Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Experimentellt protokoll för att använda Drosophila som en ryggradslösa modellsystem för toxicitetstester i laboratoriet

Published: July 10, 2018 doi: 10.3791/57450
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Communities for Building Active STEM Engagement, Colorado State University-Pueblo, 2Department of Biology, Colorado State University-Pueblo

Summary

I detta papper ger vi ett detaljerat protokoll för utsätta arter i släktet Drosophila för föroreningar med målet att studera effekterna av exponering på en rad fenotypiska utgångar i olika utvecklingsstadier och för mer än en generation.

Abstract

Emergenta egenskaper och yttre faktorer (befolkningen nivå och ekosystem-nivå interaktioner, i synnerhet) spela viktiga roller i medla ekologiskt viktiga effektmått, även om de anses sällan i toxikologiska studier. D. melanogaster framstår som en toxikologi modell för de beteendemässiga, neurologiska och genetiska effekterna av gifter, för att nämna några. Viktigare, kan art i släktet Drosophila utnyttjas som modellsystem för en integrativ ramverket strategin att införliva emergenta egenskaper och svara ekologiskt relevanta frågor i toxikologi forskning. Syftet med denna uppsats är att tillhandahålla ett protokoll för utsätta arter i släktet Drosophila för föroreningar som ska användas som modellsystem för en rad fenotypiska utgångar och ekologiskt relevanta frågor. Mer specifikt kan detta protokoll användas för att 1) länka flera biologiska nivåer av organisationen och förstå effekterna av gifter på både individ - och populationsnivå fitness; (2) testa effekterna av gifter i olika skeden av utvecklingstoxicitet exponering; (3) testa multigenerational och evolutionära konsekvenserna av föroreningar. och 4) testa flera föroreningar och stressfaktorer samtidigt.

Introduction

Varje år införs cirka 1 000 nya kemikalier av den kemiska industri1,2; dock testas miljökonsekvenserna av endast en liten andel av dessa kemikalier innan distribution2,3. Även om storskaliga katastrofer är ovanliga, subletala och kronisk exponering för en stor mängd föroreningar är utbredd i både människor och djurliv4,5. Den historiska inriktningen ekotoxikologi och miljötoxikologi var att testa dödlighet, enstaka kemisk exponering, akut exponering och fysiologiska effekter av exponering, som ett sätt att mäta effekterna av föroreningar på överlevnad6, 7 , 8 , 9 , 10. även om det finns en förskjutning mot etiska och icke-invasiva metoder för djurförsök, nuvarande metoder är begränsande på grund av rollen som utveckling, emergenta egenskaper och yttre faktorer (såsom befolkningen nivå och ekosystem-nivå interaktioner) spela i medla ekologiskt viktiga effektmått8. Därför finns det ett behov av metoder som införlivar ett mer holistiskt synsätt utan att offra djur och ryggradsdjur i laboratoriet.

Ryggradslösa modellsystem, såsom Drosophila melanogaster, är ett attraktivt alternativ till adress nöden för en mer holistisk syn toxicitetstester. D. melanogaster, utvecklades ursprungligen som en ryggradslösa modellsystem för mänskliga-relaterade genetisk forskning om ett sekel sedan11. D. melanogaster används nu tydligt som ett ryggradsdjur modell alternativ av flera skäl: 1) bevarande av gener och vägar mellan D. melanogaster och människor; (2) kort generationstid jämfört med ryggradsdjur modeller; (3) billiga kostnaden för underhåll. (4) underlätta generera stort urvalsstorlekar; och 5) uppsjö av fenotypiska - och ekologiskt-relevanta endpoints tillgänglig för testning11,12,13,14,15,16,17 .

Flera laboratorier11,15,16,17,18,19,20,21,22, 23 , 24 , 25 nu använder D. melanogaster som ett ryggradsdjur modell alternativ för toxicitetstester för att förstå konsekvenserna av föroreningar på människor. Lokala vilda arter av Drosophila kan utnyttjas, samt, som toxicitet modeller för vilda djur (och människor) att besvara ekologiskt-, behaviorally-, och evolutionärt relevanta frågor på flera olika biologiska nivåer av organisationen. Med i Drosophila släktet som modell, är flera mätbara slutpunkter möjligt11,15,16,18,19,20 ,21,22,23,24,25. Utbildningsanstalter, använda Drosophila modellen, toxikologer kan: 1) etiskt länka effekter på flera olika biologiska nivåer av organisationen. (2) införliva roll framväxande faktorer och utveckling. (3) studera ekologiskt viktiga effektmått (förutom medicinskt viktiga effektmått); (4) testa flera stressfaktorer samtidigt; (5) och test långsiktiga multigenerational (e.g. evolutionära och transgenerationell) konsekvenserna av stressfaktorer. Därför kan använder Drosophila som modellsystem en mångfald av metoder, inte begränsat till studera mekanistiska inflygningar med inavlade stammar av D. melanogaster i laboratoriet.

I detta papper presentera vi metoder för uppfödning och samla Drosophila för att besvara olika toxikologiska frågor. Mer specifikt beskriver vi metoden för 1) uppfödning Drosophila i medium spetsad med en eller flera föroreningar; (2) samla Drosophila hela utveckling (t.ex. vandrande tredje-instar larver, Pupp fall, nyligen-eclosed vuxna och mogna vuxna); och 3) uppfödning Drosophila i det förorenada mediet för att test mellan generationerna och transgenerationell överföring, samt evolutionära konsekvenserna av toxiska långtidsexponering. Med hjälp av detta protokoll, tidigare författare18,19,20,21,22,23,24har,25 rapporterat olika fysiologiska, genetiska och beteendemässiga effekter av utvecklingstoxicitet leda (Pb2 +) exponering. Detta protokoll kan toxikologer att använda en mer holistisk toxikologiska strategi, som är nödvändig för att förstå hur föroreningar är riskfaktorer för både människor och djur i en alltmer förorenad miljö.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Följande protokoll är ett experimentellt protokoll används bakåt i Drosophila släktet på förorenade medium när oralt intag av ett toxin är lämpligt; andra former av exponering är möjligt använda Drosophila modell11,15,16,26. De metoder som beskrivs i detta protokoll har tidigare beskrivits av Hirsch et al. 19 och Peterson et al. 23 , 24 , 25.

1. ställa in lager populationer av Drosophila i forskningslaboratoriet

  1. Ställa in en miljömässigt-kontrollerade inkubator (eller litet rum) till hus lager populationer av Drosophila genom att ange inkubatorerna för en konstant temperatur, ljus: mörk cykel och luftfuktighet, beroende på inställningarna för art som testas.
    Obs: Rekommenderad miljöförhållanden varierar beroende på den infödda ekologin av de arter som valts för studien. Till exempel D. melanogaster är hemma i subsahariska Afrika27 och hålls vanligtvis på 25 ° C, 12:12 ljus: mörk cykel och cirka 60% luftfuktighet16,18,19,20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 28 , 29 , 30. däremot, D. montana sträcker sig under större delen av Kanada och Mellanvästern USA, en mycket kallare region. Därför hålls vanligtvis D. montana vid 19 – 20 ° C och ibland en 24 h lättreglering för att simulera förhållanden under parning säsongen31. För en mer detaljerad beskrivning av det geografiska spänner av olika arter av Drosophila, se Drosophila artbildning mönster webbplats32.
  2. Få en rekommenderad Drosophila art eller inavlad linje från antingen ett lager center (se tabell för material), en annan forskningslaboratoriet vid begäran eller samla vilda, genetiskt variabla populationer från fältet.
    Obs: Följande steg förklarar metoderna för att samla in vilda, genetiskt variabla populationer av Drosophila att upprätthålla i forskningslaboratorium. Dessa metoder har ändrats från Markow och O'Grady33 och Werner och Jaenike34 för att samla den största mångfalden av arter på en gång, snarare än specifika målarter med en bete källa.
    1. Frysa ett halvdussin mogna bananer i frysen över natten och Frosta innan betet fällor.
    2. Förbereda flera 1 – 2 L plastflaskor genom att skära en u-formad skåra framsidan av flaskan för att tillåta flugor fångas i bete flaska och inte fly. Keps plastflaskor med deras kapsyler så att flugorna inte undgår via locken.
    3. Lägga till avfrostade bananen i botten av flaskorna så att botten av flaskorna innehåller ungefär en tum av banan. Placera en skiva mogna tomat i flaskan. Lägga till en jäst slam (överblivna jästen från själva öl processen) bananen på botten av flaskan så att banan blir i blöt i jäst slam.
    4. Lägga till trä pinnar (i vertikala upprätt) i flaskan så att flugorna har ett rena substrat att gå på från jäst slam och banan.
      Figur 1 illustrerar den slutliga produkten av dessa metoder.
    5. Häng bete flaskor i träd över natten och kontrollera varje 24 h. mun aspirera flyger ur flaskor och individuellt Placera Honorna i injektionsflaskor med medium att skapa iso-hona linjer.
      Obs: Flera kvinnliga linjer kan skapas, dock endast om honorna av varje art kan identifieras tydligt. Dessutom flyger i släktet Drosophila ockupera olika ekologiska nischer och kommer att ha olika kostbehov beroende på dessa nischer (Werner och Jaenike34); Se Werner och Jaenike34 för kost rekommendationer och matrecept.
    6. Undersöka vuxna F1 avkomma under mikroskopet dissektion för att identifiera arterna av de insamlade Drosophila (se Markow och O'Grady33 och Werner och Jaenike34 för hjälp med att identifiera olika arter ).

Figure 1
Figur 1 : Bildmässigt representation av fällor och bete som används för att samla in vilda populationer av Drosophila i fältet. (A) flyga fällor set på en lokal plats i Colorado. (B) en närmare titt på fluga fällor set på denna plats. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

  1. Bibehålla den iso-honan eller flera kvinnliga raderna i en miljömässigt-kontrollerade inkubator eller ett rum med konstant temperatur, ljus: mörk cykel och fukt. Detta gör huset flyger i injektionsflaskor eller flaskor i föredragit medium och tillåta de dräktiga honorna att lägga ägg på medellång. Övervaka injektionsflaskorna för förekomst av larver och puppor.
    Obs: Flugor i släktet Drosophila upptar olika ekologiska nischer och kommer att ha olika kostbehov och miljömässiga abiotiska preferenser beroende på dessa nischer33,34. Miljömässiga inställningar och kostrekommendationer (och ytterligare instruktioner på flyga djurhållning) kan hittas i Elgin och Miller28, Shaffer et al. 29, stocker och Gallant30, Markow och O'Grady33och Werner och Jaenike34. Om du använder viltfångade arter, kan lokala miljöförhållanden simuleras i inkubatorerna tills arterna kan identifieras.
  2. Överföra bestånden ofta till färska medium, kasta gamla flaskor, att upprätthålla friska linjer och undvika infektion från kvalster.
    Obs: Frekvensen av överföring beror på livscykeln för arten. Till exempel överföra Drosophila melanogaster varannan vecka till färska medium. För ytterligare information på att behålla linjerna i laboratorium, se Rand et al. 16, Elgin och Miller28, Shaffer et al. 29, stocker och Gallant30, Greenspan35och naturvetenskaplig utbildning databas36.

2. bakre Drosophila i det förorenada mediet

Obs: Om testning Drosophila i laboratoriet för första gången eller med en ny kontaminanter, identifiera den dödliga dosen (se Castaneda o.a. 37 och Massie o.a. 38 för metoder) och LD50 (se Castaneda et al. 37 och Akins et al. 39 för metoder) första. Kör sedan en dos-respons kurva för att identifiera biologiskt relevanta koncentrationer för den önskade fenotypiska produktionen; Se Hirsch et al. 19 och Zhou et al. 40 för metoder.

