Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Cancer Research

Floresans moleküler tomografi Glioblastoma Xenografts in Vivo içinde görüntüleme için

doi: 10.3791/57448 Published: April 26, 2018
* These authors contributed equally

Summary

Orthotopic kafa içi enjeksiyon tümör hücrelerinin Beyin tümör biyolojisi, ilerleme, evrim ve terapötik yanıt çalışmaya kanser araştırmalarında kullanılmıştır. Burada gerçek zamanlı intravital görüntüleme ve miktar tümör preklinik glioblastoma modellerinde kitle sağlayan Floresans moleküler tomografi, tümör xenografts, mevcut.

Abstract

Tumorigenicity olan bir tümör oluşturmak için yetenek kanser hücrelerinin kitle. İmmünyetmezligi fareler, subkutan kanseri hücreleri enjekte ve görünür ve elle tutulur olduktan sonra tümör kitle ölçüm hücreleri tumorigenic olup olmadığını belirlemek için yaygın olarak kullanılan bir yaklaşım olacaktır. Orthotopic enjeksiyonu kanser hücrelerinin en çok benzeyen menşe okudu tümör doku microenvironment xenograft tanıtmak amaçlanmaktadır. Beyin kanser araştırma kanser hücrelerinin tümör oluşumu ve analiz içinde beyin microenvironment benzersiz izin vermek için kafa içi enjeksiyon gerektirir. Kafa içi xenografts vivo içinde görüntüleme anında engrafted orthotopically farelerde tümör kitle izler. Burada Beyin tümör xenografts, Floresans moleküler tomografi (FMT) kullanımı raporu Kanser hücreleri ilk kızılötesi floresan proteinler ile transduced ve immün farelerin beyninde enjekte. Hayvanlar o zaman zaman uzun süre tümör kitle hakkında kantitatif bilgi edinmek için taranır. Hücre önceden etiketleme, tekrarlanabilir, uygun maliyetli ve güvenilir miktar her fare içinde tümör yükü için izin verir. Biz görüntüleme yüzeylerde enjekte için ihtiyaç ortadan kaldırılmıştır ve böylece hayvanlar üzerinde stres azalır. Bu yaklaşımın bir sınırlama çok küçük kitlelerin algılamak için yetersizlik tarafından temsil edilir; Ancak, diğer teknikleri daha büyük kitleler için daha iyi çözünürlüğe sahip. Bir uyuşturucu tedavisinin etkinliği veya genetik değişiklikler gliyom hücre satırları ve hasta elde edilen örnekler değerlendirmek için uygulanabilir.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Kanser sanayileşmiş dünya insanlarda hastalık ile ilgili ölümlerin önde gelen nedenlerinden biridir. Son derece yüksek bir ölü sayısı ile yeni tedaviler şiddetle ihtiyaç vardır. Glioblastoma multiforme (GBM) beyin kanseri, beyin tümörü, stromal ve bağışıklık hücrelerinin türdeş olmayan nüfus oluşan son derece öldürücü bir türüdür. Merkezi beyin tümörü ABD göre birincil kötü huylu ve kötü huylu olmayan beyin tümörü insidansı yaklaşık 100.000 başına 22 vaka olması. Yaklaşık 11.000 yeni vaka 20171ABD'de tanısı için bekleniyor.

Preklinik çalışmaları, uyuşturucu, yordam veya insanlarda test önce etkili olduğu için tedavi olasılığını araştırmak. Preklinik çalışmalarda erken laboratuvar adımlardan biri ilaç tedavisi için potansiyel moleküler hedef insan xenograft model olarak tanımlanan ana bilgisayar canlı, implante kanser hücrelerini kullanarak tanımlayan iş. Bu bağlamda, kafa içi Beyin tümör xenograft modelleri hasta elde edilen xenografts (PDXs) kullanarak beyin tümör biyolojisi, ilerleme, evrim ve terapötik yanıt çalışma ve son zamanlarda biyolojik gelişimi için ilaç yaygın olarak kullanılmıştır Eleme ve kişiselleştirilmiş tıp2,3,4.

Görüntüleme yöntemleri intrakranial xenografts izlemek için en uygun fiyatlı ve non-invaziv vivo içinde biridir bioluminescence görüntüleme (BLI)5,6,7,8. Ancak, bazı BLI sınırlamalar substrat yönetim ve kullanılabilirlik, enzim istikrar ve ışık Şoklama ve edinme9görüntüleme sırasında saçılma sayılabilir. Burada preklinik glioblastoma modelleri izlenecek yöntem Imaging alternatif olarak kızılötesi FMT raporu. Bu yöntem, sinyal Alım ve intracranially implant PDXs miktar, (bundan sonra FP720 adlandırılan) bir yakın kızılötesi floresan protein iRFP72010,11 ifade ya da (bundan böyle FP635 adlandırılan), turboFP635 bir FMT görüntüleme sistemi ile gerçekleştirilir. FMT teknolojisini kullanarak, tümör olabilir orthotopic vivo içinde önce sırasında veya tedaviden sonra preklinik gözlemler için non-invaziv, substrat-Alerjik ve nicel bir şekilde izlenir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Deneysel araştırma hayvanlar ve lentivirus kanser hücrelerinin transduce gibi bulaşıcı hayvan Kurulusları program tarafından ve kurumsal Biyogüvenlik Kurulu tarafından önceden onay gerektirir. Bu iletişim kuralı (UCSD) University of California San Diego hayvan bakımı kuralları izler.

