Summary
이 종이 다른 발달 단계에서 phenotypic 출력의 범위에 노출의 영향을 공부 하 고의 목표를 가진 오염 물질을 속 초파리 에서 종 노출 및 이상 한 세대에 대 한 상세한 프로토콜을 제공 합니다.
Abstract
응급 속성 및 외부 요인 (인구 수준 및 생태계 수준에서에서 상호 작용, 특히) 하지만 그들은 거의 독성 연구에서 고려 생태학적으로 중요 한 끝점, 중재에 중요 한 역할을 재생 합니다. D. melanogaster 이용과, 몇 가지 이름을 행동, 신경, 그리고 유전자에 미치는 영향에 대 한 독성 모델로 떠오르고 있다. 더 중요 한 것은, 속 초파리 에서 응급 속성 및 독성 연구에서 생태학적으로 관련 질문에 응답 하는 통합 프레임 워크 접근을 위한 모델 시스템으로 활용할 수 있습니다. 이 종이의 목적은 phenotypic 출력 및 생태 관련 질문의 범위에 대 한 모델 시스템으로 사용 될 오염 물질을 속 초파리 에서 노출에 대 한 프로토콜을 제공 하는 것입니다. 좀 더 구체적으로,이 프로토콜은 1로 사용할 수 있습니다) 여러 생물학 조직의 수준 연결 및 두 개인 및 인구 수준 피트 니스;에 유독의 영향을 이해 2) 테스트 이용과 발달 노출;의 여러 단계에서의 영향 3) 테스트 대가족제 및 진화 의미 오염 물질; 그리고 4) 동시에 여러 오염 물질과 스트레스 테스트.
Introduction
매년, 약 1000 새로운 화학 물질 화학 산업1,2;에 의해 소개 된다 그러나, 이러한 화학 물질의 단지 작은 비율의 환경에 미치는 영향 유통2,3전에 테스트 됩니다. 대규모 재해는 일반적인, 오염 물질의 큰 다양 한 sublethal 및 만성 노출은 둘 다 인간과 야생 동물4,5에서 광범위 한. Ecotoxicology 및 환경 독물학의 역사적인 초점 생존6, 에 오염 물질의 영향을 측정 하는 수단으로 치 사 율, 단일 화학 노출, 급성 노출과 노출의 생리 적 효과 테스트 하는 것 이었다 7 , 8 , 9 , 10. 역할 때문에 현재 접근 제한 동물 실험을 윤리적이 고 비-침략 적 접근으로 변화 하지만, 그 개발, 응급 속성 및 외부 요인 (인구 수준 등을 생태계 수준의 상호 작용) 생태학적으로 중요 한 끝점8중재에 재생 합니다. 따라서, 야생 동물 및 실험실에서 척추 동물을 희생 하지 않고 좀 더 전체적인 접근 방식을 통합 하는 방법에 대 한 필요가 있다.
무척 추 동물 모델 시스템, 초파리 melanogaster, 독성 시험에 대 한 좀 더 전체적인 접근에 대 한 필요를 해결 하는 매력적인 대안입니다. D. melanogaster, 전 세기에 대 한 인간 관련 유전자 연구에 대 한 무척 추 동물 모델 시스템으로 원래 개발 되었다11. D. melanogaster 지금 눈에 띄게는 척추 모델 대신 여러 가지 이유로: 1) 유전자와 D. melanogaster 그리고 인간; 사이 통로의 보존 2) 짧은 생성 시간; 척추 모델에 비해 3) 저렴 한 비용, 유지 보수; 4) 큰 샘플 크기; 생성 완화 그리고 5) phenotypic 및 생태학-관련 끝점11,12,13,,1415,16,17 테스트 하기 위해 사용할 수의 과다 .
여러 실험실11,15,16,17,18,19,20,,2122, 23 , 24 , 25 지금 사용 하는 D. melanogaster 척추 모델 대신 독성 테스트에 대 한 오염 인 간에 미치는 영향을 이해 하. 지역 야생 종의 초파리 이용 될 수 있다, 뿐만 아니라, 야생 동물 및 인간 생태학 대답에 대 한 독성 모델-, 행동-, 그리고 조직의 여러 생물 학적 수준에서 진화론 관련 질문. 모델 초파리 속 안에 종을 사용 하 여, 여러 측정 끝점은 가능한11,15,,1618,19,20 ,,2122,23,,2425. In addition, 초파리 모델을 사용 하 여, 독물학 수: 1) 윤리적 조직;의 여러 생물 학적 수준에서 효과 링크 2) 통합 응급 요소와 개발의 역할 연구 3) 생태학적으로 중요 한 끝점 (뿐만 아니라 의학적으로 중요 한 끝점); 4) 동시에; 여러 스트레스 테스트 5) 및 장기 테스트 대가족제 (예: 진화 및 transgenerational) 스트레스의 의미. 따라서, 초파리 모델 시스템으로 사용 하 여 다양을 한 접근, 공부 하는 실험실에 D. melanogaster 의 타고 난된 긴장으로 기계적 접근에 국한 되지 않을 수 있습니다.
