Summary
Wir beschreiben, gleichzeitige mechanische Prüfung und 3D-Bildgebung der Arterienwand vereinzelter, Leben, menschlichen Widerstand Arterien und Fidschi und Ilastik Bild-Analysen für die Quantifizierung von Elastin und Kollagen räumliche Organisation und Volumen Dichte. Wir diskutieren die Verwendung dieser Daten in mathematische Modelle der Arterienwand Mechanik.
Abstract
Die pathogene Beitrag der Widerstand Arterie Umgestaltung ist essentieller Hypertonie, Diabetes und das metabolische Syndrom urkundlich erwähnt. Untersuchungen und die Entwicklung des microstructurally motiviert mathematische Modelle für das Verständnis der mechanischen Eigenschaften des menschlichen Widerstand Arterien in Gesundheit und Krankheit haben das Potential zum besseren Verständnis wie Krankheit und medizinische Behandlungen Auswirkungen auf die menschliche Mikrozirkulation. Um diese mathematische Modelle zu entwickeln, ist es wichtig, die Beziehung zwischen den mechanischen und Microarchitektonische Eigenschaften der mikrovaskuläre Wand zu entschlüsseln. In dieser Arbeit beschreiben wir eine ex-Vivo -Methode für die passive mechanische Prüfung und gleichzeitige markierungsfreie dreidimensionale Bildgebung der Mikroarchitektur von Elastin und Kollagen in der Arterienwand des isolierten menschlichen Widerstand Arterien. Das Image-Protokoll kann auf Widerstand Arterien aller Arten von Interesse angewendet werden. Bild-Analysen werden für die Quantifizierung i) Druck-induzierte Veränderungen der internen elastischen Lamina Verzweigung Winkel und adventitial Kollagen Geradheit mit Fidschi und (Ii) Kollagen und Elastin Volumen Dichte bestimmt, mit Ilastik-Software beschrieben. Vorzugsweise alle mechanischen und imaging sind Messungen auf live, PERFUNDIERTEN Arterien, jedoch ist ein alternativer Ansatz mit standard Video-Mikroskopie Druck Myographie in Kombination mit Post-Fixierung Bildgebung der erneut unter Druck stehenden Behälter diskutiert. Diese alternative Methode bietet dem Anwender mit verschiedenen Optionen für Analyse-Ansätze. Die Einbeziehung der mechanischen und bildgebenden Daten in mathematische Modelle der Arterienwand Mechanik wird diskutiert, und zukünftige Entwicklung und Ergänzungen des Protokolls werden vorgeschlagen.
Introduction
Die pathogenen Beitrag und Auswirkungen der Widerstand Arterie Umgestaltung sind essentieller Hypertonie, Diabetes und das metabolische Syndrom1,2,3,4,5dokumentiert. Entschlüsselung der Beziehung zwischen den mechanischen und Microarchitektonische Eigenschaften der mikrovaskuläre Wand ist unerlässlich für die Entwicklung mathematischer Modelle dieses Vereins. Solche Modelle verbessert den Umbau Prozess zu verstehen und unterstützen die Entwicklung der in Silico Modellen pharmakologische Strategien zielen Krankheit im Zusammenhang mit Umbau der Arterienwand zu Testzwecken nützlich.
Vorherige Studien konzentrierten sich im Verständnis der Mikroarchitektur der Arterienwand bezieht sich auf die Arterienwand Mechanik durch den Einbau von mechanischen Maßnahmen und der Mikroarchitektur der extrazellulären Matrix (ECM) werden fast ausschließlich auf große durchgeführt , elastische Conduit Arterien von Mäusen oder Schwein6,7,8,9,10,11. Bildgebung von Mikrostrukturen der Wand erfolgt in der Regel mit nichtlinearen optischen Techniken, unter Ausnutzung der Autofluoreszenz von Elastin und harmonische der zweiten Generation von Kollagen. Dadurch räumlich-zeitliche Darstellung der zwei wichtigsten Komponenten der extrazellulären Matrix, Elastin und Kollagen, ohne Notwendigkeit einer Färbung. Bildgebung der Arterienwand in voller Stärke ist eine Herausforderung in großen Conduit Arterien durch Streuung des Lichts in den dicken Tunika-Medien. Aber, um festzustellen, wie der Mikroarchitektur der Strukturbestandteile der Arterienwand beziehen sich auf die beobachteten mechanischen Eigenschaften, dreidimensionale Informationen während der mechanischen Prüfung einzuholen. Für die großen Arterien wie die menschliche Aorta erfordert dies biaxialen Montage, mechanische Tests und imaging-Regionen von Interesse in 1-2 cm2 Stück der Arterienwand7,9,10, 12. nur einen Teil der Wand abgebildet und mechanisch getestet werden kann.
Für kleinere Arterien aller Arten (z. B. menschlichen Herzbeutel13, pulmonale14 und subkutane15 Arterien, Ratten mesenterialen Arterien16,17,18, 19 , 20, Maus Cremaster, mesenterialen, zerebrale, femorale und Halsschlagadern21,22,23,24,25,26, 27) Bildgebung der gesamte Wanddicke ist möglich und kombinierbar mit mechanischen Tests. Dies ermöglicht die gleichzeitige Aufnahme von der mechanischen Eigenschaften und die strukturellen Vorkehrungen innerhalb der Wand. Jedoch wurde eine direkte mathematische Modellierung des Verhältnisses zwischen der beobachteten Veränderungen in der dreidimensionalen Struktur des ECM und geänderten mechanischen Eigenschaften der Arterienwand Widerstand nach bestem Wissen und gewissen nur berichtet auf vor kurzem in menschlichen Widerstand Arterien13,15.
In dieser Arbeit wird eine ex-Vivo -Methode für die passive mechanische Prüfung und gleichzeitige dreidimensionale Bildgebung der Mikroarchitektur von Elastin und Kollagen in der Arterienwand des isolierten menschlichen Widerstand Arterien beschrieben. Das Image-Protokoll kann auf Widerstand Arterien aller Arten von Interesse angewendet werden. Bild-Analysen sind für den Erhalt der Maßnahmen der internen elastischen Lamina Verzweigung Winkel und adventitial Kollagen Geradheit13 mit Fidschi28beschrieben. Kollagen und Elastin Volumen Dichte werden mit Ilastik Software29 bestimmt und schließlich die Aufnahme der mechanischen und bildgebenden Daten in mathematische Modelle der Arterienwand Mechanik wird diskutiert.
Das Ziel der Bildgebung und Bild Analysen Techniken in Kombination mit der mathematischen Modellierung soll Prüfern eine systematische Vorgehensweise zu beschreiben und zu verstehen, zu beschreiben beobachtet Druckänderungen induziert in den ECM Widerstand Arterien. Die beschriebene Methode konzentriert sich bei der Quantifizierung der Änderungen in das ECM in einem Gefäß während der Druckbeaufschlagung, durch den Vergleich der Struktur des ECM bei 20 / 40 / 100 MmHg. Diese Belastungen wurden ausgewählt, für die Bestimmung der Struktur der Arterienwand nachgiebiger (20 MmHg), steif (100 MmHg) und Zwischenzustand (40 MmHg), beziehungsweise. Jedoch kann jeder Prozess in der Gefäßwand der live Arterien, einschließlich Änderungen induziert durch vasoaktive Komponenten, Hysterese und Flow, abhängig von der Forschung-Hypothese in Frage durch den Prüfarzt quantifiziert werden.
Die Verwendung von zwei-Photon Erregung Fluoreszenz-Mikroskopie (TPEM) in Kombination mit einer Druck-Myograph für Studium Druck (oder andere) induziert Veränderungen in der ECM live Arterien wird betont. Erstens, weil das simultane Erfassung der insgesamt dreidimensionale Struktur der Arterienwand (Durchmesser und Wandstärke) sowie dreidimensionale markierungsfreie Erwerb von hoher Qualität ermöglicht, detaillierte Bilder von Kollagen und elastin Mikroarchitekturen wie beschrieben13 unter Ausnutzung die Autofluoreszenz Elastin und Kollagen zweite harmonische Erzeugung Signal (SHG)30. Zweitens ermöglicht TPEM Verwendung von Niedrigenergie-Nah-Infrarot-Anregungslicht, lichtbedingten der Gewebe und somit wiederholte Bildgebung an genau der gleichen Position innerhalb der Gefäßwand zu minimieren darf ermöglichen wiederholte Messungen Analysen beobachtet, Änderungen.
Die Verwendung eines alternativen Ansatzes mit konfokale Bildgebung des Drucks behoben Arterien wird besprochen, damit Benutzer ohne Zugriff auf TPEM Gelegenheit, sowie das beschriebene Verfahren verwenden können. Informationen zu Struktur und Volumen Dichte ECM kann auch aus zweidimensionalen Analysen der Gewebe geschnitten in Serie, z. B. wie beschrieben von31,32abgerufen werden. Aufgrund der fehlenden Möglichkeit zum Abrufen von dreidimensionalen Strukturinformationen über die Längenskalen der Arterie sowie bei wechselnden Bedingungen mit dieser Methode, ist es jedoch nicht empfehlen die Verwendung dieses Ansatzes für Untersuchungen von Druck und Behandlung induziert dreidimensionale Änderungen in das ECM.
Die Mindestanforderung für die Ermittler, die hierin beschriebene Methode anzuwenden ist der Zugriff auf ein Setup für Kanülierung und Druckbeaufschlagung der Arterien in Kombination mit einem konfokalen oder zwei-Photon Erregung-Fluoreszenz-Mikroskop. Die Einrichtung in das folgende Protokoll beschrieben ist ein Custom-Built Druck Myograph mit einer längs Kraftaufnehmer, gebaut, um auf eine benutzerdefinierte gebaute umgekehrten zwei-Photon Erregung Fluoreszenzmikroskop passen.
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Protocol
Sammlung von Biopsien der menschlichen parietalen Herzbeutel für den Einsatz in dieser Arbeit wurde als zuvor beschriebenen33nach schriftlicher Einwilligung durchgeführt. Die Studie der menschlichen Geweben entsprechen die Grundsätze, die in der Deklaration von Helsinki34 und wurde von der regionalen Ausschüssen auf Gesundheit Forschungsethik für Süd-Dänemark (S-20100044 und S-20140202) und der dänischen Datenschutzbehörde genehmigt.
1. sammeln Sie Gewebe und isolieren (Human) Widerstand Arterie
- Gewebeproben von Interesse unmittelbar nach der Exzision während einer Operation zu sammeln. Übertragung des Gewebes auf 4 ° C HEPES gepufferten physiologischen Salzlösung (HBS) sofort bei Abholung und speichern es in HBS.
Hinweis: Menschliche Gewebe werden nur dann erhoben nach Genehmigung durch institutionelle und ethischen Gremien sowie schriftliche Einwilligungserklärung Patienten. HBS-Komposition in mM: NaCl 144, KCl 4.7, CaCl2 2.5, MgSO4 1.2, KH2PO4 1.2, HEPES 14,9 Glukose 5.5. Stellen Sie den pH-Wert 7,4 mit NaOH und Filtern Sie die Lösung aber 0,2 µm-Filter. - Lassen Sie die gesammelten Gewebe in sterilen HBS bei 4 ° C über Nacht zum Auswaschen von Anästhetika.
Hinweis: Eine Beeinträchtigung der Lagerung über Nacht Schiff Integrität und Funktionalität sollte vom einzelnen Research Laboratory überprüft werden. - Widerstand, die großen Arterien (± 200 µm Lumen Durchmesser) mit einer scharfen Spitze Zange und Schere Mikro-Dissektion sorgfältig zu isolieren.
- Speichern Sie die Arterien bei 4 ° C im eiskalten HBS beim grundieren der Bildgebung/Druckkammer.
2. Montieren Sie die isolierte Arterie in der Druck-Myograph
- Montieren Sie die Glas-Kanülen mit einem Tipp Durchmesser von ~ 80 µm auf Kanülen-Halter. Positionieren Sie die Spitzen ca. 150 µm oberhalb der Kammer Glasboden.
Hinweis: 45° gebogene Spitze Kanülen können präzise Positionierung des Schiffes über den Glasboden. - Einlass und Auslass-Schlauch mit HBS mit 1 % BSA zu füllen und mit dem Drucksystem verbinden.
Hinweis: BSA ist inbegriffen, endothelial Zelle Funktion zu bewahren. - Montieren Sie die isolierte Arterie mit zwei doppelten Knoten Fäden pro Kanüle.
Hinweis: Knoten können im Voraus vorbereitet und gespeichert auf doppelte Klebeband bis benötigt. - Füllen Sie die Kammer mit HBS und legen Sie zwei doppelknoten auf jedes Glas Kanüle.
Hinweis: Bei der Verwendung von Arterien anzeigen myogen Ton sollte HBS mit Kalzium ersetzt werden, die kostenlose HBS mit 3 µM EGTA und 3 µM Natrium Nitroprusside ergänzt. - Halten Sie die Arterie sanft an einem Ende mit zwei Paar scharfe Spitze Pinzetten. Öffnen Sie das Lumen der Arterie und schieben Sie ihn sanft auf die Kanüle. Befestigen Sie an der Kanüle mit zwei Knoten.
- Ein Druck von 5 MmHg, sanft spülen das Lumen mit HBS / 1 % BSA.
- Cannulate das andere Ende der Arterie und an der Kanüle mit zwei doppelten Knoten sichern.
- Die Myograph auf den Mikroskoptisch übertragen und unter Druck die Arterie um 5 MmHg (Eingangsdruck Ausgangsdruck =), dann auf 37 ° C für 30 min erhitzen.
- Optional: Kalibrieren Sie längs Kraftaufnehmers gemäß den Anweisungen des Herstellers (1 g = 9,81 mN).
Hinweis: Unbedingt Kalibrieren der Kraftaufnehmer nach Heizung, da es temperaturempfindlich ist.
3. führen Sie Experiment: Darstellung der arteriellen Durchmesser, Wandstärke und Kollagen und Elastin Mikroarchitektur mit TPEM
- Schnell Scannen der kanülierte Arterie unter Druck, um 5 MmHg mit einem 20 X Objektiv (numerische Apertur (NA) ≥ 0,8) und low-Power-Anregungslicht Schiffs Durchmesser und Wandstärke um 5 MmHg zu beurteilen.
Hinweis: Verwenden Sie ein Wasser-Immersion-Ziel für invertierte Mikroskope; Verwenden Sie für aufrechte Mikroskope eine Wasser eintauchen Ziel. Haben das Ziel keinen Korrektur Kragen, Deckglas Dicke zu korrigieren, stellen Sie sicher, entsprechend der verwendeten Deckglas mit dem Ziel verwendet. Die Software-Einstellungen und Beschreibungen variieren je nach Benutzer-Interphase und Mikroskop und Software verwendet.- Richten Sie den Strahlengang.
- Aktivieren Sie Mai Tai-zwei-Photonen-Laser zu und setzen Sie ihn auf 820 nm Anregungslicht.
Achtung: Vermeiden Sie jede sichtbare als auch unsichtbare Laserlicht. - Emission in zwei Kanäle gleichzeitig zu sammeln. Teilen Emission Licht zwischen den Photomultipliern mit 460 nm langen Pass dichroitischen Spiegel und sammeln Emission mit 30-60 nm breit Bandpass Filter zentriert bei 520 nm (Elastin) und 410 nm (Kollagen), beziehungsweise.
- Aktivieren Sie Mai Tai-zwei-Photonen-Laser zu und setzen Sie ihn auf 820 nm Anregungslicht.
- Kontinuierliche Abtastung mit 10 µs Laser wohnen Zeit/Pixel und 512 × 512 Pixel für 100 % Sichtfeld zu ermöglichen.
- Manuell scannen Sie durch die Arterie, die Tiefe bestimmen wo maximale Durchmesser beobachtet wird.
- Wählen Sie ein rechteckiges Stück für breiteste Durchmesser der Arterie und Scannen Sie ein Einzelbild mit Pixel Größe ≤ 300 nm/Pixel (Abbildung 2). Verwenden Sie als niedrige Erregung Lichtleistung und Pixel Verweilzeit möglichst Photodamaging live Arterie zu vermeiden.
Hinweis: Es wird empfohlen, eine rechteckige, z.B.einzuholen., 100 × 1024 Pixel großes Bild, anstatt quadratische Bild an dieser Stelle Zeit zu sparen und die Gewebe-Photon-Exposition (Abbildung 2) begrenzen. - Speichern Sie das Bild für spätere Analysen.
- Richten Sie den Strahlengang.
- Lumen Durchmesser und Wandstärke an der maximale Durchmesser der Arterie zu bestimmen.
- Laden Sie das Bild in Fidschi.
- Legen Sie den Maßstab durch Klicken auf Main Menü | Analysieren | Maßstab festlegen und geben Sie µm/Pixel und Pixel-Verhältnis (es wird dringend empfohlen, das Pixelverhältnis 1:1 zu halten).
- Die Fidschi- Linien -Werkzeug und ziehen Sie eine Linie zwischen zwei internen elastischen Schichten auf jeder Seite des arteriellen Lumens, klicken Sie und STRG + M. Fidschi-Berichte-Länge als Standard in der Ergebnistabelle.
- Ebenso zeichnen Sie mehrere Zeilen zur Messung der Dicke der Wände zu, und klicken Sie auf STRG + M um das folgende Markup zu messen.
- Speichern Sie die Messungen.
- Bild Kollagen und Elastin Mikroarchitektur um 5 MmHg durch die gesamte Dicke der Arterienwand, Erlangung 3D-Bild Stapel mit guter Qualität für 1-3-Regionen entlang der Länge der Arterie zu scannen.
- Bild-Stapel durch die gesamte Wand der Arterie mit einer 60 X Ziel, NA ≥ 1, optimierte Pixelgrößen und Z-Abstand zu erhalten.
- Berechnen Sie die optimale Bildgebung Bedingungen (Pixelgrößen und Z-Schritt Abstand) im Einklang mit den optischen Weg, Medium eintauchen und probieren Sie Refraktive Indizes mit dem wissenschaftlichen Volume Imaging Nyquist-Rechner (https://svi.nl/NyquistCalculator).
Hinweis: Bitte achten Sie hierbei auf die Differenz zwischen optimale Pixelgröße und Z-Abstand gegenüber dem Rat in Abschnitt 3.4. oben auf die Verwendung von eine Maximale Pixelgröße.
- Berechnen Sie die optimale Bildgebung Bedingungen (Pixelgrößen und Z-Schritt Abstand) im Einklang mit den optischen Weg, Medium eintauchen und probieren Sie Refraktive Indizes mit dem wissenschaftlichen Volume Imaging Nyquist-Rechner (https://svi.nl/NyquistCalculator).
- Verwenden Sie die gleichen Anregung und Emission Einstellungen wie oben (3.1.1.).
- Schnell Scannen der Gefäßwand, wie oben beschrieben auf um die Dicke des Z-Stack zu bestimmen.
- Z-Stapel-Start und Ende Tiefe, Z-Schritt Abstand und Pixeldichte (gerechnet in 3.3.1.1.) definieren und die Z-Scan durchführen. Speichern Sie jeder Kanal separat.
Hinweis: Bilder sollte klein genug, z.B. 30 x 30 µm oder 50 × 50 µm je nach Schiffsgröße, jeglichen Einfluss der Krümmung in den nachfolgenden Bild-Analysen zu vermeiden.
- Bild-Stapel durch die gesamte Wand der Arterie mit einer 60 X Ziel, NA ≥ 1, optimierte Pixelgrößen und Z-Abstand zu erhalten.
- Arterielle Durchmesser, Wandstärke und Elastin und Kollagen Mikroarchitektur bei verbleibenden drücken des Protokolls zu bestimmen.
- Wiederholen Sie 3.1-3.2 auf Druck 10 und 20 MmHg zu, wiederholen Sie 3,3 bei Druck 20 MmHg.
- Wiederholen Sie 3.1 und 3.2 auf 40 MmHg Druck.
- Wiederholen Sie 3.1-3.2 auf Druck 60, 80 und 100 MmHg zu und wiederholen Sie 3,3 bei 100 MmHg.
Hinweis: 3.1-3.3 kann für alle Drücke und Kombinationen von Druck (z.B. einer Serie/Kombination von zunehmenden sowie abnehmende Druck), je nachdem die Hypothese getestet werden wiederholt werden. Eosin Konzentration 0,3 - 1 µM zugesetzt werden, um Elastin Autofluoreszenz bei Immunofluoreszenz zu verbessern. Immunofluoreszenz kann durch die Anwendung als low-Power Anregungslicht möglichst vermieden werden. - Ersetzen Sie den Puffer in der Myograph Kammer mit frischen 37 ° C HBS nach jedem Druck. Lassen Sie die Arterie für 5 min vor Bildgebung nach jeder Änderung im Druck anzupassen.
- Kanalstapel getrennt für Bild-Analysen zu speichern.
- Lebensfähigkeit der Arterie zu testen.
- Anwenden von 10 µM U46619 in der Myograph Kammer gefolgt durch die Zugabe von 10 µM Bradykinin, wenn eine stabile Verengung beobachtet wird.
- Zeichnen Sie Durchmesser und Wandstärke auf, wie oben beschrieben in Abschnitt 3.1 nach der Anwendung der einzelnen Verbindungen.
- Fügen Sie 3 µM Natrium Nitroprusside, wenn die Arterie nicht vollständig geöffnet ist nach Zugabe von Bradykinin und Datensatz Durchmesser und Wandstärke.
Hinweis: Abhängig von den pharmakologischen Eigenschaften der Arterie von Interesse (vaskuläre Bett und Arten) können andere Vasokonstriktor und Vasodilatator (Endothel-abhängige) Verbindungen verwendet werden.
- Optional: Beheben Sie die unter Druck stehende Arterie zu oder fahren Sie mit Bildgebung von Kollagen und Elastin für Volumen dichten (Schritt 7).
- Fügen Sie 4 % Formaldehyd in 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) bei 37 ° C für 1 h.
- Waschen Sie die feste Arterie dreimal in 1 X PBS und schieben Sie die Arterie aus der Kanülen, berühren nur die Teile der Arterie außerhalb der Knoten. Nicht entfernen Sie die Knoten zu, verwenden sie für die Abhaltung der Arterie bei der Übertragung auf einen Speicher-Schlauch.
- Laden in 1 x PBS / 0,05 % Natriumazid bei 4 ° C bis Imaging für Elastin und Kollagen Volumen Dichte oder für andere Zwecke.
Hinweis: Feste Arterien können gespeichert werden, für mindestens 3 Monate 1 x PBS / 0,05 % Natriumazid bei 4 ° C.
4. Berechnung der Stress-Strain-Beziehungen und innere Wand Steifigkeit
- Bitte befolgen Sie die Formeln und Berechnungsschritte für die Berechnung der Spannungen, Belastungen und Wand Steifigkeit wie von Bloksgaard, M. Et Al. beschrieben 13 und Verweise hierin.
(5) Bildanalyse - (interne elastischen Lamina) IEL Verzweigung Winkel
- Bild öffnen-Stack in Fidschi. Gehen Sie zu Datei | Bild öffnen , Bildstapel zu wählen.
Hinweis: Max Intensität Projektionen von 2 bis 7 aufeinander folgenden Z-Abschnitte, die die IEL (1-2 µm Dicke) dienen zur Bestimmung der IEL Elastin Faser Verzweigung Winkel mit dem Winkel-Tool in Fidschi28,35. Entnehmen Sie Abbildung 4A Abbildung. - Gehen Sie zu Bild | Stapel | Z Projekt... , die Bilder und "Max Intensität Projektion" wählen.
- Speichern Sie die maximale Intensität Projektion als TIFF.
- Wählen Sie so viele IEL Faser Verzweigungspunkten möglichst mit dem "Winkel-Tool", und gehen Sie systematisch durch die Bilder. Klicken Sie auf STRG + M um jeden Winkel zu messen.
- Speichern Sie die Fidschi-Ergebnisse-Blatt.
(6) Bildanalyse - Adventitial Kollagen welligkeit
- Bild öffnen-Stack in Fidschi. Gehen Sie zu Datei | öffnen Bild Bildstapel zu wählen.
Hinweis: Max. Intensität Projektionen von 2 bis 7 aufeinander folgenden Z-Profile mit Kollagen direkt vor der externen elastischen Lamina (Aal, 1-4 µm Dicke) werden zur Ermittlung der Kollagen welligkeit mit Fidschi NeuronJ Plugin36 wie beschrieben durch Rezakhaniha, R verwendet . Et Al. 37 (Abbildung 4 b). - Legen Sie den Maßstab. Gehen Sie zu analysieren | Maßstab Pixelmaße eingeben.
- Gehen Sie zu Bild | Stapel | Z Projekt... , Bilder, mit zu arbeiten und "Max Intensität Projektion" zu wählen.
- Bildtyp, 8 Bitt TIFF ändern, indem Bild | Typ | 8 Bitt und die maximale Intensität Projektion als TIFF speichern.
- Kollagen Fasern Geradheit mit dem Fidschi Neuron J Plugin zu messen.
- Öffnen Sie das NeuronJ-Plugin, indem Fidschi | Plugins | Neuron J.
- Öffnen Sie die 8-Bit-TIFF in NeuronJ, indem Load Image | Wählen Sie die Datei.
- Klicken Sie auf Kurven hinzufügen, und wählen Sie Fasern, indem Sie auf Start und Ende jeder Faser zu analysieren.
- Klicken Sie auf Maß Umzeichnungen, wählen Sie die Ablaufverfolgung angezeigt (Lf) und Scheitelpunkt Messungen im Dialogfeld.
- L0/Lf berechnen in excel (oder ähnlich) und die Ergebnisse speichern.
- Kopieren und Einfügen von Fidschi Neuron J Kurven und Eckpunkte Ausgabe in excel (oder ähnlich) und berechnen L0 mit Pythagoras Pythagoras aus den Scheitelpunkt Messungen. Ersten und letzten Punkt auf Linie zeigen die Positionen der Enden der Hypotenuse in einem 2D Koordinatensystem.
Hinweis: Ein L0/Lf [Kollagen Faserlänge Bundle zu einem Ende durch eine gerade Linie (L0) / volle Länge (Lf)] nahe 1 zeigt eine fast gerade kollagene Faser.
- Kopieren und Einfügen von Fidschi Neuron J Kurven und Eckpunkte Ausgabe in excel (oder ähnlich) und berechnen L0 mit Pythagoras Pythagoras aus den Scheitelpunkt Messungen. Ersten und letzten Punkt auf Linie zeigen die Positionen der Enden der Hypotenuse in einem 2D Koordinatensystem.
(7) Imaging für Kollagen und Elastin Volumen Dichte
- Waschen die (feste) Arterie 1 X mit PBS-Puffer und für 15 min in 1 µM Eosin in 1 X PBS im Dunkeln Flecken. Führen Sie für feste Arterien diesen Schritt bei Raumtemperatur.
Hinweis: Eosin verbessert die Elastin-Fluoreszenz. Eosin färbt andere Strukturen wie Kollagen und das Zytoplasma der Zelle, wird die Probe in der Färbelösung für längere Zeit gelassen. Wenn die Färbung anderer Strukturen zu intensiv ist, senken Sie die Konzentration von Eosin 0,3 µM oder wiederholen Sie waschen. - Waschen Sie die Arterie 3 X in 1 X PBS
- Für feste Arterien: Montieren Sie die Arterie für die Bildgebung.
Achtung: Abbildung des drucklosen Behälter erlaubt keine Abruf von geometrischen quantitative Informationen. Bei der absolute Mengen benötigt werden, sollten diese immer auf live, unter Druck stehenden Arterien gewonnen werden. Volumen-Verhältnis erhalten Sie mit dieser Methode auf den drucklosen Arterien.- Legen Sie zwei Stücke der doppelte Klebeband Klebeband 1-1,5 cm Abstand auf ein Objekt-Glas. Doppelte Klebeband ist etwa 100 µm dick. Wenden Sie eine oder mehrere Schichten des Bandes entsprechend den Durchmesser der Arterie montiert werden.
- 10-20 µL PBS auf dem Glas in der Mitte des Platzes und die Arterie in der PBS-Drop.
Hinweis: Der Tropfen sollte möglichst klein und flach wie möglich zu vermeiden, schieben die Arterie aus der Position, bei der Montage des Deckglas. - Das Deckglas und drücken Sie auf doppelte Klebeband.
- Füllen Sie das Reservoir zwischen Deckglas und Objekt Glas mit 1 X PBS. Füllen Sie ihn stündlich um Trocknung der Probe zu vermeiden.
- Für feste Arterien: Montieren Sie die Arterie für die Bildgebung.
- Erhalten Bild-Stacks für Kollagen und Elastin Volumen Dichte mit einem 20 X Objektiv mit NA > 1, so viel der Arterienwand wie möglich abzudecken, während immer noch eine gute optische Auflösung (Abbildung 2D, 2 G und 2 H).
Hinweis: Verwenden Sie ein Wasser-Immersion-Ziel für die Darstellung von festen Arterien unter einem deckgläschen und verwenden Sie eine Wasser eintauchen Ziel für die Darstellung von Lebensadern. Haben das Ziel keinen Korrektur Kragen, Deckglas Dicke zu korrigieren, stellen Sie sicher, entsprechend dem Deckglas zum Ziel. Verwenden Sie vorzugsweise optimale Pixelgrößen und Z-Abstand. Berechnen Sie diese mit dem Nyquist-Rechner (Schritt 3.3.1.1.). Alternativ können Sie eine minimale Pixelgröße von 300 nm und Z-Abstand von 1 µm. Es wird empfohlen, drei Bilder entlang der Länge der Arterie, die dem Benutzer erlauben, Intra-Assay-Variabilität ermitteln zu erhalten. - Bild Elastin mit 820 nm Anregungslicht und sammeln Emission mit einem 30-60 nm breit Bandpass filter zentriert bei 520 nm.
- Bild-Collagen mit 990 nm Anregungslicht zu vermeiden jede Anregung von Elastin und anderen Autofluorescent Proteinen und sammeln Emission mit 10-30 nm breit Bandpass filter zentriert bei 495 nm.
- Speichern Sie Bild Stapel aus jeder Kanal separat als TIFF-Dateien
(8) Bildanalyse für die Gewinnung von Elastin und Kollagen Volumen dichten mit Ilastik
- TIFF-Bild Stacks, um HDF5 mit Fidschi28,35 durch Klicken auswählen Datei konvertieren | Speichern als... Hdf5.
- Erstellen Sie zwei Daten Dateiordner auf Festplatte des Computers, für Elastin, Kollagen Bild Stapel, beziehungsweise. Entsprechenden Bildes Stapel in den entsprechenden Ordner zu kopieren.
- Erstellen Sie zwei neue Ilastik-Projekte in der Ilastik-Software, eines für Kollagen, Elastin bzw..
- Öffnen Sie Ilastik | Neues Projekt anlegen | Pixel-Klassifizierung | Neues Projekt | Hinzufügen von Daten und wählen Sie das Bildordner in Schritt 8.2 erstellt.
Hinweis: Folgen Sie dem Ilastik-Assistenten.
- Öffnen Sie Ilastik | Neues Projekt anlegen | Pixel-Klassifizierung | Neues Projekt | Hinzufügen von Daten und wählen Sie das Bildordner in Schritt 8.2 erstellt.
- Importieren Sie ein 3D-Bild Stapel, um die Software zu trainieren.
- Wählen Sie das Applet Eingangsdaten | Hauptarbeitsbereich Bereich | Registerkarte "Raw Data" | Neues hinzufügen... | Fügen Sie eigene Bilder und wählen Sie die gewünschten Bilddaten
- Wählen Sie relevanten Funktionen in die Software.
- Offene Feature Selection Applet | Wählen Sie die Funktion die öffnet einen neuen Dialog. Details siehe Abbildung 5A .
- Fügen Sie mindestens zwei Bezeichnungen, die mit dem Label hinzufügen -Button unter Training-Applet.
Hinweis: Jedes Etikett eines Objekttyps entspricht, die getrennt werden soll. In dieser Arbeit drei Labels dienen für Elastin: Elastin selbst, helle Flecken (auszuschließende) und Hintergrund (auszuschließende). - Etiketten auf dem raw-Bild-Stapel mit dem Pinsel gestylt Annotation Tool zu zeichnen.
- Wählen Sie die entsprechende Bezeichnung: Pinsel -Werkzeug und Start Zeichnung klicken.
- Ilastik zu den Bildstapel zu analysieren und suchen Sie nach ähnlichen Eigenschaften durch Anklicken Aktivieren Live Updateaufgefordert.
- Überprüfen Sie sorgfältig die Vorhersage-Karte (Abbildung 5).
Hinweis: Der Prozess von raw-Bild in eine komplette Vorhersage-Karte ist in Abbildung 5dargestellt. Ilastik nutzt die Vorhersage Karte, um das Bild zu segmentieren Stapeln, je nachdem welches Label ist ein Pixel eher verbunden (Abbildung 5). - Kommt ein Mindestwert zur Anwendung.
- Wählen Sie Schnittstellenüberwachung Applet, wählen Sie eine geeignete Methode, Eingang Label, glatt, Schwelle und Filterparameter Größe, und klicken Sie abschließend auf anwenden.
Hinweis: Dies trennt die entsprechend gekennzeichneten Teile des Bildes in einzelne Objekte. Hochgradig vernetzten Gewebe, wie Elastin und Kollagen muss nicht getrennt werden, daher wird eine Schwelle von 0,4 angewendet (der Standardwert ist 0.5). Abbildung 5E und 5F illustrieren das Ergebnis der Anwendung einer Schwellenwerts.
- Wählen Sie Schnittstellenüberwachung Applet, wählen Sie eine geeignete Methode, Eingang Label, glatt, Schwelle und Filterparameter Größe, und klicken Sie abschließend auf anwenden.
- Die Ausbildung von Ilastik zu wiederholen, bis das Ergebnis zufriedenstellend ist (nur Elastin, bzw. Kollagen ist anerkannt für die jeweiligen Analysen).
- Häufig wechseln Sie zwischen der Ausbildung und Segmentierung (und manchmal auch die Schwellwerte) Applets während dieses Prozesses. Ein Beispiel für die Auswirkung der Umschulung Ilastik ist in Abbildung 6dargestellt.
- Charge analysieren ähnliche Bilddaten: Wählen Sie Batch Vorhersage Eingangswahl und relevanten Dateien hinzufügen.
Hinweis: Die Ilastik Ausgabe ist eine Sammlung von Pseudo - 1 Bit 3D-Bild Stacks (Bildmasken) mit 0 (null) bezeichnet das Fehlen von Elastin (oder Kollagen) und 1 (eins) bezeichnet das Vorhandensein dieses Vertrags (die tatsächliche Bittiefe ist 8-Bit). - Überprüfen Sie die Ergebnisse für jedes Bildstapel von visuell vergleichen die Bildmasken und die raw-Bilddateien.
- Optimieren Sie die Ilastik Maske (Schritte 8,4-8,9) und erneut analysieren Sie alle Bild-Stapel mit unbefriedigenden Ergebnissen.
- Berechnen von Elastin und Kollagen Volumen-Dichte von Ilastik Bildmasken mit MATLAB
- MATLABzu öffnen.
- Wählen Sie Ordner mit Ilastik Bildmasken in MATLAB "aktueller Ordner" Fenster.
- Kopieren Sie das MATLAB-Skript aus ergänzende Datei 1 in der MATLAB-Editor und speichern Sie den Code als volumeCalculator.m in der MATLAB-Ordner auf der Festplatte des Computers.
- Geben Sie in die Skript-Zeilen Pixelgrößen und Höhe in pixel
PixelSize = 0.1230000 * 0.1230000; % MIKRON * Mikron
PixelHeight = 0,9; % Mikron - Speichern Sie das Skript.
- MATLAB-Command-Fenster und geben Sie "VolumeCalculator (" Pfad-zu-Daten ")", das Skript zu laden.
- Klicken Sie auf eingeben. Jede Bild-Maske ist jetzt fasste und multipliziert mit der (bekannten) Pixel/Voxel-Volumen (Abmessungen eines Pixels multipliziert mit der z-Achse Auflösung). Die Ausgabe von MATLAB ist das Gesamtvolumen von Elastin und Kollagen in jeder Bildstapel.
- Speichern Sie die Ergebnisse.
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Representative Results
Die speziell angefertigten Druck Myograph für die Bildgebung verwendet in diesem Werk ist in Abbildung 1dargestellt. Besondere Aufmerksamkeit für die Gestaltung der Myograph war (i) der Kammer mit einer kleinen Menge (2 mL) und (Ii) die Möglichkeit zur Positionierung der Kanülen nahe und parallel mit Glasboden (Abbildung 1 b). Der Boden der Kammer passt ein 50 × 24 mm #1.5 Glas Deckglas (austauschbar). Der Druckregler entstand aus einer standard 1 L Glasflasche und ein Blutdruckmessgerät (Manschette entfernt). Für ein Myograph Setup mit Durchflussanforderungen empfiehlt sich die Verwendung von einem Servo-Druckregler.
Abbildung 2 veranschaulicht die empfohlenen Positionen für den Erhalt der Einzelbilder und Bild Stacks während des Experiments des Protokolls. Zur Veranschaulichung ist eine Übertragung Lichtmikroskopie Bild der montierten Arterie in Figur 2Aenthalten. Knoten zu Knoten dauert der montierten Arterie ca. 1,6 mm. Die Arterie wird gescannt, der breiteste Durchmesser beobachtet (Abb. 2 b), bis zu diesem Zeitpunkt sind die Durchmesser und Wandstärke ermittelt (Abbildung 2). Ebenso eine Übertragung Lichtbild der Arterie in Abb. 2D, welche die Position aufgenommen und empfohlen Breite der Bild-Stacks für die Bestimmung der Mikroarchitekturen von (Abb. 2E) Kollagen und Elastin (Abbildung 2F, kleine Platz in Abb. 2D) sowie die Bild-Stacks zur Bestimmung der (Abbildung 2) Kollagen und Elastin (Abb. 2 H) Volumen Dichte (größeren Quadrat, Abb. 2D). Mithilfe dieses Ansatzes können Daten für den Bau von Durchmesser Druckkurven, gefolgt von der Berechnung der entsprechenden Spannungs-Dehnungs-Kurven Druck, Durchmesser und Wand Dickenmessung (Abbildung 2) einzuholen.
Einem exponentiellen passen die Spannungs-Dehnungs-Beziehung nach Bloksgaard Et Al. 13 und Verweise hierin, bietet den β-Wert, eine Geometrie unabhängigen Maß Wand Steifigkeit proportional zu der inkrementellen Elastizitätsmodul Einc. Berechnung Einc an die unterschiedliche Drücke auf die Bilder für Kollagen und Elastin Mikroarchitekturen gewonnen wurden, ermöglicht eine direkte Analyse der Beziehung zwischen den induzierten Druckveränderungen in der Mikroarchitekturen von Kollagen und elastin und die inkrementelle Elastizitätsmodul bei verschiedenen drücken (Abbildung 3). Die Messung der IEL Verzweigung Winkel und Kollagen Geradheit ist in Abbildung 4dargestellt.
Wichtig für die Interpretation der mechanischen Daten Vergleich von zwei oder mehr Gruppen von Interesse, z.B. Vs normotonen Hypertonikern, ist eine Bestimmung des Gehalts von Elastin und Kollagen. Hierzu entwickelte sich eine automatische Analyse-Methode in Ilastik, ein Freeware-Bild-Analyse-Software, die trainiert werden kann, um bestimmte Merkmale Bild zu erkennen. Der Arbeitsablauf in Ilastik ist in Abbildung 5dargestellt.
Für die automatische Erkennung von Elastin und Kollagen für die Volumen-Dichte ist es wichtig, dass es ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis in den Bildern erhalten. In Humanproben wird erhebliche Autofluoreszenz aus Kollagen oft neben dem Kollagen SHG Signal beobachtet. Dadurch verringert sich das Signal-Rausch-Verhältnis für den Nachweis von Elastin. Abbildung 6 zeigt, wie Umschulung des Ilastik Programms bessere Anerkennung von dünnen Elastinfasern in einer Probe mit erheblichen Kollagen Autofluoreszenz in der "grünen" kann / Elastin-Kanal. Wenn Durchbluten die Autofluoreszenz-Signals in den Kollagen-SHG-Kanal ein Problem darstellt, kann es helfen, Erlangung der SHG-Signal mit einer längeren Wellenlänge der Erregung. Wenn der Kanal durch bluten tritt nach der Färbung mit Eosin, die Konzentration der angewandte Lösung von Eosin gesenkt werden sollte. Eosin ist leicht verwaschen damit das Signal zu wiederholtes Waschen der gefärbten Probe zu verringern kann.
Abbildung 1 . Speziell angefertigten Druck Myograph für Fluoreszenz-Bildgebung. (A) Perfusion Kammer mit Glaskapillaren befestigt, Mikromanipulatoren, welches auf einem Kraftaufnehmer (longitudinal Kraft) angebracht ist. (B) 2 mL imaging-Kammer. Die 45° Biegung der Kanülen erleichtert die Bildgebung mit einem inversen Mikroskop. (C) Druckregler. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 . Kombinierte Druck Myographie und Fluoreszenz imaging Strategie. (A) Übertragung Lichtbild der Arterie mit Abbildung (B) die Überprüfung der vollen Breite der Arterie. Das Kollagen ist SHG in grün und Elastin Autofluoreszenz in Magenta dargestellt. (C). arterielle Lumen Durchmesser (hier 238 µm) und Wandstärken (hier 17 und 18 µm oben und unten, jeweils) wird die Arterie in der Äquatorregion (größter Durchmesser beobachtet) bestimmt. (D) Übermittlung Lichtbild der Arterie mit der Darstellung der Position der Z-Stapel in einem 10-50 µm Maßstab für die Bestimmung (E) Kollagen Geradheit bezogen (F) verzweigte Winkel der internen elastischen Schichten und (G) Z-Stapel auf eine 50-100 µm erreicht Maßstab für den Erhalt der Kollagen und Elastin (H) Volumen Dichte. Bilder B/c: Höhe 300 µm (Takt 20 µm), E/f: 50 x 50 µm (Takt 10 µm), G/H 130 × 130 × 30 µm (bar = 30 µm). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 . Microstructural Änderungen der adventitial Kollagen und der internen elastischen Lamina (IEL) und ihr Verhältnis zu den umlaufenden inkrementelle elastischen Moduli bei 20 / 40 / 100 MmHg. (A) Verzweigung Winkel der Elastinfasern in der IEL. (B) Geradheit der adventitial Kollagenfasern in der Nähe der externen elastischen Lamina. p-Werte und nach F-Werte wurden ermittelt mit Hilfe von wiederholten Messungen einfache ANOVA: p/F-values A: 0.0014/24.18, B: 0.0002/37.38. (C) IEL Verzweigung Winkel korreliert Verwandlung mit Einc. (D) Kollagen Geradheit korreliert linear mit Einc. Daten werden angezeigt, wie meine ± SE Microstructural Veränderungen (A und B und x-Achsen von C und D) wurden bestimmt für 6 Widerstand Arterien vital imaging, während Einc (C und D) für 20 anderen Arterien Druck in einem Standard-Myographie berechnet wurde ausgesetzt Druck Myograph. Jede Arterie untersucht wurde von einer anderen Person. Diese Zahl wurde von Bloksgaard Et al.modifiziert. 13. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 . Darstellung der Messungen von IEL Verzweigung Winkeln und Kollagen Geradheit in Fidschi. (A) IEL Verzweigung Winkel manuell markiert und gemessen mit dem Fidschi-Winkel-Tool. (B) Kollagen Geradheit wird bestimmt mit dem Fidschi Neuron J-Plugin als das Verhältnis der End-to-End Länge einer einzelnen Kollagen Faser über eine gerade Linie (weiß) geteilt durch die tatsächliche End-to-End-Länge der Faser (Orange). Bar-Größe: 20 µm.
Abbildung 5 . Ilastik Workflow. (A) Funktion Auswahlfenster mit der Angabe der ausgewählten Features. (B) Beispiel raw-Bild mit (C) Etiketten für Elastinfasern, helle Flecken (unerwünschte) und Hintergrund in rot, grün und blau, beziehungsweise hervorgehoben. (D) die Vorhersage Karte für Bild (B) mit Etiketten in (C) angegeben. (E) Segmentierung anhand der Vorhersage-Karte (d) vor (E) und nach (F) Anwendung einen Schwellenwert von 0,5. Gelber Farbe zeigt die angeschlossenen Pixel entspricht die getrennte Funktion (Elastin). Bar-Größe: 25 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6 . Beispielbilder vor und nach der Optimierung der Ilastik Vorhersage Karte zeigt den Effekt der Umschulung Ilastik Anerkennung der Elastinfasern in einer Probe mit hoher Hintergrundfluoreszenz von Kollagen (sub-optimale Signal Rauschabstand). (A) Originalbild, (B) Ergebnis des ersten Ilastik Analyse, wo vor allem die dünne Elastinfasern (linke Seite der Abbildung B) in die Segmentierung nicht enthalten sind und (C) Endergebnis nach der Optimierung der Vorhersage Karte. Bar-Größe: 25 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Diese Arbeit stellt unser Vorschlag für eine standardisierte, kombinierte Bildgebung und Druck Myographie Ansatz, wertvoll für die gleichzeitige Prüfung der mechanischen Eigenschaften der Widerstand Arterien und der Druck im Zusammenhang mit Veränderungen in der Struktur der der arteriellen Wand über einem Druckbereich von 0 bis 100 MmHg. Das vorgestellte Konzept wurde entwickelt mit benutzerdefinierten gebauten Anlagen, jedoch Druck-Myograph, das passt auf eine zwei-Photon Erregung Fluoreszenzmikroskop eingesetzt werden, wenn die Gestaltung der beiden Geräte Bildgebung der Arterienwand ermöglicht. Besondere Aufmerksamkeit sollte auf die Form, Breite und Arbeitsabstand von das Ziel und die Bedingungen, unter denen die Bildgebung ausgeführt werden. Aufrechte Mikroskope erfordern den Einsatz von Wasser eintauchen Ziele, während die Verwendung von Wasser eintauchen Ziele für invertierte Mikroskope, unterschiedliche Brechungsindizes zwischen der Probe und das Ziel zu vermeiden empfohlen wird. Darüber hinaus sollte auf das Deckglas Dicke, durch die Anwendung einer Korrektur für ein Missverhältnis zwischen dem Ziel und dem Deckglas mit der Korrektur Kragen auf das Ziel (falls vorhanden) oder indem man das Deckglas Dicke mit dem Ziel geachtet werden verwendet.
In dem beschriebenen Protokoll ist Niedrigenergie-, Nah-Infrarot-Licht für bildgebende Autofluoreszenz Elastin und Kollagen SHG genutzt. Dies ermöglicht Imaging für längere Zeit. In den menschlichen Widerstand Arterien in dieser Studie verwendet besteht die IEL ein längs ausgerichteten Faser-ähnlichen Netz von vernetzten Elastin Fasern13,33, ähnlich der Struktur der IEL der menschlichen subkutane Widerstand Arterien (hSCA)38,39. Änderungen in den verzweigten Winkeln der Elastinfasern in der IEL wurden ausgewertet und zusammen mit Maßnahmen der allmählichen abrollen der adventitial Kollagenfasern mit zunehmendem Druck37 verwendet, um Änderungen in der Mikroarchitektur von Elastin zu beurteilen und Kollagen bzw.. Bilder zur Bewertung von Elastin und Kollagen Mikroarchitekturen erhielten in der gleichen Region von Interesse innerhalb der Arterienwand bei unterschiedlichen drücken. Dadurch können wiederholte Messungen analysiert. Wenn möglich, kann der Prüfer darauf abzielen, Bilder in mindestens 3 Regionen von Interesse, mit Bild Größen 10-50 µm in jeder Dimension zu erhalten. Ein Kompromiss muss jedoch je nach der Probe, vor allem die Dicke der Arterienwand, die Anzahl der gescannten Bereiche des Interesses und der möglich während des Experiments unterschieden werden. Im Falle der menschlichen Herzbeutel Widerstand Arterien die Arterien mindestens 8-12 Stunden des Experimentierens lebendig geblieben. Scannen von mehreren Regionen von Interesse ermöglicht eine Auswertung der Intra-gegen Inter Probe Variabilität und unterstützt somit die Schlussfolgerung auf den gewonnenen Erkenntnissen.
Es ist wichtig zu bemerken, dass zur Vermeidung von Induktion phototoxische Schäden, Bildgebung mit hoher Leistung Anregungslicht sollte vermieden werden, bei der Arbeit an live Gewebeproben. Vor diesem Hintergrund es empfiehlt sich, die große Bild-Stacks für Kollagen und Elastin Volumen Dichte am Ende des experimentellen Protokolls Alternativ erwerben auf festen Proben. Bei der absolute Mengen der ECM-Komponenten erforderlich sind, sollte eine Beeinträchtigung der Volumen-Dichte des fixiermittels quantifiziert und berücksichtigt. Fixierung und Permeabilisierung der Arterien können außerdem Färbung des intrazellulären Ziele von Interesse, wenn notwendig. In diesem Protokoll wird für Elastin Färbung mit Eosin auf die live Arterie durchgeführt. Färbung von Elastin durch spezifische Sonden (z. B. Alexa 633 hydrazid40) und Kollagen (z. B. CNA3541), zusammen mit anderen Flecken (z. B. Phalloidin42) angewandt werden oder DNA, um die Bewertung zu erleichtern Volumetrische Dichte und strukturellen Organisation der anderen Strukturen des Interesses an der Arterienwand. Diese Gelegenheit kann Forschungslabore mit Single-Photon konfokale Mikroskope Gelegenheit zu untersuchen, die mikrostrukturellen Veränderungen im Widerstand Arterien bieten. Segmente von der gleichen Arterie können unter verschiedenen Bedingungen behandelt, unter Druck fixiert und abgebildet zu einem späteren Zeitpunkt, die Wirkung der angewandten Behandlung zu vergleichen. Ziele von Interesse sollte durch bildgebende Re kanülierte, erneut unter Druck und gefärbten Gefäße visualisiert werden. Re Kanülierung und erneute Druckbeaufschlagung ist erforderlich, wenn bauliche Veränderungen berücksichtigt werden, wie Elastin nicht behoben werden und somit wird Rückstoß und verändern die 3D-Struktur des festen Arterie43,44. Der Nachteil Strukturveränderungen im festen Arterien zu bestimmen ist, dass mehrere Segmente zum Vergleich festgesetzt, und wiederholte Messung Analysen können nicht ausgeführt werden.
Mit Bildgebung gewonnenen Daten können direkt zur Wand Spannungen und Dehnungen zu berechnen, und unterstützen die Mechanik der Gefäßwand, zu verstehen, wie in Bloksgaard, M. Et al.13beschrieben verwendet werden. In dieser Arbeit ein mathematisches Modell wurde angewandt, um charakterisieren die intrinsische Steifigkeit der Elastin und Kollagen Komponenten der Arterienwand und das Kollagen Rekrutierung Stämme45,46 auf der Grundlage der Schätzung berechnet Stress-Strain-Beziehungen. Bildgebung unterstützt die Erkenntnisse aus der mathematischen Modellierung wurde das Kollagen in den menschlichen Widerstand Arterien bereits bei niedrigen umlaufende Belastung und Stress Wand rekrutiert. Die quantitative Maßnahmen der Mikroarchitektur von Elastin und Kollagen beschrieben in diesem Protokoll können weitere werden erweitert, inspiriert durch die umfangreichen Arbeiten auf die Halsschlagadern6,8,47, 48 , 49 und Aorta7,9,10,50,51: zusätzliche Analysen umfassen die Bewertung der räumlichen Verteilung und Mikroarchitektur von Kollagen und Elastinfasern innerhalb der verschiedenen Schichten der Arterienwand sowie Faser Ausrichtung Winkel (Orientierung in Bezug auf die Längsachse). Bell Et Al. 15 behandelt die Druck induzierte Reorganisation der IEL und adventitial Kollagen, einschließlich eines mehrschichtigen analytischen Modells zur Berechnung der Steifigkeit und Stress in jeder Schicht der Arterienwand. Diese Autoren15 verwendet menschlichen subkutane Widerstand Arterien von gesunden Probanden und verwandte Struktur und Wand Spannungen an 3 und 30 MmHg bzw. erhalten.
Die vorgeschlagene Methode in diesem Protokoll motiviert hoffentlich weitere Untersuchungen und Entwicklung der microstructurally motiviert mathematische Modelle für die mechanischen Eigenschaften des menschlichen Widerstand Arterien in Gesundheit und Krankheit zu verstehen. Mit weiteren Änderungen der Methode, die Kollagen und Elastin Orientierung Winkeln entlang der Längsachse auch glatte Muskulatur Zelle Volumen Dichte, räumliche Verteilung und Orientierung innerhalb der arterielle Wand, Kollagen und Elastin Verteilung und Orientierung in der Tunica Media und Elastin Organisation und Verteilung in Tunica Adventitia, die Bilddaten können füttern vorwärts Entwicklung mathematischer Modelle, Umbau Prozessverständnis in Bluthochdruck, Diabetes zu erleichtern und die Metabolisches Syndrom. In ähnlicher Weise wie für die koronaren Mikrozirkulation52,53, Chen und Kassab vorgeschlagen bieten Mikrostruktur-basierte Modelle der menschlichen Widerstand Arterien Vorhersagen der arteriellen mechanische Reaktionen auf die Makro-(ganze Arterie) und micro-(structure) mechanischen Ebenen für jeden Bestandteil. Solche Modelle müssen auf quantitative Daten der Strukturparameter und mechanischen Eigenschaften der einzelnen Schichten und Wähler in der Arterienwand der Arterien, die aus gesunden Probanden und Patienten mit verschiedenen Erkrankungen beruhen, empfangen von verschiedenen pharmakologischen Behandlungen. Daten werden gesammelt in einer standardisierten Weise und Profile über Individuen mit unterschiedlichen Risikofaktor, Krankheit und Behandlung verglichen. Die Methode hat das Potenzial, Hilfe, Verständnis, wie Krankheit und medizinische Behandlungen die menschliche Mikrozirkulation beeinflussen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Die Autoren danken den dänischen Molekulare Biomedical Imaging Center an der Fakultät für Naturwissenschaften, Universität von Süddänemark für die Nutzung von Labors und Mikroskope. Kristoffer Rosenstand und Ulla Melchior sind ausgezeichnete technische Unterstützung für den Druck Myographie und imaging anerkannt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fine Science Tools | 15401-12 | ||
| Fine Science Tools | 11251-23 | ||
| Nikon | SMZ800N | ||
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | 761028 | for dissection purpose | |
| Vitrex Medical A/S, Herlev, Denmark | 1.63, 2.13, 210mm | ||
| Smiths medical Intl, UK | |||
| Ethicon | Ethilon 11-0 | ||
| Custom built | DK patent number 201200167, University of Southern Denmark, J. Schoubo V. Jensen, F. Jensen. T.R. Uhrenholt | ||
| Mettler toledo | |||
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | B3259 | ||
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | A7030 | ||
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | C5670 | ||
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | G7021 | ||
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | E3889 | ||
| Merck Millipore, Hellerup, Denmark | 1.00496.9010 | Phosphate buffered (pH 6.9) 4% formaldehyde solution | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | H3784 | ||
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | P9666 | ||
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | P5655 | ||
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | M2643 | ||
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | S2002 | ||
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | S5886 | ||
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | S5761 | ||
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | 1.06462 | ||
| Gibco, ThermoFisher Scientific | 10010015 | ||
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | PHR1423 | ||
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | Z370525 | ||
| Tocris Bioscience, Bristol, UK | 538944 | ||
| Nikon | Custom built | ||
| Spectra Physics, Mountain View, CA | |||
| Nikon | CFI Plan Apo IR SR 60XWI NA 1.27 | ||
| Nikon | CFI Plan Fluor 20XMI (multi-immersion) NA 0.75 | ||
| Hamamatsu, Ballerup, Denmark | H7422P-40 | ||
| AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany). | ChromaET 460 nm long pass dichroic | ||
| AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany). | Semrock FF01-520/35-25 BrightLine filter | ||
| AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany). | Chroma ET402/15X | ||
| Scotch TM | |||
| coverslip thickness should match used objective on microscope (#1 or #1.5), alternatively, set adjustment collar to match coverslip |
References
- Briones, A. M., Arribas, S. M., Salaices, M. Role of extracellular matrix in vascular remodeling of hypertension. Curr Opin Nephrol Hy. 19 (2), 187-194 (2010).
- Heagerty, A. M., Heerkens, E. H., Izzard, A. S. Small artery structure and function in hypertension. J Cell Mol Med. 14 (5), 1037-1043 (2010).
- van den Akker, J., Schoorl, M. J., Bakker, E. N., Vanbavel, E. Small artery remodeling: current concepts and questions. J Vasc Res. 47 (3), 183-202 (2010).
- Rizzoni, D., Agabiti-Rosei, E. Structural abnormalities of small resistance arteries in essential hypertension. Intern Emerg Med. 7 (3), 205-212 (2012).
- Schiffrin, E. L. Vascular remodeling in hypertension: mechanisms and treatment. Hypertension. 59 (2), 367-374 (2012).
- Fonck, E., et al. Effect of elastin degradation on carotid wall mechanics as assessed by a constituent-based biomechanical model. Am J Physiol-Heart C. 292 (6), H2754-H2763 (2007).
- Chow, M. J., Turcotte, R., Lin, C. P., Zhang, Y. Arterial extracellular matrix: a mechanobiological study of the contributions and interactions of elastin and collagen. Biophys J. 106 (12), 2684-2692 (2014).
- Chen, H., et al. Biaxial deformation of collagen and elastin fibers in coronary adventitia. J Appl Physiol (1985). 115 (11), 1683-1693 (2013).
- Schriefl, A. J., Schmidt, T., Balzani, D., Sommer, G., Holzapfel, G. A. Selective enzymatic removal of elastin and collagen from human abdominal aortas: uniaxial mechanical response and constitutive modeling. Acta Biomater. 17, 125-136 (2015).
- Zeinali-Davarani, S., Wang, Y., Chow, M. J., Turcotte, R., Zhang, Y. Contribution of collagen fiber undulation to regional biomechanical properties along porcine thoracic aorta. J Biomech Eng. 137 (5), 051001 (2015).
- Mattson, J. M., Turcotte, R., Zhang, Y. Glycosaminoglycans contribute to extracellular matrix fiber recruitment and arterial wall mechanics. Biomech Model Mechan. 16 (1), 213-225 (2017).
- Schriefl, A. J., Zeindlinger, G., Pierce, D. M., Regitnig, P., Holzapfel, G. A. Determination of the layer-specific distributed collagen fibre orientations in human thoracic and abdominal aortas and common iliac arteries. J R Soc Interface. 9 (71), 1275-1286 (2012).
- Bloksgaard, M., et al. Imaging and modeling of acute pressure-induced changes of collagen and elastin microarchitectures in pig and human resistance arteries. Am J Physiol-Heart C. , (2017).
- Dora, K. A., et al. Isolated Human Pulmonary Artery Structure and Function Pre- and Post-Cardiopulmonary Bypass Surgery. J Am Heart Assoc. 5 (2), (2016).
- Bell, J. S., et al. Microstructure and mechanics of human resistance arteries. Am J Physiol-Heart C. 311 (6), H1560-H1568 (2016).
- Roque, F. R., et al. Aerobic exercise reduces oxidative stress and improves vascular changes of small mesenteric and coronary arteries in hypertension. Brit J Pharmacol. 168 (3), 686-703 (2013).
- Briones, A. M., et al. Alterations in structure and mechanics of resistance arteries from ouabain-induced hypertensive rats. Am J Physiol-Heart C. 291 (1), H193-H201 (2006).
- Briones, A. M., et al. Role of elastin in spontaneously hypertensive rat small mesenteric artery remodelling. J Physiol. 552 (Pt 1), 185-195 (2003).
- Arribas, S. M., et al. Confocal myography for the study of hypertensive vascular remodelling. Clin Hemorheol Micro. 37 (1-2), 205-210 (2007).
- Gonzalez, J. M., et al. Postnatal alterations in elastic fiber organization precede resistance artery narrowing in SHR. Am J Physiol-Heart C. 291 (2), H804-H812 (2006).
- Spronck, B., Megens, R. T., Reesink, K. D., Delhaas, T. A method for three-dimensional quantification of vascular smooth muscle orientation: application in viable murine carotid arteries. Biomech Model Mechan. 15 (2), 419-432 (2015).
- Megens, R. T., et al. In vivo high-resolution structural imaging of large arteries in small rodents using two-photon laser scanning microscopy. J Biomed Opt. 15 (1), 011108 (2010).
- Megens, R. T., oude Egbrink, M. G., Merkx, M., Slaaf, D. W., van Zandvoort, M. A. Two-photon microscopy on vital carotid arteries: imaging the relationship between collagen and inflammatory cells in atherosclerotic plaques. J Biomed Opt. 13 (4), 044022 (2008).
- Bender, S. B., et al. Regional variation in arterial stiffening and dysfunction in Western diet-induced obesity. Am J Physiol-Heart C. 309 (4), H574-H582 (2015).
- Clifford, P. S., et al. Spatial distribution and mechanical function of elastin in resistance arteries: a role in bearing longitudinal stress. Arterioscler Thromb. 31 (12), 2889-2896 (2011).
- Martinez-Revelles, S., et al. Lysyl Oxidase Induces Vascular Oxidative Stress and Contributes to Arterial Stiffness and Abnormal Elastin Structure in Hypertension: Role of p38MAPK. Antioxid Redox Sign. 27 (7), 379-397 (2017).
- Foote, C. A., et al. Arterial Stiffening in Western Diet-Fed Mice Is Associated with Increased Vascular Elastin, Transforming Growth Factor-beta, and Plasma Neuraminidase. Front Physiol. 7, 285 (2016).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Sommer, C., Straehle, C., Kothe, U., Hamprecht, F. A. Ilastik: Interactive Learning and Segmentation Toolkit. 2011 8th Ieee International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro, , 230-233 (2011).
- Campagnola, P. J., et al. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophys J. 82 (1 Pt 1), 493-508 (2002).
- Intengan, H. D., Deng, L. Y., Li, J. S., Schiffrin, E. L. Mechanics and composition of human subcutaneous resistance arteries in essential hypertension. Hypertension. 33 (1 Pt 2), 569-574 (1999).
- Saatchi, S., et al. Three-dimensional microstructural changes in murine abdominal aortic aneurysms quantified using immunofluorescent array tomography. J Histochem Cytochem. 60 (2), 97-109 (2012).
- Bloksgaard, M., et al. Elastin Organization in Pig and Cardiovascular Disease Patients' Pericardial Resistance Arteries. J Vasc Res. 52 (1), 1-11 (2015).
- World Medical Association. World Medical Association Declaration of Helsinki: ethical principles for medical research involving human subjects. JAMA. 310 (20), 2191-2194 (2013).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry A. 58 (2), 167-176 (2004).
- Rezakhaniha, R., et al. Experimental investigation of collagen waviness and orientation in the arterial adventitia using confocal laser scanning microscopy. Biomech Model Mechan. 11 (3-4), 461-473 (2012).
- Green, E. M., Mansfield, J. C., Bell, J. S., Winlove, C. P. The structure and micromechanics of elastic tissue. Interface Focus. 4 (2), 20130058 (2014).
- Bell, J. S., et al. Microstructure and mechanics of human resistance arteries. Am J Physiol-Heart C. 311 (6), H1560-H1568 (2016).
- Shen, Z., Lu, Z., Chhatbar, P. Y., O'Herron, P., Kara, P. An artery-specific fluorescent dye for studying neurovascular coupling. Nat Methods. 9 (3), 273-276 (2012).
- Megens, R. T., et al. Imaging collagen in intact viable healthy and atherosclerotic arteries using fluorescently labeled CNA35 and two-photon laser scanning microscopy. Mol Imaging. 6 (4), 247-260 (2007).
- Staiculescu, M. C., et al. Prolonged vasoconstriction of resistance arteries involves vascular smooth muscle actin polymerization leading to inward remodelling. Cardiovasc Res. 98 (3), 428-436 (2013).
- Fung, Y. C., Sobin, S. S. The retained elasticity of elastin under fixation agents. J Biomech Eng. 103 (2), 121-122 (1981).
- Fung, Y. C. Biomechanics : mechanical properties of living tissues. , 2nd, Springer-Verlag. (1993).
- Bakker, E. N., et al. Heterogeneity in arterial remodeling among sublines of spontaneously hypertensive rats. PLoS One. 9 (9), e1107998 (2014).
- VanBavel, E., Siersma, P., Spaan, J. A. Elasticity of passive blood vessels: a new concept. Am J Physiol-Heart C. 285 (5), H1986-H2000 (2003).
- Chen, H., et al. Microstructural constitutive model of active coronary media. Biomaterials. 34 (31), 7575-7583 (2013).
- Saez, P., Garcia, A., Pena, E., Gasser, T. C., Martinez, M. A. Microstructural quantification of collagen fiber orientations and its integration in constitutive modeling of the porcine carotid artery. Acta Biomater. 33, 183-193 (2016).
- Bellini, C., Ferruzzi, J., Roccabianca, S., Di Martino, E. S., Humphrey, J. D. A microstructurally motivated model of arterial wall mechanics with mechanobiological implications. Ann Biomed Eng. 42 (3), 488-502 (2014).
- Schriefl, A. J., Wolinski, H., Regitnig, P., Kohlwein, S. D., Holzapfel, G. A. An automated approach for three-dimensional quantification of fibrillar structures in optically cleared soft biological tissues. J R Soc Interface. 10 (80), 20120760 (2013).
- Weisbecker, H., Unterberger, M. J., Holzapfel, G. A. Constitutive modelling of arteries considering fibre recruitment and three-dimensional fibre distribution. J R Soc Interface. 12 (105), 20150111 (2015).
- Chen, H., Kassab, G. S. Microstructure-based biomechanics of coronary arteries in health and disease. J Biomech. 49 (12), 2548-2559 (2016).
- Chen, H., Kassab, G. S. Microstructure-based constitutive model of coronary artery with active smooth muscle contraction. Sci Rep. 7 (1), 9339 (2017).
