−", respectivamente, en el panel de "Selección de conjunto de datos" de la ventana de "Ficha de análisis".
Nota: Para obtener más información acerca de la proyección de imagen de FMT y operación del software, consulte20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Glioblastoma de células U87EGFRvIII (células U87 sobre-expresando la variante del receptor de EGF III) fueron cultivadas según el paso 1.2. Lentivirus fue producido y purificado según el paso 1.1. Determinó la concentración viral p24 análisis de ELISA. Las células fueron transduced con lentivirus con proteínas fluorescentes infrarrojos según paso 1.8. El plásmido FP72010,11 de la codificación fue amablemente proporcionado por Dr. V.V. Verkhusha y el vector de FP635 fue adquirido a un proveedor comercial. Las células de blanco fueron FACS ordenados para enriquecer para el top 10% fluorescente más población de la célula (figura 1A). Aumento de la señal fluorescente mejora la sensibilidad del sistema de tomografía de fluorescencia. Para validar la intensidad de las señales de marcada con fluorescencia de células antes de la implantación ortotópica, utilizamos el cassette fantasma del toner de la FMT. En concreto, U87EGFRvIII-TurboFP635 y U87EGFRvIII-iRFP720 las células fueron disociadas con tripsina y 1 x 105, 1 x 106, y 1 x 107 células se resuspendió en 100 μl de PBS frío hielo, respectivamente y se analizaron. El imager FMT permite la detección de 4 canales: 635 nm, 680 nm, 750 nm y 780 nm. Infrarrojo lejano canales 750 nm y 780 nm no son adecuados para este análisis porque no hay ninguna emisión en tales longitudes de onda desde el infrarrojo cercano proteínas fluorescentes utilizadas (datos no mostrados). Por lo tanto, se analizaron las señales de emisión a 635 nm y 680 nm. Registrados en la figura 1, el fluorescente cuantificación de imagen e intensidad para ambos FP635 de señal (figura 1B, C) y FP720 (figura 1, E), que aumenta proporcionalmente como el aumento de número de celular. De la nota, la emisión de FP635 es visible en el canal de 635 nm pero no en el canal 680 de nm. En cambio, la emisión de FP720 es visible en el canal 680 de nm pero no en el canal de 635 nm. Esto hace que estas dos proteínas fluorescentes del candidato adecuadas para estudios donde dos poblaciones de células pueden etiquetarse y supervisar simultáneamente mediante dos cerca infrarrojo etiquetas fluorescentes.
U87EGFRvIII las células etiquetadas con cerca de proteínas fluorescentes infrarrojos entonces fueron utilizados para la inyección de orthotopic y en vivo tumor crecimiento seguimiento, como se describe en los pasos 2.1-2.4. Se utilizó la misma línea celular, es decir, U87EGFRvIII, marcada con etiquetas fluorescentes diferentes, para excluir tumor crecimiento diferencia tipos de la célula de cáncer diferentes. Los ratones fueron inyectados con células U87EGFRvIII-TurboFP635, U87EGFRvIII-iRFP720 células o una combinación igual (1:1) de las dos variedades de células. Un total de 5 x 105 células en un volumen de 5 μl de PBS se inyectaron intracranealmente en 4-5 semanas viejos ratones desnudos athymic inmunocomprometidos utilizando un sistema estereotáctico y una jeringa Hamilton, siguientes pasos 2.3-2.4. La anestesia fue lograda por inyección intraperitoneal de ketamina/xilacina. Los animales fueron mantenidos calientes durante la inyección con una almohadilla térmica de agua y comprobados para detectar cualquier signo de angustia. Crecimiento y el engraftment tumor entonces fue supervisada por la FMT sistema de imagen. Durante las sesiones de exploración, los ratones fueron anestesiados temporalmente usando una cámara 3% de isoflurano (pasos 3.1 3.12). Los ratones fueron colocados en una cinta de proyección de imagen y reflejados dentro del cámara de escaneo láser. Cada ratón fue analizado usando el 635 nm y 680 nm canales. La cuantificación de la señal fue registrada en el tiempo y ratones fueron sacrificados en el inicio de los síntomas neurológicos, según los lineamientos institucionales el cuidado Animal y el Comité uso (IACUC). Como se indica en la figura 2A, señal de emisión de U87EGFRvIII-TurboFP635 fue evidente en el canal de 635 nm y señal de fondo mínima se registró en el canal 680 de nm (figuras 2B, C). En contraste, las células de U87EGFRvIII-iRFP720 emitidas en el 680 nm canal de poco fondo en el canal 635 de nm (figuras 2D–F). Finalmente, ratones inyectados con una mezcla 1:1 de células U87EGFRvIII-TurboFP635 y U87EGFRvIII-iRFP720 mostraron aumento de señal en ambos canales para la duración del experimento (figuras 2–). Estos datos demuestran que es posible utilizar proteínas fluorescentes infrarrojos dual en vivo imágenes de las poblaciones de la célula de cáncer. Los datos también indican que diferentes proteínas fluorescentes tienen una intensidad diferente en su emisión de señal. Aquí, intensidad de la señal de FP720 fue superior a FP635, con aumento de la sensibilidad en la detección de poblaciones más pequeñas de las células cancerosas en un ambiente de monitoreo no invasivo.
Los efectos de silenciamiento de genes relacionados con el cáncer de tumorigenicidad en modelos preclínicos pueden ser también estudio con este protocolo. Para este fin, GBM-esferas (GSC23 y GSC11) fueron cultivada (paso 1.2) y transduced con FP720-lentivirus (paso 1.8). Las células que expresan FP720 fueron ordenados como se describió anteriormente en los pasos 1.11-1.13 FACS. Etiquetado como FP720 células eran Co transduced con codificación de lentivirus shRNAs dirigidas a DAXX (shDaxx), o shRNA control (shLuc) en MOI 516. Las células fueron cultivadas durante 5 días, disociado en una suspensión de células individuales, y 1 x 106 células se resuspendió en 3 μl de PBS para inyección intracraneal. La eficacia de shRNAs dirigidas a DAXX fue confirmada por la reacción en cadena cuantitativa de polimerasa de transcripción inversa (RT-qPCR) en GSC23 (Figura 3A) y GSC11 (figura 3). GBM-iRFP720/shRNA células stereotactically fueron inyectadas en el cuerpo estriado de los ratones inmunodeficientes, según los pasos 2.3-2.4. Los animales fueron observados por signos neurológicos y la señal de fluorescencia relativa de los xenoinjertos fueron analizados por el sistema de proyección de imagen FMT, cuantificó usando software de análisis, según pasos 3.1-4.6. Imágenes representativas de FMT muestran una señal de disminución de la fluorescencia en ratones engrafted con shDAXX/GBM-esferas en comparación con los animales implantados con shControl (figura 3B y Figura 2D) para ambos modelos GBM-esferas, lo que confirma nuestra anterior del hallazgo16 que DAXX inhibición reprime el crecimiento del tumor en modelos preclínicos de glioblastoma.
Figura 1: curvas estándar utilizando células de fantasma y análisis FACS. (A) representante FACS histogramas de FP720 - y FP635-los U87EGFRvIII expresando las células (a la izquierda y la derecha panel, respectivamente). Las células de glioma se infectaron con lentivirus codifican proteínas fluorescentes infrarrojos y FASCES ordenan para enriquecer la expresión más alta de las proteínas FP720 o FP635. Representante imágenes obtenidas desde el software de U87EGFRvIII-TurboFP635 (B) y (D) U87EGFRvIII-iRFP720 sensor y analizador de suspensiones celulares usando el cassette de fantasma. Paneles superiores representan la señal en el 635 nm canal y abajo los paneles en el canal 680 de nm. Incremento en la celda número correspondió a un aumento en la visualización de la señal. Cuantificación de la señal de U87EGFRvIII-TurboFP635 (C) y U87EGFRvIII-iRFP720 (E) células en 635 nm y 680 nm canales. Unidades de fluorescencia relativa se indican en la barra de color. Barras de error representan SEM de 3 diferentes exploraciones por suspensión de la célula. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: modelo de xenoinjerto de tumor de cerebro con U87EGFRvIII las células escaneadas en canales diferentes. Imágenes representativas de la señal fluorescente en 635 nm y 680 canales nm de animales intracranially implantados con una combinación de mezcla (1:1) de U87EGFRvIII-iRFP720, U87EGFRvIII-turboFP635 (A) y U87EGFRvIII-iRFP720 (D): U87EGFRvIII-turboFP635 las células (G). Imágenes fueron adquiridas en el día 5 después de la primera exploración. (B, E, H) Señal de control de intensidad para cada ratón durante un período de 5 días. Cada ratón fue analizado en el 635 nm canal (barras azules) y en el canal 635 de nm (barras rojas). La más ligera sombra de la barra de color representa el día 1 de exploración y de la sombra más oscura representa el día 5. (C, F, I) Cuantificación relativa de la fluorescencia que muestra una comparación directa de la intensidad de la señal del canal 635 nm (azul) y 680 nm canal (rojo) en la cohorte completa de ratones. Unidades de fluorescencia relativa se indican en la barra de color. Los datos muestran los valores promedios con desviación estándar de 3 animales diferentes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: glioblastoma preclínica de silenciamiento del gen modelos usando FMT. Análisis de expresión génica de DAXX por RT-qPCR en GSC23 (A) y GSC11 (C) células de paciente derivadas de glioma transduced con lentivirus codifican shRNAs dirigidas a DAXX (shDaxx) o shRNA Control (shLuc) y FP720. Imágenes representativas de la señal fluorescente del canal 680 nm de orthotopically engrafted ratones implantados con GSC23-iRFP720 (B) y GSC11-iRFP720 (D) células derivadas del paciente. Señal de fluorescencia fuerte se observa en los animales implantados con shRNA Control (shLuc) (parte superior del panel) en comparación con ratones con shRNA-DAXX (shDaxx) (parte inferior del panel), lo que indica que DAXX inhibición suprime el tumor crecimiento en modelos preclínicos de glioma determinada por tomografía molecular de la fluorescencia. Unidades de fluorescencia relativa se indican en la barra de color. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Xenoinjertos tumorales se han utilizado en la investigación del cáncer y se ha desarrollado una serie de técnicas de imagen bien establecidas: BLI; resonancia magnética (MRI); tomografía de emisión de positrones (PET), computada (CT); FMT. Cada uno de estos enfoques viene con pros y contras, pero al final se complementan con el tipo de informaciones. Uno de los más utilizados en vivo tecnología de imagen es BLI5,6,7,8. BLI y FMT ambos requieren ingeniería celular (con enzimas luciferasa o proteínas fluorescentes infrarrojos) que puede afectar la expresión génica. BLI es más sensible para las masas de tumor pequeño pero requiere inyección intraperitoneal de un sustrato (luciferin), que alcanza la máxima distribución en el cuerpo en 10-12 min; pero ligero enfriamiento y dispersión durante la adquisición de imágenes, y remoción de sustrato ocurren con frecuencia9. FMT, en cambio, no requiere la administración de cualquier sustrato adicional a los animales y su señal es estable e independiente de la estabilidad de tiempo o de la enzima. Además, FMT, cuando se utiliza en las mismas condiciones experimentales, ofrece datos semi-cuantitativos reproducibles. BLI y FMT no ofrecen resolución espacial; acoplamiento sin embargo, estos métodos con direcciones de TC esta cuestión.
Una tomografía computarizada mide la atenuación de los fotones cuando la señal cruza el cuerpo de un animal y es ideal en la identificación de las estructuras corporales. Sin embargo, el contraste de tejidos blandos, que pueda interferir en la detección de un pequeño tumor intracraneal, es una limitación de este enfoque17,18. Una desventaja adicional de CT es el uso de la radiación y los medios de contraste, que puede inducir cambios moleculares en las células diana. Una TC puede combinarse con animal doméstico, que utiliza trazadores radiactivos como glucosa análogo, fluorodeoxyglucose 18F-FDG; pero esto también puede interferir con algunos procesos fisiológicos en animales pequeños. Por el contrario, FMT no necesita cualquier sustrato inyectado para medir el tumor masa y es posible medir el metabolismo del tumor, inflamación, angiogénesis, apoptosis y otros marcadores usando biomarcadores fluorescencia etiquetada19.
En general uno de técnicas la más útiles y versátiles para la proyección de imagen en vivo es la resonancia magnética. Menores limitaciones de la RM se pueden encontrar en el tiempo de adquisición bajo, menor sensibilidad que el PET y algunas variaciones relacionadas con el instrumento18,20.
Aquí, Divulgamos el método FMT como método alternativo para los modelos preclínicos de glioblastoma. El etiquetado de células diana con proteínas fluorescentes infrarrojos (figura 1A–E) y análisis tras la implantación en animales inmunocomprometidos pueden lograrse con un sistema de proyección de imagen de tomografía de fluorescencia. Informó el método de la FMT como método alternativo para los modelos preclínicos de glioblastoma. Con este método se aplica la proyección de imagen de manera no invasiva y libre de sustrato, son mantenidos los animales en un ambiente de bajo estrés y cuantificación del tejido profundo puede ser realizada (figura 2A–, Figura 3A, B). Este protocolo se puede aplicar para estudiar la eficacia de los tratamientos combinatorios en modelos preclínicos de glioma21para identificar nuevas dianas terapéuticas para tumores de cerebro16e investigar nuevas moléculas metabólicas druggable22, las vías epigenéticas23, o nuevos agentes quimioterapéuticos en combinación con radioterapia (datos no publicados) y aplicado a otros estudios preclínicos. Proponemos también aquí el uso de la FMT como un doble en vivo imágenes de enfoque, cuando dos coexisten, pero diferente, las poblaciones de la célula del tumor se pretenden analizar.
Algunas limitaciones con FMT deben tenerse en cuenta, tales como auto-fluorescencia generada a partir de algunos órganos que pueden interferir con la señal. Por ejemplo, higado y bazo murino emitan auto fluorescencia en el canal 680 de nm pero no a 635 nm. Por lo tanto, deben realizarse procedimientos experimentales FMT con estos órganos mediante otras proteínas fluorescentes infrarrojos, como FP635. Utilizamos desnudas foxn1-transformado ratones desnudos para evitar interferencias en la grabación de la señal de fluorescencia; Si se utiliza un modelo de ratón diferente, se recomienda afeitarse el área de interés de los animales. Además, este enfoque también está limitado en la detección de masas de tumor muy pequeño. En nuestra experiencia, mejora la relación señal a ruido que el tumor se convierte en masa más grande, aún antes de la aparición de cualquier síntoma neurológico en los ratones. De hecho, en experimentos anteriores realizados en PDXs orthotopically inyectado, hemos sido capaces de detectar tumores durante un régimen de drogas durante al menos 2 semanas en ratones sin ningún signo de angustia debido a tumor carga o drogas administración21. En última instancia, la agresividad de cada línea celular y el número de las células inyectadas determina la longitud de cada experimento. Los datos muestran una relación lineal proporcional entre el número de células y de señal (figura 1B–E) y tumor masa y señal (figura 2); pero una correlación de la señal general entre la masa y el número de células de tumor no se puede aplicar a través de diferentes líneas celulares y proteínas infrarrojo. La señal para cada combinación de proteína fluorescente de infrarrojos línea celular debe ser determinada empíricamente. Por otra parte, la señal obtenida del análisis de las células usando el fantasma (figura 1B, D) no se corresponde con la señal de xenoinjertos intracraneales como una atenuación en la señal se produce debido a la calavera del ratón.
El sensor y el analizador de software permiten la umbralización. Aunque no utilizamos ningún umbral aquí, animales sin cualquier células implantadas la exploración da ruido de fondo que tiende a ser eliminado por la reconstrucción en presencia de una señal verdadera. Algunos factores influyen en la intensidad de la señal del xenoinjerto y debe tenerse en consideración: cada proteína fluorescente infrarrojo tiene diferente espectro de emisión y la intensidad, con FP720 siendo una de las proteínas fluorescentes más utilizadas experimentalmente10 ,11; cada línea celular permite una cantidad abundante y, sin embargo, limitada, de la producción de proteína, influenciando así la fluorescencia máxima obtenible. Por último, el imager FMT es configuración con curvas estándar internas para compuestos específicos, por lo tanto, es importante considerar que el compuesto tiene el espectro de emisión más cercana a la infrarroja proteína fluorescente utilizada para etiquetar las células. Aunque bien tolerado, se recomienda para determinar posibles efectos citotóxicos mediados por la sobreexpresión de las proteínas infrarrojo8,9. Por otra parte, se recomienda utilizar cohortes de ratones de menos de 8 por grupo experimental, como pérdida de datos y los ratones, debido a procedimiento quirúrgico o variabilidad en el engraftment de la célula de cáncer, podría ocurrir; sin embargo, esto añade significación estadística para el estudio. También recomendamos analizar a la cohorte de animales de más de un día en serie y analizar la emisión de la señal al mismo tiempo, desde variaciones en la profundidad de cassette imagen y reconstrucción de la señal fluorescente podría interferir con la cuantificación de la señal final. Para solucionar este problema, el software analizador permite pequeños cambios en la intensidad del láser (de normal a alta y muy alta), aunque en nuestra experiencia el resultado final no es dramáticamente diferente. Una nota final en cuanto a rentabilidad es que el FMT sistema de imagen puede compartirse fácilmente como un instrumento de base entre diferentes laboratorios, que ayuda a sufragar su coste de compra y mantenimiento. En conclusión, la TMF es un recurso valioso que facilita la evaluación experimental y preclínica en vivo del crecimiento del tumor y confiable.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores declaran no hay conflictos de intereses.
Acknowledgments
Agradecemos al Dr. Frederick Lang, MD Anderson Cancer Center para GBM-PDX neuroesferas. Este trabajo fue apoyado por la derrota GBM investigación colaborativa, una filial de la sociedad nacional de cerebro Tumor (Frank Furnari), R01-NS080939 (Frank Furnari), la James S. McDonnell Foundation (Frank Furnari); Jorge Benítez fue apoyada por un premio de la Asociación Americana de Tumor cerebral (ABTA); Ciro Zanca fue parcialmente financiado por una beca de investigación postdoctoral de la Fundación de cáncer americano italiano. Frank Furnari recibe salario y apoyo adicional del Instituto Ludwig para la investigación del cáncer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/High Glucose | HyClone/GE | SH30022.1 | |
| DMEM/F12 1:1 | Gibco | 11320-082 | |
| FBS | HyClone/GE | SH30071.03 | |
| Accutase | Innovative cell technologies | AT-104 | |
| Trypsin | HyClone/GE | SH30236.01 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504044 | |
| human recombinant EGF | Stemcell Technologies | 2633 | |
| human recombinant FGF | Stemcell Technologies | 2634 | |
| DPBS | Corning | 21-031-00 | |
| FACS tubes | Falcon | 352235 | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
| Blasticidin | ThermoFisher Scientific | A1113903 | |
| p24 ELISA | Clontech | 632200 | |
| Xylazine | Akorn | NDC 59399-110-20 | |
| Ketamine | Zoetis | NADA 043-403 | Controlled substance |
| Ointment | Dechron | NDC 17033-211-38 | |
| Absorbable suture | CpMedical | VQ392 | |
| 5 ul syringe | Hamilton | 26200-U | Catalog number as sold by Sigma-Aldrich |
| Cell Sorter | Sony | SH8007 | |
| Mouse stereotaxic frame | Stoelting | 51730 | |
| Motorized stereotaxic injector | Stoelting | 53311 | |
| Micromotor hand-held drill | Foredom | K1070 | |
| Mouse warming pad | Ken Scientific Corporation | TP-22G | |
| Fluorescence Tomography System | PerkinElmer | FMT 2500 XL | |
| TrueQuant Imaging Software | Perkin Elmer | 7005319 | |
| Ultra-centrifuge Optima L-80 XP | Beckman Coulter | 392049 | |
| Tissue Culture 100mm Dishes | Olympus Plastics | 25-202 | |
| Tissue Culture 150mm Dishes | Olympus Plastics | 25-203 | |
| Tissue Culture Flasks T75 | Corning | 430720U | |
| 50 mL conical tubes | Corning | 430290 | |
| 15 mL conical tubes | Olympus Plastics | 28-101 | |
| Centrifuge Avanti J-20 | Beckman Coulter | J320XP-IM-5 | |
| Tube, Polypropylene, Thinwall, 5.0 mL | Beckman Coulter | 326819 | |
| Tube, Thinwall, Polypropylene, 38.5 mL, 25 x 89 mm | Beckman Coulter | 326823 | |
| Athymic nude mice | Charles River Laboratories | Strain Code 490 (Homozygous) | Prior approval by the Institutional Animal Care Program and by the Institutional Biosafety Committee required. |
References
- Ostrom, Q. T., et al. CBTRUS Statistical Report: Primary Brain and Other Central Nervous System Tumors Diagnosed in the United States in 2009-2013. Neuro-Oncology. 18 (suppl_5), v1-v75 (2016).
- Pauli, C., et al. Personalized In Vitro and In Vivo Cancer Models to Guide Precision Medicine. Cancer Discovery. 7 (5), 462-477 (2017).
- Stewart, E. L., et al. Clinical Utility of Patient-Derived Xenografts to Determine Biomarkers of Prognosis and Map Resistance Pathways in EGFR-Mutant Lung Adenocarcinoma. Journal of Clinical Oncology. 33 (22), 2472-2480 (2015).
- Gao, H., et al. High-throughput screening using patient-derived tumor xenografts to predict clinical trial drug response. Nat Med. 21 (11), 1318-1325 (2015).
- Ozawa, T., James, C. D. Establishing Intracranial Brain Tumor Xenografts With Subsequent Analysis of Tumor Growth and Response to Therapy using Bioluminescence Imaging. J. Vis. Exp. (41), e1986 (2010).
- Kondo, A., et al. An experimental brainstem tumor model using in vivo bioluminescence imaging in rat. Child's Nervous System. 25 (5), 527-533 (2009).
- Nyati, S., Young, G., Ross, B. D., Rehemtulla, A. ATM Kinase: Methods and Protocols. Kozlov, S. V. , Springer. New York. 97-111 (2017).
- Kondo, A., et al. Longitudinal assessment of regional directed delivery in a rodent malignant glioma model. J Neurosurg Pediatr. 4 (6), 592-598 (2009).
- Badr, C. E. Bioluminescent Imaging: Methods and Protocols. Badr, C. E. , Humana Press. 1-18 (2014).
- Shcherbakova, D. M., Verkhusha, V. V. Near-infrared fluorescent proteins for multicolor in vivo imaging. Nat Meth. 10 (8), 751-754 (2013).
- Filonov, G. S., et al. Bright and stable near-infrared fluorescent protein for in vivo imaging. Nat Biotech. 29 (8), 757-761 (2011).
- Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. Production and purification of lentiviral vectors. Nat. Protocols. 1 (1), 241-245 (2006).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). J. Vis. Exp. (41), e1546 (2010).
- Pritchett-Corning, K. R., Luo, Y., Mulder, G. B., White, W. J. Principles of rodent surgery for the new surgeon. J Vis Exp. (47), (2011).
- Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nat. Protocols. 1 (6), 3166-3173 (2007).
- Benitez, J. A., et al. PTEN regulates glioblastoma oncogenesis through chromatin-associated complexes of DAXX and histone H3.3. Nature Communications. 8, 15223 (2017).
- Kirschner, S., et al. Imaging of Orthotopic Glioblastoma Xenografts in Mice Using a Clinical CT Scanner: Comparison with Micro-CT and Histology. PLOS ONE. 11 (11), e0165994 (2016).
- Mannheim, J. G., et al. Standardization of Small Animal Imaging-Current Status and Future Prospects. Molecular Imaging and Biology. , (2017).
- Engblom, C., et al. Osteoblasts remotely supply lung tumors with cancer-promoting SiglecFhigh neutrophils. Science. 358 (6367), (2017).
- Lauber, D. T., et al. State of the art in vivo imaging techniques for laboratory animals. Laboratory Animals. 51 (5), 465-478 (2017).
- Zanca, C., et al. Glioblastoma cellular cross-talk converges on NF-κB to attenuate EGFR inhibitor sensitivity. Genes & Development. 31 (12), 1212-1227 (2017).
- Villa, G. R., et al. An LXR-Cholesterol Axis Creates a Metabolic Co-Dependency for Brain Cancers. Cancer Cell. 30 (5), 683-693 (2016).
- Liu, F., et al. EGFR Mutation Promotes Glioblastoma through Epigenome and Transcription Factor Network Remodeling. Molecular Cell. 60 (2), 307-318 (2015).