이 종이에 우리는 양육 하 고 다양 한 독성에 관한 질문에 대답을 초파리 를 수집 하기 위한 방법을 제시. 좀 더 구체적으로, 우리는 1에 대 한 방법론을 설명) 하나 이상의 오염 물질; 엮 여 매체에 초파리 를 양육 2) 개발 (예: 제 3 탈피 애벌레, 번데기의 경우, 새로 eclosed 성인 그리고 성숙한 어른 방황); 전체 초파리 수집 그리고 3) 장기 toxicant 노출의 진화 의미 뿐만 아니라 테스트 세대간 및 transgenerational 전송, 오염된 매체에 초파리 를 양육. 이 프로토콜, 이전 작가18,19,20,,2122,23,24를 사용 하 여,25 보고 발달의 다른 생리 적, 유전적, 그리고 행동 효과 지도 (Pb2 +) 노출. 이 프로토콜 독물학을 어떻게 오염 물질이 모두 인간 고도 점점 더 오염 된 환경에서 야생 동물에 대 한 위험 요소를 이해 하는 데 필수적 이다 전체 론 독물학 방법을 사용 수 있습니다.
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Protocol
다음 프로토콜은 독 소의 구강 섭취가 적절 한; 때 오염된 매체에 초파리 속에서 후방에 사용 되는 실험 프로토콜 노출의 다른 형태는 초파리 모델11,15,,1626를 사용 하 여 가능 합니다. 이 프로토콜에서 설명 하는 방법 이전 허쉬 외. 으로 설명 되었습니다. 19 와 피터슨 외. 23 , 24 , 25.
1. 연구 실험실에서 초파리 의 주식 인구를 설정
- 일정 온도, 빛: 다크 사이클 및 테스트 종의 환경 설정에 따라 습도 부 화기를 설정 하 여 초파리 의 집 주식 인구는 환경 제어 인큐베이터 (또는 작은 방)을 설정 합니다.
참고: 기본 환경 조건 연구에 대 한 선택한 종족의 기본 생태에 따라 달라 집니다. 예를 들어 D. melanogaster 이남의 아프리카27 기본 이며 25 ° C, 12시 12분 빛: 다크 사이클, 그리고 약 60% 습도16,18,,1920 에서 일반적으로 유지 관리 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 28 , 29 , 30. 디 몬타나 범위 대부분의 캐나다 및 midwest 미국, 많은 추운 지역에 걸쳐 확장 하는 다른 한편으로, 따라서, 디 몬타나 19-20 ° C 그리고 때로는 24 시간 빛 정권 짝짓기 시즌31동안 조건을 시뮬레이션에서 일반적으로 유지 됩니다. 초파리의 다양 한 수 종의 지리적인 범위의 자세한 설명에 대 한 초파리 Speciation 패턴 웹사이트32를 참조 하십시오. -
어느 주식 센터에서 선호 초파리 종 또는 타고 난된 라인을 얻기 (재료의 표 참조), 요청, 또는 수집 야생 현장에서 유전자 변수 인구에 따라 다른 연구소.
참고: 다음 단계는 연구 실험실에서 유지 하기 위해 초파리 의 유전자 변수, 인구를 수집 하는 방법을 설명 합니다. 이러한 방법은 한 미끼 소스와 대상 특정 종 보다 다양 한 종족을 한 번에 수집 하 Markow 고 O'Grady33 와 베르너와 Jaenike34 에서 수정 되었습니다.- 대여섯 익은 바나나는 냉장고에 하룻밤 동결 하 고 미끼 트랩을 설정 하기 전에 서 리 없애다.
- 파리 미끼 병에 탈출 하지 캡처할 수 있도록 병 앞 u 자 모양의 슬릿을 절단 하 여 여러 1-2 L 플라스틱 병을 준비 합니다. 파리는 뚜껑을 통해 이스케이프 하지 않습니다 그래서 그들의 병 뚜껑을 가진 플라스틱 병 모자.
- 추가 defrosted 바나나 병의 바닥에 약 1 인치 바나나의 병의 하단에 포함 되어 있습니다. 병에 잘 익은 토마토 슬라이스를 놓습니다. 있도록 바나나 효 모 슬러리에 흡수 되 면 병의 바닥에 바나나를 효 모 슬러리 (맥주 만드는 과정에서 남은 효 모)를 추가 합니다.
- 그래서 파리는 효 모 슬러리와 바나나에 걸어 깨끗 한 기판 병 (수직 수직 위치)에 나무 막대기를 추가 합니다.
그림 1 에서는 이러한 방법의 최종 제품을 보여 줍니다. - 잠시 미끼 나무에서 밤새 병과 24 h. 입 aspirate 모든 병 날아 확인 그리고 개별적으로 iso 여성 라인을 만드는 매체와 튜브에 여성을 배치.
그러나 참고: 다중 여성 라인 만들 수 있습니다,, 경우에 각 종족의 암컷을 명확 하 게 확인 될 수 있다. 또한, 파리 속 초파리 내 다른 생태 틈새를 점유 하 고 그 틈새 (베르너와 Jaenike34);에 따라 다른 식이 요구 해야한다 다이어트 권장 사항 및 음식 요리법 베르너와 Jaenike34 을 참조 하십시오. - 수집 된 초파리 의 종 식별 해 부 현미경 아래 성인 F1 자식 검사 (Markow 및 O'Grady33 및 다양 한 수 종 식별에 베르너와 Jaenike34 참조 ).
그림 1 : 트랩 및 미끼 필드에 초파리 의 강포한 인구를 수집 하는 데 사용의 그림 표현. (A) 플라이 트랩 콜로라도에 로컬 필드 사이트에서 설정 합니다. (B)는 파리의 가까이 보기가 필드 사이트 설정 트랩. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
- Iso-여성 또는 보육 환경 제어 또는 일정 한 온도 빛: 다크 사이클, 습도에 다 여성 라인을 유지 합니다. 이렇게 하려면 집 튜브에서 파리 또는 병에 매체 그리고 매체에 계란을 낳 기 위해 벗 여성을 허용. 애벌레와 번데기의 존재에 대 한 튜브를 모니터링 합니다.
참고: 파리 속 초파리 내 다른 생태 틈새를 점유 하 고 다른 식이 요구 사항 및 그 틈새33,34에 따라 환경 비 생물 적인 환경 설정을 해야한다. 환경 및 식이 권장 (환경과 비행 축산에 대 한 추가 지침) 과천시와 밀러28에서 찾을 수 있습니다 섀 퍼 외. 29, stocker 및 용감한30, Markow 및 O'Grady33, 그리고 베르너와 Jaenike34. 야생 종에 사용 하 여, 종 확인 될 수 있다 때까지 로컬 환경 조건은 인큐베이터에서 시뮬레이션할 수 있습니다. - 신선한 매체 주식을 자주 전송, 건강 한 라인을 유지 하 고 진드기에서 감염을 방지 하 오래 된 튜브를 삭제.
참고: 전송의 주파수는 종의 라이프 사이클에 따라 달라 집니다. 예를 들어 전송 초파리 melanogaster 2 주마다 신선한 매체. 실험실에서 라인을 유지에 관한 자세한 내용은 랜드 외를 참조 하십시오. 16, 과천시와 밀러28, 섀 퍼 외. 29, stocker 및 용감한30, 그린스펀35및 과학 교육 데이터베이스36.
2. 후면 초파리 오염된 매체에
참고: 처음 또는 새로운 contaminant(s)와 초파리 실험실에서 테스트를 하는 경우 식별 치명적인 복용량 (참조 Castaneda 외. 37 그리고 Massie 외. 방법에 대 한 38 )와 LD50 (Castaneda 외를 참조 하십시오. 37 Akins 외. 방법에 대 한 39 ) 첫 번째. 그런 다음 원하는 phenotypic 출력;에 대 한 생물학 관련 농도 식별 하는 복용량 응답 곡선을 실행 허쉬 외를 참조 하십시오. 19 와 저 우 외. 40 방법에 대 한입니다.
- 오염 물질의 화학에 따라 원하는 concentration(s)에서 오염 된 매체의 재고 솔루션을 준비 합니다.
참고: 예: PbAc의 재고 솔루션을 준비: 오염 물에 도달 원하는 농도 매체까지 증류수 (dH20)를 오염 물질을 추가 하 여 납 아세테이트 (PbAc) 매체의 재고 솔루션을 준비. 예를 들어 1000 µ M의 재고 솔루션 PbAc, 준비 될 수 있다 1000 µ M에 도달할 때까지 PbAc dH20을 추가 하 여 PbAc. 또한, 원하는 농도를 재고 솔루션 (예: 는 1000 µ M PbAc 솔루션)를 희석 (500 µ M 같은 PbAc) 재고 또한 이러한 솔루션을 유지 하 고. - 매체, 제어 매체 역할을 다음 제조 업체의 지침을 준비 합니다. 추가 매체, 다음 제조 업체의 지침; 준비 그러나, 보충 dH20 오염 솔루션을 준비.
참고: 예를 들어 인스턴트 초파리 매체를 사용 하는 경우 추가 약 1 작은 술 인스턴트 중간 플라스틱 병을. 매체를 약 5-5.5 mL dH20을 추가 합니다. 라이브 베이커의 효 모 제어 매체 준비의 몇 알갱이 뿌려. 실험적인 매체를 준비 하려면 재고 솔루션을 보완 (500 µ M 같은 PbAc) dH20. -
컨트롤 및 실험 매체에 전송 주식 인구에서 재생산으로 가능한 성숙한 남성과 여성.
참고: 생식 성숙 시간 후 일수로 초파리 종41사이 다르다.- 부드럽게 지배적인 손으로 아래로 재고 파리의 유리병을 누릅니다. 파리 자동으로 유리병의 하단으로 이동 확인 하십시오. 다른 한편으로는, 유리병을 도청 하는 동안 유리병의 뚜껑을 제거 하 고 컨트롤 또는 오염 된 매체의 신선한 유리병 파리와 유리병 위에 배치. 튜브를 함께 누른 뒤집어 그들, 부드럽게 도청, 파리 제어 또는 오염 된 매체의 신선한 유리병에 자동으로 전송 되도록 합니다. 아직도 파리와 유리병 도청, 하는 동안 유리병을 모자.
- 표준화 각 유리병에 파리의 수를 확인 하 고 더 많은 튜브와 반복.
참고: 성인의 총 수 이전을 통해 전송 또는 마 취과 밀을 방지 하는 데 사용 하는 튜브의 크기에 따라 달라 집니다. - 표준 환경 조건 (즉, 인큐베이터)에 성인을 품 어 고 성인 친구 및 24-96 h에 대 한 매체에 알 수 있습니다.
- 성인 자료실 (미네랄 오일으로 가득 하 고 꽉 끼는 깔때기와 플라스 크)에서 삭제 후 24-96 h, 계란 (실험 과목 나중 될) 테스트를 위한 성숙 수정 된 뒤에 남겨두고. 개발을 알 수 있도록 인큐베이터에 튜브를 놓습니다.
- 매체에서 나오는 애벌레를 찾아 방황 탈피 애벌레에 대 한 튜브를 모니터링 합니다.
3. 다양 한 발달 단계에 실험 과목을 수집 합니다.
참고: 실험 과목 어떤 발달 단계, 맹인 코딩된 15 mL 원뿔 튜브에 배치 하 고 축적에 대 한 테스트에서 수집 된 수. 있습니다 오염 물질의 축적을 테스트 하기 위한 방법을 공부 되 고 오염 물질에 따라 달라 집니다. 예를 들어 PbAc의 축적 Inductively-Coupled 플라즈마 질량 분석 (ICP-MS)42를 사용 하 여 테스트할 수 있습니다. 또한, 실험 과목 다양 한 오염 물질의 phenotypic 효과 대 한 테스트할 모든 발달 단계에서 수집 된 수 있습니다. 그림 2 43 초파리 수명 주기 보여 줍니다. 그림 3 에 노출에 대 한 실험 프로토콜 컬렉션에 대 한 서로 다른 발달 단계에서는 보여 줍니다.
그림 2 : D. melanogaster (가장 일반적으로 사용 되 초파리 모델 시스템)의 라이프 사이클에 대 한 개념적인 개요. Drosophila 라이프 사이클의 단계는: 1) 계란, 2) 첫 번째 탈피 유 충, 유 충 3) 2 차 탈피, 5) 방황 유 충 탈피 3, 4) 제 3-탈피 유 충 6) 동박새과 번데기, 7) 적목 번데기, 8) 새로-eclosed 성인, 및 9) 성숙한 성인. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 구두로 보호자 (F0) 후속 세대에 오염된 매체에 초파리 를 노출 하는 방법에 대 한 개념적인 개요 (F1 과 이후). 구두 노출 노출 세대에서 개발 중 (A) 방법. (B) 자손 (F1 을 원하는 세대)에 게 오염 물질의 전송 테스트 방법. 이 그림에서 피터슨 외 수정 되었습니다. 24 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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방황-3 탈피 애벌레를 수집
- 조명 설정, 인큐베이터에서 애벌레 매체에서 등장 하 고 후에 빛 인큐베이터에는 h에서 유리병 측면 위쪽으로 이동 때 튜브를 모니터링 시작 합니다. 이 h 내에서 신중 하 게 나무로 되는 지팡이 또는 핀셋을 사용 하 여 유리병의 측면에서 방황 3 탈피 애벌레를 제거 합니다.
참고: 컬렉션에 사용할 수 있는 애벌레의 수 "2.3.4"에 누워 계란의 수에 따라 달라 집니다. - 애벌레에서 초과 매체를 제거 하려면 dH2오 부 어 dH2O 비 커에서 작은 비 커에 애벌레를 배치 하 고 섬세 한 작업와이 퍼에 애벌레를 놓습니다. 애벌레에서 초과 dH2O를 제거 부드럽게 섬세 한 작업와이 퍼를 사용 하 여.
- 환경 제어 인큐베이터에서 실험적인 인구를 유지 합니다.
- 조명 설정, 인큐베이터에서 애벌레 매체에서 등장 하 고 후에 빛 인큐베이터에는 h에서 유리병 측면 위쪽으로 이동 때 튜브를 모니터링 시작 합니다. 이 h 내에서 신중 하 게 나무로 되는 지팡이 또는 핀셋을 사용 하 여 유리병의 측면에서 방황 3 탈피 애벌레를 제거 합니다.
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새로-eclosed 성인 수집
- 튜브의 측면을 따라 pupae의 채색을 관찰 하 여 일수로 대 한 튜브를 모니터링 합니다.
참고: 개발 중 Pupae 어두워질 것 이다. 개발 시간, 특히 사전 일수로 테스트 종류에 따라 달라 집니다. - 첫 번째 성인 eclose에 시작, 덤프 하 고 광 유를 포함 하는 영안실으로 이러한 성인을 삭제.
- 빛을 켤 때 인큐베이터에 다음 아침, 덤프 하 고 삭제할 수 있는 eclosed 하룻밤 또는 morningbefore 빛 중에 알 수 없는 나이 (또는 순 결)의 어른.
- 약 4 시간 후, 새로 eclosed 성인 튜브에 CO2 총으로 등장 하는 어른 anesthetize. 해 부 현미경 공동2 접시에 성인을 놓습니다. 섹스 성인 남성과 여성에서 ovipositors의 앞 발에 섹스 빗에 대 한 보고.
참고: D. melanogaster 의 짝짓기 피하려고 일수로 6 h 이내를 수집 해야 합니다 하지만 다른 종 이상 개발 시간을 있을 수 있습니다 (그리고 따라서,이 기간 내 수집 필요 하지 않습니다). - 나무 막대기를 사용 하 여 CO2 접시에 별도 성인. 부드럽게 성인 섹스 관련 그룹 중간 일치 기존의 역사에 나무 막대기를 사용 하 여 전송 합니다.
- 튜브의 측면을 따라 pupae의 채색을 관찰 하 여 일수로 대 한 튜브를 모니터링 합니다.
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성숙한 어른 후 일수로 수집
- 성인 환경 제어 인큐베이터에서 원하는 나이 사후 일수로 하 계란 단계에서 중간 일치 사전 일수로 노출에 남아 있을 수 있습니다.
- 성인 성인 그들의 시체에서 초과 오염된 매체를 손질 하는 것을 허용 하도록 테스트 전에 24 h에 대 한 제어 매체 단독으로 전송.
4. 후면 대가족제의 효과 또는 Transgenerational 노출 테스트 실험 과목.
- 후면 부모의 세대 (일명 P0 또는 F0 세대), 전송 성인 주식 인구 제어 및 실험 매체 "2.1" 단계에서 "2.3"와 "3.3" "3.1".
- 어른은 재생산으로 성숙 (Pitnick 외를 참조 하십시오. 41), 단독 제어 또는 실험 매체의 신선한 유리병에 남성의 전송 (2.3.1에와 명시) 한 유리병. 단독 지금 남성을 포함 하는 신선한 유리병에 여성의 한 유리병을 전송 합니다. 24-96 h. 덤프에 대 한 친구와 누워 계란 성인 매체에서 허용 광 유를 포함 하는 영안실에 성인을 삭제 하 고 다시 개발 하는 자손 수 있도록 튜브를 품 어.
- 4.1 원하는 세대 수에 따라 4.2 통해 단계를 반복 합니다.
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Representative Results
구두 노출 함으로써 초파리 개발을 통해 contaminant(s)에, 다양 한 독성에 관한 질문은 생물 학적 조직의 서로 다른 수준에서 초파리 를 노출 하 여 테스트할 수 있습니다. 이 섹션에서는 이전에 게시 논문23,24에서이 프로토콜을 사용 하 여 얻은 대표적인 결과 합니다. 특히,이 프로토콜은 이전 축적, 제거 및 노출의 같은 세대 자손23; 1 세대에 걸쳐 내 납 (Pb)의 격리 사용 그리고 메이 트 선택24에 축적의 의미를 공부 합니다.
표 1 과 그림 4 축적과 F0 F1 세대에서 Pb의 제거를 확인 하기 위해이 프로토콜을 사용 하 여 얻은 대표적인 결과 보여줍니다.
표 1 세대 내에서 노출 하는 경우 Pb의 축적을 나타내는 대표적인 결과 보여줍니다 (다양 한 복용량에서: 0, 10, 40, 50, 75, 100, 250, 및 500 µ M PbAc) (제 3-탈피 애벌레, 방황 하는 여러 개발 단계에서 테스트 샘플에 번데기의 경우, 새로 eclosed 성인 그리고 성숙한 여성 및 남성) 피터슨 외에. 23 샘플 다양 한 발달 단계,-20 ° C에서 냉동, 질소 산 및 과산화 수소 처리 및 Pb ICP MS23,42를 사용 하 여에 대 한 테스트에서 수집 되었습니다.
| 복용량 (PbAc µ M) | 유 충 | 번데기의 경우 | 새로-Eclosed 성인 | 성숙한 성인 여성 | 성숙한 성인 남성 |
| 0 | 0.009 ± 0.001 | 0.099 ± 0.02 | 0.04 ± 0.005 | 0.069 ± 0.031 | 0.0015 ± 0.003 |
| 10 | 0.42 ± 0.025 | 0.46 ± 0.03 | 0.12 ± 0.009 | 0.12 ± 0.012 | 0.056 ± 0.008 |
| 40 | 7.5 ± 0.67 | ||||
| 50 | 5.2 ± 0.71 | 2.77 ± 0.30 | 1.11 ± 0.14 | ||
| 75 | 14 ± 1.06 | ||||
| 100 | 12 ± 0.95 | 4.7 ± 0.38 | 3.36 ± 0.58 | 1.20 ± 0.63 | 1.24 ± 0.46 |
| 250 | 89 ± 8.49 | 25.06 ± 4.72 | 5.46 ± 0.75 | ||
| 500 | 271 ± 41.01 | 334.30 ± 39.43 | 8.44 ± 0.84 | 46.50 ± 14.72 | 14.43 ± 1.83 |
표 1: Pb 부하 (ng/개인)에서 테스트를 의미 D. melanogaster 계란 단계 단계 테스트에서 Pb에 경구 노출 후 개발 중. 표시 하는 의미의 의미 (ng/비행) ± 표준 오차 (n 8 유 충, n = 3 제어 reared 성인, n = = Pb reared 성인 3 명). 야생 타입 D. melanogaster 제어에 reared 했다 또는 매체를 리드 (0, 10, 40, 50, 75, 100, 250 또는 500 µ M PbAc) 계란 단계 개발의 다양 한 단계에서에서. 샘플 수집 되었고 Pb 축적 ICP 양42 피터슨 외에서 수정 된이 테이블을 사용 하 여에 대 한 테스트. 23
그림 4(F0) 부모의 세대 제어 매체, 성관계, 성인 기에 계란 단계에서 Pb에 노출 되었다 그리고 자손 (F1) 1 세대 성인24까지 제어 매체에 reared 했다. Pb 축적과 제거를 감지 하는 방법 피터슨 외에 유사 했다. 23.이 실험에서 결과 부모의 노출 성인 자손24의 1 세대에 전송 되지 않습니다 나타냅니다. 따라서,이 프로토콜을 사용 하 여, F0 노출의 transgenerational 효과 뿐 아니라 다양 한 진화 스케일 적응 응답 테스트 가능 하다. 비슷한 결과 피터슨 외에서 발견 됐다. 23
그림 4: Pb 축적 D. melanogaster (A) 부모 (F0) 및 (B) unexposed 자손 (F1). (A) 와 (B) 막대 표시 의미 (ng/성인) ±SEM. (A)에 바 위에 표시 된 샘플 크기와 (B). p = < 0.001. (A) F0 성인 구두 250 µ M에 노출 됐다 PbAc Pb 축적 ICP 양42(B)를 사용 하 여에 대 한 검사 (후 24 h depuration) 나이 5 후 일수로 하 고 수집 나 두 일 후 일수로 하 계란 무대에서이 프로토콜을 사용 하 여 F0 성인 치료 제어 매체에서 내에서 성관계를 했다. 노출 되지 않은 F1 자손 (이 프로토콜을 사용 하 여) 성인 기에 그 단계에서 제어 매체에 reared 되었고 Pb 축적 ICP-MS를 사용 하 여에 대 한 테스트. 시내 (B): 부모와 함께 "CF + CM"= F1 성인 reared 제어 매체, "CF + PbM" 유연된 매체, "PbF + CM"에 양육 하는 아버지와 함께 F1 성인 = 유연된 매체, "PbF + PbM"에 양육 하는 어머니와 함께 F1 성인 = = F1 부모와 성인 유연된 매체에 기르는. 이 그림에서 피터슨 외 수정 되었습니다. 24 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
표 1 과 그림 4 에서 제시 하는 결과 초파리 는 쉽게 다른 복용량, 발달 단계, 그리고이 프로토콜을 사용 하 여 진화 비늘에 Pb를 축적 나타냅니다. 따라서,이 D. melanogaster 구두 오염 물질에 노출에서 프로토콜의 효율성을 나타냅니다.
그림 5에서 여기에 설명 된 프로토콜 피터슨 외 여러분 에 의해 사용 되었다 24 친구 취향에 발달 Pb 노출의 효과 테스트 하. 실험 과목 제어에 성인 기에 그 무대에서 reared 했다 또는 성인 기에 그 단계에서 중간 납을 첨가 하 고 depuration의 24 시간 후 친구 취향에 대 한 테스트. 피터슨 외. 24 Pb 노출 남성 컨트롤이 나 Pb 노출 남성 옵션을 제공 하는 경우에 우선적으로 Pb 노출 여성 성관계는 발견. 이러한 결과 phenotypic 출력 검사 프로토콜의 구현에 대 한 대표적인 예입니다.
그림 5: 남성 및 여성 250 µ M에 노출에 메이 트 선호 PbAc 계란에서 성인 기에 무대. (A)에 바 (B), 그리고 (C) 평균 (%) (60 분)에 성공 ± SEM. 짝짓기 쇼 * * * = p < 0.001. * p = < 0.05. (A), (B), 및 (C) 실험 과목 컨트롤에 노출 된 또는 매체를 리드 (250 µ M PbAc) 계란 성인 성숙 단계에서 친구 선택에 차이 대 한 테스트. 어느 컨트롤 또는 Pb reared 남성 (즉 2 선택 테스트) (A) 여성 특혜. 샘플 크기 했다: N = 126 제어 reared 여성 및 137 Pb reared 여성. (B) 제어 및 Pb reared 여성 (즉 2 선택 테스트)에 대 한 남성 특혜. 샘플 크기 했다: N = 59 제어 reared 남성 및 N = 64 Pb reared 남성. (C) 친구 둘 다 남성과 여성 단독으로 어느 노출 (예: 아니오 선택 테스트)의 한 파트너와 함께 결합 하는 경우에 기본 설정. 시내 (C): "CF + CM" 제어 reared 여성 대응 한 제어 reared 남자 하나 = (N = 85 쌍), "CF + PbM" 제어 reared 여성 한 Pb reared 남자와 결합 한 = (N = 79 쌍), "PbF + CM" Pb reared 여성 대응 한 제어 reared 남자 하나 = (N = 91 쌍), "PbF + PbM"= 한 Pb reared 여성 + 한 Pb reared 남성 (N = 98 쌍). 이 그림에서 피터슨 외 수정 되었습니다. 24. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
초파리 melanogaster 유전자와 D. melanogaster 그리고 인간13,14사이 통로의 광범위 한 보존으로 인해 생물 학적 과정의 범위에 대 한 강력한 모델로 설립 되었습니다. 같은 이유로 그것은 의료 과학에 대 한 강력한 모델, 초파리 는 독물학 끝점의 범위에 anthropogenic 오염의 영향을 공부 하기 적합 한 모델 시스템으로 떠오르고 있다. 여러 실험실 성공적으로 사용 하는 D. melanogaster 모델 시스템으로 다양 한 화합물, 중 금속11,,1618-25,37 포함 하 여 공부 하기 ,,3839,40,44,45, 에탄올46, 나노26,47, 농약48 , 그리고 용 제49. 독극물 모델 초파리 를 활용 최근 노력에도 불구 하 고 수많은 독성에 관한 질문에 대답 하는 모델 시스템으로 사용 초기 단계에 아직도 있다. 그러나, 주어진50 생태학 및 진화 연구17에 그것의 사용 뿐만 아니라 의학 관련 끝점에 대 한 모델의 광범위 한 사용, 독물학 모델 시스템으로 그것의 잠재력은 거 대 한.
여기, 우리는 다양 한 독성 학적 끝점에 대 한 테스트 오염된 매체에 초파리 속에서 다양 한 종 양육 방법 제시. 노출의 다른 형태는 가능 하지만 (예: 흡입 및 피부 노출), 모델 초파리 를 사용 하 여이 프로토콜에 초점을 맞추고 오염 물질의 오염 물질을 자연스럽 게 섭취 (것을 위해 필요한 구강 소비 와 같은 먹이 사슬을 통해). 이러한 메서드는 여러 초파리 종 및 오염 물질의 사용을 수용할 수 있습니다. 초파리 의 유전자 변수, 인구 또한 분야에서 수집 하 고 연구 실험실에 유지 수 있습니다. 트랩 및 미끼 사용 될 수 있는, 종 식품 환경 설정;에 따라 많은 선택권이 있다 필드 컬렉션에 필드 가이드, Markow 및 O'Grady33 와 베르너와 Jaenike34참조. 또한, 방법 다양 한 중요 한 발달 기간에 개발 노출의 영향을 결정 하기 위해 변경 될 수 있습니다 하며 오염 물질 노출의 장기 대가족제 테스트
이 방법의 중요 한 단계를 포함: 환경 제어 조건, (2) 피하 비행 인구의 밀 (3)의 화학적 특성에 따라 테스트 오염 물질을 희석 하 고 (4) 선택에서 주식을 비행 (1) 유지 테스트 오염 물질의의 생물학 관련 농도 환경 규제 인큐베이터 (작은 방)의 주식을 유지 환경 조건에서 추가 변형 결과 혼동 하지 않습니다 보장 합니다. 또한, 계절 변화 행동에 이전 발견 되었습니다51 고 여러 초파리 종 겨울52이상 diapause를 입력 합니다. 두 번째, 애벌레과 밀 개발30, 성인 몸 크기30, 그리고 장 수53에 대 한 지속적인 의미를 가질 수 있습니다. 또한, 오염 물질의 희석 오염 물질은 생물학 오염 물질 축적 초파리 사용할 수 있도록 하는 필수적인 단계입니다. 예를 들어 PbAc는 dH2O23,24,25, 녹 반면 다른 화학 염 분 물 또는 에탄올에 용 해 될 필요가 있습니다. 결과;의 방향에 영향을 미칠 수 오염 물질의 농도 생물학으로 관련 선택 예를 들어 PbAc의 낮은 복용량 증가 (20 분), 이내 남성과 짝짓기 평균 숫자 여성 반면 높은 복용량19짝짓기 한 암컷의 평균 수에 상당한 감소. 테스트 오염 물질의 생물학적으로 관련 농도 식별 하기 위해 독자는 치명적인 복용량 및 복용량 응답 곡선을 수행 하기 위해 적절 한 복용량을 결정 하는 LD50 결정 예비 연구 실행 고려해 야 합니다. 복용량 응답 곡선을 특정 끝점에 농도의 범위를 테스트를 수행 하 여 독자 수 있는 추가 테스트를 위해 "유익한" 또는 "위험한" 개인 또는 인구에 있는 복용량 정확 하 게.
이 프로토콜은 확인 하는 수단을 제공 합니다: 1) 여러 생물 학적 수준의 피트 니스 및 독물학 끝점; 조직의 상호 작용 2) 개발, 긴급 요인;의 역할 3) 생태학적으로 중요 한 끝점; 4) 의학적으로 중요 한 끝점; 5) 어떻게 여러 스트레스 작용 생산 결과; 그리고 6) 세대를 초월 하는 장기간 노출의 영향. 이 프로토콜의 효과 설명 하기 위해 증거 개인 개발에 걸쳐 노출 Pb (표 1)23,24축적 나타내는 제공 되었다. 또한, 대표적인 결과 생태학적으로 중요 한 끝점에서 노출의 영향을 테스트 하려면이 프로토콜을 사용할 수 있는 표시 (예., 친구 선택24발달 Pb 노출의 영향). 또한, 다른 조직의 여러 생물 학적 수준에서 오염 물질의 효과 테스트 했습니다 (생리18,21를 포함 하 여 유전20,22 및 phenotypic 수준19 , 23 , 24 , 25) 의학적으로 중요 한 끝점18,20,21,,2223, 그리고 장기 대가족제 효과23,24 ,,2554. 또한, 예비 데이터 발달 Pb 노출 transgenerational D. melanogaster54통치에 epigenetic 효과 유도 나타냅니다. 이 프로토콜의 중요 한 제한 초파리 와이 프로토콜을 사용 하는 초기 단계에서입니다. 따라서, 제한 된 간행물18,19,20,21,22,23,,2425 있다 프로토콜의 잠재력 개발 및 응급, 추가 생태학적으로 중요 한 끝점, 여러 스트레스 요인과 노출의 진화 의미의 역할과 같은 추가 독성에 관한 질문에 대답을 해결 하기 위해
이 프로토콜을 사용 하 여, 독자 들에 게 오염 물질을 생물학적으로 관련 메서드를 사용 하 여 자연스럽 게 섭취를 테스트할 수 있습니다. 연속 액체 먹이 Soares 외에 의해 개발. 55 특히 농약 노출에 대 한 구두 섭취에 대 한 대체입니다. 그러나 연속 액체 먹이 액체 오염 물질의 성인 섭취에 대 한 적절 하 고 오염 물질에는 적용 되지 않습니다 개인 노출된 사전 일수로 있을 수 있습니다. 이것은 특히 중요 한 노출에 대 한 개발에 중요 한 기간에 대 한 잠재력을 주어진입니다. 이전 연구는 Pb 노출23에 대 한 중요 한 기간을 나타났습니다. 따라서, 초파리 중대 한 기간을 확인할 수 있습니다까지 테스트 전에 초파리 에 의해 오염 물질의 잠재적인 활성 제거를 피하기 위해 개발 전체에 노출 되어야 합니다.
요약 하자면, 우리 구두로 초파리 오염 물질에 노출 하는 프로토콜을 제공. 이 프로토콜 및 모델 시스템을 사용 하 여, 독물학 동시에 오염 물질8의 영향을 이해 하는 데 더 전체적인 접근 방식을 통합 하는 동안 동물 실험을 윤리적이 고 비-침략 적 접근으로 이동할 수 있다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 게시는 교육부에서 교부 금에 의해 지원 되었다 (홍보 수상 #P031C160025-17, 프로젝트 제목: 84.031 C) 활성 줄기 구축 참여 (C-베이스)는 콜로라도 주립 대학-토 인 부락 (CSU-남) 지역 사회. 현재 동물학 감사와 대표적인 결과 사용할 수 있는 권한을 제공 하는 Elsevier 출판 정돈의 편집자 뿐 아니라 이전 서류,이 프로토콜을 게시할 수 있는 기회를 제공에 대 한. 우리는 또한 토마스 Graziano, 박사 버나드 Possidente (학과 생물학, Skidmore 대학), 그리고 박사 클레어 Varian 라모스 C 기반 프로그램, 박사 브라이언 Vanden Heuvel (C 기반 및 학과 생물학, CSU-남), CSU 푸에블로 생물학과, 감사 하 고 싶습니다. (학과 생물학, 콜로라도 주립 대학-토 인 부락) 그들의 지원과 도움.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Carolina Biological Instant Drosophila Medium Formula 4-24 | Carolina Biological | 173204 | |
| Drosophila vials, Narrow (PS), Polystyrene, Superbulk, 1000 vials/unit | Genessee Scientific | 32-116SB | Used to store flies |
| Flugs Closures for vials and bottles, Narrow plastic vials | Genessee Scientific | 49-102 | Used to store flies |
| Cardboard trays, trays only, narrow | Genessee Scientific | 32-124 | Used to organize populations of flies |
| Cardboard trays, dividers only, narrow | Genessee Scientific | 32-126 | Used to organize populations of flies |
| Thermo Scientific Nalgene Square Wide-Mouth HDPE Bottles with Closure | Fischer Scientific | 03-312D | Useful for storage of contaminants |
| Thermo Scientific Nalgene Color-Coded LDPE Wash Bottles | Fischer Scientific | 03-409-17C | Useful for storage of contaminants |
| Eppendorf Repeater M4 Manual Handheld Pipette Dispenser | Fischer Scientific | 14-287-150 | Used to prepare medium |
| Combitips Advanced Pipetter Tips - Standard, Eppendorf Quality Tips | Fischer Scientific | 13-683-708 | Used to prepare medium |
| Flypad, Standard Size (8.1 X 11.6cm) | Genessee Scientific | 59-114 | Used to anesthetize flies |
| Flystuff foot valve | Genessee Scientific | 59-121 | Used to anesthetize flies |
| Tubing, green (1 continguous foot/unit) | Genessee Scientific | 59-124G | Used to anesthetize flies |
| Mineral Oil, Light, White, High Purity Grade, 500 mL HDPE Bottle | VWR | 97064-130 | Used to make a morgue |
| Glass Erlenmeyer Flask Set - 3 Sizes - 50, 150 and 250ml, Karter Scientific 214U2 | Walmart | Not applicable | Used to make a morgue |
| BGSET5 Glass Beaker Set Of 5 | Walmart | ||
| Inbred or wildtype line of Drosophila | Bloomington Drosophila Stock Center at Indiana University | https://bdsc.indiana.edu | |
| Wild popultions of Drosophila | UC San Diego Drosophila Stock Center | https://stockcenter.ucsd.edu/info/welcome.php |
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