1. FP635 veya FP720 yapı Glioblastoma hücrelerle etiketlerine göre

  1. Üretmek ve lentivirus Tiscornia vd tarafından açıklanan protokolüne göre arındırmak 12
  2. Kültür yaklaşık 2.0 x 106 DMEM artı % 10 fetal sığır serum (FBS) 15 cm tabak içinde insan gliyom hücre satırıyla hücrelerden; ya da kültür 2.0 x 106 insan glioblastoma hasta kaynaklı (GBM-PDX) yuvar DMEM ile/B27 ile F12 1:1 orta takviyesi plus insan rekombinant epidermal büyüme faktörü (EGF; 20 ng/mL) ve FGF (10 ng/mL) bir T75 şişesi içinde.
  3. 37 ° C, % 5 CO2ve %100 bağıl nem tüm hücreleri korumak.
  4. Hücreleri ayırmak.
    1. Tümörü hücreler için: süpernatant plakalar kaldır ve tripsin 1 X 3-5 mL gliyom hücrelere ekleme.
    2. GBM için yuvar: 15 mL tüp içine hücreleri pipetting tarafından hücreleri toplamak.
      1. Spin aşağı GBM küreler 200 x g masa üstü bir santrifüj oda sıcaklığında kullanarak 5 min için de.
      2. Süpernatant kaldırın ve 3-5 mL hücre dekolmanı çözeltisi ekleyin.
    3. 10-15 dk 37 ° C'de tüm hücreleri kuluçkaya.
  5. Hücreleri yukarı ve aşağı birkaç kez pipetting tarafından özenle ayırmak (küreler ve tümörü hücreleri tamamlandığından emin olun Disosiye) ve 5 min için 200 x g aşağı spin.
  6. Süpernatant kaldırın ve yukarı ve aşağı birkaç kez pipetting tarafından orta 5 mL hücrelerle resuspend. Hücre canlılığı trypan mavi dışlama tarafından belirler.
  7. Plaka 1.0 x 106 hedef hücre 10 cm tabak ile 5 mL pipetting tarafından orta de.
  8. Hücreleri enfeksiyon (MOI) Tiscornia vd tarafından açıklandığı gibi 5 çokluğu, floresan proteinler ifade lentivirus ile transduce 12 ve 37 ° C'de kuluçkaya
  9. 24 saat sonra orta transduced hücrelerden kaldırma, taze orta 5 mL ekleyin ve ek 48 h 37 ° C'de için kuluçkaya
  10. Enfekte hücreleri tek hücre süspansiyon adımlarda 1.4-1.6 açıklandığı içine ayırmak. Hücreleri 200 x g 5 min için de aşağı spin ve 500 µL çözüm sıralama resuspend (fosfat tamponlu tuz (PBS) % 1 FBS).
  11. Hücre süspansiyon FACS tüpler içine pipette. 1 µL/mL 4', ölü hücreleri dışlamak için 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) dihydrochloride hücrelerle birlikte leke. Negatif denetimleri Akış Sitometresi kapıları ayarlamak için gerekli (sigara transduced hücreleri ve sigara transduced hücreleri / DAPI lekeli).
  12. Floresan-pozitif/DAPI-negatif hücreleri çözüm, sıralama içine Basu vd tarafından açıklandığı gibi sıralama 13ve 15 mL konik tüp içine sıralanmış hücreleri toplamak.
  13. Spin aşağı 200 x g 5 min için de sıralanmış hücreleri, süpernatant kaldırmak ve kültür orta 5 mL resuspend. Tohum pipetting tarafından bir 10 cm çanak sıralanmış hücrelerde. En az 48-72 saat için 37 ° C'de kuluçkaya.
  14. Hücreleri dissociating tarafından sıralanmış hücreleri genişletin aşağıdaki adımları 1.4-1.6 ve içine birden çok yemekler vivo deneyler için kaplama.
    Not: hücre hazırlık ve arıtma sıralama hakkında daha fazla bilgi için bkz: Basu vd. 13

2. immünyetmezligi fareler içine iRFP öğesini Glioblastoma hücre kafa içi enjeksiyon

Not: ameliyat başlamadan önce Araçlar ve cerrahi Oda yordamı için temiz olduğundan emin olun. İmmünyetmezligi korele çıplak (Foxn1nu) erkek ya da dişi fareler, 4-5 hafta yaşlı ve kafa içi enjeksiyonlar için 17-19 g arasında kullanın. Hayvanlar en az 3 gün boyunca geldikten sonra ve ameliyattan önce yer.

  1. Hücre hazırlık
    1. Hasat ve floresan pozitif tümörü hücreleri tek hücre süspansiyon (Adım 1.4-1.6) ayırmak ve 2-5 µL PBS enjeksiyon hayvan başına ücret, 0,5 veya 1.0 x 106 hücrelerde resuspend. 1.5 mL microcentrifuge tüp ve buz üzerinde yer içine hücre süspansiyon pipette.
  2. Anestezi hazırlama ve yönetim
    1. 200 µL serum fizyolojik çözüm ketamin (100 mg/kg) ve xylazine fare vücut ağırlığının 20 gram (10 mg/kg) içeren hazır olun. Hayvanlar tartmak ve anestezi uygun doz hesaplayın.
    2. Mayi iğne anestezi sağlamak ve oftalmik merhem su kaybı önlemek için gözler için geçerlidir. Bu adım hakkında daha fazla bilgi için bkz: Kathleen vd. 14 Place bir Önceden ısıtılmış su termal yastık 37 ° C'de üzerinde hayvan
    3. Hayvanların ayak çimdik yanıt (pedal refleks), izleme tarafından genellikle 5-10 dk içinde anestezi ki kontrol edin.
  3. Kafa içi enjeksiyon
    1. 5 µL yük Hamilton şırınga (künt ucu iğne) hücre süspansiyon ve sonda tutucu bağlama ile.
    2. Fareyi bir küçük hayvan stereotaksik çerçevesine yerleştirin ve kulak Bar ve çetin vd tarafından açıklanan detayları takip kesici bağdaştırıcısı kullanarak kafa tamir 15
    3. Başından % 70 etanol ve betadine solüsyonu ile dezenfekte. Cerrahi sitesi olduğunu tamamlamak steril emin. Küçük bir neşter ile orta bir kesi gerçekleştirmek ve cilt ve bağ dokusu ayrı.
    4. Hamilton şırınga micromanipulator kullanarak bregma noktasına yerleştirin.
    5. Sonda tutucu 1.0 mm hastanın ve 2.0 mm yanal bregma noktasından hareket. Bu konumunu bir kalemle işaretlemek.
    6. Bu konumda dikkatle kan damarları görünür olana kadar aşağı doğru hafif basınç uygulayarak bir micromotor el matkapla kafatası içinde bir delik açın. Araknoid mater ve beyin parankimi bozmak değil.
    7. İğne burr deliğe tanıtmak ve pial yüzeyinin altında 3,0 mm ilerlemek.
    8. Birim (2-5 µL) ve akış hızı (1 µL/dak) motorlu stereotaksik enjektör kullanarak enjeksiyon ayarlamak veya el ile enjeksiyon gerçekleştirir.
    9. Enjeksiyon sonra iğne yavaş yavaş 1.0 mm her 1dk artan tarafından çıkarın ve % 70 etanol ile enjeksiyon yeri temizleyin.
    10. Yakın cilt cerrahi zımba ile veya cerrahi dikiş (genellikle dikiş anılacaktır) yaparak yara ve Kathleen ve ark. görmek 14 daha fazla ayrıntı için.
  4. Hayvan Kurtarma
    1. Hayvan su termal pad (37 ° C) için aktarım ve vücut ısısı, solunum hızı ve kalp hızı, tam kurtarma kadar izlemek. Analjezi başına standart iletişim kuralları yönetmek.
      Not: diğer raporları5,14,15cerrahi ve koordinatları, stereotaktik yordam hakkında daha fazla bilgi için bkz:.

3. FMT görüntüleme

Not: deneysel amacı göre iRFP öğesini glioblastoma hücreler olabilir önce sırasında veya tedaviden sonra vivo içinde izlenen. İçin amaç düşsel, hayvanlar isoflurane indüksiyon odası kullanarak anestezi, tarama ve görüntü FMT Imager yerleştirme istasyonundaki sırasında görüntüleme bir kasete koru.

  1. Kafes ve isoflurane indüksiyon odası yerde hayvan kaldırın. Odası kapatın ve oksijen akışı ve % 3-5 için Buharlaştırıcı açın.
  2. Hayvan izlemek kadar tamamen anestezi, genellikle 1-2 dk. baygın içinde hayvanlar dış uyaranlara yanıt.
  3. İmzalat hayvan odasından kaldırın ve hayvan görüntüleme kasete ilk olarak, baş adaptör yerleştirerek koymak aşağı bakacak şekilde hayvan yerleştirerek takip ettim. Baş kaset ortasına bulunduğundan emin olun.
  4. Kaset üst plaka üstüne yerleştirin ve ayar düğmeleri 17 mm kadar sıkın.
  5. Bir kez bu hayvan görüntüleme kasete güvenlidir, görüntüleme için kaset nerede isoflurane pompalanır anestezi hayvan tutmak için iç Dok FMT Imager ekleyerek devam edin.
  6. Imager ve analyzer yazılımı yazılım simgesini çift tıklatarak çalıştırın.
  7. "Deneysel sekmesi" penceresinde, "Veritabanı" ve "çalışma grubu" seçin.
  8. "Tarama sekmesini" pencereye git ve görüntü konuya "konu seçin" tıklatarak seçin. Ayrıca, "Lazer kanal" panelinde lazer kanalını seçin. FP635 etiketli hücreleri için "lazer kanal 635 nm" seçin ve "Kanal 680 nm lazer" FP720 etiketli hücreleri için seçin.
  9. Bir görüntü elde etmek "Tarama sekme" penceresinde "Yakalama" seçeneğini tıklatarak. Sonra tarama alanını tıklatıp kaynak konumları, genellikle içinde 20-25 kaynakları Ipsilateral tarafı için kararlı bir dizi için yakaladığınız görüntüyü tarama alanına sürükleyerek ayarlayın.
  10. "Yeniden yapılanma Kuyruğa Ekle" seçeneğini işaretleyin ve "Tarama" "Tarama sekmesini" penceresinde vurmak.
  11. Tarama tamamlanana kadar bekleyin ve ardından görüntüleme kaset takma biriminden çıkarma.
  12. Kaset üst plaka çıkarın ve hayvan arka kafesin içine yerleştirin.
  13. Tekrarlamak belgili tanımlık merdiven 3.1-3.12 hayvanları geri kalanı için.

4. görüntü analizi

  1. Imager ve analyzer yazılımı, "Analiz sekmesi" pencereyi seçin.
  2. Veri kümesi ve konu "Analiz sekmesi" penceresinin "Veri kümesi seçimi" panelinde "+" düğmesini tıklatarak analiz etmek için yükleyin.
  3. "Analiz sekmesi" penceresinde görüntü yüklendikten sonra "Analiz sekmesi" penceresinin sol üst köşesinde bulunan elips simgesini seçerek bölgesi faiz (ROI) analizi gerçekleştirin.
  4. Eşik "istatistik veri" panelinde yanında doğru tıkırtı "Analiz sekmesi" penceresinde "eşik" sütun sıfır olarak ayarlayın.
  5. Toplam değer "İstatistik veri" Masası'ndaki fare beyninde implante floresan öğesini glioblastoma hücrelerden sinyali temsil eder.
  6. 4.2-4.4 hayvanları geri kalanı için yineleyin. Yüklemek veya yeni bir konu kaldırmak "+" veya "−" düğmesini, sırasıyla, "Analiz sekmesi" pencere "Veri kümesi seçimi" panelinde.
    Not: FMT görüntüleme ve yazılım işlemi hakkında daha fazla bilgi için bkz:20.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Glioblastoma U87EGFRvIII hücreleri (EGF reseptör değişken III aşırı ifade U87 hücreleri) adım 1.2 göre kültürlü. Lentivirus üretilen ve adım 1.1 göre saf. Viral konsantrasyon p24 tarafından belirlendi ELISA analiz. Hücreleri adım 1.8 göre kızılötesi floresan protein taşıyan lentivirus ile transduced. FP72010,11 kodlama plazmid lütfen Dr V.V. Verkhusha tarafından sağlanan ve FP635 vektör ticari bir satıcıdan satın alınmıştır. Hedef hücrelerin üst % 10 en floresan hücre nüfus için (şekil 1A) zenginleştirmek için sıralanmış FACS vardı. Floresan sinyal artan duyarlılık Floresans tomografi sistemi geliştirir. Sinyalleri fluorescently etiketli hücre orthotopic implantasyon öncesinde yoğunluğunu doğrulamak için FMT Imager ve hayalet kaset yapardık. Özellikle, U87EGFRvIII-TurboFP635 ve U87EGFRvIII-iRFP720 hücreleri tripsin ve 1 x 105, 1 x 106, ayrışmış ve 1 x 107 hücreler buz soğuk PBS, 100 µL içinde sırasıyla resuspended ve analiz. FMT Imager 4 kanal algılamasını sağlar: 635 nm, 680 nm, 750 nm ve 780 nm. Uzak kızılötesi kanallar 750 nm ve 780 çünkü hiçbir emisyon kullanılan yakın kızılötesi floresan proteinler (veri gösterilmez) üzerinden böyle dalga boylarında, nm bu analiz için uygun değildir. Bu nedenle, analiz ettik emisyon sinyalleri, 635 nm ve 680 nm. Şekil 1' de rapor, floresan sinyal görüntü ve yoğunluğu miktar için her iki FP635 (şekil 1B, C) ve FP720 (şekil 1 d, E), hangi cep numarası arttıkça orantılı olarak artar. Not, FP635 için emisyon görülür 635 nm kanal ama 680 nm kanal içinde. Buna ek olarak, emisyon FP720 için görünür 680 nm kanal ama 635 nm kanal içinde. Bunlar iki bu yapar aday floresan proteinler nerede hücre iki popülasyonun etiketli ve aynı anda iki yakın kızılötesi floresan etiketleri kullanılarak izlenen çalışmalar için uygundur.

U87EGFRvIII hücreleri ile kızılötesi floresan protein etiketli, açıklandığı gibi 2.1-2.4 adım sonra orthotopic enjeksiyon ve in vivo tümör büyüme izleme için kullanıldı. Biz farklı floresan etiketleri ile aynı hücre çizgisi etiketlenmiş, Yani, U87EGFRvIII, tümör büyüme fark farklı kanser hücre tipleri arasında dışlamak için kullanılır. Fareler U87EGFRvIII-TurboFP635 hücreleri, U87EGFRvIII-iRFP720 hücreleri veya iki hücre satırları eşit bir kombinasyonu (1:1) ile enjekte edildi. PBS 5 µL hacmi 5 x 105 hücrelerinin toplam stereotaksik bir sistem ve bir Hamilton şırınga, aşağıdaki adımları 2.3-2.4 kullanarak eski immün korele çıplak fareler intracranially 4-5 hafta içine enjekte. Anestezi ketamin/xylazine mayi enjeksiyonu ile başarılı oldu. Hayvanlar su termal pad kullanarak enjeksiyon sıcak ve kontrol için birisi işaret-in acı. Tümör engraftment ve büyüme sonra görüntüleme sistemi FMT tarafından takip. Tarama oturumları sırasında fareler geçici olarak % 3 isoflurane Odası (Adım 3.1-3.12) kullanarak anestezi. Fareler daha sonra görüntüleme bir kasete yerleştirilir ve kamera tarama lazer içinde yansıma. Her fare 635 kullanılarak taranmıştır nm ve 680 nm kanalları. Sinyal miktar zamanla kaydedildi ve fareler nörolojik belirtiler başlangıcında kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) kurallarına göre ötenazi. Şekil 2Agösterildiği gibi U87EGFRvIII-TurboFP635 emisyon sinyal 635 nm kanalda açıktı ve minimal arka plan sinyal 680 nm kanalda (rakamlar 2B, C) kaydedildi. Aksine, U87EGFRvIII-iRFP720 hücreleri küçük arka plan 635 nm kanalda (rakamlar 2D-F) gösterilen 680 nm kanaldaki yayılan. Son olarak, U87EGFRvIII-TurboFP635 hücreleri ve U87EGFRvIII-iRFP720 hücreleri bir 1:1 karışımı ile enjekte fareler (rakamlar 2 g-ben) deneme süresi için her iki kanal yüksek sinyal gösterdi. Bu veriler kanser hücre popülasyonlarının çift vivo içinde görüntüleme için kızılötesi floresan proteinler yararlanmak mümkün olduğunu göstermektedir. Verileri Ayrıca farklı floresan proteinler farklı bir yoğunluk onların sinyal emisyon gösteriyor. Burada, FP720 sinyal şiddeti FP635 için üstün ile içinde kanser hücrelerinin daha küçük nüfus bir non-invaziv izleme ortamda hafiye duyarlılık arttı.

Gen tumorigenicity preklinik modelleri üzerinde kanserle ilgili genlerin susturmak etkileri de bu iletişim kuralı ile çalışma olabilir. Bu amaç için GBM-küreler (GSC23 ve GSC11) kültürlü (Adım 1.2) idi ve FP720-lentivirus (Adım 1.8) ile transduced. FP720 ifade hücreleri daha önce açıklanan adımları 1.11-1,13 olarak sıralanmış FACS vardı. FP720 etiketli hücreleri yönlendirmeyi sergi (shDaxx) veya shRNA denetimi (shLuc) MOI 516lentivirus-kodlama shRNA ile birlikte transduced. Hücreleri tek hücre süspansiyon ayrışmış 5 gün için kültürlü ve 1 x 106 hücre içinde PBS 3 µL kafa içi enjeksiyon için resuspended. Sergi hedefleme shRNA etkinliğini GSC23 içinde ters transkripsiyon nicel Polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR) tarafından teyit edildi (şekil 3A) ve GSC11 (şekil 3 c). GBM-iRFP720/shRNA hücre stereotactically adımları göre 2.3-2.4 immünyetmezligi fareler, striatum enjekte edildi. Hayvanlar için nörolojik belirtiler gözlenmiştir ve xenografts göreli Floresans sinyalinin adımları göre 3.1-4,6 FMT görüntüleme sistemi tarafından analiz yazılımı kullanarak sayısal, analiz. FMT temsilcisi görüntülerini farelerde shDAXX/GBM-küre ile karşılaştırıldığında shControl ile implante hayvanlar ile engrafted bir azalma Floresans sinyal göstermek (şekil 3B ve şekil 2B) onaylayan her iki GBM-küreler model için bizim sergi inhibisyon tümör büyüme preklinik glioblastoma modellerinde represses önceki bulma16 .

Figure 1
Şekil 1: phantom ve FACS analiz için hücreleri kullanarak standart eğrileri. (A) temsilcisi FACS histogramlar, FP720 - ve FP635-(sol ve sağ paneli, sırasıyla) hücreleri ifade U87EGFRvIII. Tümörü hücreleri kızılötesi floresan protein kodlama lentivirus ile enfekte ve FASC FP720 veya FP635 proteinler yüksek ifadesi için zenginleştirmek için sıralanır. Temsili resim U87EGFRvIII-TurboFP635 (B) ve U87EGFRvIII-iRFP720 (D) Imager ve analyzer yazılımı hücre süspansiyonlar hayalet kaset kullanarak elde. Üst panelleri 635 nm kanal ve alt panellerinde 680 nm kanaldaki sinyali temsil eder. Hücrede artırmak sinyal görselleştirme bir artışa denk numarası. Sinyal miktar U87EGFRvIII-TurboFP635 (C) ve U87EGFRvIII-iRFP720 (E) hücreleri içinde 635 nm ve 680 nm kanalları. Göreli Floresans birimleri renk çubuğunda gösterilir. Hata çubukları temsil 3 farklı tarama / hücre süspansiyon S.E.M.. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2: U87EGFRvIII kullanarak beyin tümör xenograft modeli hücreleri içinde taranan farklı kanalları. 635 floresan sinyal temsilcisi görüntülerini nm ve intracranially U87EGFRvIII-turboFP635(a), U87EGFRvIII-iRFP720 (D) ve (1:1) karışımı kombinasyonu U87EGFRvIII-iRFP720 ile implante hayvanlardan 680 nm kanalları: U87EGFRvIII-turboFP635 hücreleri (G). Görüntüleri ilk taramadan sonra 5 gün elde. (B, E, H) Sinyal şiddeti her fare için bir 5 gün boyunca izleme. Her fare 635 nm kanal (mavi Bar) ve 635 nm kanal (Kırmızı çubuklar) taranmıştır. Bar hafif gölge renk temsil gün 1 tarama ve en karanlık gölge / 5 gün temsil eder. (C, F, Ben) Sinyal şiddeti 635 nm kanal üzerinden doğrudan karşılaştırılması (mavi) gösterilen göreli Floresans miktar ve 680 nm kanal (kırmızı) içinde farelerin kohort tüm. Göreli Floresans birimleri renk çubuğunda gösterilir. Veriler 3 farklı hayvanlardan standart sapma ile ortalama değerleri göstermektedir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: gen içinde preklinik glioblastoma susturmak modelleri FMT kullanarak. Sergi RT-qPCR içinde GSC23 tarafından gen ifade analizi(a)ve GSC11 (C) tümörü hasta elde edilen hücre transduced ile lentivirus kodlanmış shRNAs sergi (shDaxx) veya shRNA hedefleyen kontrolü (shLuc) ve FP720. Orthotopically 680 nm kanaldan floresan sinyal temsilcisi görüntülerini GSC23-iRFP720 (B) ve GSC11-iRFP720 (D) hasta elde edilen hücreleri ile implante fareler engrafted. Güçlü Floresans sinyal gözlenen shRNA denetimi (shLuc) (panelinin üst kısmı) ile implante hayvanlarda (shDaxx) (panelin alt kısmında), shRNA-sergi ile implante fareler karşılaştırıldığında sergi inhibisyon tümör bastırır gösteren Preklinik gliyom modelleri Floresans moleküler tomografi tarafından belirlenen büyüme. Göreli Floresans birimleri renk çubuğunda gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Tümör xenografts kapsamlı kanser araştırmalarında hem de bir dizi köklü görüntüleme teknikleri geliştirilmiştir: BLI; Manyetik rezonans görüntüleme (MRG); Pozitron emisyon tomografisi (PET), bilgisayarlı tomografi (CT); FMT. Her bu yaklaşımların artıları ve eksileri ile gelir, ama sonuçta birbirini tamamlayıcı bilgiler türü ile. Görüntü teknolojisi en sık kullanılan vivo içinde biridir BLI5,6,7,8. Saçınıza ve FMT her ikisi de gen ekspresyonu etkileyen hücre mühendislik (ile luciferase enzimler veya kızılötesi floresan proteinler) gerektirir. BLI küçük tümör kitleler için daha duyarlıdır ancak 10-12 dakika içinde vücutta en fazla dağıtım ulaştığı bir substrat (biyoluminesans), mayi enjeksiyon gerektirir; Ama Şoklama ve saçılma edinme görüntüleme sırasında hafif ve substrat izni sık olarak ortaya çıkan9. FMT, bunun yerine hayvanlar için herhangi bir ek substrat yönetim gerektirmez ve onun sinyal istikrarlı ve bağımsız zaman ya da enzim istikrar. Ayrıca, aynı deneysel koşullarda kullanıldığında FMT, tekrarlanabilir yarı Nicel veri sunmaktadır. Saçınıza ve FMT Uzaysal çözünürlük sunuyor musunuz; Ancak, bu yöntemlerin CT taraması adresleriyle bu sorun kaplin.

A CT taraması fotonlar zayıflama sinyallerini bir hayvan bedeni haçlar ve vücut yapıları teşhis etmek için idealdir ölçer. Ancak, küçük bir kafa içi tümör tespiti ile etkileşebilir, yumuşak doku kontrast bu yaklaşım17,18için bir kısıtlamadır. CT ek dezavantaj bir radyasyon ve moleküler değişiklikler hedef hücrelerdeki tetikleyebilir kontrast kullanmaktır. A CT taraması glikoz analog, florodeoksiglikoz 18F-FDG gibi radiolabeled izleyicileri kullanır evde beslenen hayvan ile kombine edilebilir; Ama bu aynı zamanda küçük hayvanlarda fizyolojik bazı süreçleri engelleyebilir. Buna ek olarak, FMT tümör ölçmek için eklenen herhangi bir yüzey gerekmez kütle ve bu yeri tümör metabolizma, inflamasyon, anjiogenez, Apoptozis ve fluorescently etiketli biyolojik19kullanarak diğer işaretleri ölçmek.

Mr'ı vivo içinde görüntüleme için en yararlı ve çok yönlü teknikleri, genel olarak biridir. Mr'ı küçük sınırlamaları düşük satın alma zaman, evde beslenen hayvan daha düşük duyarlılık ve bazı varyasyonları enstrüman ile ilgili18,20içinde bulunabilir.

Burada, preklinik glioblastoma modelleri için alternatif bir yöntem olarak FMT yöntemi raporu. Hedef hücre kızılötesi floresan proteinler (şekil 1A-E) ile önceden etiketleme ve immün hayvanlarda sonrası implantasyon tarama Floresans tomografi görüntüleme sistemi ile elde edilebilir. FMT yöntemi preklinik glioblastoma modelleri için alternatif bir yöntem olarak bildirdi. Bu yöntemle görüntüleme substrat-Alerjik ve non-invaziv bir şekilde uygulanan, hayvanlar bir düşük stres ortamında tutulur ve derin doku miktar olabilir (şekil 2A-ben, şekil 3A, B) gerçekleştirilen. Bu iletişim kuralı Beyin Tümörleri16için yeni tedavi hedefleri belirlemek ve yeni druggable metabolik molekülleri22araştırmak için preklinik gliyom modelleri21, Kombinatorik tedavilerin etkinliğini incelemek için uygulanabilir, epigenetik yollar23veya radyoterapi (yayınlanmamış veri), ile birlikte yeni kemoterapötik ajanlar ve preklinik diğer çalışmalar için uygulanır. Biz de burada kullanılması teklif yaklaşım Imaging çift in vivo olarak FMT iki farklı ama ortak temeli, tümör hücre popülasyonlarının çözümlenmesi için içindir.

FMT bazı kısıtlamalarla otomatik Floresans sinyali engelleyebilir bazı organların oluşturulduğu gibi dikkate alınması gerekir. Örneğin, fare dalak ve karaciğer yayarlar auto-floresan 680 nm kanaldaki ancak 635 nm. Bu nedenle, bu organların içeren FMT ilgili deneysel yordamlar diğer kızılötesi floresan proteinler, FP635 gibi kullanılarak gerçekleştirilmelidir. Biz çıplak foxn1kullanılan-mutasyona uğramış Floresans sinyal kayıt; bir girişimi engellemek için çıplak fareler farklı fare modeli kullanılması gerekir, hayvanların ilgi alanı tıraş için önerilir. Ayrıca, bu yaklaşım aynı zamanda çok küçük tümör kitleleri saptamada sınırlıdır. Deneyim, sinyal-gürültü oranı tümör geliştirir kitle olur daha büyük, daha önce farelerde herhangi bir nörolojik semptom başlangıcı. Aslında, enjekte orthotopically PDXs üzerinde yürütülen önceki deneylerde farelerde tümör yükünü veya ilaç yönetim21nedeniyle sıkıntının herhangi bir işaret olmadan en az 2 hafta için bir ilaç rejimi sırasında tümör tespit etmek başardık. Sonuçta, her hücre kültürünü ve enjekte hücre sayısı saldırganlık her deney uzunluğunu belirler. Veri hücreleri ve sinyal (şekil 1B-E) sayısı ile tümör kitle ve sinyal (Şekil 2); arasındaki doğrusal bir orantılı ilişkileri gösteren Ama tümör kitle ve hücre sayı arasında bir genel sinyal ilişki farklı hücre satırları ve kızılötesi proteinler arasında uygulanamaz. Her hücre satırı/kızılötesi floresan protein birleşimi için sinyal ampirik olarak belirlenmelidir. Bir zayıflama sinyal içinde fare kafatası nedeniyle oluşur gibi Ayrıca, Operadaki Hayalet (şekil 1B, D) kullanarak hücreleri analizinden elde edilen sinyal için sinyal intrakranial xenografts karşılık gelmiyor.

Imager ve analyzer yazılımı eşik için izin verir. Her ne kadar biz burada herhangi bir eşik kullanımı yoktu, hayvanlar yerleştirilmiş hücreler olmadan tarama tarafından yeniden gerçek bir sinyal huzurunda ortadan eğilimi arka plan gürültü verir. Birkaç faktör xenograft sinyal yoğunluğu etkisi ve dikkat etmeniz gereken tutulmalıdır: farklı emisyon spektrum ve şiddeti, kızılötesi her floresan protein olan FP720 ile deneysel olarak kullanılan en floresan proteinler10 biri olan ,11; her hücre kültürünü bir bol henüz sınırlı, miktar protein üretimi, böylece elde edilebilecek maksimum Floresans etkileyen sağlar. Son olarak, FMT Imager kurulum belirli bileşikler için iç standart eğrileri ile bu nedenle, hangi bileşik yakın emisyon spektrum vardır dikkate almak önemlidir kızılötesi floresan protein hücreleri etiketlemek için kullanılır. İyi tolere rağmen bu potansiyel sitotoksik efekt kızılötesi proteinler8,9overexpression tarafından aracılı belirlemek için tavsiye edilir. Ayrıca, kaybetme-in veri ve fare, cerrahi müdahale veya kanser hücre engraftment değişkenlik nedeniyle oluşabilir gibi deney grubu başına en az 8 farelerin tabur kullanmanızı öneririz; Yine de, bu çalışma odasına istatistiksel anlamlılık ekler. Biz de seri olarak hayvan kohort bir günden fazla tarama ve sinyal emisyon görüntüleme kaset derinliği değişimler beri aynı zamanda analiz için tavsiye ve floresan sinyal imar son sinyalini miktar ile etkileşebilir. Bizim deneyimi nihai sonucu önemli ölçüde farklı olmasa da bu sorunu çözmek için analyzer yazılımı için küçük değişiklikler lazer yoğunluğu (gelen yüksek ve çok yüksek normal), verir. Maliyet-etkililik ile ilgili son bir not görüntüleme sistemi FMT kolayca yardımcı olan satın alma ve bakım maliyetini ödemek farklı laboratuvarlar arasında bir temel aracı olarak paylaşılabilir olduğunu. Sonuç olarak, FMT vivo içinde tümör büyüme deneysel ve preklinik değerlendirilmesi kolay ve güvenilir yapar değerli bir kaynaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar çakışma çıkarlarının bildirin.

Acknowledgments

Dr. Frederick Lang, MD Anderson Kanser Merkezi GBM-PDX neurospheres için teşekkür ederim. Bu eser yenilgi GBM araştırma işbirliği tarafından Ulusal beyin tümörü toplum (Frank Furnari), R01-NS080939 (Frank Furnari), James S. McDonnell Vakfı (Frank Furnari); bir iştiraki desteklenmiştir Jorge Benitez bir ödülü Amerikan beyin tümörü Derneği (ABTA) üzerinden tarafından desteklenen; Ciro Zanca kısmen bir Amerikan-İtalyan kanser Vakfı doktora sonrası araştırma bursu tarafından desteklenmiştir. Frank Furnari maaş ve ek destek Ludwig Enstitüsü'nden kanser araştırmaları için alır.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM/High Glucose  HyClone/GE SH30022.1
DMEM/F12 1:1  Gibco 11320-082
FBS HyClone/GE SH30071.03
Accutase Innovative cell technologies AT-104
Trypsin HyClone/GE SH30236.01
B27 supplement Gibco 17504044
human recombinant EGF  Stemcell Technologies 2633
human recombinant FGF Stemcell Technologies 2634
DPBS Corning 21-031-00
FACS tubes Falcon 352235
DAPI ThermoFisher Scientific 62248
Blasticidin ThermoFisher Scientific A1113903
p24 ELISA  Clontech 632200
Xylazine Akorn NDC 59399-110-20
Ketamine Zoetis NADA 043-403 Controlled substance
Ointment Dechron NDC 17033-211-38
Absorbable suture CpMedical VQ392
5 ul syringe Hamilton 26200-U Catalog number as sold by Sigma-Aldrich
Cell Sorter Sony SH8007
Mouse stereotaxic frame  Stoelting 51730
Motorized stereotaxic injector Stoelting 53311
Micromotor hand-held drill Foredom K1070
Mouse warming pad  Ken Scientific Corporation TP-22G
Fluorescence Tomography System  PerkinElmer FMT 2500 XL
TrueQuant Imaging Software  Perkin Elmer  7005319
Ultra-centrifuge Optima L-80 XP Beckman Coulter 392049
Tissue Culture 100mm Dishes Olympus Plastics 25-202
Tissue Culture 150mm Dishes Olympus Plastics 25-203
Tissue Culture Flasks T75 Corning 430720U
50 mL conical tubes Corning 430290
15 mL conical tubes Olympus Plastics 28-101
Centrifuge Avanti J-20 Beckman Coulter J320XP-IM-5
Tube, Polypropylene, Thinwall, 5.0 mL Beckman Coulter 326819
Tube, Thinwall, Polypropylene, 38.5 mL, 25 x 89 mm Beckman Coulter 326823
Athymic nude mice Charles River Laboratories Strain Code  490 (Homozygous) Prior approval by the Institutional Animal Care Program and by the Institutional Biosafety Committee required.   

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ostrom, Q. T., et al. CBTRUS Statistical Report: Primary Brain and Other Central Nervous System Tumors Diagnosed in the United States in 2009-2013. Neuro-Oncology. 18, (suppl_5), v1-v75 (2016).
  2. Pauli, C., et al. Personalized In Vitro and In Vivo Cancer Models to Guide Precision Medicine. Cancer Discovery. 7, (5), 462-477 (2017).
  3. Stewart, E. L., et al. Clinical Utility of Patient-Derived Xenografts to Determine Biomarkers of Prognosis and Map Resistance Pathways in EGFR-Mutant Lung Adenocarcinoma. Journal of Clinical Oncology. 33, (22), 2472-2480 (2015).
  4. Gao, H., et al. High-throughput screening using patient-derived tumor xenografts to predict clinical trial drug response. Nat Med. 21, (11), 1318-1325 (2015).
  5. Ozawa, T., James, C. D. Establishing Intracranial Brain Tumor Xenografts With Subsequent Analysis of Tumor Growth and Response to Therapy using Bioluminescence Imaging. J. Vis. Exp. (41), e1986 (2010).
  6. Kondo, A., et al. An experimental brainstem tumor model using in vivo bioluminescence imaging in rat. Child's Nervous System. 25, (5), 527-533 (2009).
  7. Nyati, S., Young, G., Ross, B. D., Rehemtulla, A. ATM Kinase: Methods and Protocols. Kozlov, S. V. Springer. New York. 97-111 (2017).
  8. Kondo, A., et al. Longitudinal assessment of regional directed delivery in a rodent malignant glioma model. J Neurosurg Pediatr. 4, (6), 592-598 (2009).
  9. Badr, C. E. Bioluminescent Imaging: Methods and Protocols. Badr, C. E. Humana Press. 1-18 (2014).
  10. Shcherbakova, D. M., Verkhusha, V. V. Near-infrared fluorescent proteins for multicolor in vivo imaging. Nat Meth. 10, (8), 751-754 (2013).
  11. Filonov, G. S., et al. Bright and stable near-infrared fluorescent protein for in vivo imaging. Nat Biotech. 29, (8), 757-761 (2011).
  12. Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. Production and purification of lentiviral vectors. Nat. Protocols. 1, (1), 241-245 (2006).
  13. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). J. Vis. Exp. (41), e1546 (2010).
  14. Pritchett-Corning, K. R., Luo, Y., Mulder, G. B., White, W. J. Principles of rodent surgery for the new surgeon. J Vis Exp. (47), (2011).
  15. Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nat. Protocols. 1, (6), 3166-3173 (2007).
  16. Benitez, J. A., et al. PTEN regulates glioblastoma oncogenesis through chromatin-associated complexes of DAXX and histone H3.3. Nature Communications. 8, 15223 (2017).
  17. Kirschner, S., et al. Imaging of Orthotopic Glioblastoma Xenografts in Mice Using a Clinical CT Scanner: Comparison with Micro-CT and Histology. PLOS ONE. 11, (11), e0165994 (2016).
  18. Mannheim, J. G., et al. Standardization of Small Animal Imaging-Current Status and Future Prospects. Molecular Imaging and Biology. (2017).
  19. Engblom, C., et al. Osteoblasts remotely supply lung tumors with cancer-promoting SiglecFhigh neutrophils. Science. 358, (6367), (2017).
  20. Lauber, D. T., et al. State of the art in vivo imaging techniques for laboratory animals. Laboratory Animals. 51, (5), 465-478 (2017).
  21. Zanca, C., et al. Glioblastoma cellular cross-talk converges on NF-κB to attenuate EGFR inhibitor sensitivity. Genes & Development. 31, (12), 1212-1227 (2017).
  22. Villa, G. R., et al. An LXR-Cholesterol Axis Creates a Metabolic Co-Dependency for Brain Cancers. Cancer Cell. 30, (5), 683-693 (2016).
  23. Liu, F., et al. EGFR Mutation Promotes Glioblastoma through Epigenome and Transcription Factor Network Remodeling. Molecular Cell. 60, (2), 307-318 (2015).
Floresans moleküler tomografi Glioblastoma Xenografts in <em>Vivo içinde</em> görüntüleme için
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Benitez, J. A., Zanca, C., Ma, J., Cavenee, W. K., Furnari, F. B. Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts. J. Vis. Exp. (134), e57448, doi:10.3791/57448 (2018).More

Benitez, J. A., Zanca, C., Ma, J., Cavenee, W. K., Furnari, F. B. Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts. J. Vis. Exp. (134), e57448, doi:10.3791/57448 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter