Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

הערכת Microarchitectures תלויי-לחץ קולגן ואלסטין, חיים, אנושי התנגדות העורקים על ידי קרינה פלואורסצנטית ללא תווית מיקרוסקופ

Published: April 9, 2018 doi: 10.3791/57451
Automatic Translation
1, 2, 2, 1,3
1Department of Cardiovascular and Renal Research, Institute of Molecular Medicine, University of Southern Denmark, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Southern Denmark, 3Department of Cardiac, Thoracic and Vascular Surgery, Odense University Hospital

Summary

אנו לתאר בדיקות מכניות בו זמנית, 3D-הדמיה של העורקים בדופן מבודדים, לחיות ההתנגדות האנושית העורקים, וניתוחים פיג'י, Ilastik התמונה עבור כימות של אלסטין וקולגן המרחבי הארגון ונפח צפיפות. נדון השימוש של נתונים אלה במודלים מתמטיים של קיר עורקי מכניקה.

Abstract

התרומה פתוגניים של עמידות העורק שיפוץ מתועדת חיוני יתר לחץ דם, סוכרת, התסמונת המטבולית. חקירות ופיתוח מודלים מתמטיים microstructurally מוטיבציה להבנת התכונות המכאניות של העורקים ההתנגדות האנושית מחלה ובריאות יש פוטנציאל לסייע להבין כיצד מחלות וטיפולים רפואיים להשפיע את microcirculation אנושי. כדי לפתח מודלים מתמטיים האלה, זה חיוני כדי לפענח את הקשר בין המאפיינים מכני ו המיקרו-ארכיטקטוני של הקיר microvascular. בעבודה זו, אנו מתארים שיטה שמחוץ עבור בדיקות מכניות פסיבי, בו זמנית ללא תווית תלת מימדי הדמיה של המיקרו-ארכיטקטורה של אלסטין וקולגן בקיר עורקי עורקי התנגדות אנושית מבודדת. פרוטוקול הדמיה ניתן ליישם התנגדות העורקים של כל מין עניין. ניתוח התמונה מתוארים לכימות תנועת i) לחץ-induced שינויים זוויות הסתעפות פנימית פרופריה אלסטי וכן קולגן adventitial יושר באמצעות פיג'י צפיפויות כרך ii) קולגן ואלסטין נקבע באמצעות תוכנת Ilastik. רצוי כל המדידות מכני, דימות מבוצעות על העורקים בשידור חי, perfused, עם זאת, גישה חלופית באמצעות לחץ וידאו-מיקרוסקופ רגיל myography בשילוב עם קיבוע שאחרי הדמיה של כלי מווסת מחדש דנו. זו שיטה חלופית מספק למשתמשים עם אפשרויות שונות עבור ניתוח הגישות. ההכללה של הנתונים מכני, הדמיה במודלים מתמטיים של המכניקה קיר עורקי הנדונה, פיתוח עתידי ותוספות בפרוטוקול מוצעים.

Introduction

התרומה פתוגניים ואת ההשפעות של עמידות העורק שיפוץ מתועדים חיוני יתר לחץ דם, סוכרת, תסמונת מטבולית1,2,3,4,5. לפענח את הקשר בין המאפיינים מכני ו המיקרו-ארכיטקטוני של הקיר microvascular חיוני לפיתוח מודלים מתמטיים של עמותה זו. מודל שכזה לשפר את הבנת תהליך שיפוץ, יתמוך ההתפתחות במודלים silico שימושי לבדיקת אסטרטגיות תרופתי מיקוד מחלות הקשורות שיפוץ של הקיר עורקי.

מחקרים קודמים התמקדו בהבנת המיקרו-ארכיטקטורה של הקיר עורקי מתייחס מכניקה קיר העורק על ידי שילוב אמצעים מכניים וכיצד המיקרו-ארכיטקטורה של מטריצות (ECM) מבוצעות באופן כמעט בלעדי על גדול , צינור גמיש העורקים של עכברים או חזיר6,7,8,9,10,11. הדמיה של מזערים הקיר מתבצעת בדרך כלל באמצעות טכניקות אופטית לא-ליניאריות, מנצל autofluorescence של אלסטין, הדור השני הרמונית על ידי קולגן. פעולה זו מאפשרת הדמיה זמן-מרחבי של שני מרכיביה העיקריים של מטריצה חוץ-תאית, אלסטין קולגן, ללא צורך מכתים. הדמיה של הקיר עורקי בעובי מלא הוא אתגר בתוך צינור גדול עורקים עקב פיזור של האור בתקשורת tunica עבה. עם זאת, כדי לקבוע כיצד המיקרו-ארכיטקטורה של הרכיבים המבניים של הקיר עורקי להתייחס התכונות המכאניות נצפתה, יש להשיג מידע תלת מימדי במהלך הבדיקה מכני. עבור עורקים גדולים כמו העורקים אנושי, זה דורש הרכבה biaxial, מכני בדיקות הדמיה של אזורים עניין ב- 1-2 ס מ2 חתיכות של עורקי קיר7,9,10, 12. רק חלק הקיר יכול להיות עם תמונה ונבדק באופן מכני.

עבור עורקים קטנים יותר של כל מין (למשל, סביב הלב האנושי13, ריאתי14 ותת עורית15 העורקים, עכברוש העורקים מצע המעי העליון16,17,18, 19 , 20, העכבר cremaster, מצע המעי העליון, מוחי, הירך ואת עורק21,22,23,24,25,26, 27) הדמיה של עובי קיר שלם הינה אפשרית, יכול להיות משולב עם בדיקות מכניות. דבר זה מאפשר הקלטה בו זמנית של תכונות מכאניות, הסידורים מבניים בתוך הקיר. עם זאת, מידול מתמטי ישירה של יחסי הגומלין בין השינויים שנצפו במבנה תלת מימדי של ECM שהשתנו תכונות מכניות של הקיר עורקי ההתנגדות, לפי מיטב ידיעתנו רק דווחה על לאחרונה, ההתנגדות האנושית העורקים13,15.

בעבודה זאת, מתוארת שיטה שמחוץ עבור בדיקות מכניות פסיבי, הדמיה תלת מימדי בו זמנית של המיקרו-ארכיטקטורה של אלסטין וקולגן בקיר עורקי עורקי התנגדות אנושית מבודדת. פרוטוקול הדמיה ניתן ליישם התנגדות העורקים של כל מין עניין. ניתוח התמונה מתוארים להשגת למדידת זוויות הסתעפות פנימית פרופריה אלסטי, יושר קולגן adventitial13 באמצעות פיג'י28. צפיפות האחסון קולגן ואלסטין נקבעים באמצעות תוכנת Ilastik29 ונדון בסופו של דבר, ההכללה של הנתונים מכני, הדמיה במודלים מתמטיים של המכניקה קיר העורק.

מטרתו לתאר את הבדיקות לדימות ותמונה טכניקות בשילוב עם מודלים מתימטיים היא לספק החוקרים בגישה שיטתית כדי לתאר ולהבין נצפו שינויים בלחץ המושרה ה-ECM של התנגדות העורקים. השיטה המתוארת מתמקדת ב לכימות השינויים ECM מגרגרי בזמן לחץ, על-ידי השוואת מבנה ה-ECM-20, 40 ו- 100 מ מ כספית. הלחצים הללו נבחרו לקביעת המבנה של החומה העורקים שלו תואם יותר (20 מ מ כספית), נוקשה (100 מ מ כספית) ומצב ביניים (40 מ מ כספית), בהתאמה. עם זאת, כל תהליך בדופן כלי הדם העורקים בשידור חי, כולל שינויים המושרה על ידי רכיבים vasoactive, היסטרזיס וזרימה, ניתן לכמת, בהתאם ההשערה במחקר המדובר על-ידי החוקר.

השימוש של שני הפוטונים עירור קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ (TPEM) בשילוב myograph לחץ לשינויים לומד לחץ (או השני) הנגרמת ב- ECM העורקים בשידור חי מודגשת. קודם כל, כי זה מאפשר רכישת סימולטני של מבנה תלת-ממדי הכולל של החומה עורקי (קוטר וקיר עובי) יחד עם רכישת תלת-ממדי ללא תווית של איכות גבוהה, מפורט תמונות של קולגן, אלסטין microarchitectures כמו שמתואר13 על-ידי ניצול של autofluorescence של אלסטין, קולגן השני דור הרמונית אות (SHG)30. שנית, TPEM מאפשר שימוש של אור אנרגיה נמוכה-סגול עירור, מזעור נזקי של רקמות, לפיכך, הדמיה חוזרות ונשנות-בדיוק באותה התנוחה בתוך קיר וסקולרית מותרת, המתיר ניתוח מדידות חוזרות של שנצפו שינויים.

השימוש בגישה אלטרנטיבית באמצעות הדמיה קונאפוקלית של לחץ קבוע העורקים נדון כדי לאפשר למשתמשים ללא גישה TPEM הזדמנות להשתמש בשיטה המתוארת גם כן. גם ניתן יהיה לאחזר מידע על צפיפות במבנה ונפח ECM מניתוחי דו-ממדית של רקמות למחלקה של יציאה טורית, למשל כפי שמתואר על ידי31,32. עם זאת, בשל היעדר אפשרות לאחזר נתוני מבנה תלת-ממדי על המאזניים אורך של העורק, כמו גם במהלך שינוי תנאי השימוש בשיטה זו, זה לא מומלץ שימוש בגישה זו החקירות של לחץ, טיפול המושרה תלת מימדי לשינויים ECM.

הדרישה המינימלית עבור החוקר להחיל את שיטת המתוארים במסמך זה היא הגישה אל מלכודת תעלות, לחץ עורקי בשילוב עם מיקרוסקופ קונפוקלי או שני הפוטונים עירור קרינה פלואורסצנטית. ההגדרה תיאר בפרוטוקול הבא תהיה myograph לחץ לפי הזמנה עם מתמר כוח האורך, שנבנה כדי להתאים מיקרוסקופ פלורסצנטיות עירור מותאם אישית שני הפוטונים בנוי הפוכה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

אוסף של ביופסיות של הכפורת הקודקוד אנושיים לשימוש בעבודה זו בוצעה לאחר בכתב הסכמה מדעת, כפי שתואר לעיל33. המחקר של רקמות לציית העקרונות המתוארים בקוד הצהרת הלסינקי34 , אושרה על ידי ה ועדות אתיקה במחקר בריאות דרום דנמרק (S-20100044 ו- S-20140202), הסוכנות להגנת נתונים דנית.

1. לאסוף את רקמת עורק התנגדות בידוד (האדם)

  1. לאסוף דגימות רקמה עניין מיד לאחר הכריתה במהלך ניתוח. העברת הרקמה עד 4 ° C HEPES buffered פיזיולוגיים תמיסת מלח (HBS) מיד על אוסף ואחסן אותו ב- HBS.
    הערה: ברקמות אנושיות רק נאספים לאחר אישור על ידי ועדות אתיות המוסדיות הרלוונטיים, כמו גם הסכמה בכתב של המטופלים. קומפוזיציה HBS במ מ: NaCl 144, אשלגן כלורי 4.7, CaCl2 2.5, MgSO4 1.2, ח'2PO4 1.2, HEPES 14.9, גלוקוז 5.5. להתאים את ה-pH 7.4 עם NaOH, לסנן את המסנן למרות 0.2 µm פתרון.
  2. השאירו את הרקמה שנאספו HBS סטרילי ב 4 ° C לילה לשטוף הרדמה.
    הערה: כל השפעה של אחסון לילה על תקינות כלי ופונקציונליות צריך להיבדק על ידי המעבדה מחקר אישיים.
  3. בזהירות לבודד ההתנגדות בגודל העורקים (± 200 מיקרומטר לומן קוטר) באמצעות זוג חד-טיפ מלקחיים ומספריים ניתוח מיקרו.
  4. לאחסן את העורקים ב 4 ° C כקרח HBS תוך הטרמה תא הדמיה/לחץ.

2. הר העורק מבודדים ב Myograph הלחץ

  1. הר כגון זכוכית עם עצה קטרים של מיקרומטר ~ 80 על מחזיקי גליליים. מקם את מיקרומטר טיפים כ 150 מעל החלק התחתון זכוכית קאמרית.
    הערה: 45° עצה גהר גליליים עשוי לאפשר מיקום מדויק של כלי השיט מעל רצפת הזכוכית.
  2. למלא גם כניסה וגם שקע אבובים עם HBS עם 1% BSA וחבר מערכת הלחץ.
    הערה: BSA הינו כלול כדי לשמר את תפקוד תאי אנדותל.
  3. לטעון את העורק מבודדים בעזרת שני תפרים קשר כפול לכל בצינורית.
    הערה: קשרים יכול להיות מוכן מראש ומאוחסנים על סקוטש כפול עד שהוא נדרש.
  4. למלא את החדר עם HBS ומניחים שני קשרים כפולים על כל בצינורית זכוכית.
    הערה: בעת שימוש העורקים הצגת צליל myogenic, HBS צריך להיות מוחלף עם סידן ש-HBS בחינם בתוספת 3 מיקרומטר EGTA ו 3 מיקרומטר חמצן.
  5. החזק בעדינות את העורק בקצה אחד באמצעות שני זוגות של מלקחיים קצה חד. פתח לומן של העורק והחלק בעדינות אותו על גבי הצינורית. תקן על הצינורית באמצעות שני קשרים.
  6. החל בלחץ של 5 מ מ כספית לשטוף בעדינות לומן עם HBS / 1% BSA.
  7. נקרר את הקצה השני של העורק ואבטח אותו על הצינורית באמצעות שני קשרים כפולים.
  8. להעביר את myograph על הבמה מיקרוסקופ ואת תתאימי את העורק עד 5 מ מ כספית (כניסת הלחץ = לחץ outlet), ואז מחממים עד 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  9. אופציונלי: כיילו מתמר כוח האורך לפי הוראות היצרן (1 גרם = 9.81 mN).
    הערה: זה חיוני כדי לכייל את מתמר כוח לאחר חימום כפי שהוא רגיש לטמפרטורה.

3. לבצע ניסוי: הדמיה של קוטר העורקים, עובי הקיר, קולגן, אלסטין המיקרו-ארכיטקטורה באמצעות TPEM

  1. סריקה מהירה את העורק cannulated מווסתת 5 מ מ כספית באמצעות X 20 אובייקטיבי (מפתח נומרי (NA) ≥ 0.8) צריכת חשמל נמוכה עירור אור כדי להעריך את עובי קוטר וקיר כלי ב- 5 מ מ כספית.
    הערה: עבור מיקרוסקופים הפוכה, השתמש מטרה טבילה במים; לשימוש מיקרוסקופים זקוף, מים טובלים אובייקטיבי. אם המטרה אין קולר תיקון לתיקון מכסה עובי, הקפד להתאים בתגית כיסוי בשימוש עם המטרה בשימוש. הגדרות התוכנה והתיאורים עשוי להשתנות בהתאם למשתמש-לאטמוספרה, מיקרוסקופ והתוכנות בהם נעשה שימוש.
    1. תוכנית ההתקנה את הנתיב אופטי.
      1. להפעיל את הלייזר שני הפוטונים מאי טאי ולהגדיר אותו אור 820 של עירור ננומטר.
        זהירות: הימנעו כל חשיפה לאור לייזר גלוי, כמו גם בלתי נראה.
      2. לאסוף את פליטת במקביל בשני ערוצים. לפצל את פליטת אור בין photomultipliers באמצעות nm מעבר ארוך מראה ודיקרואיק זוהר 460 פליטת איסוף באמצעות 30-60 ננומטר bandpass רחב מסננים מרוכז בכל 520 nm (אלסטין) ו 410 nm (קולגן), בהתאמה.
    2. הפעל סריקה רציפה עם 10 µs לייזר להתעכב זמן לפיקסל ו 512 × 512 פיקסלים עבור 100% שדה ראייה.
    3. סרוק באופן ידני דרך העורק כדי לקבוע את העומק שבו נצפית מאקסימאלי.
    4. בחרו פרוסה מלבני מכסה קוטר הרחבה של העורק ולסרוק מסגרת אחת עם פיקסל גודל ≤ 300 ננומטר לפיקסל (איור 2C). כדי להשתמש כוח האור עירור נמוכות פיקסל זמן להתעכב ככל האפשר להימנע photodamaging את העורק בשידור חי.
      הערה: מומלץ להשיג מלבני, למשל., 100 × 1024 פיקסלים בתמונה, יותר מאשר תמונה ריבועית בעמדה זו כדי לחסוך זמן, להגביל את החשיפה פוטון של רקמות (איור 2C).
    5. שמור את התמונה עבור בהמשך מנתח.
  2. לקבוע את עובי קוטר וקיר לומן-הקוטר המרבי של העורק.
    1. טען את התמונה בפיג'י.
    2. קבע את קנה המידה על-ידי לחיצה על תפריט ראשי | לנתח | לקבוע קנה מידה והזן יחס לפיקסל מיקרומטר, פיקסל (מומלץ מאוד לשמור על היחס פיקסל 1:1).
    3. בחר בכלי קו פיג'י, למתוח קו ברור בין שני סחוס אלסטי פנימי בכל צד של לומן עורקים ולחץ ctrl + M. פיג'י אורך דוחות כברירת מחדל בטבלת התוצאות.
    4. באופן דומה, לצייר קווים יותר למדידת עובי של כל אחד מהקירות, לחץ על ctrl + M כדי למדוד את הסימונים הבאים.
    5. שמור את המידות.
  3. התמונה קולגן ואלסטין המיקרו-ארכיטקטורה-5 מ מ כספית על-ידי סריקת כל עובי הקיר עורקי, קבלת אוספי תמונות תלת-ממד עם איכות טובה עבור 1-3 אזורים מעניינים לאורכו של העורק.
    1. להשיג את אוספי תמונות דרך קיר שלם של העורק באמצעות 60 X אובייקטיבית, ≥ 1 נה, מידות פיקסלים ממוטבת, z-ריווח.
      1. לחשב את התנאים הדמיה אופטימלית (מידות פיקסלים ו- z-צעד ריווח) לפי מסלול אופטי, טבילה בינוני ולטעום מדדי השבירה באמצעות המחשבון המדעי אמצעי הדמיה נייקוויסט (https://svi.nl/NyquistCalculator).
        הערה: נא לשים לב כאן ההבדל בין גודל הפיקסל אופטימלית z-המרווח לעומת העצה בסעיף 3.4. מעל על השימוש של גודל פיקסל מרבי .
    2. להשתמש באותן עירור, פליטה ההגדרות כמו לעיל (3.1.1.).
    3. סריקה מהירה הקיר כלי כמתואר לעיל כדי לקבוע את העובי של הערימה-z.
    4. להגדיר את z-מחסנית ההתחלה סוף עומק, z-צעד ריווח ואת צפיפות פיקסלים (מחושבת באופן 3.3.1.1.) ולבצע את z-הסריקה. שמור כל ערוץ בנפרד.
      הערה: התמונות צריך להיות קטן מספיק למשל 30 x 30 מיקרומטר או 50 × 50 מיקרומטר בהתאם לגודל הכלי כדי למנוע השפעה של עקמומיות של הניתוחים תמונות עוקבות.
  4. לקבוע קוטר העורקים, עובי הקיר, המיקרו-ארכיטקטורה אלסטין וקולגן ב לחצים הנותרים של פרוטוקול.
    1. חזור על 3.1-3.2-לחצים 10 ו- 20 מ מ כספית, לחזור 3.3-לחץ 20 מ מ כספית.
    2. חזור על 3.1 ו- 3.2-לחץ 40 מ מ כספית.
    3. 3.1-3.2-לחצים 60, 80 ו 100 מ מ כספית חוזר וחוזר 3.3-100 מ מ כספית.
      הערה: 3.1-3.3 יכול לחזור על כל הלחצים, שילובים של לחצים (למשל סדרת/שילוב של לחצים גם כמו הפחתת הגוברת), בהתאם ההשערה להיבדק. אאוזין בריכוז 0.3 - 1 מיקרומטר עשויים להתווסף כדי לשפר את אלסטין autofluorescence במקרה של photobleaching. ניתן להימנע Photobleaching על-ידי החלת כמו צריכת חשמל נמוכה עירור קלים ככל האפשר.
    4. להחליף את המאגר בבית הבליעה myograph טריים 37 ° C HBS לאחר כל שלב לחץ. לאפשר את העורק להסתגל במשך 5 דקות לפני הדמיה בעקבות כל שינוי בלחץ.
  5. לאחסן ערוץ ערימות עבור ניתוח תמונה בנפרד.
  6. בדיקת הכדאיות של העורק.
    1. החלת 10 מיקרומטר U46619 בבית הבליעה myograph ואחריו התוספת של 10 מיקרומטר bradykinin בעת כיווץ יציב נצפית.
    2. להקליט קוטר ו הקיר עובי כמתואר לעיל בסעיף 3.1 בעקבות היישום של כל אחד של תרכובות.
    3. להוסיף 3 מיקרומטר חמצן כאשר העורק הוא לא מורחבים לגמרי בעקבות התוספת של עובי קוטר וקיר bradykinin ולהקליט.
      הערה: בהתאם תכונות פרמקולוגיות של העורק עניין (מיטה כלי דם ו מינים) אחרים מצר את כלי הדם וחיבורים מרחיב כלי דם (תלויי-אנדותל) יכול לשמש.
  7. אופציונלי: לתקן את העורק בלחץ או להמשיך עם הדמיה של קולגן ואלסטין עבור אמצעי האחסון צפיפויות (שלב 7).
    1. להוסיף 4% פורמלדהיד 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) ב 37 מעלות לשעה.
    2. לשטוף את העורק קבוע 3 פעמים ב- PBS 1 x והחלק בעדינות את העורק מחוץ גליליים, נוגע רק את החלקים של העורק בחוץ הקשרים. לא להסיר את הקשרים, להשתמש בהם עבור מחזיק את העורק בעת העברת צינור אחסון.
    3. חנות 1 x PBS / 0.05% אזיד הנתרן ב 4 ° C עד הדמיה אלסטין וקולגן צפיפות האחסון או למטרות אחרות.
      הערה: עורקים קבוע ניתן לאחסן במשך 3 חודשים לפחות 1 x PBS / 0.05% אזיד הנתרן ב 4 º C.

4. חישוב מתח מתח מערכות יחסים וקשיחות קיר פנימי

  1. נא בצע את הנוסחאות ואת צעדי החישוב לחישוב מדגיש, זנים, קשיחות קיר כפי שתואר על ידי Bloksgaard, מ. et al. 13 , הפניות במסמך זה.

5. ניתוח - (פרופריה אלסטית פנימית) אישור IEL מסעף זוויות תמונה

  1. אוסף תמונות פתוח בפיג'י. עבור אל קובץ | תמונה פתוחה לבחור אוסף תמונות.
    הערה: מקס תחזיות בעוצמה סעיפים 2-7 ברציפות z-מכסה את אישור IEL (1-2 מיקרומטר עובי) משמשים לקביעת אישור IEL אלסטין סיבים מסעף הזוויות בעזרת הכלי זווית פיג'י28,35. עיין 4A איור להמחשה.
  2. ללכת תמונה | ערימות | פרוייקט z. לבחור את התמונות ואת "הטלה בעוצמה מקס".
  3. שמור את הטלה בעוצמה מקסימלית כקובץ TIFF.
  4. לבחור נקודות הסתעפות סיבים אישור IEL רבות ככל האפשר באמצעות הכלי"זווית" ולעבוד באופן שיטתי באמצעות התמונות. לחץ על ctrl + M כדי למדוד כל זווית.
  5. שמור את הגיליון תוצאות פיג'י.

6. ניתוח - קולגן Adventitial Waviness תמונה

  1. אוסף תמונות פתוח בפיג'י. עבור אל קובץ | פתח תמונה לבחור אוסף תמונות.
    הערה: מקסימום עוצמת תחזיות סעיפים 2-7 ברציפות z-כיסוי קולגן ממש מחוץ חיצוני הנדן אלסטי (צלופח, עובי 1-4 מיקרומטר) משמשים לקביעת קולגן waviness באמצעות תוסף פיג'י NeuronJ36 כפי שתואר על ידי Rezakhaniha, R . ואח. 37 (איור 4B).
  2. קבע את קנה המידה. עבור אל לנתח | לקבוע קנה מידה להזין מידות פיקסלים.
  3. ללכת תמונה | ערימות | פרוייקט z. לבחור תמונות כדי לעבוד עם "מקס הטלה בעוצמה".
  4. לשנות סוג תמונה 8 bitt TIFF על-ידי לחיצה על תמונה | סוג | 8 bitt ולשמור את הטלה בעוצמה מקסימלית כקובץ TIFF.
  5. למדוד יושר סיבי הקולגן באמצעות התוסף J נוירון פיג'י.
    1. לפתוח את התוסף NeuronJ על ידי לחיצה פיג'י | תוספים | נוירון J.
    2. פתח את 8 סיביות TIFF ב NeuronJ על ידי לחיצה טען תמונה | בחר בקובץ.
    3. לחץ על הוסף לשרטוטיםובחר סיבים כדי לנתח על ידי לחיצה על ההתחלה והסוף של כל סיב.
    4. לחץ על מדד לשרטוטים, בחר להציג מעקב (Lf) ומדידות קודקוד בתיבת הדו-שיח.
  6. לחשב מיזוגי L0/אם ב- excel (או דומה) ולשמור את התוצאות.
    1. העתק והדבק לשרטוטים פיג'י נוירון J פלט קודקודים להצטיין (או דומה) ולחשב מיזוגי L0 באמצעות המשפט של פיתגורס מן המדידות קודקוד. הנקודה הראשונה והאחרונה בקו מציינים את העמדות של קצות היתר במערכת קואורדינטות 2D.
      הערה: מיזוגי L0/אם [צרור סיבי קולגן end-to-end אורך באמצעות קו ישר (מיזוגי L0) / מלא אורך (Lf)] קרוב 1 מציין של סיבי קולגן כמעט ישר.

7. הדמיה קולגן, אלסטין נפח צפיפות

  1. לשטוף את העורק (קבוע) 1 x ב- PBS כתם זה למשך 15 דקות 1 מיקרומטר אאוזין ב- 1 x PBS בחושך. עבור קבוע העורקים, לבצע שלב זה בטמפרטורת החדר.
    הערה: אאוזין משפר את אלסטין זריחה. אאוזין אכתים מבנים אחרים כגון קולגן, הציטופלסמה תא אם המדגם הושארה הפתרון מכתימים במשך זמן ממושך. אם צביעת מבנים אחרים היא חזקה מדי, להוריד את ריכוז אאוזין מיקרומטר 0.3 או לחזור על הכביסה.
  2. לשטוף את העורק 3 ב PBS 1 x-x
    1. עבור קבוע עורקים: לטעון את העורק עבור הדמיה.
      התראה: הדמיה של כלי שיט שאינו מווסת אינו מאפשר באחזור מידע כמותי גיאומטריים. כאשר מוחלט כמויות נדרשות, אלה תמיד ניתן להגיע על חיים, מווסת את העורקים. נפח-יחסי ניתן להשיג על העורקים שאינם מווסתת באמצעות שיטה זו.
      1. במקום שתי חתיכות של דבק כפול קלטת 1-1.5 ס מ זו מזו על הזכוכית האובייקט. סקוטש כפול הוא עבה כ 100 מיקרומטר. החלת אחד או יותר שכבות של נייר דבק כדי להתאים את הקוטר של העורק שיש לטעון.
      2. מקום 10-20 µL ל- PBS על הזכוכית במרכז הכיכר ולמקם את העורק בתיבה הנפתחת PBS.
        הערה: הירידה צריך להיות כמו קטנים שטוחים ככל האפשר כדי להימנע דוחף את העורק התפקיד בעת התקנת בתגית כיסוי.
      3. מקם את coverslip והקש על סקוטש כפול.
      4. מילוי המאגר בין coverslip לבין האובייקט זכוכית עם 1 x PBS. למלא כל שעה כדי למנוע ייבוש של המדגם.
  3. לקבל תמונה-ערימות של קולגן ואלסטין צפיפות האחסון באמצעות מטרה X 20 עם נה > 1 כדי לכסות כל כך הרבה של הקיר העורקים ככל האפשר אך עדיין עם רזולוציה אופטית טובה (איור דו-ממדי, 2 G ו- 2 H).
    הערה: השתמש מטרה טבילה במים עבור הדמיה של העורקים קבוע תחת coverslip, והשתמש מים טובלים המטרה עבור הדמיה של העורקים החיוניים. אם המטרה אין קולר תיקון לתיקון מכסה עובי, הקפד להתאים את coverslip אל המטרה. רצוי להשתמש z ריווח וגדלים פיקסל אופטימלית. לחשב את אלה באמצעות המחשבון נייקוויסט (שלב 3.3.1.1.). לחלופין, השתמש גודל הפיקסל המזעריות של 300 ננומטר ו- z-מרווח של 1 מיקרומטר. מומלץ לקבל שלוש תמונות לאורכו של העורק כדי לאפשר למשתמש לקבוע אינטרה-assay השתנות.
  4. אלסטין התמונה באמצעות 820 nm עירור אור ולסנן באמצעות פליטת איסוף 30-60 ננומטר bandpass רחב ממורכז-520 ננומטר.
  5. קולגן תמונות באמצעות אור עירור ננומטר 990 כדי למנוע כל עירור של אלסטין וחלבונים אחרים autofluorescent ולאסוף פליטה באמצעות מסנן 10-30 ננומטר bandpass רחב ממורכז-495 ננומטר.
  6. שמור אוספי תמונות של כל ערוץ בנפרד כקובצי TIFF

8. התמונה ניתוח לחילוץ וסיבי קולגן צפיפות האחסון באמצעות Ilastik

  1. להמיר אוספי תמונות TIFF כדי HDF5 באמצעות פיג'י28,35 על-ידי לחיצה על בחר קובץ | שמירה בשם... HDF5.
  2. ליצור שתי תיקיות בקובץ הנתונים על הכונן הקשיח של המחשב, עבור אלסטין, אחד עבור אוספי תמונות קולגן, בהתאמה. העתק אוספי תמונות רלוונטיות אל התיקייה הרלוונטיים.
  3. ליצור שני פרויקטים חדשים של Ilastik התוכנה Ilastik, אחד של אלסטין, אחד עבור קולגן, בהתאמה.
    1. פתח Ilastik | ליצור פרוייקט חדש | סיווג פיקסל | פרוייקט חדש | להוסיף נתונים בחר תמונת התיקיה שנוצר בשלב 8.2.
      הערה: בצע את אשף Ilastik.
  4. לייבא מחסנית אחת תמונה תלת-ממדית כדי לאמן את התוכנה.
    1. בחר את היישומון קלט נתונים | סביבת העבודה המרכזי באזור | הכרטיסיה נתונים גולמיים | הוספת חדש... | להוסיף כתמונות נפרד ובחרו את נתוני התמונה הרצוי
  5. בחר באפשרות ' תכונות רלוונטיות התוכנה.
    1. יישומון בחירת תכונות פתוח | בחר תכונה אשר פותח תיבת דו-שיח חדשה. לפרטים, ראה איור 5A .
  6. להוסיף לפחות שתי תוויות באמצעות לחצן הוסף תווית מתחת יישומון ה הכשרה.
    הערה: בכל תווית יתאים את סוג אובייקט זה צריך להיות מופרדים. בעבודה זאת, תוויות שלושה משמשים אלסטין: אלסטין עצמה, כתמים בהירים (כדי להיות נכלל), ואת הרקע (כדי להיות נכלל).
  7. צייר תוויות על גבי הערימה תמונת raw שימוש במברשת צבע מנוסח כלי ביאור.
    1. בחר בתווית המתאימה: לחץ על הכלי מברשת ולהתחיל ציור.
  8. מנחה Ilastik לנתח של אוסף התמונות ולחפש תכונות דומות על ידי לחיצה על הפעל עדכון חי.
  9. בדוק היטב את המפה חיזוי (איור 5D).
    הערה: התהליך מתמונת raw, מפת חיזוי מלא מוצג באיור5. Ilastik שימושים מחסנית המפה חיזוי כדי לחלק את התמונה על פי איזה לייבל פיקסל יש סבירות גבוהה יותר להיות קשורה (איור 5D).
  10. החל סף.
    1. בחרו קביעת סף יישומוןלבחור בשיטה המתאימה למקרה, תווית קלט, חלקה, סף, גודל סינון פרמטרים, ולבסוף לחץ על החל.
      הערה: זה segregates את חלקי התמונה באופן דומה שכותרתו לעצמים נפרדים. רקמת מאוד מחובר, כמו אלסטין וקולגן אינו צריך להיות הפרדה, לכן, הסף של 0.4 מוחל (ברירת המחדל היא 0.5). איור 5E ו- 5F להדגים התוצאה של החלת סף.
  11. חזור על ההכשרה של Ilastik עד התוצאה הוא משביע רצון (רק אלסטין, בהתאמה קולגן מזוהה עבור הבדיקות המתאימות).
    1. לעתים קרובות מעבר בין האימונים, פילוח (לפעמים גם את קביעת סף) יישומוני בתהליך זה. דוגמא להשפעה של מאמן Ilastik מוצג באיור 6.
  12. אצווה לנתח את נתוני תמונה דומה: לבחור בחירה קלט של חיזוי אצווה ולהוסיף את הקבצים הרלוונטיים.
    הערה: Ilastik פלט הוא אוסף של אוספי תמונות 3D מדומה - סיבית (במסיכות תמונה) עם 0 (אפס) המציין היעדר אלסטין (או קולגן) ו- 1 (אחד) המציין את הנוכחות ב (עומק הסיביות בפועל הוא 8 סיביות).
  13. ודא את התוצאות עבור כל אוסף תמונות על-ידי השוואת באופן חזותי את המסכות תמונות וקבצי ה-raw התמונה.
  14. למטב את המסכה Ilastik (שלבים 8.4-8.9) ולנתח מחדש את כל אוספי תמונות עם תוצאות לא מספקות.
  15. חישוב צפיפות האחסון אלסטין וקולגן מ Ilastik במסיכות תמונה בתוכנת MATLAB
    1. פתח MATLAB.
    2. בחר את התיקיה עם ilastik במסיכות תמונה ב- MATLAB "תיקיה נוכחית" חלון.
    3. להעתיק את התסריט MATLAB 1 קובץ משלים למערכת MATLAB ושמור את הקוד volumeCalculator.m MATLAB תיקיה בכונן הקשיח המחשב.
    4. הזינו מידות פיקסלים וגובה פיקסל בשורות ה-script
      pixelSize = 0.1230000 * 0.1230000; מיקרון % * מיקרון
      pixelHeight = 0.9; % מיקרון
    5. שמור את קובץ ה-script.
    6. עבור אל חלון הפקודה MATLAB והזן "volumeCalculator (" נתיב-כדי-נתונים ') "כדי לטעון את קובץ ה-script.
    7. לחץ על הזן. כל מסכה התמונה עכשיו סיכם, מוכפל האחסון פיקסל (ידוע) / voxel (הממדים הפיזיים של פיקסל כפול הרזולוציה ציר z). הפלט של MATLAB הוא הנפח הכולל של אלסטין וקולגן בערימה כל תמונה.
  16. שמור את התוצאות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Myograph לחץ לפי הזמנה עבור הדמיה להשתמש בעבודה זו מוצג באיור1. תשומת לב מיוחדת לעיצוב myograph הוקדשה i) קאמרית עם נפח קטן (2 מ"ל) ואפשרות ii) כדי למקמם את גליליים מקרוב ומקבילי עם תחתית זכוכית (איור 1B). החלק התחתון של החדר מתאים של 50 × 24 מ מ #1.5 זכוכית coverslip (להחלפה). הבקר לחץ נבנה בין בקבוק זכוכית 1 ליטר סטנדרטי של מד לחץ דם (השרוול הוסר). מלכודת myograph עם דרישות הזרימה, מומלץ השימוש בקר לחץ servo.

איור 2 מדגים את העמדות המומלצת להשגת תמונות יחיד, אוספי תמונות במהלך הניסוי שפורטו בפרוטוקול. להמחשה, תמונת מיקרוסקופ אור שידור של העורק הנטען נכללת באיור 2A. אורך הקשר לקשר של העורק הנטען הוא כ 1.6 מ מ. העורק נסרק עד לקוטר הרחב ביותר נצפית (איור 2B), בשלב זה, עובי הקיר, כולם הם קבעו (איור 2C). באופן דומה, תמונת אור שידור של העורק הוא כלול איור דו-ממדי, מציג את המיקום, מומלץ רוחב אוספי תמונות לקביעת את microarchitectures של קולגן (איור 2E) ואלסטין (איור 2F, קטן כיכר איור דו-ממדי) כמו גם אוספי תמונות לקביעת קולגן (איור 2G) את וצפיפות נפח אלסטין (איור 2 H) (ריבוע גדול, איור דו-ממדי). באמצעות גישה זו, הנתונים עבור בניית לחץ בקוטר עקומות, ואחריו את החישוב של עקומות לחץ-זן המתאימים ניתן להשיג מידות עובי לחץ, קוטר וקיר (איור 2C).

התאמה מעריכי יחיד של קשר הגומלין מתח-זן לפי Bloksgaard et al. 13 הפניות במסמך זה, מספק הערך-β, גיאומטריה עצמאית מידת קשיחות קיר פרופורציונלי הנפח מצטבר, Einc. חישוב Einc ב הלחצים השונים-אילו תמונות עבור קולגן ואלסטין התקבלו microarchitectures, מאפשר ניתוח ישירה של הקשר בין שינויי הלחץ הנגרם microarchitectures של קולגן ואלסטין את הנפח מצטבר על לחצים שונים (איור 3). מדידת זוויות מסעף אישור IEL, יושר קולגן מודגם באיור4.

חשובות על הפרשנות של נתונים מכאניים השוואת קבוצות של שניים או יותר מעניינים, כגון לחץ דם גבוה לעומת normotensive חולים, היא קביעה של התוכן של אלסטין וקולגן. לשם כך, פותחה שיטת ניתוח אוטומטית ב Ilastik, תוכנת ניתוח התמונה freeware יכולים להיות מאומנים לזהות תכונות תמונות מסוימות. זרימת העבודה ב- Ilastik מודגם באיור5.

איתור אוטומטי אלסטין וקולגן עבור הצפיפויות נפח, זה חשוב כי יש יחס אות לרעש טוב של תמונות שהושג. בדגימות אנושי, autofluorescence משמעותית של קולגן נצפית לעיתים קרובות בנוסף האות SHG קולגן. זה מקטין את יחס אות לרעש איתור אלסטין. איור 6 ממחישה איך אימון מחדש של התוכנית Ilastik יכול לגרום הכרה טובה יותר של סיבי אלסטין דק במדגם עם קולגן משמעותית autofluorescence "ירוק" / אלסטין ערוץ. אם הדימום-דרך של האות autofluorescence לתוך התעלה SHG קולגן היא בעיה, קבלת האות SHG באמצעות אורך גל ארוך יותר עירור עשוי לעזור. אם הערוץ לדמם דרך מתרחשת לאחר צביעת עם אאוזין, צריך להיות הנמיך את הריכוז של הפתרון יישומית של eosin. אאוזין נשטף בקלות, אז כביסה חוזרות ונשנות של המדגם מוכתם עשויה להקטין את האות גם.

Figure 1
איור 1 . שנבנה במיוחד לחץ myograph עבור הדמיה קרינה פלואורסצנטית. (א) זלוף קאמרית עם נימים זכוכית המצורפת את micromanipulators, אשר מותקן על כוח מתמר (האורך כוח). (ב) 2 מ ל הדמיה קאמרית. 45° כיפוף של גליליים מקלה על הדמיה באמצעות מיקרוסקופ הפוכה. (ג) הלחץ בקר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 . בשילוב הלחץ myography, זריחה הדמיה אסטרטגיה. (א) שידור אור התמונה של העורק עם איור של (ב) הסריקה של רוחב מלא של העורק. הקולגן SHG מוצג ירוק ולאחר אלסטין autofluorescence ילבשו ארגמן. (ג). קוטר העורקים לומן (כאן 238 מיקרומטר), עובי הקיר (כאן 17 ו- 18 מיקרומטר העליון והתחתון, בהתאמה) נקבע-באיזור קו המשווה (קוטר הגדול ביותר שנצפה) של העורק. (ד) שידור התמונה אור של העורק עם האיור של העמדה של z-מהערימות שהושג בקנה מידה 10-50 מיקרומטר לקביעת יושר קולגן (E), (נ) מסעף זוויות של סחוס אלסטי פנימי, z (G)-לקבלו של 50-100 מיקרומטר במחסן סולם להשגת קולגן ואלסטין (H) צפיפות האחסון. תמונות B/c: גובה 300 מיקרומטר (בר 20 מיקרומטר), E/f: 50 x 50 מיקרומטר (בר 10 מיקרומטר), G/H 130 × 130 × 30 מיקרומטר (בר = 30 מיקרומטר). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 . שינויים Microstructural adventitial קולגן, הנדן אלסטית פנימית (אישור IEL) ואת שייכותם מודולים אלסטי מצטבר במבניו ב- 20, 40 ו- 100 מ מ כספית. (A) Branching זוויות של סיבי אלסטין אישור IEL. (ב) יושר של סיבי קולגן adventitial קרוב חיצוני הנדן אלסטי. p-ערכים ועל -פי ערכי F-נקבעו באמצעות מדידות חוזרות ונשנות חד-כיווני אנובה: p/F-values ת 0.0014/24.18, ב': 0.0002/37.38. (ג) אישור IEL זוויות מסעף להרכב nonlinearly Einc. (ד) קולגן יושר באופן ליניארי להרכב Einc. הנתונים מוצגים אומר ± SE-Microstructural שינויים (A, B ו- x-axes של C ו- D) נקבעו עבור 6 העורקים ההתנגדות נתון חיוני הדמיה בזמן Einc (C ו- D) מחושב עבור 20 העורקים אחרים נתון ללחץ myography תקן לחץ myograph. כל עורק למד היה אדם שונה. איור זה השתנה מ Bloksgaard et al. 13. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4 . איור של מדידות של זוויות מסעף אישור IEL, קולגן יושר בפיג'י. (א) אישור IEL מסעף זוויות מסומנות באופן ידני, נמדד באמצעות הכלי זווית פיג'י. (ב) קולגן יושר נקבעת באמצעות התוסף פיג'י נוירון J כמו היחס בין האורך מקצה-לקצה של סיבי קולגן יחיד באמצעות קו ישר (לבן) מחולק באורך end-to-end בפועל של סיבי (כתום). בר גודל: 20 מיקרומטר.

Figure 5
איור 5 . זרימת Ilastik. (א) תכונה חלון בחירה עם הסימן של התכונות שנבחרו. (ב) דוגמה raw התמונה עם תוויות (ג) עבור סיבי אלסטין, נקודות האור (לא רצויות) ורקע בצבע אדום, ירוק וכחול, בהתאמה. (ד) וכתוצאה מכך-חיזוי מפת התמונה (B) עם תוויות המצוין (C). (ה) פילוח המבוסס על המפה חיזוי ב (ד) לפני (E) ואחרי (נ) החלת את הסף של 0.5. צבע צהוב מראה הפיקסלים מחוברים המתאימים התכונה הפרדה (אלסטין). בר גודל: 25 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6 . דוגמה תמונות לפני ואחרי אופטימיזציה של הנבואה Ilastik מפה המציגה את השפעת מחדש הכשרה Ilastik זיהוי של סיבי אלסטין במדגם עם רקע זריחה של קולגן (תת אופטימלית אות יחס הרעש). (א) התמונה המקורית, (ב) תוצאה של ניתוח Ilastik הראשון, שבו במיוחד את סיבי אלסטין דק (בצד של תמונה B שמאל) אינם נכללים את פילוח, התוצאה הסופית (ג) בעקבות אופטימיזציה של המפה חיזוי. בר גודל: 25 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

הקבצים המשלימים אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

עבודה זו מייצגת את ההצעה שלנו עבור סטנדרטית בשילוב הדמיה ואת הלחץ myography גישה, יקר עבור הערכה בו זמנית של התכונות המכאניות של התנגדות העורקים ושינויים הקשורים ללחץ במבנה של העורקים קיר על טווח הלחץ בין 0 ל- 100 מ מ כספית. הגישה הציג פותחה תוך שימוש בציוד בנוי מותאם אישית, עם זאת, כל myograph לחץ מתאים במיקרוסקופ שני הפוטונים עירור קרינה פלואורסצנטית יכול לשמש, כאשר העיצוב של שניהם חסכון מאפשר הדמיה של הקיר עורקי. תשומת לב מיוחדת צריך להיות משולם צורה, רוחב, ומרחק עבודה של המטרה, ואת התנאים שבהם יבוצעו ההדמיה. מיקרוסקופים זקוף דורשים שימוש המים טובלים מטרות, ואילו השימוש של מטרות טבילה במים מומלצת מיקרוסקופים הפוך להימנע ההבדלים מדדי השבירה בין המדגם לבין המטרה. יתר על כן, תשומת הלב צריך להיות משולם העובי coverslip, או על-ידי החלת תיקון עבור אי-התאמה בין המטרה לבין coverslip באמצעות תיקון הקולר על המטרה (אם קיים) או על ידי התאמת עובי coverslip עם המטרה בשימוש.

ב פרוטוקול המתואר, היתרון הוא נלקח אור אנרגיה נמוכה, אינפרא אדום עבור הדמיה autofluorescence אלסטין וקולגן SHG. פעולה זו מאפשרת הדמיה לתקופות ממושכות של זמן. בעורקים ההתנגדות האנושית השתמשו במחקר זה, אישור IEL מורכבת של רשת סיבים דמוי מיושר longitudinally של אלסטין מחוברים הסיבים13,33, דומה למבנה של אישור IEL ההתנגדות תת עורית אנושי 38,העורקים (hSCA)39. שינוי זוויות הסתעפות של סיבי אלסטין, אישור IEL היו מוערכים, נהגה יחד עם מדדים של שהשתחרר הדרגתית של סיבי קולגן adventitial עם הגדלת לחצים37 להעריך שינויים המיקרו-ארכיטקטורה של אלסטין, קולגן בהתאמה. תמונות להערכת microarchitectures אלסטין וקולגן התקבלו באותו האזור של עניין בתוך הקיר בעורקים לחצים שונים. פעולה זו מאפשרת ניתוח מדידות חוזרות. במידת האפשר, החוקר יכול לכוון קבלת תמונות לפחות 3 אזורים מעניינים, עם תמונות בגדלים 10-50 מיקרומטר בכל ממד. עם זאת, בהתאם הדגימה, במיוחד את עובי הקיר עורקי, פשרה צריך להתבצע בין מספר אזורי סרוקים עניין ריאלי משך הניסוי. במקרה של העורקים ההתנגדות סביב הלב, העורקים נשארו בחיים זמן לפחות 8-12 שעות של ניסויים. סריקה מספר אזורים מעניינים מאפשר הערכה של אינטרה-לעומת ההשתנות הבין-לדוגמה, ובכך מחזקת את המסקנה על הממצאים שהושג.

זה חשוב לשים לב כי כדי למנוע גרימת נזק פוטוטוקסי, הדמיה באמצעות מתח גבוה עירור אור להימנע בעת עבודה על דגימות רקמה חיה. לאור זאת, מומלץ לקבל הערימות תמונה גדולה של קולגן ואלסטין צפיפויות נפח בקצה של פרוטוקול נסיוני, לחלופין על דגימות קבוע. כאשר כמויות מוחלטת של רכיבי ה-ECM נדרשות, השפעה של מקבע על הצפיפויות נפח צריך להיות לכמת ולקחת בחשבון. קיבעון, permeabilization של העורקים מאפשר בנוסף מכתים של מטרות תאיים עניין בעת הצורך. ב פרוטוקול זה, צביעת עבור אלסטין מתבצעת באמצעות אאוזין על העורק בשידור חי. ניתן להחיל מכתים של אלסטין מאת הגששים ספציפיים (למשל, אלקסה 633 hydrazide40) וקולגן (למשל, CNA3541), יחד עם כתמים אחרים (למשל, phalloidin42) או ה-DNA, כדי להקל את ההערכה צפיפויות הנפחי וארגון מבנית של מבנים אחרים עניין בדופן העורקים. בהזדמנות זו עשויה לספק מעבדות מחקר עם מיקרוסקופ קונפוקלי פוטון בודד הזדמנות לחקור את השינויים microstructural התנגדות העורקים. מקטעי העורק באותו עשוי להיות בתנאים שונים, קבוע תחת לחץ ובא עם תמונה בשלב מאוחר יותר כדי להשוות את השפעת הטיפול יישומית. מטרות של עניין, כדאי ניתן לאבחן על ידי הדמיה כלי לצינוריות מחדש, מווסת מחדש, מיטה. תעלות מחדש, לחץ מחדש נדרש כאשר שינויים מבניים נחשבים, כפי אלסטין שאי אפשר לתקן, ולכן ובצינתם, לשנות את מבנה תלת-ממד של העורק קבוע43,44. החיסרון של קביעת ביצוע שינויים מבניים קבועים העורקים היא למספר פלחים חייב להיות קבוע להשוואה, אין אפשרות לבצע מדידה חזר על ניתוחים.

הנתונים שהושגו באמצעות הדמיה ניתן להשתמש ישירות לחשב קיר מדגיש וללחצים, ולתמוך להבנת המכניקה של הקיר כלי הדם, כפי שמתואר Bloksgaard, ואחמ13. בעבודה זאת, מודל מתמטי הוחלה לאפיין את הנוקשות מהותי של אלסטין ואת מרכיבי קולגן של הקיר עורקי, כדי להעריך את הקולגן גיוס זנים45,46 על בסיס החישוב מתח מתח מערכות יחסים. הדמיה צידדתי בממצאי מ מודלים מתמטיים, את הקולגן בתוך העורקים ההתנגדות האנושית גויס כבר ב נמוך במבניו המתח והלחץ קיר. האמצעים כמותית של המיקרו-ארכיטקטורה של אלסטין וקולגן שמתואר פרוטוקול זה יכול להיות עוד יותר מורחב, בהשראת העבודה נרחב שנערך על עורק6,8,47, 48 , 49 ואבי העורקים7,9,10,50,51: ניתוחים נוספים עשויים לכלול הערכת התפוצה המרחבית של המיקרו-ארכיטקטורה של קולגן, סיבי אלסטין בתוך הרבדים השונים קיר העורק, כמו גם סיבים כיוון זוויות (תצורת ביחס לציר האורך). בל ואח. 15 התייחס הלחץ הנגרם לארגונו מחדש של אישור IEL, קולגן adventitial כולל מודל אנליטי רב שכבתית כדי לחשב את הנוקשות והמתח בכל שכבה של הקיר עורקי. מחברים אלה15 משמש העורקים תת עורית ההתנגדות המתקבל מתנדבים בריאים, ואת מבנה קשורים קיר מדגיש ב 3 עד 30 מ מ כספית, בהתאמה.

השיטה המוצעת ב פרוטוקול זה מניע בתקווה חקירות נוספות ופיתוח מודלים מתמטיים microstructurally מוטיבציה להבנת התכונות המכאניות של העורקים ההתנגדות האנושית מחלה ובריאות. עם עוד תיקונים של השיטה כדי לכלול גם זוויות אוריינטציה קולגן ואלסטין לאורך ציר האורך, תא שריר חלק צפיפות האחסון, התפוצה המרחבית וכיוון בתוך ההתפלגות עורקי קיר, קולגן ואלסטין, התמצאות tunica מדיה, והארגון אלסטין והפצה tunica adventitia, הנתונים ההדמיה יכולה להאכיל קדימה בפיתוח מודלים מתמטיים, להקל על ההבנה של תהליך שיפוץ יתר לחץ דם, סוכרת ו תסמונת מטבולית. באופן דומה, כפי שהוצע על ידי חן ו- Kassab עבור52,microcirculation כלילית53, מיקרו מבוססי מודלים של העורקים ההתנגדות האנושית יכולה לספק תחזיות של עורקי תגובות מכני מאקרו-(כל עורק) micro-(structure) רמות מכני עבור כל המכוננת. מודל שכזה חייב להתבסס על נתונים כמותיים של פרמטרים מבנית ואת התכונות המכאניות של שכבות בודדות ומרכיבים בדופן העורקים שמקורם מתנדבים בריאים והן לחולים הסובלים ממחלות שונות, עורקי קבלת טיפול תרופתי אחר. הנתונים שנאספו בצורה סטנדרטית, בהשוואה בין אנשים עם גורמי סיכון שונים, מחלות וטיפול פרופילים. השיטה יש פוטנציאל לסייע להבין כיצד מחלות וטיפולים רפואיים להשפיע את microcirculation אנושי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

המחברים תודה דנית מולקולרית ביו-רפואית במרכז-הפקולטה למדעי הטבע, באוניברסיטת דרום דנמרק, לשימוש של מעבדות ומיקרוסקופים. כריסטופר Rosenstand, אולה מלכיאור הם הכירו לסיוע טכני מעולה עם הלחץ myography, הדמיה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fine Science Tools 15401-12
Fine Science Tools 11251-23
Nikon SMZ800N
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. 761028 for dissection purpose
Vitrex Medical A/S, Herlev, Denmark 1.63, 2.13, 210mm
Smiths medical Intl, UK
Ethicon Ethilon 11-0
Custom built DK patent number 201200167, University of Southern Denmark, J. Schoubo V. Jensen, F. Jensen. T.R. Uhrenholt
Mettler toledo
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. B3259
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. A7030
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. C5670
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. G7021
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. E3889
Merck Millipore, Hellerup, Denmark 1.00496.9010 Phosphate buffered (pH 6.9) 4% formaldehyde solution 
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. H3784
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. P9666
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. P5655
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. M2643
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. S2002
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. S5886
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. S5761
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. 1.06462
Gibco, ThermoFisher Scientific 10010015
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. PHR1423
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. Z370525
 Tocris Bioscience, Bristol, UK 538944
Nikon Custom built
Spectra Physics, Mountain View, CA
Nikon CFI Plan Apo IR SR 60XWI NA 1.27
Nikon CFI Plan Fluor 20XMI (multi-immersion) NA 0.75
Hamamatsu, Ballerup, Denmark H7422P-40
AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany). ChromaET 460 nm long pass dichroic
AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany). Semrock FF01-520/35-25 BrightLine filter
AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany). Chroma ET402/15X 
Scotch TM
coverslip thickness should match used objective on microscope (#1 or #1.5), alternatively, set adjustment collar to match coverslip

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Briones, A. M., Arribas, S. M., Salaices, M. Role of extracellular matrix in vascular remodeling of hypertension. Curr Opin Nephrol Hy. 19 (2), 187-194 (2010).
  2. Heagerty, A. M., Heerkens, E. H., Izzard, A. S. Small artery structure and function in hypertension. J Cell Mol Med. 14 (5), 1037-1043 (2010).
  3. van den Akker, J., Schoorl, M. J., Bakker, E. N., Vanbavel, E. Small artery remodeling: current concepts and questions. J Vasc Res. 47 (3), 183-202 (2010).
  4. Rizzoni, D., Agabiti-Rosei, E. Structural abnormalities of small resistance arteries in essential hypertension. Intern Emerg Med. 7 (3), 205-212 (2012).
  5. Schiffrin, E. L. Vascular remodeling in hypertension: mechanisms and treatment. Hypertension. 59 (2), 367-374 (2012).
  6. Fonck, E., et al. Effect of elastin degradation on carotid wall mechanics as assessed by a constituent-based biomechanical model. Am J Physiol-Heart C. 292 (6), H2754-H2763 (2007).
  7. Chow, M. J., Turcotte, R., Lin, C. P., Zhang, Y. Arterial extracellular matrix: a mechanobiological study of the contributions and interactions of elastin and collagen. Biophys J. 106 (12), 2684-2692 (2014).
  8. Chen, H., et al. Biaxial deformation of collagen and elastin fibers in coronary adventitia. J Appl Physiol (1985). 115 (11), 1683-1693 (2013).
  9. Schriefl, A. J., Schmidt, T., Balzani, D., Sommer, G., Holzapfel, G. A. Selective enzymatic removal of elastin and collagen from human abdominal aortas: uniaxial mechanical response and constitutive modeling. Acta Biomater. 17, 125-136 (2015).
  10. Zeinali-Davarani, S., Wang, Y., Chow, M. J., Turcotte, R., Zhang, Y. Contribution of collagen fiber undulation to regional biomechanical properties along porcine thoracic aorta. J Biomech Eng. 137 (5), 051001 (2015).
  11. Mattson, J. M., Turcotte, R., Zhang, Y. Glycosaminoglycans contribute to extracellular matrix fiber recruitment and arterial wall mechanics. Biomech Model Mechan. 16 (1), 213-225 (2017).
  12. Schriefl, A. J., Zeindlinger, G., Pierce, D. M., Regitnig, P., Holzapfel, G. A. Determination of the layer-specific distributed collagen fibre orientations in human thoracic and abdominal aortas and common iliac arteries. J R Soc Interface. 9 (71), 1275-1286 (2012).
  13. Bloksgaard, M., et al. Imaging and modeling of acute pressure-induced changes of collagen and elastin microarchitectures in pig and human resistance arteries. Am J Physiol-Heart C. , (2017).
  14. Dora, K. A., et al. Isolated Human Pulmonary Artery Structure and Function Pre- and Post-Cardiopulmonary Bypass Surgery. J Am Heart Assoc. 5 (2), (2016).
  15. Bell, J. S., et al. Microstructure and mechanics of human resistance arteries. Am J Physiol-Heart C. 311 (6), H1560-H1568 (2016).
  16. Roque, F. R., et al. Aerobic exercise reduces oxidative stress and improves vascular changes of small mesenteric and coronary arteries in hypertension. Brit J Pharmacol. 168 (3), 686-703 (2013).
  17. Briones, A. M., et al. Alterations in structure and mechanics of resistance arteries from ouabain-induced hypertensive rats. Am J Physiol-Heart C. 291 (1), H193-H201 (2006).
  18. Briones, A. M., et al. Role of elastin in spontaneously hypertensive rat small mesenteric artery remodelling. J Physiol. 552 (Pt 1), 185-195 (2003).
  19. Arribas, S. M., et al. Confocal myography for the study of hypertensive vascular remodelling. Clin Hemorheol Micro. 37 (1-2), 205-210 (2007).
  20. Gonzalez, J. M., et al. Postnatal alterations in elastic fiber organization precede resistance artery narrowing in SHR. Am J Physiol-Heart C. 291 (2), H804-H812 (2006).
  21. Spronck, B., Megens, R. T., Reesink, K. D., Delhaas, T. A method for three-dimensional quantification of vascular smooth muscle orientation: application in viable murine carotid arteries. Biomech Model Mechan. 15 (2), 419-432 (2015).
  22. Megens, R. T., et al. In vivo high-resolution structural imaging of large arteries in small rodents using two-photon laser scanning microscopy. J Biomed Opt. 15 (1), 011108 (2010).
  23. Megens, R. T., oude Egbrink, M. G., Merkx, M., Slaaf, D. W., van Zandvoort, M. A. Two-photon microscopy on vital carotid arteries: imaging the relationship between collagen and inflammatory cells in atherosclerotic plaques. J Biomed Opt. 13 (4), 044022 (2008).
  24. Bender, S. B., et al. Regional variation in arterial stiffening and dysfunction in Western diet-induced obesity. Am J Physiol-Heart C. 309 (4), H574-H582 (2015).
  25. Clifford, P. S., et al. Spatial distribution and mechanical function of elastin in resistance arteries: a role in bearing longitudinal stress. Arterioscler Thromb. 31 (12), 2889-2896 (2011).
  26. Martinez-Revelles, S., et al. Lysyl Oxidase Induces Vascular Oxidative Stress and Contributes to Arterial Stiffness and Abnormal Elastin Structure in Hypertension: Role of p38MAPK. Antioxid Redox Sign. 27 (7), 379-397 (2017).
  27. Foote, C. A., et al. Arterial Stiffening in Western Diet-Fed Mice Is Associated with Increased Vascular Elastin, Transforming Growth Factor-beta, and Plasma Neuraminidase. Front Physiol. 7, 285 (2016).
  28. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  29. Sommer, C., Straehle, C., Kothe, U., Hamprecht, F. A. Ilastik: Interactive Learning and Segmentation Toolkit. 2011 8th Ieee International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro, , 230-233 (2011).
  30. Campagnola, P. J., et al. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophys J. 82 (1 Pt 1), 493-508 (2002).
  31. Intengan, H. D., Deng, L. Y., Li, J. S., Schiffrin, E. L. Mechanics and composition of human subcutaneous resistance arteries in essential hypertension. Hypertension. 33 (1 Pt 2), 569-574 (1999).
  32. Saatchi, S., et al. Three-dimensional microstructural changes in murine abdominal aortic aneurysms quantified using immunofluorescent array tomography. J Histochem Cytochem. 60 (2), 97-109 (2012).
  33. Bloksgaard, M., et al. Elastin Organization in Pig and Cardiovascular Disease Patients' Pericardial Resistance Arteries. J Vasc Res. 52 (1), 1-11 (2015).
  34. World Medical Association. World Medical Association Declaration of Helsinki: ethical principles for medical research involving human subjects. JAMA. 310 (20), 2191-2194 (2013).
  35. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  36. Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry A. 58 (2), 167-176 (2004).
  37. Rezakhaniha, R., et al. Experimental investigation of collagen waviness and orientation in the arterial adventitia using confocal laser scanning microscopy. Biomech Model Mechan. 11 (3-4), 461-473 (2012).
  38. Green, E. M., Mansfield, J. C., Bell, J. S., Winlove, C. P. The structure and micromechanics of elastic tissue. Interface Focus. 4 (2), 20130058 (2014).
  39. Bell, J. S., et al. Microstructure and mechanics of human resistance arteries. Am J Physiol-Heart C. 311 (6), H1560-H1568 (2016).
  40. Shen, Z., Lu, Z., Chhatbar, P. Y., O'Herron, P., Kara, P. An artery-specific fluorescent dye for studying neurovascular coupling. Nat Methods. 9 (3), 273-276 (2012).
  41. Megens, R. T., et al. Imaging collagen in intact viable healthy and atherosclerotic arteries using fluorescently labeled CNA35 and two-photon laser scanning microscopy. Mol Imaging. 6 (4), 247-260 (2007).
  42. Staiculescu, M. C., et al. Prolonged vasoconstriction of resistance arteries involves vascular smooth muscle actin polymerization leading to inward remodelling. Cardiovasc Res. 98 (3), 428-436 (2013).
  43. Fung, Y. C., Sobin, S. S. The retained elasticity of elastin under fixation agents. J Biomech Eng. 103 (2), 121-122 (1981).
  44. Fung, Y. C. Biomechanics : mechanical properties of living tissues. , 2nd, Springer-Verlag. (1993).
  45. Bakker, E. N., et al. Heterogeneity in arterial remodeling among sublines of spontaneously hypertensive rats. PLoS One. 9 (9), e1107998 (2014).
  46. VanBavel, E., Siersma, P., Spaan, J. A. Elasticity of passive blood vessels: a new concept. Am J Physiol-Heart C. 285 (5), H1986-H2000 (2003).
  47. Chen, H., et al. Microstructural constitutive model of active coronary media. Biomaterials. 34 (31), 7575-7583 (2013).
  48. Saez, P., Garcia, A., Pena, E., Gasser, T. C., Martinez, M. A. Microstructural quantification of collagen fiber orientations and its integration in constitutive modeling of the porcine carotid artery. Acta Biomater. 33, 183-193 (2016).
  49. Bellini, C., Ferruzzi, J., Roccabianca, S., Di Martino, E. S., Humphrey, J. D. A microstructurally motivated model of arterial wall mechanics with mechanobiological implications. Ann Biomed Eng. 42 (3), 488-502 (2014).
  50. Schriefl, A. J., Wolinski, H., Regitnig, P., Kohlwein, S. D., Holzapfel, G. A. An automated approach for three-dimensional quantification of fibrillar structures in optically cleared soft biological tissues. J R Soc Interface. 10 (80), 20120760 (2013).
  51. Weisbecker, H., Unterberger, M. J., Holzapfel, G. A. Constitutive modelling of arteries considering fibre recruitment and three-dimensional fibre distribution. J R Soc Interface. 12 (105), 20150111 (2015).
  52. Chen, H., Kassab, G. S. Microstructure-based biomechanics of coronary arteries in health and disease. J Biomech. 49 (12), 2548-2559 (2016).
  53. Chen, H., Kassab, G. S. Microstructure-based constitutive model of coronary artery with active smooth muscle contraction. Sci Rep. 7 (1), 9339 (2017).

Tags

בביו-הנדסה בעיה 134 שני הפוטונים עירור קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ מטריצה חוץ-תאית התמונה ניתוחים התנגדות העורקים Ilastik פיג'י מיקרו מכניקה מודלים מתמטיים
הערכת Microarchitectures תלויי-לחץ קולגן ואלסטין, חיים, אנושי התנגדות העורקים על ידי קרינה פלואורסצנטית ללא תווית מיקרוסקופ
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bloksgaard, M., Thorsted, B.,… More

Bloksgaard, M., Thorsted, B., Brewer, J. R., De Mey, J. G. R. Assessing Collagen and Elastin Pressure-dependent Microarchitectures in Live, Human Resistance Arteries by Label-free Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (134), e57451, doi:10.3791/57451 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter