Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Vurdering af kollagen og Elastin pres-afhængige Microarchitectures i Live, menneskelige modstand arterierne af Label-fri Fluorescens mikroskopi

doi: 10.3791/57451 Published: April 9, 2018

Summary

Vi beskriver samtidige mekanisk testning og 3D-billedbehandling af arterievæggen af isolerede, levende menneskelige modstand arterier og Fiji og Ilastik billede analyser til kvantitativ bestemmelse af elastin og kollagen rumlige organisation og volumen tætheder. Vi diskuterer brugen af disse data i matematiske modeller af arterievæggen mekanik.

Abstract

Patogene bidrag modstand arterie remodellering er dokumenteret i essentiel hypertension, diabetes og det Metaboliske syndrom. Undersøgelser og udvikling af microstructurally motiveret matematiske modeller til at forstå de mekaniske egenskaber af menneskelige modstand arterier i sundhed og sygdom har potentiale til at støtte forståelse hvordan sygdom og medicinsk behandlinger påvirke den menneskelige mikrocirkulationen. For at udvikle disse matematiske modeller, er det vigtigt at afkode forholdet mellem de mekaniske og mikroarkitektonisk egenskaber af mikrovaskulære væggen. I dette arbejde beskriver vi en ex vivo metode for passiv mekanisk testning og samtidige etiket-fri tredimensional billeddannelse af mikroarkitektur elastin og kollagen i arterievæggen af isolerede menneskelige modstand arterier. Imaging protokollen kan anvendes til modstand arterier af alle arter af interesse. Billede analyser er beskrevet for kvantificering i) Tryk-inducerede ændringer i indre elastisk lamina forgrening vinkler og adventitial kollagen rethed ved hjælp af Fiji og ii) kollagen og elastin volumen tætheder bestemmes ved hjælp af Ilastik software. Helst alle mekaniske og billedbehandling målingerne udføres på live, perfunderet arterier, men en alternativ tilgang ved hjælp af standard video-mikroskopi pres blodkar i kombination med efter fiksering billeddannelse af re trykisoleret fartøjer er drøftet. Denne alternative metode giver brugere med forskellige muligheder for analyse tilgange. Medtagelsen af de mekaniske og billeddiagnostiske data i matematiske modeller af arterievæggen mekanik er drøftet, og fremtidige udvikling og tilføjelser til protokollen er foreslået.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Patogene bidrag og effekter af modstand arterie remodellering er dokumenteret i essentiel hypertension, diabetes og det Metaboliske syndrom1,2,3,4,5. Afkodning af forholdet mellem den mekaniske og mikroarkitektonisk egenskaber af mikrovaskulære væggen er afgørende for udviklingen af matematiske modeller af denne tilknytning. Sådanne modeller vil forbedre forståelsen af remodeling proces og vil støtte udviklingen af siliciummangan modeller nyttig ved afprøvning af farmakologiske strategier rettet mod sygdom relateret remodellering af arterievæggen.

Forudgående undersøgelser fokuseret i forståelsen af hvordan mikroarkitektur af arterievæggen vedrører arterievæggen mekanik ved at indarbejde mekaniske foranstaltninger og mikroarkitektur af den ekstracellulære matrix (ECM) er næsten udelukkende udført på store , elastisk conduit arterier fra mus eller svin6,7,8,9,10,11. Billeddannelse af mikrostrukturer af væggen er typisk udføres ved hjælp af ulineære optiske teknikker, at drage fordel af autofluorescence af elastin og anden harmonisk generation af kollagen. Dette giver mulighed for spatiotemporelle billeddannelse af de to vigtigste komponenter i den ekstracellulære matrix, elastin og kollagen, uden behov for farvning. Billeddannelse af arterievæggen i fuld tykkelse er en udfordring i store conduit arterierne på grund af scatter af lyset i den tykke tunica media. For at bestemme, hvordan mikroarkitektur af de strukturelle komponenter af arterievæggen vedrører de observerede mekaniske egenskaber, skal tre-dimensionelle oplysninger indhentes i løbet af den mekaniske test. For store arterier som menneskelige aorta kræver dette biaksiale montering, mekanisk prøvning og imaging af regioner af interesse i 1-2 cm2 stykker af arterievæggen7,9,10, 12. kun en del af væggen kan være afbildet og mekanisk testet.

For mindre arterier af enhver art (f.eks. menneskelige perikardial13, pulmonal14 og subkutane15 arterier, rotte mesenteriallymfeknuderne arterier16,17,18, 19 , 20, mus cremaster, mesenteriallymfeknuderne, cerebral, collum og halspulsårer21,22,23,24,25,26, 27) billeddannelse af hele vægtykkelse er muligt og kan være kombineret med mekaniske test. Dette giver mulighed for simultan optagelse af de mekaniske egenskaber og de strukturelle ordninger inden for muren. Imidlertid er en direkte matematisk modellering af forholdet mellem de observerede ændringer i de tre-dimensionelle struktur af ECM og ændrede mekaniske egenskaber af arterievæggen modstand til bedst af vores viden kun blevet rapporteret efter for nylig i menneskernes modstand arterier13,15.

I dette arbejde, er en ex vivo metode for passiv mekanisk testning og samtidige tredimensional billeddannelse af mikroarkitektur elastin og kollagen i arterievæggen af isolerede menneskelige modstand arterier beskrevet. Imaging protokollen kan anvendes til modstand arterier af alle arter af interesse. Billede analyser er beskrevet for at opnå indre elastisk lamina forgrening vinkler og adventitial kollagen rethed13 ved hjælp af Fiji28. Kollagen og elastin volumen tætheder bestemmes ved hjælp af Ilastik software29 og endelig optagelse af den mekaniske og billeddiagnostiske data i matematiske modeller af arterievæggen mekanik er diskuteret.

Mål at beskrive billedbehandling og image analyserne teknikker i kombination med matematisk modellering er at give efterforskere en systematisk tilgang til at beskrive og forstå observeret induceret trykændringer i ECM af modstand arterier. Den beskrevne metode er fokuseret i kvantificere ændringer i ECM i en beholder under opretholdelse, tryk i hovedbrandledningssystemet ved at sammenligne struktur af ECM på 20, 40 og 100 mmHg. Disse pres blev valgt til at bestemme strukturen af arterievæggen på sin mere kompatibel (20 mmHg), stiv (100 mmHg) og (40 mmHg) mellemtilstand, henholdsvis. Imidlertid kan enhver proces i det vaskulære mur af levende arterier, herunder ændringer foranlediget af vasoaktive komponenter, hysterese og flow, kvantificeres, afhængigt af den forskning hypotese pågældende investigator.

Brugen af to-foton excitation Fluorescens mikroskopi (TPEM) i kombination med et tryk myograph for at studere pres (eller andre) induceret ændringer i ECM af levende arterier er understreget. Først, fordi det giver mulighed for samtidig erhvervelse af den samlede tre-dimensionelle struktur af arterievæggen (diameter og væg tykkelse) sammen med tre-dimensionelle etiket-fri erhvervelse af høj kvalitet, detaljerede billeder af kollagen og elastin microarchitectures som beskrevet13 ved at udnytte autofluorescence elastin og kollagen anden harmonisk generation signal (SHG)30. Andet, TPEM giver mulighed for brug af lavenergi-nær-infrarødt excitations lys, minimere solskader af væv og dermed gentagne imaging på præcis den samme position indenfor den vaskulære væg er tilladt, tillader det gentagne målinger analyser af observerede ændringer.

Brug af en alternativ tilgang ved hjælp af Konfokal billeddannelse af presset fast arterier diskuteres for at tillade brugere uden adgang til TPEM en mulighed for at anvende den beskrevne metode. Oplysninger om ECM struktur og volumen tætheder kan også hentes fra to-dimensionelle analyser af væv sectioned i serie, f.eks. som beskrevet af31,32. På grund af manglende mulighed for at hente tre-dimensionelle strukturelle oplysninger over længdeskalaer af arterie og under skiftende betingelser ved hjælp af denne metode, er det imidlertid ikke anbefale at bruge denne fremgangsmåde for undersøgelser af pres og behandling induceret tre-dimensionelle ændringer i ECM.

Mindstekravet til investigator at anvende den heri beskrevne metode er adgang til en opsætning for cannulation og opretholdelse tryk i hovedbrandledningssystemet af arterier i kombination med en Konfokal eller to-foton excitation fluorescens mikroskop. Konfigurationen som beskrevet i følgende protokol er en specialbygget presset myograph med en langsgående krafttransducer, bygget til at passe på en brugerdefineret bygget inverteret to-foton excitation fluorescens mikroskop.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Samling af biopsier af menneskelige parietal hjertesækken til brug i dette arbejde blev udført efter skriftlig informeret samtykke, som tidligere beskrevet33. Studiet af menneskelige væv i overensstemmelse med principperne i Helsinki-erklæringen34 og blev godkendt af det regionale udvalg for sundhed Research etik for Syddanmark (S-20100044 og S-20140202) og Dansk Data Protection Agency.

1. indsamle væv og isolat (Human) modstand arterie

  1. Indsamle vævsprøver af interesse umiddelbart efter excision under en operation. Overførsel af væv til 4 ° C HEPES buffered fysiologiske saltopløsning (HBS) umiddelbart efter indsamling og gemme det i HBS.
    Bemærk: Humane væv indsamles kun efter godkendelse af relevante institutionelle og etiske udvalg samt patienternes skriftlig informeret samtykke. HBS sammensætning i mM: NaCl 144, KCl 4.7, CaCl2 2,5, MgSO4 1.2, KH2PO4 1,2, HEPES 14,9, glucose 5.5. Justere pH 7,4 med NaOH, og filtrere løsning selv 0,2 µm filter.
  2. Forlade den indsamlede væv i sterile HBS ved 4 ° C natten udviske anæstetika.
    Bemærk: Nogen effekt af overnight opbevaring på fartøjets integritet og funktionalitet bør kontrolleres af de enkelte forskningslaboratorium.
  3. Omhyggeligt isolere modstand mellemstore arterier (± 200 µm lumen diameter) ved hjælp af et par skarpe-spids pincet og mikro-dissektion saks.
  4. Gemme arterierne ved 4 ° C i iskold HBS mens priming imaging/trykkammeret.

2. montere den isolerede arterie i pres-Myograph

  1. Mount glas kanyler med tip diametre af ~ 80 µm på kanyler indehavere. Placer tips ca 150 µm ovenfor kammer glas bund.
    Bemærk: 45° bøjet spids kanyler kan præcis positionering af fartøjet over glas bund.
  2. Udfylde både indsugnings- og outlet rør med HBS med 1% BSA og oprette forbindelse til tryksystem.
    Bemærk: BSA er medtaget for at bevare endotel cellefunktion.
  3. Montere den isolerede arterie ved hjælp af to dobbelt knude suturer pr. kanyle.
    Bemærk: Knob kan være forberedt på forhånd og gemt på dobbelt klæbende tape indtil det skal bruges.
  4. Fyld salen med HBS og placere to dobbelt knob på hvert glas kanyle.
    Bemærk: Når du bruger arterier vise myogenic tone, HBS bør erstattes med calcium frie HBS suppleret med 3 µM EGTA og 3 µM natrium nitroprusside.
  5. Holde arterien forsigtigt i den ene ende ved hjælp af to par af skarp spids pincet. Åbn lumen af arterien og forsigtigt skubbe det over på kanylen. Fix på kanyle ved hjælp af to knob.
  6. Anvende et tryk på 5 mmHg til forsigtigt flush lumen med HBS / 1% BSA.
  7. Kanyleres anden enden af arterie og sikkert det på kanylen ved hjælp af to dobbelt knob.
  8. Overførsel af myograph til stadiet mikroskop og presse arterie til 5 mmHg (indgangstryk = afgangstryk), derefter opvarmes til 37 ° C i 30 min.
  9. Valgfrit: Kalibrere den langsgående krafttransducer ifølge producentens anvisninger (1 g = 9,81 mN).
    Bemærk: Det er nødvendigt at kalibrere krafttransducer efter opvarmning som det er temperatur følsom.

3. udføre eksperiment: Imaging af arteriel Diameter, vægtykkelse og kollagen og Elastin mikroarkitektur ved hjælp af TPEM

  1. Hurtigt scanne den kanylerede arterie Pressurised til 5 mmHg ved hjælp af en 20 X mål (numerisk blænde (NA) ≥ 0,8) og lav effekt excitations lys for at vurdere fartøj diameter og væg tykkelse på 5 mmHg.
    Bemærk: For inverterede mikroskoper, bruge en vand fordybelse mål; opretstående mikroskoper, et vandforbrug dypning mål. Hvis mål ikke har en korrektion krave at korrigere for cover slip tykkelse, Sørg for at matche de anvendte dække glide med det formål anvendes. Den software-indstillinger og beskrivelser kan variere afhængigt af bruger-interphase og mikroskop og software, der anvendes.
    1. Setup den optiske transmissionslængde.
      1. Aktivere Mai Tai to-foton laser og sæt den til 820 nm excitations lys.
        Forsigtig: Undgå eksponering for såvel synlige som usynlige laserlys.
      2. Indsamle emission samtidigt i to kanaler. Split udledning lyse mellem Fotomultiplikatorer ved hjælp af en 460 nm lang pass dichroic spejl og indsamle emission ved hjælp af 30-60 nm bred bandpass filtre centreret på 520 nm (elastin) og 410 nm (kollagen), henholdsvis.
    2. Aktiver fortløbende scanning med 10 µs laser dwell tid/pixel og 512 × 512 pixel for 100% synsfelt.
    3. Manuelt scanne gennem arterien til at bestemme dybde hvor maksimale diameter er observeret.
    4. Vælg et rektangulært stykke der dækker den arterie bredeste diameter og scanne et enkelt billede med pixel størrelse ≤ 300 nm/pixel (figur 2 c). Bruge som lav excitations lys magt og pixel hviletid som muligt for at undgå photodamaging live arterie.
      Bemærk: Det anbefales at anskaffe en rektangulær, fx., 100 × 1024 pixel billede, i stedet for kvadratiske billede på denne position at spare tid og begrænse væv photon eksponering (figur 2 c).
    5. Gem billede for senere analyser.
  2. Bestemme lumen diameter og væg tykkelse på den maksimale diameter af arterie.
    1. Indlæse billedet i Fiji.
    2. Angive skalaen ved at klikke på Main menu | Analysere | angive skala og Indtast µm/pixel, og pixel forholdet (det anbefales at holde pixel forholdet 1:1).
    3. Vælg stregværktøjet Fiji og trække en linje mellem de to indre elastisk bladplader på hver side af arteriel lumen, og klik på ctrl + M. Fiji rapporter længde som standard i resultattabellen.
    4. Ligeledes tegner flere streger for at måle tykkelsen af hver væg, og klik på ctrl + M for at måle den følgende markup.
    5. Gemme måleresultaterne.
  3. Billede kollagen og elastin mikroarkitektur på 5 mmHg ved at scanne hele tykkelsen af arterievæggen, at opnå 3D billedstakke med god kvalitet for 1-3 regioner af interesse langs længden af arterien.
    1. Få billedstakke gennem hele væggen af arterien ved hjælp af en 60 X mål, NA ≥ 1, optimeret pixel størrelser og z-afstand.
      1. Beregne de optimale imaging betingelser (pixel størrelser og z-trin afstand) i overensstemmelse med den optiske pathway, fordybelse medium og prøve refraktive indeks ved hjælp af videnskabelige volumen Imaging Nyquist regnemaskine (https://svi.nl/NyquistCalculator).
        Bemærk: Vær opmærksom her forskellen mellem optimal pixelstørrelse og z-afstand kontra Råd i afsnit 3.4. ovenfor om anvendelse af en maksimal pixelstørrelse.
    2. Brug de samme excitations- og indstillinger som ovenfor (3.1.1.).
    3. Hurtigt scanne i karvæggen, som beskrevet ovenfor for at bestemme tykkelsen af z-stakken.
    4. Definere z-stakken start og slutningen dybde, z-trin afstand og pixel densitet (beregnet i 3.3.1.1.) og udføre z-scanning. Gem hver kanal adskilt.
      Bemærk: Billeder skal være lille nok f.eks. 30 x 30 µm eller 50 × 50 µm afhængig af fartøjernes størrelse til at undgå enhver påvirkning af krumning i de efterfølgende billede analyser.
  4. Bestemme arteriel diameter, vægtykkelse og elastin og kollagen mikroarkitektur på resterende pres af protokollen.
    1. Gentag 3.1-3.2 på pres 10 og 20 mmHg, Gentag 3.3 på pres 20 mmHg.
    2. Gentag 3.1 og 3.2 på pres 40 mmHg.
    3. Gentag 3.1-3.2 på pres 60, 80 og 100 mmHg og Gentag 3.3 på 100 mmHg.
      Bemærk: 3.1-3.3 kan gentages for alle belastninger, og kombinationer af pres (f.eks. en serie/kombination af stigende såvel som faldende pres), afhængigt af hypotesen der skal testes. Eosin i koncentration 0,3 - 1 µM kan tilføjes for at styrke elastin autofluorescence i tilfælde af photobleaching. Photobleaching kan undgås ved at anvende som lavt strømforbrug excitations lys som muligt.
    4. Erstatte buffer i myograph kammer med friske 37 ° C HBS efter hvert tryk trin. Tillad arterie at tilpasse for 5 min før imaging efter hver ændring i pres.
  5. Gemme kanalen stakke særskilt for billede analyser.
  6. Teste levedygtighed af arterie.
    1. Anvende 10 µM U46619 i myograph sal efterfulgt af tilsætning af 10 µM bradykinin, når en stabil konstriktion er observeret.
    2. Optage diameter og væg tykkelse, som beskrevet ovenfor i afsnit 3.1 efter anvendelsen af hvert af forbindelser.
    3. Tilføje 3 µM natrium nitroprusside, når arterien ikke er fuldt opspilede efter tilsætning af bradykinin og post diameter og væg tykkelse.
      Bemærk: Afhængigt af de farmakologiske egenskaber af arterie i interesse, (vaskulære seng og arter) andre vasokonstriktor og (endotel-afhængig) vasodilatator forbindelser kan bruges.
  7. Valgfrit: Fix arteria trykisoleret eller fortsætte med billeddannelse af kollagen og elastin for volumen tætheder (trin 7).
    1. Tilføj 4% formaldehyd i 1 x fosfatbufferet saltopløsning (PBS) ved 37 ° C i 1 time.
    2. Vaske den faste arterie tre gange i 1 x PBS og blidt skub arterie off kanyler, berører kun delene af arteria knuder. Ikke fjerne knuderne, bruge dem til at holde arterien, når der overføres til en opbevaring rør.
    3. Butik i 1 x PBS / 0,05% natriumazid ved 4 ° C indtil imaging for elastin og kollagen volumen tætheder eller andre formål.
      BEMÆRKNING: Fast arterier kan opbevares i mindst 3 måneder i 1 x PBS / 0,05% natriumazid ved 4 ° C.

4. beregning af Stress stamme relationer og iboende væg stivhed

  1. Følg formler og beregningstrin for beregning af spændinger, stammer og væg stivhed som beskrevet af Bloksgaard, M. et al. 13 og referencer heri.

5. billedanalyse - (indre elastisk Lamina) IEL forgrening vinkler

  1. Åben billedstak i Fiji. Gå til fil | åbent billede at vælge billedstak.
    Bemærk: Max intensitet fremskrivninger af 2-7 på hinanden følgende z-sektioner der dækker IEL (1-2 µm tykkelse) bruges til bestemmelse af IEL elastin fibre forgrening vinkler ved hjælp af værktøjet vinkel i Fiji28,35. Se figur 4A for illustration.
  2. Gå til billede | stakke | z projekt... at vælge billeder og "Max intensitet projektion".
  3. Gemme max intensitet projektion som TIFF.
  4. Vælg så mange IEL fiber forgrening point som muligt ved hjælp af værktøjet"vinkel", og arbejde systematisk gennem billederne. Klik på ctrl + M for at måle hver vinkel.
  5. Gemme arket Fiji resultater.

6. billedanalyse - Adventitial kollagen Waviness

  1. Åben billedstak i Fiji. Gå til fil | åbne billede for at vælge billedstak.
    Bemærk: Max intensitet fremskrivninger af 2-7 på hinanden følgende z-sektioner der dækker kollagen lige uden for den eksterne elastisk lamina (ål, 1-4 µm tykkelse) bruges til bestemmelse af kollagen waviness ved hjælp af Fiji NeuronJ plugin36 , som beskrevet af Rezakhaniha, R . mfl. 37 (Figur 4B).
  2. Angiv skalaen. Gå til analysere | sat skala at angive pixeldimensioner.
  3. Gå til billede | stakke | z projekt... at vælge billeder at arbejde med og "Max intensitet projektion".
  4. Skift billedtype til 8 bitt TIFF ved at klikke på billede | type | 8 bitt og gemme max intensitet projektionen som TIFF.
  5. Måle kollagen fiber rethed ved hjælp af Fiji Neuron Jørgensen Plugin.
    1. Åbne NeuronJ plugin ved at klikke på Fiji | Plugins | Neuron Jørgensen.
    2. Åbn 8 bit TIFF i NeuronJ ved at klikke på belastning billede | Vælg filen.
    3. Klik på Tilføj tracings, og vælg fibre til at analysere ved at klikke på start og slutningen af hver fiber.
    4. Klik på foranstaltning tracings, Vælg vise sporing (Lf) og vertex målinger i dialogboksen.
  6. Beregne L0/Lf i excel (eller lignende) og gemme resultaterne.
    1. Kopier og Indsæt Fiji Neuron Jørgensen tracings og vertices output til excel (eller lignende) og beregne L0 ved hjælp af Pythagorass sætning fra vertex målinger. Første og sidste punkt på linje angiver positioner af enderne af hypotenusen i en 2D koordinatsystem.
      Bemærk: En L0/Lf [kollagen fiber bundt ende til længde via en lige linje (L0) / fuld længde (Lf)] tæt på 1 angiver en næsten lige kollagen fiber.