  1. Förbereda stamlösningar av förorenade mediet vid den önskade koncentrationer, beroende på det främmande ämnet kemi.
    Obs: till exempel, att förbereda stamlösningar av PbAc: förbereda stamlösningar av blyacetat (PbAc) medium genom att lägga till föroreningar i destillerat vatten (dH20) tills medium med främmande vatten når önskad koncentration. Exempelvis en stamlösning av 1000 µM PbAc, kan förberedas genom att lägga till PbAc dH20 tills den når 1000 µM PbAc. Ytterligare, späd stamlösningen (t.ex. 1000 µM PbAc lösning) till önskad koncentration (till exempel 500 µM PbAc) och underhålla dessa lösningar som lager samt.
  2. Förbereda medium, följande tillverkarens riktlinjer att tjäna som kontroll medium. Förbereda ytterligare medium, följande tillverkarens riktlinjer. dock komplettera beredda föroreningars lösning för dH20.
    Obs: exempelvis om du använder ett ögonblick Drosophila medium, tillsätt cirka en tesked instant medium till en plast injektionsflaska. Lägg till ca 5-5,5 mL dH20 till medium. Strö några korn av levande bagerijäst att förbereda kontroll medium. För att förbereda experimentella medium, komplettera stamlösning (till exempel 500 µM PbAc) för dH20.
  3. Överföra reproduktivt livskraftig mogna män och kvinnor från lager populationer i kontrollen och det experimentella mediet.
    Obs: Den tid efter eclosion till reproduktiva mognad är olika mellan de Drosophila arter41.
    1. Knacka försiktigt på injektionsflaskan med lager flugor ner med den dominerande handen. Säkerställa att flugorna automatiskt flytta till botten av injektionsflaskan. Med den andra handen, ta av locket på injektionsflaskan samtidigt knacka injektionsflaskan och placera en färsk injektionsflaska av kontroll eller förorenade medium ovanpå injektionsflaskan med flugor. Håll injektionsflaskorna tillsammans och vända dem över, knacka, så att flugorna automatiskt överförs till injektionsflaskan med färska kontroll eller förorenade mediet. Medan fortfarande knacka injektionsflaskan med flugor, cap injektionsflaskan.
    2. Upprepa med fler injektionsflaskor, se till att standardisera antalet flugor i varje injektionsflaska.
      Obs: Det totala antalet vuxna överförs via enskild överföring eller anestesi kommer att bero på storleken på de flaskor som används för att undvika överbeläggning.
    3. Inkubera vuxna i en standard miljöförhållanden (dvs. en inkubator) och låta de vuxna att para sig och lägga ägg på medellång för 24 – 96 h.
    4. Efter 24 – 96 h, kassera vuxna i ett bårhus (en kolv fylld med mineralolja och utjämnade med en åtsittande tratt) lämnar bakom befruktade ägg (som senare blir de experimentella ämnena) att mogna för testning. Placera rören i inkubatorn att låta äggen att utvecklas.
    5. Övervaka injektionsflaskorna för vandrande-instar larver av letar larver som uppstår från mediet.

3. samla in experimentella ämnen i olika utvecklingsstadier

Obs: Experimentella ämnen kan samlas på alla utvecklingsstadier, placeras i de blinda kodade 15 mL koniska rör, och testade för ackumulering. Metoder för provning av ansamling av föroreningar kommer att bero på det främmande ämnet som studeras. Exempelvis kan ansamling av PbAc testas med hjälp av Inductively-Coupled Plasma-masspektrometri (ICP-MS)42. Dessutom kan experimentella ämnen samlas på alla utvecklingsstadier som ska testas för en mängd olika fenotypiska effekterna av föroreningar. Figur 2 illustrerar den Drosophila livscykel43. Figur 3 illustrerar det experimentellt protokollet för exponering och de olika utvecklingsstadierna för samling.

Figure 2
Figur 2 : Översikt över livscykeln för D. melanogaster (den vanligaste Drosophila modellsystem). Stadier av Drosophila livscykel är: 1) ägg, 2) första-instar larv, 3) sekund-instar larv, 4) tredje-instar larv, 5) vandrande tredje-instar larv, 6) glasögonfågel pupa, 7) röda ögon pupa, 8) nyligen-eclosed vuxen och 9) mogna vuxna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 : Översikt över metoder för oralt utsätta Drosophila för förorenade mediet i både föräldraledighet (F0) och efterföljande generationer (F1 och framåt). (A) metoder för oral exponering under utveckling i exponerade generation. (B) metoder för att testa överföring av föroreningar till avkomma (F1 till önskad generation). Denna siffra har ändrats från Peterson et al. 24 Klicka här för att se en större version av denna siffra.

  1. Samla in vandrande-tredje instar larver
    1. Börja övervaka injektionsflaskor när lampor som aktiveras i inkubatorn, eftersom larver kommer att dyka upp från medlet och flytta uppåt på sidan av injektionsflaskan inom ett h efter lampor slår i inkubatorn. Inom detta h, ta bort vandrande-tredje instar larverna från sidorna av injektionsflaskan försiktigt med en träpinne eller pincett.
      Anmärkning: Antalet larver tillgängliga för utlämning beror på antalet ägg som i ”2.3.4”.
    2. Ta bort överflödigt medel från larver, placera larver i en liten bägare med dH2O. Häll den dH2O ur bägaren och placera larver på en delikat uppgift torkare. Med en delikat uppgift wiper, ta försiktigt bort den överskjutande dH2O från larverna.
    3. Upprätthålla experimentella populationer i kuvös miljömässigt-kontrollerade.
  2. Samla in nyligen-eclosed vuxna
    1. Övervaka injektionsflaskor för eclosion genom att observera färgning av the puppor längs sidorna av injektionsflaskorna.
      Obs: Puppor kommer att mörkna under utveckling. Utvecklande tid, särskilt före eclosion, beror på den art som testas.
    2. När de första vuxna börjar eclose, dumpa och kassera dessa vuxna till ett bårhus som innehåller mineralolja.
    3. När ljusen slår på i inkubatorn följande morgon, dumpa och kassera alla vuxna okänd ålder (eller oskuld) som kan ha eclosed över natten eller under morningbefore lampor på.
    4. Cirka 4 h senare, söva alla vuxna som framkommit som nyligen-eclosed vuxna med en CO2 pistol i skålarna. Placera vuxna på en CO2 tallrik i dissektion Mikroskop. Sex vuxna genom att leta kön kammar på frambenen av hanar och ovipositors hos kvinnor.
      Obs: D. melanogaster måste samlas in inom 6 h av eclosion att undvika parning men andra arter kan ha längre utvecklande gånger (och behöver därför inte samlas in inom denna tidsram).
    5. Separat vuxna på CO2 plattan med hjälp av en träpinne. Försiktigt överför vuxna i sex-specifika grupper med hjälp av en träpinne till medelstora matchande redan existerande historia.
  3. Samla mogna vuxna efter eclosion
    1. Ge vuxna att förbli på medellång matchande före eclosion exponeringen från ägg scenen för den önskad ålder efter eclosion i en miljömässigt-kontrollerade inkubator.
    2. Ensamma överföra vuxna till kontroll medium för 24 h före testning för att ge vuxna till groom överskott förorenade mediet upp sina kroppar.

4. bakre experimentella ämnen att testa effekterna av Multigenerational eller transgenerationell exponering.

  1. För att bakre föräldragenerationen (Arvidsson P0 eller F0 generationer), överföra vuxna från lager befolkningar att kontroll och experimentella mediet enligt anvisningarna i ”2,1” till ”2.3” och ”3.1” till ”3.3”.
  2. När vuxna är reproduktionsmässigt mogna (se Pitnick et al. 41), ensamma överföring (som anges i 2.3.1) en injektionsflaska med hanar till en färsk injektionsflaska av kontroll eller experimentella medium. Ensamma överför en injektionsflaska av Honor till färska injektionsflaskan som innehåller nu hanar. Möjliggör 24-96 h. Dump vuxna att mate och lägger ägg på medellång och kassera vuxna till ett bårhus som innehåller mineralolja och åter Inkubera injektionsflaskor för att tillåta avkomma att utveckla.
  3. Upprepa steg 4.1 genom 4.2 beroende på önskat antal generationer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Genom att muntligen utsätta Drosophila för en kontaminanter i hela utveckling, kan olika toxikologiska frågor testas genom att exponera Drosophila på olika nivåer av biologisk organisation. Detta avsnitt presenterar representativa resultat som erhållits med detta protokoll i tidigare publicerade uppsatser23,24. I synnerhet användes detta protokoll tidigare för att utvärdera ackumulering, eliminering och upptag av bly (Pb) inom samma generation över exponering och den första generationen avkomma23; och för att studera konsekvenserna av ackumulering på mate val24.

Tabell 1 och figur 4 visar representativa resultat som erhållits med detta protokoll för att bestämma ackumulering och eliminering av Pb i både F0 och F1 generationer.

Tabell 1 visar representativa resultat vägledande av ackumulationen av Pb när utsatt inom generation (vid olika doser: 0, 10, 40, 50, 75, 100, 250 och 500 µM PbAc) i prov i flera utvecklingsstadier (vandrande tredje-instar larver, Pupp fall, nyligen-eclosed vuxna och mogna kvinnor och män) i Peterson et al. 23 prover samlades i olika utvecklingsstadier, fryst vid-20 ° C, behandlas med salpetersyra och väteperoxid och testade för Pb med ICP-MS23,42.

Dos (µM PbAc) Larv Pupp fall Nyligen-Eclosed vuxna Mogna vuxna kvinnor Mogna vuxna män
0 0,009 ± 0,001 0.099 ± 0,02 0,04 ± 0,005 0.069 ± 0,031 0,0015 ± 0,003
10 0,42 ± 0,025 0,46 ± 0,03 0,12 ± 0,009 0,12 ± 0,012 0,056 ± 0,008
40 7,5 ± 0,67
50 5,2 ± 0,71 2,77 ± 0,30 1.11 ± 0,14
75 14 ± 1,06
100 12 ± 0,95 4.7 ± 0,38 3.36 ± 0,58 1.20 ± 0,63 1.24 ± 0,46
250 89 ± 8,49 25.06 ± 4.72 5.46 ± 0,75
500 271 ± 41.01 334.30 ± 39.43 8,44 ± 0,84 46,50 ± 14,72 14.43 ± 1,83

Tabell 1: menar Pb laster (ng/individuell) testas i D. melanogaster under utveckling efter oral exponering till Pb från ägg scenen att testa scenen. Medel (ng/fly) ± medelfel av medelvärdet visas (n = 8 larv, n = 3 kontroll-uppfödda vuxna, n = 3 Pb-uppfödda vuxna). Vildtyp D. melanogaster har fötts upp på kontroll eller blyad medium (0, 10, 40, 50, 75, 100, 250 eller 500 µM PbAc) från ägg scenen till olika stadier av utveckling. Proverna samlades in och testade för Pb ackumulering med ICP-MS.42 denna tabell har ändrats från Peterson et al. 23

I figur 4, föräldragenerationen (F0) utsattes för Pb från ägg stadier till vuxenlivet, parad i kontroll medium, och den första generationen avkomma (F1) var uppfödda i kontroll medium fram till vuxen ålder24. Metoder för att upptäcka Pb ackumulering och eliminering liknade Peterson et al. 23. resultat från detta experiment visar att föräldrarnas exponering inte överförs till den första generationen av vuxen avkomma24. Därför är använder det här protokollet, det möjligt att testa adaptiv respons vid olika evolutionära skalor, samt transgenerationell effekterna av F0 exponering. Liknande resultat hittades i Peterson et al. 23

Figure 4
Figur 4: PB ackumulering i D. melanogaster (A) föräldrar (F0) och (B) oexponerad avkomma (F1). Staplarna i (A) och (B) medelvärde (ng/vuxen) ±SEM. urvalsstorlekar som visas ovan barer i (A) och (B). = p < 0,001. (A) F0 vuxna utsattes muntligen till 250 µM PbAc använder det här protokollet från ägg scenen till ålder 5 d efter eclosion och insamlade ålder 6 dagar efter eclosion (efter 24 h utsöndringsfasen) ska testas för Pb ackumulering med ICP-MS.42(B) F0 vuxna parades inom behandling i kontroll medium. Oexponerad F1 avkomma var uppfödda i kontroll medium från ägg scenen till vuxen ålder (med detta protokoll) och testade för Pb ackumulering med ICP-MS. I (B): ”CF + CM”= F1 vuxna med föräldrar uppfödda i kontroll medium, ”CF + PbM” = F1 vuxna med fäder uppfödda i blyhaltig medium, ”PbF + CM” = F1 vuxna med mödrar föds upp i blyhaltig medium, ”PbF + PbM” = F1 vuxna med föräldrar uppfödda i blyhaltig medium. Denna siffra har ändrats från Peterson et al. 24 Klicka här för att se en större version av denna siffra. 

Resultaten presenteras i tabell 1 och figur 4 visar att Drosophila lätt ackumuleras Pb på olika doser, utvecklingsstadier och evolutionära skalor använder detta protokoll. Därför anger protokollets effektivitet i utsätta D. melanogaster för en muntlig föroreningar.

I figur 5användes protokollet beskrivs här av Peterson et al. 24 att testa effekterna av utvecklingstoxicitet Pb exponering på mate preferens. Experimentella ämnen har fötts upp från ägg scenen till vuxen på kontroll eller blyad medium från ägg scenen till vuxenlivet och testas för mate preferens efter 24 h för utsöndringsfasen. Peterson et al. 24 hittade att Pb-exponerade kvinnor företrädesvis parad med Pb-exponerade hanar när det ges möjlighet att antingen en kontroll eller Pb-exponerade hane. Dessa resultat är ett representativt exempel på genomförandet av protokollet till granska fenotypiska utdata.

Figure 5
Figur 5: Mate preferens hos män och kvinnor utsätts för 250 µM PbAc från ägg steg till vuxen ålder. Barer i (A), (B), och (C) visar genomsnittlig procent (%) parning framgång (i 60 min) ± SEM. *** = p < 0.001. * = p < 0,05. Experimentella ämnen i (A), (B) och (C) utsattes för kontroll eller blyad medium (250 µM PbAc) från ägg stadier att mogna vuxenlivet och testade för skillnader i mate val. (A) kvinnlig förkärlek för antingen kontroll - eller Pb-uppfödda hanar (dvs. två-val test). Urvalsstorlekar var: N = 126 kontroll-uppfödda tikar och 137 Pb-uppfödda honor. (B) manlig preferens för kontroll - och Pb-uppfödda honor (dvs. två-val test). Prover storlekar var: N = 59 kontroll-uppfödda hanar och N = 64 Pb-uppfödda hanar. (C) Mate preferens hos både män och kvinnor när ensamma paras ihop med en partner av antingen exponering (dvs. no-prov). I (C): ”CF + CM” = ett kontroll-uppfödda hona paras ihop med en kontroll-uppfödda hane (N = 85 par), ”CF + PbM” = ett kontroll-uppfödda hona paras ihop med en Pb-uppfödda hane (N = 79 par), ”PbF + CM” = ett Pb-uppfödda hona paras ihop med en kontroll-uppfödda hane (N = 91 par), ”PbF + PbM ”= en Pb-uppfödda hona + en Pb-uppfödda hane (N = 98 par). Denna siffra har ändrats från Peterson et al. 24. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Drosophila melanogaster har etablerats som en kraftfull modell för en rad biologiska processer på grund av omfattande bevarande av gener och vägar mellan D. melanogaster och människor13,14. Av samma skäl att det är en kraftfull modell för medicinsk vetenskap, har Drosophila framträtt som en lämplig modellsystem studera konsekvenserna av antropogena föroreningar på ett utbud av toxikologiska ändpunkter. Flera laboratorier använder framgångsrikt D. melanogaster som modellsystem för att studera en rad föreningar, inklusive tungmetaller11,16,18–25,37 ,38,39,40,44,45, etanol46, nanopartiklar26,47, bekämpningsmedel48 , och lösningsmedel49. Trots senaste ansträngningar att utnyttja Drosophila som toxikologi modell, dess användning som modellsystem att besvara de otaliga toxikologiska frågorna är fortfarande i sin linda. Men är med tanke på dess omfattande användning som en modell för medicinskt-relaterade effektvariabler, liksom dess användning i ekologiskt50 och evolutionära studier17, dess potential som toxikologiska modellsystem enorma.

Här presenterar vi metoder för uppfödning av olika arter inom släktet Drosophila på förorenade medium att testa för olika toxikologiska ändpunkter. Även om andra former av exponering är möjliga fokuserar med Drosophila som modell (t.ex. inandning och dermal exponering), detta protokoll på oral konsumtion av föroreningar som är nödvändig för föroreningar som vore naturligt intas) såsom genom livsmedelskedjan). Dessa metoder kan rymma flera Drosophila arter och föroreningar. Vilda, genetiskt variabla populationer av Drosophila kan också samlas i fältet och underhålls i forskningslaboratorium. Det finns många alternativ av fällor och bete som kan användas, beroende på Art matpreferenser; för naturguider på fältuppsättningen, se Markow och O'Grady33 och Werner och Jaenike34. Dessutom metoderna skulle kunna ändras för att avgöra effekterna av utvecklingstoxicitet exponering på olika kritiska utvecklingsmässiga perioder och möjliggör långsiktiga multigenerational testning av lakvattnets exponering.

De kritiska steg dessa metoder inkluderar: (1) upprätthålla flyga bestånd i miljömässigt-kontrollerade villkor, (2) att undvika överbefolkning av flyga populationer, (3) att späda ut det främmande ämnet test enligt dess kemiska egenskaper och (4) välja biologiskt relevanta koncentrationer av det främmande ämnet på test. Att bibehålla bestånden i miljömässigt-reglerade inkubatorer (eller ett litet rum) säkerställer att ytterligare varianter miljöförhållanden inte förbistrar resultat. Dessutom säsongsvariationer i beteende har hittats tidigare51 och flera Drosophila arter ange diapause över vintern52. Andra, larval överbeläggning kan få långvariga konsekvenser för utveckling30, vuxna kroppen storlek30och livslängd53. Utspädning av det främmande ämnet är dessutom ett viktigt steg för att säkerställa att det främmande ämnet är biologiskt tillgänglig för Drosophila ansamlas det främmande ämnet. Till exempel löses PbAc i dH2O23,24,25, medan andra kemikalier kan behöva lösas upp i salthaltigt vatten eller etanol. Att välja biologiskt relevanta koncentrationer av det främmande ämnet kan påverka riktningen av resultaten. till exempel öka låga doser av PbAc genomsnittliga antal honorna parning med hanar (inom 20 min), medan högre doser visar signifikanta minskningar i det genomsnittliga antalet honor parning19. För att identifiera biologiskt relevanta koncentrationer av det främmande ämnet på test, bör läsare överväga kör preliminära studier för att avgöra den dödliga dosen och LD50 att bestämma de lämpliga doserna att utföra en dos-respons kurva. Genom att utföra en dos-respons kurva för att testa en serie koncentrationer på en viss endpoint, läsare kunde peka ut doser som är antingen ”nyttiga” eller ”farliga” till individer eller befolkningsgrupper för ytterligare tester.

Detta protokoll ger en avenue att avgöra: 1) samspelet mellan flera biologiska nivåer av organisationen på fitness och toxikologiska ändpunkter; (2) rollen av utvecklings- och behandlingsrelaterade faktorer; (3) ekologiskt viktiga effektmått; (4) medicinskt-viktiga effektmått; (5) hur flera faktorer samverkar för att producera resultat. och 6) effekterna av långvarig exponering som överskrider generationer. För att illustrera effekten av detta protokoll, lämnades bevis som visar att individer som exponerats under hela utvecklingen ackumulerar Pb (tabell 1)23,24. Dessutom representativa resultat visar att detta protokoll kan användas för att testa effekterna av exponering på ekologiskt viktiga endpoints (t.ex., effekterna av utvecklingstoxicitet Pb exponering på mate val24). I tillägg, andra har testat effekterna av föroreningar på flera biologiska nivåer av organisation (inklusive fysiologiska18,21, genetiska20,22 och fenotypiska-nivåer19 , 23 , 24 , ( 25), medicinskt viktiga effektmått18,20,21,22,23, och långsiktiga multigenerational effekter23,24 ,25,54. Preliminära data indikerar dessutom att utvecklingstoxicitet Pb exponering inducerar transgenerationell epigenetiska effekter på fruktsamhet i D. melanogaster54. En viktig begränsning av detta protokoll är att användningen av detta protokoll med Drosophila är i sin linda. Därför finns det begränsad publikationer18,19,20,21,22,23,24,25 adress potential i protokollet besvara ytterligare toxikologiska frågor, såsom rollen för utveckling och framväxande faktorer, ytterligare ekologiskt viktiga effektmått, flera stressfaktorer och evolutionära konsekvenserna av exponering.

Användning av detta protokoll, kan läsare testa föroreningar som naturligt intas med biologiskt relevanta metoder. Kontinuerlig flytande utfodring, utvecklat av Soares et al. 55 är en alternativ metod för oralt intag, särskilt för bekämpningsmedel exponering. Dock kontinuerlig flytande utfodringen är lämpligt för vuxna intag av flytande föroreningar och inte tillämplig föroreningar där individer kan vara exponerad före eclosion. Detta är särskilt viktigt med tanke på potentialen för kritiska perioder i utvecklingen för exponering. Tidigare studier har visat en kritisk period för Pb exponering23. Därför bör Drosophila utsättas under utveckling för att undvika potentiella aktiva eliminering av föroreningar av Drosophila före testet tills kritiska perioder kan bestämmas.

Sammanfattningsvis har vi tillhandahållit ett protokoll för att muntligen avslöja Drosophila föroreningar. Med detta protokoll och modell system, kan toxikologer skifta till etiska och icke-invasiva metoder till djurförsök samtidigt som den innehåller samtidigt ett mer holistiskt synsätt att förstå effekterna av föroreningar8.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Denna publikation stöddes av ett anslag från utbildningsdepartementet (PR Award #P031C160025-17, projektnamn: 84.031 C) till Colorado State University-Pueblo (CSU-Pueblo) samhällen att bygga aktiva stammen engagemang (C-bas). Vi tackar nuvarande zoologi och Elsevier för att ge rättigheter att använda de representativa resultat publicerade i tidigare artiklar, samt redaktörerna för JoVE för att ge oss möjlighet att publicera detta protokoll. Vi vill också tacka de C-bas Program, Dr Brian Vanden Heuvel (C-BASE och Institutionen för biologi, CSU-Pueblo), CSU-Pueblo biologi institutionen, Thomas Graziano, Dr. Bernard Possidente (Institutionen för biologi, Skidmore College) och Dr Claire Varian Ramos (Institutionen för biologi, Colorado State University-Pueblo) för deras stöd och hjälp.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Carolina Biological Instant Drosophila Medium Formula 4-24 Carolina Biological 173204
Drosophila vials, Narrow (PS), Polystyrene, Superbulk, 1000 vials/unit Genessee Scientific 32-116SB Used to store flies
Flugs Closures for vials and bottles, Narrow plastic vials Genessee Scientific 49-102 Used to store flies
Cardboard trays, trays only, narrow Genessee Scientific 32-124 Used to organize populations of flies
Cardboard trays, dividers only, narrow Genessee Scientific 32-126 Used to organize populations of flies
Thermo Scientific Nalgene Square Wide-Mouth HDPE Bottles with Closure Fischer Scientific 03-312D Useful for storage of contaminants
Thermo Scientific Nalgene Color-Coded LDPE Wash Bottles Fischer Scientific 03-409-17C Useful for storage of contaminants
Eppendorf Repeater M4 Manual Handheld Pipette Dispenser Fischer Scientific 14-287-150 Used to prepare medium
Combitips Advanced Pipetter Tips - Standard, Eppendorf Quality Tips Fischer Scientific 13-683-708 Used to prepare medium
Flypad, Standard Size (8.1 X 11.6cm) Genessee Scientific 59-114 Used to anesthetize flies
Flystuff foot valve Genessee Scientific 59-121 Used to anesthetize flies
Tubing, green (1 continguous foot/unit) Genessee Scientific 59-124G Used to anesthetize flies
Mineral Oil, Light, White, High Purity Grade, 500 mL HDPE Bottle VWR 97064-130 Used to make a morgue
Glass Erlenmeyer Flask Set - 3 Sizes - 50, 150 and 250ml, Karter Scientific 214U2 Walmart Not applicable Used to make a morgue
BGSET5 Glass Beaker Set Of 5 Walmart
Inbred or wildtype line of Drosophila Bloomington Drosophila Stock Center at Indiana University https://bdsc.indiana.edu
Wild popultions of Drosophila UC San Diego Drosophila Stock Center https://stockcenter.ucsd.edu/info/welcome.php

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Postel, S. Defusing the Toxics Threat: Controlling Pesticides and Industrial Waste. , Worldwatch Institute. Washington, DC. (1987).
  2. Vitousek, P. M., Mooney, H. A., Lubchenco, J., Melillo, J. M. Human domination of earth's ecosystems. Science. 277, 494-499 (1997).
  3. United Nations Environment Program (UNEP). Saving Our Planet: Challenges and Hopes. , UNEP. Nairobi. (1992).
  4. Hansen, L. J., Johnson, M. L. Conservation and toxicology: Integrating the disciplines. Conservation Biology. 13, 1225-1227 (1999).
  5. Johnston, E. L., Mayer-Pinto, M., Crowe, T. P. REVIEW: Chemical contaminant effects on marine ecosystem functioning. Journal of Applied Ecology. 52, 140-149 (2015).
  6. Dell'Omo, G. Behavioral ecotoxicology. , John Wiley & Sons, LTD. West. Sussex, UK. (2002).
  7. Clotfelter, E. D., Bell, A. M., Levering, K. R. The role of animal behaviour in the study of endocrine-disrupting chemicals. Animal Behaviour. 68, 665-676 (2004).
  8. Peterson, E. K., Buchwalter, D. B., Kerby, J. L., LeFauve, M. K., Varian-Ramos, C. W., Swaddle, J. P. Integrative behavioral ecotoxicology: bringing together fields to establish new insight to behavioral ecology, toxicology, and conservation. Current Zoology. 63, 185-194 (2017).
  9. Scott, G. R., Sloman, K. A. The effects of environmental pollutants on complex fish behaviour: Integrating behavioural and physiological indicators of toxicity. Aquatic Toxicology. 68, 369-392 (2004).
  10. Zala, S. M., Penn, D. J. Abnormal behaviors induced by chemical pollution: A review of the evidence and new challenges. Animal Behaviour. 68, 649-664 (2004).
  11. Abolaji, A. O., Kamdem, J. P., Farombi, E. O., Rocha, J. B. T. Drosophila melanogaster as a promising model organism in toxicological studies. Archives of Basic & Applied Medicine. 1, 33-38 (2013).
  12. Jennings, B. H. Drosophila-a versatile model in biology and medicine. Materials Today. 14, 190-195 (2011).
  13. Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacology Reviews. 63, 411-436 (2011).
  14. Rubin, G. M., et al. Comparative genomics of the eukaryotes. Science. 287, 2204-2215 (2000).
  15. Rand, M. D. Drosophotoxicology: The growing potential for Drosophila in neurotoxicology. Neurotoxicol Teratol. 32, 74 (2010).
  16. Rand, M. D., Montgomery, S. L., Prince, L., Vorojeikina, D. Developmental toxicity assays using the Drosophila model. Current Protocols in Toxicology. 59, 1.12.1-1.12.20 (2015).
  17. Burke, M. K., Rose, M. R. Experimental evolution with Drosophila. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 296, R1847-R1854 (2009).
  18. He, T., Hirsch, H. V. B., Ruden, D. M., Lnenicka, G. A. Chronic lead exposure alters presynaptic calcium regulation and synaptic facilitation in Drosophila larvae. NeuroToxicology. 30, 777-784 (2009).
  19. Hirsch, H. V., et al. Behavioral effects of chronic exposure to low levels of lead in Drosophila melanogaster. NeuroToxicology. 24, 435-442 (2003).
  20. Hirsch, H. V. B., et al. Variations at a quantitative trait locus (QTL) affect development of behavior in lead-exposed Drosophila melanogaster. NeuroToxicology. 30, 305-311 (2009).
  21. Morley, E. J., Hirsch, H. V. B., Hollocher, K., Lnenicka, G. A. Effects of chronic lead exposure on the neuromuscular junction in Drosophila larvae. NeuroToxicology. 24, 35-41 (2003).
  22. Ruden, D. M., et al. Genetical toxicologenomics in Drosophila identifies master- modulatory loci that are regulated by developmental exposure to lead. NeuroToxicology. 30, 898-914 (2009).
  23. Peterson, E. K., et al. Accumulation, elimination, sequestration, and genetic variation of lead (Pb2+) loads within and between generations of Drosophila melanogaster. Chemosphere. 181, 368-375 (2017).
  24. Peterson, E. K., et al. Asymmetrical positive assortative mating induced by developmental lead (Pb2+) exposure in a model system, Drosophila melanogaster. Current Zoology. 63, 195-203 (2017).
  25. Peterson, E. K. Consequences of developmental lead (Pb2+) exposure on reproductive strategies in Drosophila. , University at Albany-State University of New York. Dissertation (2016).
  26. Chifiriuc, M. C., Ratiu, A. C., Popa, M., Ecovolu, A. A. Drosophotoxicology: An emerging research area for assessing nanoparticles interaction with living organisms. International Journal of Molecular Sciences. 17, 36 (2016).
  27. Lachaise, D., Cariou, M. L., David, J. R., Lemeunier, F., Tsacas, L., Ashburner, M. Historical biogeography of the Drosophila melanogaster species subgroup. Evolutionary Biology. 22, 159-225 (1988).
  28. Elgin, C. R., Miller, D. W. Mass rearing of flies and mass production and harvesting of embryos. The Genetics and Biology of Drosophila. Ashburner, M., Wright, T. R. F. 2a, 112-121 (1978).
  29. Shaffer, C. D., Wuller, J. M., Elgin, C. R. Chapter 5: Raising large quantities of Drosophila for biochemical experiments. Methods in Cell Biology. 44, 99-108 (1994).
  30. Stocker, H., Gallant, P. Getting started: an overview on raising and handling Drosophila. Methods in Molecular Biology. 420, 27-44 (2008).
  31. Jennings, J. H., Etges, W. J., Schmitt, T., Hoikkala, A. Cuticular hydrocarbons of Drosophila montana: geographic variation, sexual dimorphism and potential roles as pheromones. Journal of Insect Physiology. 61, 16-24 (2014).
  32. Drosophila Speciation Patterns. , http://www.drosophila-speciation-patterns.com/rangemaps.html. (2018).
  33. Markow, T. A., O'Grady, P. M. Drosophila: A Guide to Species Identification and Use. , Academic Press. London. (2005).
  34. Werner, T., Jaenike, J. Drosopholids of the midwest and northeast. , River Campus Libraries, University of Rochester. Rochester NY. (2017).
  35. Greenspan, R. J. The basics of doing a cross. Fly Pushing: The theory and practice of Drosophila genetics. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. New York. 3-24 (1997).
  36. JoVE Science Education Database. . Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans. Drosophila Maintenance. , JoVE. Cambridge, MA. (2018).
  37. Castañeda, P. L., Muñoz, G. L. E., Durán, D. A., Heres, P. M. E., Dueñas, G. I. E. LD50 in Drosophila melanogaster. fed on lead nitrate and lead acetate. Drosophila Information Service. 84, 44-48 (2001).
  38. Massie, H. R., Aiello, V. R., Whitney, S. J. P. Lead accumulation during aging of Drosophila and effect of dietary lead on life span. Age. 15, 47-49 (1992).
  39. Akins, J. M., Schroeder, J. A., Brower, D. L., Aposhian, H. V. Evaluation of Drosophila melanogaster as an alternative animal for studying the neurotoxicity of heavy metals. BioMetals. 5, 111-120 (1992).
  40. Zhou, S., et al. The genetic basis for variation in sensitivity to lead toxicity in Drosophila melanogaster. Environmental Health Perspectives. 124, 1062-1070 (2016).
  41. Pitnick, S., Markow, T. A., Spicer, G. S. Delayed male maturity is a cost of producing large sperm in Drosophila. Proceedings of National Academy of Sciences USA. 92, 10614-10618 (1995).
  42. Beauchemin, D. Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 82, 4786-4810 (2010).
  43. Tyler, M. S. Development of the fruit fly Drosophila melanogaster. Developmental Biology, a Guide for Experimental Study. Tyler, M. S. , 2nd, Sinauer Associates Inc. Sunderland, MA, USA. 8-27 (2000).
  44. Ortiz, J. G., Opoka, R., Kane, D., Cartwright, I. L. Investigating arsenic susceptibility from a genetic perspective in Drosophila reveals a key role for glutathione synthetase. Toxicological Sciences. 107, 416-426 (2009).
  45. Bonilla, E., Contreras, R., Medina-Leendertz, S., Mora, M., Villalobos, V., Bravo, Y. Minocycline increases the life span and motor activity and decreases lipid peroxidation in manganese treated Drosophila melanogaster. Toxicology. 294, 50-53 (2012).
  46. Guarnieri, D. J., Heberlein, U. Drosophila melanogaster, a genetic model system for alcohol research. International Review of Neurobiology. 54, 199-228 (2003).
  47. Posgai, R., Cipolla-McCulloch, C. B., Murphy, K. R., Hussain, S. M., Rowe, J. J., Nielsen, M. G. Differential toxicity of silver and titanium dioxide nanoparticles on Drosophila melanogaster development, reproductive effort, and viability: size, coatings and antioxidants matter. Chemosphere. 85, 34-42 (2011).
  48. Gupta, S. C., et al. Adverse effect of organophosphate compounds, dichlorvos and chlorpyrifos in the reproductive tissues of transgenic Drosophila melanogaster: 70kDa heat shock protein as a marker of cellular damage. Toxicology. 238, 1-14 (2007).
  49. Wasserkort, R., Koller, T. Screening toxic effects of volatile organic compounds using Drosophila melanogaster. Journal of Applied Toxicology. 17, 119-125 (1997).
  50. Markow, T. A., O'Grady, P. O. Reproductive ecology of Drosophila. Functional Ecology. 22, 747-759 (2008).
  51. Dev, K., Chahal, J., Parkash, R. Seasonal variations in the mating-related traits of Drosophila melanogaster. Journal of Ethology. 31, 165-174 (2013).
  52. Salminen, T. S., Vesala, L., Laiho, A., Merisalo, M., Hoikkala, A., Kankare, M. Seasonal gene expression kinetics between diapause phases in Drosophila virilus group species and overwintering differences between diapausing and non-diapausing females. Nature Scientific Reports. 5, 11197 (2015).
  53. Miller, R. S., Thomas, J. L. The effects of larval crowding and body size on the longevity of adult Drosophila melanogaster. Ecology. 39, 118-125 (1958).
  54. Peterson, E. K., Ghiradella, H., Possidente, B., Hirsch, H. Transgenerational epigenetic effects of lead exposure on behavior in Drosophila melanogaster. Abstracts of the IBANGS Genes, Brain and Behavior Meeting, May 16-19, 2012, Boulder, CO, 11, Genes, Brain & Behavior 492-493 (2012).
  55. Soares, J. J., et al. Continuous liquid feeding: New method to study pesticides toxicity in Drosophila melanogaster. Analytical Biochemistry. 537, 60-62 (2017).

Tags

Biologi fråga 137 toxikologi ekotoxikologi integrativ beteendemässiga ekotoxikologi emergenta egenskaper emergenta egenskaper vandrande-tredje instar larver puppor eclosion mellan generationerna transgenerationell
Experimentellt protokoll för att använda <em>Drosophila</em> som en ryggradslösa modellsystem för toxicitetstester i laboratoriet
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Peterson, E. K., Long, H. E.… More

Peterson, E. K., Long, H. E. Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory. J. Vis. Exp. (137), e57450, doi:10.3791/57450 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter