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Bioengineering

用无标签荧光显微镜评价活体、人体阻力动脉中胶原蛋白和弹性蛋白的压力依赖性 Microarchitectures

doi: 10.3791/57451 Published: April 9, 2018

Summary

我们描述同时进行的机械测试和 3 d 成像的动脉壁的孤立, 活着的人的抵抗动脉, 斐济和 Ilastik 图像分析, 以量化的弹性蛋白和胶原的空间组织和体积密度。我们讨论了这些数据在动脉壁力学数学模型中的应用。

Abstract

在原发性高血压、糖尿病和代谢综合征中, 抗血管重塑的致病作用有记录。microstructurally 动机的研究与发展了解人体阻力动脉力学性能的数学模型在健康和疾病方面有可能帮助理解疾病和医疗治疗影响人体微循环。为了开发这些数学模型, 必须对微血管壁的力学和 microarchitectural 特性之间的关系进行解密。在这项工作中, 我们描述了一个体方法进行被动的机械测试和同时无标签的三维成像的弹性体和胶原质的微结构的动脉壁上的孤立的人的阻力动脉。成像协议可应用于任何感兴趣物种的抗性动脉。图像分析描述量化 i) 压力诱发变化的内部弹性板分枝角和血管外膜胶原直线度使用斐济和 ii) 胶原蛋白和弹力蛋白体积密度确定使用 Ilastik 软件。最好所有的机械和影像测量都是在活的, 灌注的动脉, 但是, 一个替代方法使用标准的视频显微镜压力 myography 结合后固定成像的再加压血管是讨论。此替代方法为用户提供了不同的分析方法选项。讨论了机械和成像数据在动脉壁力学数学模型中的包含, 并提出了该协议的未来发展和补充。

Introduction

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原发性高血压、糖尿病和代谢综合征的致病作用和抗性动脉重塑的作用记录在1,2,3,4,5。破译微血管壁的力学和 microarchitectural 特性之间的关系对于发展该协会的数学模型是必不可少的。这些模型将改善理解的重塑过程, 并将支持在硅模型的发展, 有助于测试的药理策略针对与疾病相关的重建的动脉壁。

先前的研究集中于了解动脉壁微结构与动脉壁力学的关系, 包括机械措施和细胞外基质 (ECM) 的微体系结构, 几乎完全是在大, 从小鼠或猪的弹性导管动脉6,7,8,9,10,11。通常采用非线性光学技术, 利用弹性蛋白的荧光性和胶原蛋白的二次谐波产生, 对墙体的显微组织进行成像。这允许时空成像的两个主要组成部分的细胞外基质, 弹性蛋白和胶原蛋白, 不需要染色。在厚膜介质中, 由于光的散射, 全厚度动脉壁的成像是大导管动脉的一个挑战。然而, 为了确定动脉壁结构成分的微体系与观测到的力学性能有关, 必须在机械测试过程中获得三维信息。对于像人主动脉这样的大动脉, 这需要双轴安装, 机械测试和成像区域的兴趣在 1-2 cm2块的动脉壁7,9,10,12. 只有部分墙可以进行成像和机械测试。

对于任何种类的小动脉 (例如, 人心包13, 肺14和皮下15动脉, 大鼠肠系膜动脉16,17,18 ,19, 20, 小鼠提睾肌, 肠系膜, 脑, 股骨和颈动脉21, 22, 23, 24, 25, 26,27) 整个壁厚的成像是可能的, 可以与机械测试相结合。这允许同时记录的机械性能和结构安排在墙内。然而, 一个直接的数学模型的关系, 观察改变的三维结构的 ECM 和改变的力学性质的阻力动脉壁, 有最好的知识, 只有报告后,最近在人体阻力动脉13,15

在这项工作中, 介绍了一种用于被动机械测试的体方法, 以及在隔离的人体阻力动脉的动脉壁上, 弹性蛋白和胶原质微结构的同时三维成像。成像协议可应用于任何感兴趣物种的抗性动脉。本文介绍了利用斐济28对内弹性板分枝角和血管外膜胶原直线13 进行图像分析的方法。用 Ilastik 软件29确定胶原蛋白和弹力蛋白的体积密度, 最后讨论了在动脉壁力学数学模型中包含的机械和成像数据。

描述成像和图像分析技术与数学建模相结合的目标是为研究者提供一个系统的方法来描述和理解观察到的压力引起的电阻动脉 ECM 的变化。所述方法主要是通过比较20、40和 100 mmHg 的 ecm 结构, 在加压过程中对容器中 ecm 的变化进行量化。这些压力的选择, 以确定的动脉壁的结构, 其更符合 (20 mmHg), 僵硬 (100 mmHg) 和中间 (40 mmHg) 状态, 分别。然而, 根据调查者所提出的研究假说, 活动脉血管壁的任何过程, 包括血管活性成分、迟滞和流引起的变化都可以量化。

强调了双光子激发荧光显微术 (TPEM) 与压力 myograph 的结合, 以研究压力 (或其他) 诱发活动脉 ECM 的变化。首先, 因为这允许同时获得的整体三维结构的动脉壁 (直径和壁厚) 连同三维无标签获得高质量的, 详细的胶原蛋白和弹力蛋白图像microarchitectures 如描述的13通过利用弹性蛋白自发荧光和胶原第二谐波产生信号 (SHG)30。第二, TPEM 允许使用低能量近红外激发光, 尽量减少组织的光损伤, 因此, 允许在血管壁内完全相同的位置重复成像, 容许重复测量分析观察变化。

本文讨论了一种利用压力固定动脉共焦成像的替代方法, 使用户没有机会 TPEM 使用所描述的方法。关于 ECM 结构和体积密度的信息也可以从对连续切片的二维组织分析中检索出来, 如3132所述。然而, 由于缺乏可能检索三维结构信息在动脉的长度刻度以及在变化的情况下使用这种方法, 它不建议使用这种方法来调查压力和治疗引起的三维变化的 ECM。

研究人员对应用本法所述方法的最低要求是, 结合共焦或双光子激发荧光显微镜, 获得动脉插管和加压的设置。在下面的协议中描述的设置是一个定制的压力 myograph 与纵向力传感器, 建立适合于一个定制的倒置双光子励磁荧光显微镜。

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Protocol

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本工作中使用的人顶叶心包活检的收集是在书面知情同意后进行的, 如前所述的33。对人体组织的研究符合《赫尔辛基宣言》34中概述的原则, 并得到了丹麦南部 (S-20100044 和 S-20140202) 和丹麦数据保护局的卫生研究伦理学区域委员会的批准。

1. 收集组织和隔离 (人) 抵抗动脉

  1. 在手术过程中立即收集感兴趣的组织样本。将组织转移到4°c HEPES 缓冲的生理盐溶液 (哈佛商学院) 立即收集和存储在哈佛商学院。
    注: 只有在相关的机构和伦理委员会批准以及患者书面知情同意的情况下, 才会收集人体组织。哈佛商学院的组成在 mM: NaCl 144, 氯化钾 4.7, CaCl2 2.5, MgSO4 1.2,, HEPES 2 PO 4 1.2,, 葡萄糖 14.9.用氢氧化钠调整 pH 值 7.4, 通过0.2 µm 过滤器过滤溶液。
  2. 将所收集的组织在不育的哈佛商学院过夜4摄氏度, 以清洗麻醉剂。
    注: 夜间贮存对船只完整性和功能的任何影响, 应由个别研究实验室检查。
  3. 用一对尖尖钳和微解剖剪刀仔细隔离阻力大小的动脉 (200 µm 流明直径)。
  4. 将动脉储存在冰冷的哈佛商学院4摄氏度, 同时启动成像/压力室。

2. 在压力 Myograph 中安装隔离动脉

  1. 安装在套管持有人的套管直径为80µm 的玻璃杯。把小贴士放在µm 的上方约150。
    注意: 45°弯曲尖端套管可能允许精确定位在玻璃底部的容器。
  2. 将进口和出口油管与哈佛商学院的 1% BSA 和连接到压力系统。
    注意: BSA 包括在保留内皮细胞功能。
  3. 每套管使用两个双结缝合线安装隔离动脉。
    注: 结可以预先准备好, 并储存在双胶带, 直到需要。
  4. 用哈佛商学院填满房间, 在每个玻璃套管上放置两个双节。
    注: 当使用动脉显示肌音, 哈佛商学院应取代钙免费哈佛商学院补充3µM EGTA 和3µM 硝普钠。
  5. 用两对尖尖钳将动脉轻轻地放在一端。打开动脉腔并轻轻地将其滑入套管。用两个结来固定套管。
  6. 应用 5 mmHg 的压力, 用哈佛商学院/1% BSA 轻轻冲洗流明。
  7. Cannulate 动脉的另一端, 并用两个双结固定在套管上。
  8. 将 myograph 转移到显微镜阶段, 将动脉加压至 5 mmHg (进气压力 = 出口压力), 然后加热至37摄氏度, 30 分钟。
  9. 可选: 根据制造商的指示校准纵力传感器 (1 克 = 9.81 锰)。
    注意: 加热后的压力传感器必须校准, 因为温度敏感。

3. 进行实验: 用 TPEM 对动脉直径、壁厚、胶原蛋白和弹性体微结构进行成像

  1. 用20X 目标 (数字孔径 (NA) ≥ 0.8) 和低功率激发光快速扫描空心动脉加压至 5 mmHg, 以评估 5 mmHg 的血管直径和壁厚。
    注: 对于倒置显微镜, 使用水浸泡目标;对于直立显微镜, 使用水浸的目的。如果目标没有矫正衣领为盖子滑动厚度改正, 请确保匹配使用的盖子滑与目标使用。软件设置和描述可能会因使用的用户界面、显微镜和软件而异。
    1. 设置光学路径。
      1. 激活麦泰双光子激光器并将其设置为 820 nm 激发光。
        注意: 避免任何暴露在可见光和隐形的激光光。
      2. 同时在两个通道中收集发射。在光电倍增管之间使用 460 nm 长通分色镜和收集发射, 使用 30-60 nm 宽带通滤波器, 分别居中 520 nm (弹性蛋白) 和 410 nm (胶原蛋白)。
    2. 启用10µs 激光驻留时间/像素和 512 x 512 像素的连续扫描100% 个视野。
    3. 手动扫描动脉, 以确定最大直径观察到的深度。
    4. 选择一个覆盖动脉最宽直径的矩形切片, 并扫描一个像素大小≤ 300 nm/像素的单帧 (图 2C)。使用低励磁光功率和像素停留时间尽可能避免 photodamaging 活动脉。
      注意: 建议获得一个矩形, e. g, 100 x 1024 像素图像, 而不是在这个位置的二次图像, 以节省时间和限制组织光子曝光 (图 2C)。
    5. 保存图像以供以后分析。
  2. 确定动脉最大直径的流明直径和壁厚。
    1. 在斐济加载图像。
    2. 通过单击主菜单 | 来设置刻度分析 |设置缩放并输入µm/像素和像素比率 (强烈建议保持像素比 1:1)。
    3. 选择斐济折线工具, 并在动脉腔的两侧的两个内部弹性板之间绘制一条线, 然后单击ctrl+ M。斐济在结果表中报告长度为默认值。
    4. 同样, 绘制更多的线条来测量每面墙的厚度, 然后单击ctrl + M来测量以下标记。
    5. 保存测量结果。
  3. 图像胶原蛋白和弹性蛋白微结构在 5 mmHg 通过扫描整个动脉壁厚度, 获得3D 图像栈与良好的质量, 1-3 个地区的动脉长度的兴趣。
    1. 使用60X 目标, NA ≥ 1, 优化像素大小和 z 间距, 通过整个动脉壁获得图像栈。
      1. 利用科学的容积成像比计算器 (https://svi.nl/NyquistCalculator), 计算最佳成像条件 (像素大小和 z 步长), 按照光学通路、浸入介质和试样折射率。
        注意: 请注意最佳像素大小和 z 间距与3.4 节中的建议之间的区别。上面使用最大像素大小。
    2. 使用与上述相同的励磁和发射设置 (3.1.1)。
    3. 如上文所述, 快速扫描容器壁以确定 z 堆栈的厚度。
    4. 定义 z 堆栈开始和结束深度、z 步长间距和像素密度 (在3.3.1.1 中计算) 并执行 z 扫描。分别保存每个通道。
      注意: 图像应该足够小例如30 x 30 µm 或 50 x 50 µm, 这取决于容器大小, 以避免在后续图像分析中曲率的影响。
  4. 确定动脉直径, 壁厚, 弹性蛋白和胶原微体系结构的剩余压力的协议。
    1. 重复 3.1-3.2 在压力10和 20 mmHg, 重复3.3 在压力 20 mmHg。
    2. 重复3.1 和3.2 在压力 40 mmHg。
    3. 重复 3.1-3.2 在压力 60, 80 和 100 mmHg 和重复3.3 在 100 mmHg。
      注: 3.1-3.3 可以重复的所有压力, 和组合的压力 (如一系列/组合的增加和减少压力), 取决于要测试的假设。在漂白的情况下, 在浓度为 0.3-1 µM 的红蛋白可以增加弹性体荧光。漂白可以避免通过尽可能低功率励磁光。
    4. 在每个压力步骤后, 用新鲜的37°c 哈佛商学院取代 myograph 室的缓冲器。在每次压力变化后, 让动脉适应5分钟的成像。
  5. 分别存储通道栈以进行图像分析。
  6. 测试动脉的可行性。
    1. 在 myograph 室应用10µM U46619, 在观察到稳定收缩后加入10µM 缓激肽。
    2. 记录直径和壁厚, 如上文3.1 节所述的每个化合物的应用之后。
    3. 添加3µM 钠, 当动脉没有完全扩张后, 增加了缓激肽和记录直径和壁厚。
      注: 根据感兴趣的动脉的药理性质 (血管床和物种) 其他收缩和 (内皮依赖性) 血管扩张剂化合物可以使用。
  7. 可选: 固定加压动脉或继续以胶原蛋白和弹力蛋白为体积密度的影像 (步骤 7)。
    1. 在1x 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 中添加4% 甲醛, 37 摄氏度, 1 小时。
    2. 在 1x PBS 中洗三次固定动脉, 轻轻地将动脉从套管上滑开, 只触及节外的动脉部分。不要移除结节, 在转移到存储管时使用它们来保持动脉。
    3. 存储在 1x PBS/0.05% 叠氮化钠在4°c, 直到成像的弹性蛋白和胶原体积密度或其他目的。
      注: 1x PBS/0.05% 叠氮化钠4摄氏度, 固定动脉可贮存至少3月。

4. 应力应变关系和内壁刚度的计算

  1. 请按照 Bloksgaard、m. et等) 所描述的计算应力、应变和壁刚度的公式和计算步骤。13和此处的引用。

5. 图像分析-(内弹性板) IEL 分枝角

  1. 在斐济打开图像栈。转到文件 | 打开图像以选择图像堆栈。
    注: 使用斐济2835中的角度工具, IEL (1-2 µm 厚度) 的2-7 个连续 z 剖面的最大强度投影用于确定 IEL 弹性纤维分支角度。有关说明, 请参阅图 4A
  2. 转到图像 | 堆栈 | z 项目...选择图像和 "最大强度投影"。
  3. 将最大强度投影保存为 TIFF。
  4. 使用 "角度工具" 选择尽可能多的 IEL 光纤分支点, 并系统地通过图像进行工作。单击ctrl + M以测量每个角度。
  5. 保存斐济结果表。

6. 图像分析. 血管外膜胶原波纹度

  1. 在斐济打开图像栈。转到文件 | 打开图像以选择图像堆栈。
    注: 在外部弹性板 (鳗鱼, 1-4 µm 厚度) 外, 2-7 个连续 z 段的最大强度投射用于测定胶原的波纹度, 使用斐济 NeuronJ 插件36 , 如 Rezakhaniha 所述, R.et al37(图 4B)。
  2. 设置刻度。转到分析 | 设置比例以输入像素尺寸。
  3. 转到图像 | 堆栈 | z 项目...选择要使用的图像和 "最大强度投影"。
  4. 通过单击图像类型 | 8 苦味将图像类型更改为8苦味 tiff, 并将最大强度投影保存为 tiff。
  5. 使用斐济神经元 J 插件测量胶原纤维的直线度。
    1. 通过单击斐济 | 打开 NeuronJ 插件插件 |神经元 J
    2. 在 NeuronJ 中打开 8bit TIFF, 单击加载图像 |选择文件
    3. 单击添加追查, 然后通过单击每个光纤的开始和结束选择要分析的光纤。
    4. 单击测量追查, 在对话框中选择显示跟踪(Lf) 和顶点测量
  6. 在 excel 中计算 L0/Lf (或类似的) 并保存结果。
    1. 复制和粘贴斐济神经元 J 追查和顶点输出到 excel (或类似) 和计算 L0 使用毕达哥拉斯的定理从顶点测量。线上的第一个和最后一个点表示2D 坐标系中斜边端点的位置。
      注: L0/Lf [胶原纤维束端到端长度通过一条直线 (L0)/全长 (Lf)] 接近1表示几乎直胶原纤维。

7. 胶原蛋白和弹力蛋白体积密度的成像

  1. 清洗 (固定) 动脉1x 在 PBS 和染色15分钟, 在1µM 在 1x PBS 在黑暗中。对于固定动脉, 在室温下执行此步骤。
    注: 伊红增强弹性蛋白荧光。如果样品在染色溶液中留长时间, 则将会染色其他结构, 如胶原蛋白和胞浆。如果其他结构的染色过于剧烈, 则将µM 的浓度降低到0.3 或重复洗涤。
  2. 在 1x PBS 中冲洗动脉3x
    1. 用于固定动脉: 将动脉装入成像。
      注意: 非加压容器的成像不允许检索任何几何定量信息。当需要绝对数量时, 这些都应该在活的、加压的动脉上获得。该方法可获得非加压动脉的容积比。
      1. 将两片双面胶带 1-1. 5 厘米, 在物体玻璃上分开。双面胶带的厚度约为100µm。应用一个或多个层的磁带来匹配要安装的动脉直径。
      2. 将10-20 µL 的 pbs 放在正方形中间的玻璃上, 将动脉放在 pbs 滴下。
        注: 降应尽可能小, 尽量平, 以避免在安装盖子滑动时将动脉推出位置。
      3. 把盖玻片放在双面胶带上。
      4. 用 1x PBS 填充盖玻片与目标玻璃之间的储层。每小时重新灌装, 以避免样品干燥。
  3. 获得胶原蛋白和弹力蛋白体积密度的图像栈使用与 NA > 1 的20X 目标来覆盖尽可能多的动脉壁, 同时仍有良好的光学分辨率 (图 2D, 2G 和 2H)。
    注: 使用水浸泡目标盖玻片下固定动脉的成像, 并使用水浸目标成像的重要动脉。如果目标没有矫正衣领为盖子滑动厚度改正, 请确保匹配盖玻片到目标。最好使用最佳像素大小和 z 间距。使用3.3.1.1 计算器 (步进法) 计算这些。或者, 使用最小像素大小为 300 nm 和 z 间距为1µm。建议在动脉长度处获取三张图像, 以允许用户确定检测内的变异性。
  4. 图像弹性蛋白使用 820 nm 激发光和收集发射使用 30-60 nm 宽带通滤波器居中 520 nm。
  5. 图像胶原蛋白使用 990 nm 激发光, 以避免任何刺激的弹性蛋白和其他 autofluorescent 蛋白和收集发射使用 10-30 nm 宽带通滤波器中心在 495 nm。
  6. 将每个通道中的图像堆栈分别保存为 TIFF 文件

8. 用 Ilastik 提取弹性蛋白和胶原体积密度的图像分析

  1. 通过单击 "选择文件" | "使用斐济28,35将 TIFF 图像堆栈转换为 HDF5" |另存为..。HDF5
  2. 在计算机硬盘驱动器上创建两个数据文件文件夹, 一个用于弹性蛋白, 分别用于胶原图像堆栈。将相关的图像堆栈复制到相关文件夹。
  3. 在 Ilastik 软件中创建两个新的 Ilastik 项目, 其中一个弹性蛋白, 分别用于胶原蛋白。
    1. 打开Ilastik |创建新项目 |像素分类 |新项目 |添加数据并选择在步骤8.2 中创建的图像文件夹。
      注意: 请按照 Ilastik 向导操作。
  4. 导入一个3D 图像栈来培训软件。
    1. 选择输入数据小程序 | 主工作区区域 |原始数据选项卡 |添加新... |添加单独的图像并选择所需的图像数据
  5. 选择软件中的相关功能。
    1. 打开功能选择小程序 |选择打开新对话框的功能。有关详细信息, 请参阅图 5A
  6. 使用培训小程序下的添加标签按钮至少添加两个标签。
    注意: 每个标签都对应于需要分隔的对象类型。在这项工作中, 三标签用于弹性蛋白: 弹性蛋白本身, 明亮的斑点 (被排除) 和背景 (被排除)。
  7. 使用 "画笔样式" 注释工具在原始图像堆栈顶部绘制标签。
    1. 选择适当的标签: 单击画笔工具并开始绘图。
  8. 通过单击启用实时更新, 提示 Ilastik 分析图像堆栈并查找类似的功能。
  9. 仔细检查预测图 (图 5D)。
    注意: 从原始图像到完整预测映射的过程显示在图 5中。Ilastik 使用预测映射来分割图像堆栈, 根据哪个像素更有可能关联的标签 (图 5D)。
  10. 应用阈值。
    1. 选择阈值小程序, 选择适当的方法、输入标签、平滑、阈值和大小筛选参数, 最后单击 "应用"。
      注意: 这将图像中相似的标记部分隔离为离散对象。高度连接的组织, 如弹力蛋白和胶原蛋白不需要被隔离, 因此, 一个阈值为0.4 的应用 (默认为 0.5)。图 5E5F说明了应用阈值的结果。
  11. 重复 Ilastik 的训练, 直到结果令人满意 (只有弹性蛋白, 分别为各自的分析承认胶原蛋白)。
    1. 在这个过程中经常切换训练和分割 (有时还有阈值) 小程序。重新培训 Ilastik 的效果示例显示在图 6中。
  12. 批量分析类似的图像数据: 选择批预测输入选择并添加相关文件。
    注意: Ilastik 输出是一个 pseudo-1bit 3D 图像栈 (图像掩码) 的集合, 0 (零) 表示缺少弹性蛋白 (或胶原蛋白) 和 1 (一) 表示存在 (实际位深度为8位)。
  13. 通过直观地比较图像掩码和原始图像文件, 验证每个图像堆栈的结果。
  14. 优化 Ilastik 掩码 (步骤 8.4-8.9) 并重新分析任何图像堆栈, 结果不令人满意。
  15. 用 MATLAB 计算 Ilastik 图像掩膜的弹性蛋白和胶原体积密度
    1. 打开MATLAB
    2. 在 MATLAB "当前文件夹" 窗口中选择带有 ilastik 图像掩码的文件夹。
    3. 将 matlab 脚本从辅助文件 1复制到 matlab 编辑器中, 并将代码保存为 volumeCalculator 在计算机硬盘驱动器上的 matlab 文件夹中。
    4. 在脚本行中输入像素大小和像素高度
      pixelSize = 0.1230000 * 0.1230000;%micron * 微米
      pixelHeight = 0.9;微米%
    5. 保存脚本。
    6. 转到 MATLAB 命令窗口, 输入 "volumeCalculator (" 路径到数据 ") 以加载脚本。
    7. 单击 "输入"。现在, 每个图像掩码都被汇总并乘以 (已知的) 像素/体素体积 (像素的物理尺寸乘以 z 轴分辨率)。MATLAB 的输出是每个图像栈中弹性体和胶原蛋白的总体积。
  16. 保存结果。

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Representative Results

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此工作中使用的用于成像的自定义压力 myograph 显示在图 1中。特别注意为 myograph 的设计被支付了对 i) 房间以小容量 (2 毫升) 和 ii) 可能性安置套管接近, 并且平行与玻璃底部 (图 1B)。房间的底部适合 50 x 24 毫米 #1. 5 玻璃盖玻片 (可更换)。该压力控制器是由标准的1升玻璃瓶和血压计 (袖口删除)。对于具有流量要求的 myograph 设置, 建议使用伺服压力控制器。

图 2说明了在协议中概述的实验中获取单个图像和图像堆栈的推荐位置。为说明起见, 已安装的动脉的透射光显微图像包括在图 2A中。固定动脉的结对结长度约为1.6 毫米。扫描动脉直到观测到最宽的直径 (图 2B), 此时将确定直径和壁厚 (图 2C)。同样,图 2D中包含了动脉的透射光图像, 显示了用于确定胶原蛋白 (图 2E) 和弹性蛋白 microarchitectures 的图像堆栈的位置和建议宽度 (图 2F, 小正方形图 2D) 以及用于确定胶原蛋白 (图 2G) 和弹性蛋白 (图 2H) 体积密度 (较大的正方形、图 2D) 的图像堆栈。使用这种方法, 可以从压力、直径和壁厚测量 (图 2C) 中获得用于构造压力直径曲线的数据, 然后计算相应的应力应变曲线。

基于 Bloksgaard et的应力-应变关系的单指数拟合。13和此处的引用提供了β值, 这是与增量弹性模量 (Einc) 成正比的壁刚度的几何独立度量。计算 E公司在不同的压力下, 胶原蛋白和弹性蛋白 microarchitectures 的图像得到, 允许直接分析的压力诱发变化的 microarchitectures 胶原蛋白和弹性蛋白以及在不同压力下的增量弹性模量 (图 3)。IEL 分枝角和胶原直线度的测量在图 4中说明。

重要的是解释的机械数据比较两个或更多的兴趣群体,例如高血压 vs 正常人患者, 是一个确定的内容, 弹性蛋白和胶原蛋白。为此, 开发了一种可用于识别某些图像特征的免费图像分析软件 Ilastik 的自动分析方法。Ilastik 中的工作流在图 5中进行了说明。

为自动检测弹性体和胶原蛋白的体积密度, 重要的是有一个良好的信噪比的图像获得。在人体标本中, 除了胶原 SHG 信号外, 还经常观察到胶原蛋白的显著自体荧光。这降低了信噪比检测弹性蛋白。图 6说明了 Ilastik 程序的重新培训如何能够更好地识别在 "绿色"/弹性体通道中具有显著胶原荧光的样本中的薄弹性蛋白纤维。如果将自体荧光信号出血到胶原 SHG 通道是一个问题, 使用较长的激发波长获得 SHG 信号可能会有所帮助。如果在用伊红染色后出现通道出血, 应降低其应用溶液的浓度。红梅很容易被冲出, 所以反复洗涤的染色样品可能会减少信号太多。

Figure 1
图 1.自定义内置压力 myograph 用于荧光成像.(A) 与并联相连的玻璃毛细血管的灌注室, 安装在力传感器 (纵力) 上。(B) 2 毫升成像室。45°弯曲的套管促进成像使用倒置显微镜。(C) 压力控制器。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2.联合压力 myography 和荧光成像策略.(A) 动脉的透射光图像, 图示 (B) 扫描动脉的全宽度。胶原蛋白 SHG 以绿色显示, 而在洋红中, 弹性蛋白自发荧光。(C). 动脉腔直径 (这里238µm) 和壁厚 (这里17和18µm 的顶部和底部分别) 是在赤道区域 (观察到的最大直径) 确定的。(D) 动脉的透射光图像, 以10-50 µm 尺度获得的 z 栈的位置说明, 以确定 (E) 胶原的直线度, (F) 内弹性板的分支角, (G) 在50-100 µm 上获得的 z 栈获得胶原蛋白和 (H) 弹力蛋白体积密度的尺度。图片 B/C: 高度300µm (酒吧20µm), E/F:50 x 50 µm (酒吧10µm), G/小时 130 x 130 x µm (酒吧 = 30 µm)。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3.血管外膜胶原和内弹性叶片 (IEL) 的显微结构变化及其与20、40和 100 mmHg 周向增量弹性模量的关系。(A) IEL 中弹力纤维的分枝角。(B) 血管外膜胶原纤维的平直度接近外部弹性叶片。p-值和根据 F 值确定使用重复测量单向方差分析: p/F 值 A: 0.0014/24.18, B: 0.0002/37.38。(C) IEL 分支角度与 E公司的非线性关联。(D) 胶原直线度与 E公司呈线性关联。数据显示为平均值 "SE". 对6例受生命成像影响的血管进行了显微组织变化 (A、B 和 x 轴) 测定, 而 E公司(c 和 d) 则计算了在标准的压力 myography 下的20个其他动脉。压力 myograph。每个被研究的动脉来自不同的个体。此数字已从 Bloksgaard et al中进行了修改。13.请单击此处查看此图的更大版本.

Figure 4
图 4.斐济 IEL 分枝角和胶原直线度测量的说明.(A) 用斐济角工具手工标记和测量 IEL 分枝角。(B) 胶原直线度的确定使用斐济神经元 J 插件作为一个单一的胶原纤维端到端长度的比率通过一条直线 (白色) 除以纤维的实际端到端长度 (橙色)。酒吧大小:20 µm。

Figure 5
图 5.Ilastik 工作流.(A) 特征选择窗口, 并指示选定的功能。(B) 示例原始图像 (C) 弹性蛋白纤维的标签、明亮斑点 (不想要的) 和背景, 分别以红色、绿色和蓝色突出显示。(D) 产生的图像 (B) 的预测图 (C) 中标明的标签。(e) 根据 (D) 之前 (e) 和 (F) 项下的预测图进行的分段应用阈值为0.5。黄色显示与隔离特征 (弹性蛋白) 对应的连接像素。条形大小:25 µm.请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 6
图 6.示例图像优化前后的 Ilastik 预测图显示了重新训练 Ilastik 对弹性蛋白纤维在高背景荧光的样品中识别的效果 (子最优信噪比).(a) 原始图像, (B) 第一 Ilastik 分析的结果, 特别是薄弹性蛋白纤维 (图像 B 的左侧) 不包括在分割和 (C) 预测图优化之后的最终结果中。条形大小:25 µm.请单击此处查看此图的较大版本.

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Discussion

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这项工作代表我们建议的标准化, 联合成像和压力 myography 方法, 有价值的同时评估的力学性质的阻力动脉和压力相关变化的动脉结构墙壁在压力范围从0到 100 mmHg。提出的方法是使用定制的设备开发的, 但是, 当两种设备的设计允许动脉壁的成像时, 任何适合于双光子激发荧光显微镜的压力 myograph 都可以使用。应特别注意目标的形状、宽度和工作距离, 以及成像将执行的条件。直立显微镜要求使用水浸的目标, 而使用水浸泡目标被推荐用于倒置显微镜, 以避免样品和目标之间的折射率的差异。此外, 应注意的盖玻片厚度, 无论是通过对目标和盖玻片的不匹配的纠正, 使用矫正衣领的目标 (如果存在) 或匹配的盖玻片厚度与目标使用。

在描述的协议中, 利用低能量、近红外光来成像弹性蛋白自发荧光和胶原 SHG。这允许成像的时间延长。在这项研究中使用的人体阻力动脉中, IEL 由一根纵向排列的纤维状网络组成, 相互关联的弹性体纤维13,33, 类似于人体皮下阻力的 IEL 结构。动脉 (hSCA)38,39。对 IEL 中弹性蛋白纤维的分枝角的变化进行了评价, 并与血管外膜胶原纤维逐渐开卷的措施进行了分析, 增加了压力37 评估弹性蛋白微体系结构的变化和胶原蛋白分别。评估弹性蛋白和胶原 microarchitectures 的图像在同一地区的动脉壁内的不同压力下获得。这允许重复测量分析。在可能的情况下, 调查人员可以瞄准至少3个感兴趣的区域获取图像, 每个维度中的图像大小为10-50 µm。然而, 根据样品, 特别是动脉壁的厚度, 必须在所扫描的感兴趣区域的数量和实验的可行性持续时间之间作出妥协。在人心包阻力动脉的情况下, 动脉仍然存活至少8-12 小时的实验。扫描几个感兴趣的区域可以评估内部和样本间的变异性, 从而支持得出结论。

重要的是要注意, 为了避免诱发光毒性损伤, 使用高功率激发光的成像应避免在工作的活体组织标本。鉴于此, 建议在实验性协议的末尾为胶原蛋白和弹性蛋白体积密度获取大的图像栈, 或者在固定样本上。当需要绝对数量的 ECM 组件时, 固定剂对体积密度的任何影响都应加以量化并加以考虑。在必要时, 动脉的固定和通透允许进一步染色细胞内靶点。在这个协议中, 弹力蛋白的染色是使用在活动脉上的伊红。通过特定探针 (例如, alexa 633 酰肼40) 和胶原蛋白 (例如, CNA3541), 可以与其他污渍 (例如罗丹明42) 或 DNA 一起应用弹性蛋白染色, 以促进评估在动脉壁上的其他感兴趣结构的容积密度和结构组织。这一机会可以为研究实验室提供单光子共焦显微镜, 这是一个调查阻力动脉显微结构变化的机会。同一动脉段可在不同条件下治疗, 在压力下固定, 并在稍后阶段进行成像, 以比较应用治疗的效果。应通过对重空心、再加压和染色容器的成像来可视化目标。当考虑结构变化时, 需要重新插管和重新加压, 因为弹性蛋白不能固定, 因此会反冲和改变固定动脉的3D 结构43,44。确定固定动脉结构变化的缺点是, 必须固定几个段进行比较, 重复测量分析不能进行。

通过成像获得的数据可以直接用于计算壁面应力和应变, 并支持理解血管壁的力学, 如 Bloksgaard, m. et al13中所述。在这项工作中, 应用数学模型来表征动脉壁弹性体和胶原成分的内在刚度, 并根据计算得出的胶原蛋白的招募菌株45,46 。应力应变关系。影像支持数学建模的结果, 即人体抵抗动脉中的胶原蛋白已经在低周向应变和壁应力中被吸收。本议定书所述的弹性蛋白和胶原微结构的定量测量方法可以进一步扩展, 其灵感来自于颈动脉的广泛工作6,8,47,48,49和主动脉7,9,10,50,51: 其他分析可能包括评估胶原蛋白的空间分布和微结构, 以及弹性体纤维在动脉壁的不同的层数之内并且纤维取向角度 (取向关于纵轴)。响铃et al15讨论了 IEL 和血管外膜胶原的压力诱发重组, 包括多层分析模型, 用于计算动脉壁各层的刚度和应力。这些作者15使用人体皮下抵抗动脉从健康志愿者获得, 并且相关的结构和壁重音在3和 30 mmHg, 分别。

本议定书中提出的方法有望推动进一步调查和发展 microstructurally 动机的数学模型, 以了解人体阻力动脉在健康和疾病中的力学特性。进一步修正的方法, 也包括胶原蛋白和弹性体方向角沿纵轴, 平滑肌细胞体积密度, 空间分布和方向在动脉壁, 胶原蛋白和弹性蛋白分布和在膜介质中的定位和弹性蛋白的组织和分布, 成像数据可以促进数学模型的发展, 有助于了解高血压、糖尿病的重塑过程和代谢综合征。同样, 正如陈和 Kassab 为冠状动脉微循环的建议52,53, 基于显微组织的人的抵抗动脉模型可以提供预测的动脉机械反应在宏观-(全动脉)和微 (结构) 机械水平的每个组成部分。这类模型必须根据来自健康志愿者和患有不同疾病的患者的动脉壁内各层和成分的结构参数和力学性能的定量数据,接受不同的药理治疗。数据以标准化的方式收集, 并与不同风险因素、疾病和治疗概况的个人进行比较。该方法有可能帮助理解疾病和医疗治疗如何影响人体微循环。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

作者感谢丹麦南部大学自然科学系的丹麦分子生物医学成像中心, 用于实验室和显微镜的使用。kris 专职 Rosenstand 和乌拉梅尔基奥是公认的优秀技术援助与压力 myography 和成像。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fine Science Tools 15401-12
Fine Science Tools 11251-23
Nikon SMZ800N
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. 761028 for dissection purpose
Vitrex Medical A/S, Herlev, Denmark 1.63, 2.13, 210mm
Smiths medical Intl, UK
Ethicon Ethilon 11-0
Custom built DK patent number 201200167, University of Southern Denmark, J. Schoubo V. Jensen, F. Jensen. T.R. Uhrenholt
Mettler toledo
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. B3259
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. A7030
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. C5670
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. G7021
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. E3889
Merck Millipore, Hellerup, Denmark 1.00496.9010 Phosphate buffered (pH 6.9) 4% formaldehyde solution 
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. H3784
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. P9666
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. P5655
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. M2643
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. S2002
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. S5886
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. S5761
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. 1.06462
Gibco, ThermoFisher Scientific 10010015
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. PHR1423
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. Z370525
 Tocris Bioscience, Bristol, UK 538944
Nikon Custom built
Spectra Physics, Mountain View, CA
Nikon CFI Plan Apo IR SR 60XWI NA 1.27
Nikon CFI Plan Fluor 20XMI (multi-immersion) NA 0.75
Hamamatsu, Ballerup, Denmark H7422P-40
AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany). ChromaET 460 nm long pass dichroic
AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany). Semrock FF01-520/35-25 BrightLine filter
AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany). Chroma ET402/15X 
Scotch TM
coverslip thickness should match used objective on microscope (#1 or #1.5), alternatively, set adjustment collar to match coverslip

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用无标签荧光显微镜评价活体、人体阻力动脉中胶原蛋白和弹性蛋白的压力依赖性 Microarchitectures
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Bloksgaard, M., Thorsted, B., Brewer, J. R., De Mey, J. G. R. Assessing Collagen and Elastin Pressure-dependent Microarchitectures in Live, Human Resistance Arteries by Label-free Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (134), e57451, doi:10.3791/57451 (2018).More

Bloksgaard, M., Thorsted, B., Brewer, J. R., De Mey, J. G. R. Assessing Collagen and Elastin Pressure-dependent Microarchitectures in Live, Human Resistance Arteries by Label-free Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (134), e57451, doi:10.3791/57451 (2018).

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