7. imaging for kollagen og Elastin volumen tætheder

  1. Vaske arteria (fast) 1 x i PBS og bejdse det i 15 min. i 1 µM eosin i 1 x PBS i mørke. For faste arterier, udføre dette trin ved stuetemperatur.
    Bemærk: Eosin forbedrer elastin fluorescens. Eosin pletten andre strukturer såsom kollagen og cellen cytoplasma, hvis prøven er tilbage i Farvningsopløsningen i længere tid. Hvis farvning af andre strukturer er for intens, sænke koncentrationen af eosin til 0,3 µM eller Gentag vask.
  2. Vaske arterie 3 x i 1 x PBS
    1. For faste arterier: mount arterie for billeddannelse.
      Forsigtig: Billeddannelse af ikke-trykreguleret fartøjer ikke tillader hentning af geometriske kvantitative oplysninger. Når absolutte mængder er påkrævet, skal disse altid indhentes på live, trykisoleret arterier. Volumen-nøgletal kan fås på de ikke-trykreguleret arterier med denne metode.
      1. Sted to stykker af dobbelt klæbende tape 1-1,5 cm fra hinanden på et objekt-glas. Dobbelt klæbende tape er ca 100 µm tykt. Anvende et eller flere lag af tape til at matche diameter af arterie skal monteres.
      2. Sted 10-20 µL af PBS på glas i midten af pladsen og placere arterie i PBS drop.
        Bemærk: Drop skal være så lille og flad som muligt for at undgå at skubbe arterie ude af position, når du monterer dække slip.
      3. Placere coverslip og tryk på dobbelt klæbende tape.
      4. Fyld reservoir mellem coverslip og objekt glas med 1 x PBS. Refill det hver time for at undgå udtørring af prøven.
  3. Få billedstakke for kollagen og elastin volumen tætheder ved hjælp af en 20 X mål med NA > 1 til at dække så meget af arterievæggen som muligt samtidig stadig have en god optisk opløsning (figur 2D, 2 G og 2 H).
    Bemærk: Bruge en vand fordybelse mål for billeddannelse af faste arterierne under en coverslip, og bruge en vand dypning mål for billeddannelse af vitale arterier. Hvis mål ikke har en korrektion krave at korrigere for cover slip tykkelse, Sørg for at matche coverslip til formålet. Brug fortrinsvis optimal pixel størrelser og z-afstand. Beregne disse benytter Nyquist regnemaskine (trin 3.3.1.1.). Alternativt kan du bruge et minimum pixelstørrelse af 300 nm og z-afstand på 1 µm. Det anbefales at få tre billeder langs længden af arterien til at tillade brugeren at bestemme intra-assay variation.
  4. Billede elastin bruger 820 nm excitations lys og indsamle emission ved hjælp af en 30-60 nm bred bandpass filter centreret på 520 nm.
  5. Billede kollagen bruger 990 nm excitations lys til at undgå enhver excitation af elastin og andre autofluorescent proteiner og indsamle emission bruger 10-30 nm bred bandpass filter centreret på 495 nm.
  6. Gemme billedstakke fra hver kanal adskilt som TIFF-arkiver

8. billedanalyse til at udtrække Elastin og kollagen volumen tætheder ved hjælp af Ilastik

  1. Konvertere TIFF billedstakke til HDF5 ved hjælp af Fiji28,35 ved at klikke på Vælg fil | Gem som... HDF5.
  2. Opret to data filmapper på computerens harddisk, en for elastin, for kollagen billedstakke, henholdsvis. Kopiere relevante billedstakke til den relevante mappe.
  3. Opret to nye Ilastik projekter i Ilastik software, en af elastin, én for kollagen, henholdsvis.
    1. Åbn Ilastik | Opret nyt projekt | pixel klassifikation | nyt projekt | tilføje data og vælg billedmappe oprettet i trin 8.2.
      Bemærk: Følg guiden Ilastik.
  4. Importere en 3D billedstak for at træne softwaren.
    1. Vælg Input Data applet | vigtigste arbejdsområde område | Rå Data tab | Tilføj ny... | Tilføje separate billederne og vælge den ønskede billeddata
  5. Vælg relevante funktioner i softwaren.
    1. Åben funktion udvalg applet | Vælg funktion som åbner en ny dialogboks. Se figur 5A for detaljer.
  6. Tilføj mindst to etiketter ved hjælp af knappen Tilføj etiket under uddannelse-applet.
    Bemærk: Hver etiket vil svare til en objekttype, der skal adskilles. I dette arbejde, tre etiketter bruges til elastin: elastin, selv, lyse pletter (udelukkes), og baggrunden (skal udelukkes).
  7. Tegne labels oven på den rå billedstak bruger malerpensel stylet annotation værktøj.
    1. Vælg den passende etiket: Klik på pensel værktøj og opståen tegning.
  8. Lynhurtig Ilastik til at analysere billedstak og kigge efter lignende funktioner ved at klikke på Aktiverer Live Update.
  9. Kontroller omhyggeligt forudsigelse kort (fig. 5 d).
    Bemærk: Processen fra raw-billede til et komplet forudsigelse kort er vist i figur 5. Ilastik bruger forudsigelse kort at segmentere billedet stable alt efter hvilket mærke en pixel er mere tilbøjelige til at være forbundet (fig. 5 d).
  10. Anvend en taerskel.
    1. Vælg tærskel applet, vælge en passende metode, input label, glat, tærskel og størrelse filterparametre, og endelig skal du klikke på Anvend.
      Bemærk: Dette udskiller de tilsvarende mærket dele af billedet i diskrete objekter. Stærkt forbundne væv, ligesom elastin og kollagen behøver ikke at være adskilt, derfor, en tærskel på 0,4 anvendes (standard er 0,5). Figur 5E og 5F illustrere resultatet af at anvende en tærskel.
  11. Gentag uddannelse af Ilastik, indtil resultatet er tilfredsstillende (kun elastin, henholdsvis kollagen er anerkendt for de respektive analyser).
    1. Ofte skifte mellem uddannelse og segmentering (og undertiden også tærskel) applets under denne proces. Et eksempel på effekten af efteruddannelse Ilastik er vist i figur 6.
  12. Batch analysere lignende billeddata: Vælg batch forudsigelse indgående udvælgelsen og tilføje relevante filer.
    Bemærk: Ilastik udgang er en samling af pseudo - 1 bit 3D billedstakke (billede masker) med 0 (nul) angiver mangel af elastin (eller kollagen) og 1 (én) betegner tilstedeværelsen heraf (faktiske bitdybden er 8-bit).
  13. Kontrollere resultaterne for hver billedstak ved at visuelt sammenligne billede masker og raw-billedfilerne.
  14. Optimere Ilastik maske (trin 8,4-8,9) og re analysere enhver billedstakke med utilfredsstillende resultater.
  15. Beregne elastin og kollagen volumen tætheder fra Ilastik billede masker ved hjælp af MATLAB
    1. Åbne MATLAB.
    2. Vælg mappe med ilastik billede masker i MATLAB "aktuelle mappe" vindue.
    3. Kopiere scriptet MATLAB fra supplerende fil 1 til MATLAB editor, og Gem koden som volumeCalculator.m i MATLAB-mappen på computeren harddisk.
    4. Angiv pixel højde og pixel størrelser i linjerne script
      pixelSize = 0.1230000 * 0.1230000; % micron * micron
      pixelHeight = 0,9; % micron
    5. Gemme scriptet.
    6. Gå til MATLAB kommandovindue og skriv "volumeCalculator (' sti til data')" til at indlæse scriptet.
    7. Klik på enter. Hvert billede maske er nu opsummerede og ganges med (kendte) pixel/voxel volumen (fysiske dimensioner af en pixel ganget med z-aksen opløsning). Output fra MATLAB er det samlede volumen af elastin og kollagen i hver billedstak.
  16. Gem resultaterne.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Den specialbyggede pres myograph for billeddannelse anvendes i dette arbejde er vist i figur 1. Særlig opmærksomhed til design af myograph blev til i) kammer med en lille mængde (2 mL) og ii) mulighed for positionering kanyler tæt på og parallel med glas bund (figur 1B). Kammerets bund passer en 50 × 24 mm #1.5 glas coverslip (udskiftelig). Pres controller blev bygget fra en standard 1 L glasflaske og en blodtryksmaaler (manchet fjernet). Til et myograph setup med flow krav anbefales at anvende en servo pres controller.

Figur 2 illustrerer de anbefalede positioner for at opnå indre billeder og billedstakke under eksperimentet skitseret i protokollen. Henblik på illustration indgår en transmission lysmikroskopi billede af arteria monteret i figur 2A. Knude til knude længden af den monterede arterie er ca. 1,6 mm. Arterien er scannet indtil den bredeste diameter er observeret (figur 2B), og på dette punkt, diameter og væg tykkelse er fastlagt (figur 2 c). Ligeledes er en transmission lys billede af arterie inkluderet i figur 2D, viser placeringen og anbefalede bredde af billedstakke til bestemmelse af microarchitectures af kollagen (figur 2E) og elastin (figur 2F, lille pladsen i figur 2D) samt billedstakke til bestemmelse af kollagen (fig. 2 g) og elastin (figur 2 H) volumen tætheder (større square, figur 2D). Brug denne fremgangsmåde, kan indhentes data til at konstruere pres diameter kurver, efterfulgt af beregningen af de tilsvarende stress-strain kurver fra pres, diameter og væg tykkelsesmålinger (figur 2 c).

En enkelt eksponentiel pasform af stress-strain forholdet efter Bloksgaard mfl. 13 og referencer heri, giver β-værdi, en geometri uafhængige foranstaltning af væg stivhed proportional med den trinvise elasticitetsmodul, Einc. Beregning af Einc på de forskellige belastninger på hvilke billeder for kollagen og elastin microarchitectures blev indhentet, giver mulighed for en direkte analyse af forholdet mellem trykændringer induceret i microarchitectures af kollagen og elastin og den trinvise elasticitetsmodul ved forskellige tryk (figur 3). Måling af IEL forgrening vinkler og kollagen rethed er illustreret i figur 4.

Vigtigt for fortolkningen af mekaniske data sammenligner to eller flere grupper af interesse, fx hypertensive vs normotensive patienter, er en bestemmelse af indholdet af elastin og kollagen. For dette er blev en automatisk analysemetode i Ilastik, en freeware billede analyse software, der kan være uddannet til at anerkende visse billede funktioner, udviklet. Arbejdsgangen i Ilastik er illustreret i figur 5.

For den automatiske registrering af elastin og kollagen for volumen tætheder er det vigtigt, at der er et godt signal-støj-forholdet i de billeder, der er opnået. I menneskelige prøver, er betydelige autofluorescence fra kollagen ofte observeret ud over kollagen SHG signal. Dette formindsker signal-støj-forholdet for påvisning af elastin. Figur 6 illustrerer hvordan omskoling af programmet Ilastik kan resultere i bedre anerkendelse af tynde elastin fibre i en prøve med betydelig kollagen autofluorescence i "grønne" / elastin kanal. Hvis gennemblødning af autofluorescence signalet ind i kollagen SHG kanal er et problem, kan at opnå SHG signalet ved hjælp af en længere excitation bølgelængde hjælpe. Hvis kanalen bløder igennem opstår efter farvning med eosin, koncentrationen af den anvendte opløsning af eosin bør sænkes. Eosin er let vasket ud, så gentagne vask af bejdset prøven kan nedsætte signalet også.

Figure 1
Figur 1 . Specialbygget pres myograph for fluorescens imaging. (A) perfusion kammer med glas kapillærer knyttet til micromanipulators, som er monteret på en krafttransducer (langsgående kraft). (B) 2 mL imaging kammer. 45° bøjning af kanyler letter imaging ved hjælp af en omvendt mikroskop. C presset controller. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 . Kombineret pres blodkar og fluorescens imaging strategi. (A) transmission lys billede af arterien med illustration af (B) scanning af den fulde bredde af arterie. Kollagen SHG er vist i grøn og elastin autofluorescence i magenta. C. arteriel lumen diameter (her 238 µm) og vægtykkelser (her 17 og 18 µm top og bund, henholdsvis) bestemmes ved den ækvatoriale regionen (største diameter observeret) af arterie. (D) transmission lys billede af arterien med illustration af placeringen af de z-stakke opnået på en 10-50 µm skala til bestemmelse af (E) kollagen rethed, (F) forgrening vinkler af de indre elastisk bladplader, og (G) z-stakke opnået på en 50-100 µm skala for opnåelse af kollagen og (H) elastin volumen tætheder. Billeder B/C: højde 300 µm (bar 20 µm), E/F: 50 x 50 µm (bar 10 µm), G/H 130 × 130 × 30 µm (bar = 30 µm). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 . Microstructural ændringer i adventitial kollagen og den indre elastisk lamina (IEL) og deres relation til de omkredsen incremental elastiske moduli på 20, 40 og 100 mmHg. (A) Branching vinkler elastin fibre i IEL. B rethed af adventitial kollagen fibre tæt på den eksterne elastisk lamina. p-værdier og ifølge F-værdier blev bestemt ved hjælp af gentagne målinger en-vejs ANOVA: p/F-values A: 0.0014/24.18, B: 0.0002/37.38. C IEL forgrening vinkler korrelerer nonlinearly med Einc. (D) kollagen rethed korrelerer lineært med Einc. Tallene vises som betyder ± SE. Microstructural ændringer (A og B og x-axes af C og D) blev fastsat til 6 modstand arterier underkastes vitale imaging mens Einc (C og D) blev beregnet for 20 andre arterier, udsat for pres blodkar i en standard Tryk myograph. Hver arterie studerede var fra en anden person. Dette tal er blevet ændret fra Bloksgaard mfl. 13. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 . Illustration af målinger af IEL forgrening vinkler og kollagen rethed i Fiji. (A) IEL forgrening vinkler markeres manuelt og måles ved hjælp af værktøjet Fiji vinkel. B kollagen rethed bestemmes ved hjælp af Fiji Neuron Jørgensen plugin som forholdet mellem ende til længden af en enkelt kollagen fiber via en lige linje (hvid) divideret med den faktiske ende til længden af fiber (orange). Bar størrelse: 20 µm.

Figure 5
Figur 5 . Ilastik arbejdsproces. (A) funktion udvalg rude med angivelse af udvalgte funktioner. (B) eksempel raw-billede med (C) etiketter for elastin fibre, lyse pletter (uønskede) og baggrund fremhæves i rød, grøn og blå, henholdsvis. (D) resulterer forudsigelse kort for billede (B) med etiketter anført i (C). (E) segmentering baseret på kortet forudsigelse i (D) før (E) og efter (F) anvender en tærskel på 0, 5Promille. Gul farve viser de tilsluttede pixels svarer til funktionen segregeret (elastin). Bar størrelse: 25 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6 . Eksempel billeder før og efter optimering af Ilastik forudsigelse kort som viser effekten af efteruddannelse Ilastik for anerkendelse af elastin fibre i en prøve med høj baggrund fluorescens fra kollagen (sub-optimale signal til støjforhold). (A) originale billede, (B) resultatet af første Ilastik analyse, hvor især den tynde elastin fibre (venstre side af billede B) ikke er inkluderet i segmenteringen og (C) endelige resultat efter optimering af kortet forudsigelse. Bar størrelse: 25 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende fil Venligst klik her for at downloade denne fil

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Dette arbejde repræsenterer vores forslag til en standardiseret, kombinerede imaging og pres blodkar tilgang, værdifulde for samtidige vurdering af de mekaniske egenskaber af modstand arterier og pres-relaterede ændringer i strukturen af arteriel væggen over et pres fra 0 til 100 mmHg. Den præsenterede tilgang blev udviklet ved hjælp af brugerdefinerede indbygget udstyr, dog kan ethvert pres myograph, der passer på en to-foton excitation fluorescens mikroskop bruges, når udformningen af både udstyr giver billeddannelse af arterievæggen. Særlig opmærksomhed bør betales til form, bredde og arbejde afstand af formålet, og de betingelser, hvorunder imaging vil blive udført. Opretstående mikroskoper kræver brug af vand dypning mål, mens brugen af vand fordybelse mål anbefales til omvendte mikroskoper til at forebygge forskelle i refraktive indeks mellem prøven og målet. Desuden bør lægges vægt på coverslip tykkelse, enten ved at anvende en korrektion for en uoverensstemmelse mellem mål og coverslip ved hjælp af korrektion kraven på mål (hvis tilstede) eller ved at matche coverslip tykkelse med formålet anvendes.

I den beskrevne protokol udnyttes af lav-energi, nær-infrarødt lys for billedbehandling elastin autofluorescence og kollagen SHG. Dette giver mulighed for billedbehandling for længere perioder. I den menneskelige modstand arterier anvendes i denne undersøgelse, består IEL af et på langs justeret fiber-lignende netværk af sammenkoblede elastin fibre13,33, svarer til strukturen af IEL af menneskelige subcutan modstand arterier (hSCA)38,39. Ændringer i forgrening vinkler elastin fibre i IEL blev evalueret og bruges sammen med foranstaltninger af den gradvise uncoiling af adventitial kollagen fibre med stigende pres37 til at vurdere ændringer i mikroarkitekturen af elastin og kollagen henholdsvis. Billeder til vurdering af elastin og kollagen microarchitectures blev fremstillet på den samme region af interesse i arterievæggen på forskellige belastninger. Dette giver mulighed for gentagne målinger analyser. Når det er muligt, investigator kunne tage sigte på at opnå billeder i mindst 3 regioner af interesse, med billedet størrelser 10-50 µm i hver dimension. Dog afhængig af prøven, specielt arterievæggen tykkelse, har et kompromis mellem antallet af scannede regioner af interesse og gennemførlige varigheden af forsøget. I tilfælde af menneskelige perikardial modstand arterierne forblev arterier i live i mindst 8-12 h eksperimenter. Scanning flere regioner af interesse giver mulighed for evaluering af intra-versus Inter prøve variation og dermed understøtter konklusionen om de opnåede resultater.

Det er vigtigt at bemærke, at for at undgå inducerende fototoksisk skader, imaging ved hjælp af high power excitations lys bør undgås, når du arbejder på levende væv prøver. I lyset af dette, anbefales det at få store billedstakke kollagen og elastin volumen tætheder for enden af forsøgsplan, alternativt på faste prøver. Når absolutte mængder af ECM komponenter er påkrævet, bør enhver påvirkning af fiksativ volumen tætheder kvantificeret og tages i betragtning. Fiksering og permeabilization af arterierne tillader desuden farvning af intracellulære mål af interesse når det er nødvendigt. I denne protokol udføres farvning for elastin ved hjælp af eosin på den levende arterie. Farvning af elastin af specifikke sonder (fx alexa 633 maleinhydrazid40) og kollagen (f.eks., CNA3541), kan anvendes sammen med andre pletter (f.eks. phalloidin42) eller DNA, skal lette vurderingen volumetriske tætheder og strukturelle organisation af andre strukturer af interesse i arterievæggen. Lejligheden kan give forskningslaboratorier med enkelt-foton Konfokal mikroskoper mulighed for at undersøge de mikrostrukturanalyse ændringer i modstand arterier. Segmenter fra samme arterie kan behandles under forskellige betingelser, fast under pres og afbildet på et senere tidspunkt at sammenligne effekten af den anvendte behandling. Mål af interesse bør være visualiseret af imaging re kanylerede, igen under tryk og farves fartøjer. Re cannulation og re opretholdelse tryk i hovedbrandledningssystemet er påkrævet, når strukturelle ændringer overvejes, elastin kan ikke fastsættes og dermed vil rekyl og ændre 3D-struktur af faste arterie43,44. Ulempen ved bestemmelse af strukturelle ændringer i faste arterier er at flere segmenter skal fastsættes for sammenligning, og gentaget måling analyser kan ikke udføres.

Oplysninger indhentet ved hjælp af imaging kan bruges direkte til at beregne væggen understreger og stammer, og støtte forståelse af mekanikken i det vaskulære væg, som beskrevet i Bloksgaard, M. al.13. I dette arbejde, en matematisk model blev anvendt til at karakterisere den iboende stivhed af elastin og kollagen komponenter af arterievæggen og vurdere kollagen rekruttering stammer45,46 på grundlag af beregnet stress stamme relationer. Imaging understøttes af resultaterne fra den matematiske modellering, at kollagen i menneskernes modstand arterier var allerede ansat på lav omkredsen stamme og wall stress. De kvantitative foranstaltninger af mikroarkitektur elastin og kollagen er beskrevet i denne protokol kan blive yderligere udvidet, inspireret af det omfattende arbejde, der udføres på halspulsårer6,8,47, 48 , 49 og aorta7,9,10,50,51: yderligere analyser kan omfatte vurdering af de rumlige fordeling og mikroarkitektur af kollagen og elastin fibre i de forskellige lag af arterievæggen samt fiber orientering vinkler (orientering med hensyn til den langsgående akse). Bell mfl. 15 rettet pres induceret reorganisering af IEL og adventitial kollagen herunder multi-lag analytisk model til at beregne den stivhed og stress i hvert lag af arterievæggen. Disse forfattere15 anvendes menneskelige subcutan modstand arterier stammer fra raske frivillige, og relaterede struktur og væggen understreger på 3 og 30 mmHg, henholdsvis.

Den foreslåede metode i denne protokol motiverer forhåbentlig yderligere undersøgelser og udvikling af microstructurally motiveret matematiske modeller til at forstå de mekaniske egenskaber af menneskelige modstand arterier i sundhed og sygdom. Med yderligere ændringer af metoden til at omfatte også kollagen og elastin orientering vinkler langs den langsgående akse, glat muskel celle volumen tæthed, geografiske fordeling og orientering inden for den arterielle væg, kollagen og elastin distribution og orientering i tunica media, og elastin organisation og distribution i tunica adventitia, den billeddiagnostiske data kan feed forward udvikling af matematiske modeller, at lette forståelsen af den remodeling proces i hypertension, diabetes og den metabolisk syndrom. På samme måde, som foreslået af Chen og Kassab for koronar mikrocirkulationen52,53, kan mikrostruktur-baserede modeller af menneskers modstand arterier give forudsigelser af arteriel mekanisk svar på makro-(hele arterie) og micro-(structure) mekaniske niveauer for hver bestanddel. Sådanne modeller skal være baseret på kvantitative data af strukturelle parametre og mekaniske egenskaber af enkelte lag og bestanddele i arterievæggen af arterier stammer fra både raske frivillige og patienter med forskellige sygdomme, modtager forskellige farmakologiske behandlinger. Data er indsamlet på en standardiseret måde og sammenlignes på tværs af individer med forskellige risikofaktor, sygdom og behandling profiler. Metoden har potentiale til at støtte forståelse hvordan sygdom og medicinske behandlinger, der påvirker den menneskelige mikrocirkulationen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Forfatterne takke Dansk Molekylær biomedicinsk Imaging Center på Det Naturvidenskabelige Fakultet, Syddansk Universitet, til brug i laboratorier og mikroskoper. Kristoffer Rosenstand og Ulla Melchior er anerkendt for fremragende teknisk bistand med presset blodkar og billedbehandling.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fine Science Tools 15401-12
Fine Science Tools 11251-23
Nikon SMZ800N
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. 761028 for dissection purpose
Vitrex Medical A/S, Herlev, Denmark 1.63, 2.13, 210mm
Smiths medical Intl, UK
Ethicon Ethilon 11-0
Custom built DK patent number 201200167, University of Southern Denmark, J. Schoubo V. Jensen, F. Jensen. T.R. Uhrenholt
Mettler toledo
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. B3259
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. A7030
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. C5670
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. G7021
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. E3889
Merck Millipore, Hellerup, Denmark 1.00496.9010 Phosphate buffered (pH 6.9) 4% formaldehyde solution 
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. H3784
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. P9666
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. P5655
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. M2643
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. S2002
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. S5886
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. S5761
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. 1.06462
Gibco, ThermoFisher Scientific 10010015
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. PHR1423
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. Z370525
 Tocris Bioscience, Bristol, UK 538944
Nikon Custom built
Spectra Physics, Mountain View, CA
Nikon CFI Plan Apo IR SR 60XWI NA 1.27
Nikon CFI Plan Fluor 20XMI (multi-immersion) NA 0.75
Hamamatsu, Ballerup, Denmark H7422P-40
AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany). ChromaET 460 nm long pass dichroic
AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany). Semrock FF01-520/35-25 BrightLine filter
AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany). Chroma ET402/15X 
Scotch TM
coverslip thickness should match used objective on microscope (#1 or #1.5), alternatively, set adjustment collar to match coverslip

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Briones, A. M., Arribas, S. M., Salaices, M. Role of extracellular matrix in vascular remodeling of hypertension. Curr Opin Nephrol Hy. 19, (2), 187-194 (2010).
  2. Heagerty, A. M., Heerkens, E. H., Izzard, A. S. Small artery structure and function in hypertension. J Cell Mol Med. 14, (5), 1037-1043 (2010).
  3. van den Akker, J., Schoorl, M. J., Bakker, E. N., Vanbavel, E. Small artery remodeling: current concepts and questions. J Vasc Res. 47, (3), 183-202 (2010).
  4. Rizzoni, D., Agabiti-Rosei, E. Structural abnormalities of small resistance arteries in essential hypertension. Intern Emerg Med. 7, (3), 205-212 (2012).
  5. Schiffrin, E. L. Vascular remodeling in hypertension: mechanisms and treatment. Hypertension. 59, (2), 367-374 (2012).
  6. Fonck, E., et al. Effect of elastin degradation on carotid wall mechanics as assessed by a constituent-based biomechanical model. Am J Physiol-Heart C. 292, (6), H2754-H2763 (2007).
  7. Chow, M. J., Turcotte, R., Lin, C. P., Zhang, Y. Arterial extracellular matrix: a mechanobiological study of the contributions and interactions of elastin and collagen. Biophys J. 106, (12), 2684-2692 (2014).
  8. Chen, H., et al. Biaxial deformation of collagen and elastin fibers in coronary adventitia. J Appl Physiol (1985). 115, (11), 1683-1693 (2013).
  9. Schriefl, A. J., Schmidt, T., Balzani, D., Sommer, G., Holzapfel, G. A. Selective enzymatic removal of elastin and collagen from human abdominal aortas: uniaxial mechanical response and constitutive modeling. Acta Biomater. 17, 125-136 (2015).
  10. Zeinali-Davarani, S., Wang, Y., Chow, M. J., Turcotte, R., Zhang, Y. Contribution of collagen fiber undulation to regional biomechanical properties along porcine thoracic aorta. J Biomech Eng. 137, (5), 051001 (2015).
  11. Mattson, J. M., Turcotte, R., Zhang, Y. Glycosaminoglycans contribute to extracellular matrix fiber recruitment and arterial wall mechanics. Biomech Model Mechan. 16, (1), 213-225 (2017).
  12. Schriefl, A. J., Zeindlinger, G., Pierce, D. M., Regitnig, P., Holzapfel, G. A. Determination of the layer-specific distributed collagen fibre orientations in human thoracic and abdominal aortas and common iliac arteries. J R Soc Interface. 9, (71), 1275-1286 (2012).
  13. Bloksgaard, M., et al. Imaging and modeling of acute pressure-induced changes of collagen and elastin microarchitectures in pig and human resistance arteries. Am J Physiol-Heart C. (2017).
  14. Dora, K. A., et al. Isolated Human Pulmonary Artery Structure and Function Pre- and Post-Cardiopulmonary Bypass Surgery. J Am Heart Assoc. 5, (2), (2016).
  15. Bell, J. S., et al. Microstructure and mechanics of human resistance arteries. Am J Physiol-Heart C. 311, (6), H1560-H1568 (2016).
  16. Roque, F. R., et al. Aerobic exercise reduces oxidative stress and improves vascular changes of small mesenteric and coronary arteries in hypertension. Brit J Pharmacol. 168, (3), 686-703 (2013).
  17. Briones, A. M., et al. Alterations in structure and mechanics of resistance arteries from ouabain-induced hypertensive rats. Am J Physiol-Heart C. 291, (1), H193-H201 (2006).
  18. Briones, A. M., et al. Role of elastin in spontaneously hypertensive rat small mesenteric artery remodelling. J Physiol. 552, (Pt 1), 185-195 (2003).
  19. Arribas, S. M., et al. Confocal myography for the study of hypertensive vascular remodelling. Clin Hemorheol Micro. 37, (1-2), 205-210 (2007).
  20. Gonzalez, J. M., et al. Postnatal alterations in elastic fiber organization precede resistance artery narrowing in SHR. Am J Physiol-Heart C. 291, (2), H804-H812 (2006).
  21. Spronck, B., Megens, R. T., Reesink, K. D., Delhaas, T. A method for three-dimensional quantification of vascular smooth muscle orientation: application in viable murine carotid arteries. Biomech Model Mechan. 15, (2), 419-432 (2015).
  22. Megens, R. T., et al. In vivo high-resolution structural imaging of large arteries in small rodents using two-photon laser scanning microscopy. J Biomed Opt. 15, (1), 011108 (2010).
  23. Megens, R. T., oude Egbrink, M. G., Merkx, M., Slaaf, D. W., van Zandvoort, M. A. Two-photon microscopy on vital carotid arteries: imaging the relationship between collagen and inflammatory cells in atherosclerotic plaques. J Biomed Opt. 13, (4), 044022 (2008).
  24. Bender, S. B., et al. Regional variation in arterial stiffening and dysfunction in Western diet-induced obesity. Am J Physiol-Heart C. 309, (4), H574-H582 (2015).
  25. Clifford, P. S., et al. Spatial distribution and mechanical function of elastin in resistance arteries: a role in bearing longitudinal stress. Arterioscler Thromb. 31, (12), 2889-2896 (2011).
  26. Martinez-Revelles, S., et al. Lysyl Oxidase Induces Vascular Oxidative Stress and Contributes to Arterial Stiffness and Abnormal Elastin Structure in Hypertension: Role of p38MAPK. Antioxid Redox Sign. 27, (7), 379-397 (2017).
  27. Foote, C. A., et al. Arterial Stiffening in Western Diet-Fed Mice Is Associated with Increased Vascular Elastin, Transforming Growth Factor-beta, and Plasma Neuraminidase. Front Physiol. 7, 285 (2016).
  28. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9, (7), 676-682 (2012).
  29. Sommer, C., Straehle, C., Kothe, U., Hamprecht, F. A. Ilastik: Interactive Learning and Segmentation Toolkit. 2011 8th Ieee International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro, 230-233 (2011).
  30. Campagnola, P. J., et al. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophys J. 82, (1 Pt 1), 493-508 (2002).
  31. Intengan, H. D., Deng, L. Y., Li, J. S., Schiffrin, E. L. Mechanics and composition of human subcutaneous resistance arteries in essential hypertension. Hypertension. 33, (1 Pt 2), 569-574 (1999).
  32. Saatchi, S., et al. Three-dimensional microstructural changes in murine abdominal aortic aneurysms quantified using immunofluorescent array tomography. J Histochem Cytochem. 60, (2), 97-109 (2012).
  33. Bloksgaard, M., et al. Elastin Organization in Pig and Cardiovascular Disease Patients' Pericardial Resistance Arteries. J Vasc Res. 52, (1), 1-11 (2015).
  34. World Medical Association. World Medical Association Declaration of Helsinki: ethical principles for medical research involving human subjects. JAMA. 310, (20), 2191-2194 (2013).
  35. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, (7), 671-675 (2012).
  36. Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry A. 58, (2), 167-176 (2004).
  37. Rezakhaniha, R., et al. Experimental investigation of collagen waviness and orientation in the arterial adventitia using confocal laser scanning microscopy. Biomech Model Mechan. 11, (3-4), 461-473 (2012).
  38. Green, E. M., Mansfield, J. C., Bell, J. S., Winlove, C. P. The structure and micromechanics of elastic tissue. Interface Focus. 4, (2), 20130058 (2014).
  39. Bell, J. S., et al. Microstructure and mechanics of human resistance arteries. Am J Physiol-Heart C. 311, (6), H1560-H1568 (2016).
  40. Shen, Z., Lu, Z., Chhatbar, P. Y., O'Herron, P., Kara, P. An artery-specific fluorescent dye for studying neurovascular coupling. Nat Methods. 9, (3), 273-276 (2012).
  41. Megens, R. T., et al. Imaging collagen in intact viable healthy and atherosclerotic arteries using fluorescently labeled CNA35 and two-photon laser scanning microscopy. Mol Imaging. 6, (4), 247-260 (2007).
  42. Staiculescu, M. C., et al. Prolonged vasoconstriction of resistance arteries involves vascular smooth muscle actin polymerization leading to inward remodelling. Cardiovasc Res. 98, (3), 428-436 (2013).
  43. Fung, Y. C., Sobin, S. S. The retained elasticity of elastin under fixation agents. J Biomech Eng. 103, (2), 121-122 (1981).
  44. Fung, Y. C. Biomechanics : mechanical properties of living tissues. 2nd, Springer-Verlag. (1993).
  45. Bakker, E. N., et al. Heterogeneity in arterial remodeling among sublines of spontaneously hypertensive rats. PLoS One. 9, (9), e1107998 (2014).
  46. VanBavel, E., Siersma, P., Spaan, J. A. Elasticity of passive blood vessels: a new concept. Am J Physiol-Heart C. 285, (5), H1986-H2000 (2003).
  47. Chen, H., et al. Microstructural constitutive model of active coronary media. Biomaterials. 34, (31), 7575-7583 (2013).
  48. Saez, P., Garcia, A., Pena, E., Gasser, T. C., Martinez, M. A. Microstructural quantification of collagen fiber orientations and its integration in constitutive modeling of the porcine carotid artery. Acta Biomater. 33, 183-193 (2016).
  49. Bellini, C., Ferruzzi, J., Roccabianca, S., Di Martino, E. S., Humphrey, J. D. A microstructurally motivated model of arterial wall mechanics with mechanobiological implications. Ann Biomed Eng. 42, (3), 488-502 (2014).
  50. Schriefl, A. J., Wolinski, H., Regitnig, P., Kohlwein, S. D., Holzapfel, G. A. An automated approach for three-dimensional quantification of fibrillar structures in optically cleared soft biological tissues. J R Soc Interface. 10, (80), 20120760 (2013).
  51. Weisbecker, H., Unterberger, M. J., Holzapfel, G. A. Constitutive modelling of arteries considering fibre recruitment and three-dimensional fibre distribution. J R Soc Interface. 12, (105), 20150111 (2015).
  52. Chen, H., Kassab, G. S. Microstructure-based biomechanics of coronary arteries in health and disease. J Biomech. 49, (12), 2548-2559 (2016).
  53. Chen, H., Kassab, G. S. Microstructure-based constitutive model of coronary artery with active smooth muscle contraction. Sci Rep. 7, (1), 9339 (2017).
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bloksgaard, M., Thorsted, B., Brewer, J. R., De Mey, J. G. R. Assessing Collagen and Elastin Pressure-dependent Microarchitectures in Live, Human Resistance Arteries by Label-free Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (134), e57451, doi:10.3791/57451 (2018).More

Bloksgaard, M., Thorsted, B., Brewer, J. R., De Mey, J. G. R. Assessing Collagen and Elastin Pressure-dependent Microarchitectures in Live, Human Resistance Arteries by Label-free Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (134), e57451, doi:10.3791/57451 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter