Summary
Vi beskriva samtidig mekanisk provning och 3D-imaging i kärlväggen av isolerade, levande mänskliga motstånd artärer, och Fiji och Ilastik image analyser för kvantifiering av elastin och kollagen rumslig organisation och volym tätheter. Vi diskutera användningen av dessa data i matematiska modeller av kärlväggen mekanik.
Abstract
Patogena bidrag motstånd artär remodeling dokumenteras i essentiell hypertoni, diabetes och metabola syndromet. Utredningar och utveckling av microstructurally motiverade matematiska modeller för att förstå de mekaniska egenskaperna av mänskliga motstånd artärerna i hälsa och sjukdom har potential att hjälpa förståelse hur sjukdom och medicinska behandlingar påverka människors mikrocirkulationen. För att utveckla dessa matematiska modeller, är det viktigt att dechiffrera förhållandet mellan mekanisk och mikrostrukturell egenskaperna för mikrovaskulära väggen. I detta arbete beskriver vi en ex vivo -Metod för passiv mekanisk provning och samtidiga etikett-fri tredimensionell avbildning av mikroarkitekturen av elastin och kollagen i kärlväggen av isolerade mänskliga motstånd artärer. Imaging protokollet kan tillämpas på motstånd artärer av alla arter av intresse. Bild analyser beskrivs för att kvantifiera i) tryckinducerad förändringar i intern elastisk lamina förgrenade vinklar och adventitial kollagen rakhet med Fiji och ii) kollagen och elastin volym densiteter fastställs med hjälp av Ilastik programvara. Helst alla mekaniska och imaging mätningar utförs på levande, perfunderade artärer, dock en alternativ metod med standardtryck video-mikroskopi myography i kombination med efter fixering avbildning av nytt trycksatt fartyg är diskuteras. Denna alternativa metod ger användare med olika alternativ för analys metoder. Införandet av mekaniska och tänkbar data i matematiska modeller av kärlväggen mekanikerna diskuteras, och föreslås framtida utveckling och tillägg till protokollet.
Introduction
Det patogena bidrag och effekterna av motstånd artär remodeling dokumenteras i essentiell hypertoni, diabetes och metabola syndromet1,2,3,4,5. Dechiffrera förhållandet mellan mekanisk och mikrostrukturell egenskaperna för mikrovaskulära väggen är viktigt för att utveckla matematiska modeller av denna förening. Sådana modeller kommer att förbättra förstå remodeling processen och kommer att stödja utvecklingen av i silico modeller användbara för att testa farmakologiska strategier inriktning sjukdom relaterade remodeling i kärlväggen.
Tidigare studier fokuserat förstå hur mikroarkitekturen i kärlväggen avser kärlväggen mekanik mekaniska åtgärder och mikroarkitekturen av den extracellulär matrixen (ECM) utförs nästan uteslutande på stora , elastisk conduit artärer från möss eller svin6,7,8,9,10,11. Avbildning av mikrostrukturer av väggen är vanligen utförs med hjälp av olinjära optiska tekniker, utnyttja autofluorescens av elastin och harmonisk understödjautvecklingen av kollagen. Detta tillåter spatiotemporal avbildning av de två viktigaste komponenterna av extracellulärmatrix, elastin och kollagen, utan ett behov för färgning. Avbildning av kärlväggen i full tjocklek är en utmaning i stora conduit artärer tack vare scatteren av ljuset i tjock tunica media. För att avgöra hur mikroarkitekturen strukturella komponenter i kärlväggen avser observerade mekaniska egenskaper, måste dock tredimensionell information fås vid mekanisk provning. För stora artärer som mänskliga aorta kräver detta biaxiell montering, mekanisk provning och avbildning av regioner av intresse i 1-2 cm2 bitar av kärlväggen7,9,10, 12. endast en del av väggen kan avbildas och mekaniskt testade.
För mindre artärer av någon art (t.ex., mänskliga perikardiell13, pulmonell14 och subkutan15 artärer, råtta mesenterica artärer16,17,18, 19 , 20, mus cremaster, mesenteriska, cerebral, femorala och carotid artärer21,22,23,24,25,26, 27) avbildning av hela väggtjockleken är möjligt och kan kombineras med mekanisk provning. Detta tillåter samtidig inspelning av de mekaniska egenskaperna och de strukturella arrangemang inom väggen. Dock rapporterats en direkt matematisk modellering av förhållandet mellan de observerade förändringarna i ECM tredimensionella struktur och ändrade mekaniska egenskaper i kärlväggen motstånd, till bäst av vår kunskap endast vid nyligen i mänskliga motstånd artärer13,15.
I detta arbete beskrivs en ex vivo -Metod för passiv mekanisk provning och samtidiga tredimensionell avbildning av mikroarkitekturen av elastin och kollagen i kärlväggen av isolerade mänskliga motstånd artärer. Imaging protokollet kan tillämpas på motstånd artärer av alla arter av intresse. Bild analyser beskrivs för åtgärder av intern elastisk lamina förgrenade vinklar och adventitial kollagen rakhet13 använda Fiji28. Kollagen och elastin volym tätheter bestäms med Ilastik programvara29 och slutligen införandet av mekaniska och tänkbar data i matematiska modeller av kärlväggen mekanikerna diskuteras.
Målet att beskriva imaging och bild analyserna tekniker i kombination med matematisk modellering är att ge utredarna en systematisk metod för att beskriva och förstå observerat inducerad tryckförändringar i ECM av motstånd artärer. Den beskrivna metoden är fokuserad kvantifiera förändringar i ECM i ett fartyg under trycksättning, genom att jämföra struktur ECM på 20, 40 och 100 mmHg. Dessa tryck valdes för att bestämma strukturen i kärlväggen vid dess mer kompatibel (20 mmHg), stiff (100 mmHg) och mellantillstånd (40 mmHg), respektive. Dock kan någon process i kärlväggen av levande artärer, inklusive ändringar som induceras av vasoaktiva komponenter, hysteres och flöde, kvantifieras, beroende på forskning hypotesen i fråga av prövaren.
Användning av två-photon excitation fluorescensmikroskopi (TPEM) i kombination med en tryck-myograph för studera trycket (eller annan) inducerade förändringar i ECM av levande artärer framhävs. Först, eftersom detta tillåter samtidiga förvärv av den övergripande tredimensionella strukturen i kärlväggen (diameter och väggtjocklek) tillsammans med tredimensionella etikett-gratis förvärv av hög kvalitet, detaljerade bilder av kollagen och elastin microarchitectures som beskrivs13 genom att utnyttja den elastin autofluorescens och kollagen andra harmoniska generation signal (SHG)30. Det andra tillåter TPEM användning av energisnåla infrarött excitation ljus, minimera åldrad hud vävnad och således upprepade imaging på exakt samma position inom kärlväggen är tillåtet, tillåter upprepade-mätningar analyser av observerade förändringar.
Användningen av en alternativ metod som använder confocal avbildning av trycket fast artärer diskuteras så att användare utan tillgång till TPEM en möjlighet att använda den beskrivna metoden också. Information om ECM struktur och volym tätheter kan också hämtas från tvådimensionell analyser av vävnader sektioneras i följetong, e.g. som beskrivs av31,32. På grund av möjligheten att hämta tredimensionella strukturell information via längd skalorna i artären samt under förändrade villkor med hjälp av denna metod, det är dock inte rekommenderar detta tillvägagångssätt för utredningar av tryck och behandling inducerad tredimensionella förändringar i ECM.
Minimikravet för utredaren att tillämpa den häri beskrivna metoden är tillgång till en setup för kanylering och trycksättning av artärerna i kombination med en confocal eller två-photon excitation fluorescens Mikroskop. Den inställning som beskrivs i följande protokoll är en specialbyggd tryck myograph med en längsgående kraftgivare, byggd för att passa på en anpassad inbyggd inverterad två-photon excitation fluorescens Mikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Samling av biopsier av mänskliga parietala hjärtsäck för användning i detta arbete utfördes efter skriftligt informerat samtycke, som tidigare beskrivits33. Studiet av mänskliga vävnader överensstämma med principerna i Helsingforsdeklarationen34 och godkändes av den regionala kommittéer för hälsa forskningsetik för södra Danmark (S-20100044 och S-20140202) och danska dataskyddsverket.
1. samla vävnad och isolat (mänskliga) motstånd artär
- Samla vävnadsprover på intresse omedelbart efter excision under en operation. Överföring vävnaden till 4 ° C HEPES buffrad fysiologisk saltlösning (HBS) omedelbart vid insamling och lagra den i HBS.
Obs: Mänskliga vävnader bara samlas in efter godkännande av relevanta institutionella och etiska kommittéer samt patienternas skriftligt informerat samtycke. HBS sammansättning i mM: NaCl 144, KCl 4,7, CaCl2 2,5, MgSO4 1.2, KH2PO4 1.2, HEPES 14,9, glukos 5.5. Justera pH 7,4 med NaOH och filtrera lösningen dock 0,2 µm filter. - Lämna den insamlade vävnaden i sterila HBS vid 4 ° C över natten för att tvätta ut anestetika.
Obs: Någon effekt av övernattning lagring på fartyget integritet och funktionalitet bör kontrolleras av enskilda research laboratory. - Noggrant isolera motstånd medelstora artärer (± 200 µm lumen diameter) med ett par skarpa-tip pincett och mikro-dissektion sax.
- Du kan lagra artärerna vid 4 ° C i iskall HBS samtidigt priming den imaging/tryckkammaren.
2. Montera den isolera artären i den tryck-Myograph
- Montera glas kanyler med tip diametrar ~ 80 µm på kanyler innehavare. Placera den tips ca 150 µm ovan kammaren glas botten.
Obs: 45° bockad tip kanyler kan exakt positionering av fartyget ovan glas botten. - Fyll både inlopp och utlopp slang med HBS med 1% BSA och Anslut till trycksystemet.
Obs: BSA ingår att bevara endotelceller funktion. - Montera den isolera artär med två dubbel Knut suturer per kanyl.
Obs: Knop kan förberedas i förväg och lagras på dubbel tejp tills behövs. - Fyll i kammaren med HBS och placera två dubbla knutar på varje glas kanyl.
Obs: När du använder artärer visar myogenic tonen, HBS bör ersättas med kalcium gratis HBS kompletteras med 3 µM EGTA och 3 µM natriumnitroprussid. - Håll artären försiktigt i ena änden med två par vass spets pincett. Öppna lumen av artär och skjut den försiktigt på kanylen. Fixa på kanyl med två knutar.
- Tillämpa ett tryck på 5 mmHg att försiktigt spola lumen med HBS / 1% BSA.
- Hål i andra änden av artären och säkra den på kanylen med två dubbla knutar.
- Överföring av myograph till Mikroskop scenen och trycksätta artären till 5 mmHg (inloppstrycket = utloppstryck), sedan Värm till 37 ° C i 30 min.
- Valfritt: Kalibrera den längsgående kraftgivare enligt tillverkarens anvisningar (1 g = 9,81 mN).
Obs: Det är viktigt att kalibrera kraft givaren efter uppvärmning eftersom det är temperaturkänsliga.
3. utföra Experiment: Avbildning av arteriell Diameter, väggtjocklek och kollagen och Elastin-mikroarkitektur med TPEM
- Snabbt Skanna den kanylerade artär trycksatt till 5 mmHg med ett 20 X-objektiv (numeriska bländaröppningen (NA) ≥ 0,8) och strömsnål excitation ljus för att bedöma fartyget diameter och väggtjocklek på 5 mmHg.
Obs: För omvänt Mikroskop, använda ett vatten nedsänkning mål; för upprätt Mikroskop, använda en vatten doppning mål. Om målet inte har en korrigering krage att korrigera för täckglasets tjocklek, se till att matcha det begagnade täckglaset med syftet används. Programvaruinställningar och beskrivningar kan variera beroende på användaren-interphase och Mikroskop och programvara som används.- Setup den optiska vägen.
- Aktivera Mai Tai två-photon laser och ange det till 820 nm excitation ljus.
Undvik all exponering för såväl synliga som osynliga laserljus. - Samla utsläpp samtidigt i två kanaler. Dela utsläpp ljus mellan den fotomultiplikatorer som använder en 460 nm lång pass dichroic spegel och samla utsläpp med 30-60 nm brett bandpass filter centrerad på 520 nm (elastin) och 410 nm (kollagen), respektive.
- Aktivera Mai Tai två-photon laser och ange det till 820 nm excitation ljus.
- Aktivera kontinuerlig skanning med 10 µs laser dwell time/pixel och 512 × 512 pixlar för 100% synfält.
- Manuellt söka igenom artären att bestämma djupet där maximal diameter observeras.
- Välja ett rektangulärt segment som täcker artärens bredaste diameter och skanna en enda bildruta med pixel storlek ≤ 300 nm/pixel (figur 2 c). Använda som låg excitation ljus makt och pixel uppehållstid som möjligt för att undvika photodamaging levande artären.
Obs: Det rekommenderas att skaffa en rektangulär, t.ex., 100 × 1024 pixel bild, snarare än kvadratisk bild på denna position att spara tid och begränsa vävnad photon exponering (figur 2 c). - Spara bilden för senare analyser.
- Setup den optiska vägen.
- Bestämma lumen diameter och väggtjocklek på maximal diameter av artären.
- Läsa in bilden i Fiji.
- Ställa in skalan genom att klicka Main menyn | Analysera | Ange skala och ange µm/pixel och pixel baserat (det rekommenderas starkt att hålla pixel förhållandet 1:1).
- Välj linjeverktyget Fiji och dra en linje mellan de två inre elastiska bladskivan på varje sida av arteriell lumen och klicka på ctrl + M. Fiji rapporterar längd som standard i resultattabellen.
- Jämväl, rita fler linjer för att mäta tjockleken på varje vägg, och klicka på ctrl + M för att mäta följande uppmärkning.
- Spara mätningarna.
- Bild kollagen och elastin mikroarkitektur på 5 mmHg genom att skanna hela tjockleken på kärlväggen, erhålla 3D bildstaplar med god kvalitet för 1-3 regioner av intresse längs längden av artären.
- Erhålla bildstaplar genom hela väggen i artären med hjälp av en 60 X mål, NA ≥ 1, optimerad pixel storlekar och z-avståndet.
- Beräkna optimala imaging förutsättningar (pixel storlekar och z-stegs avstånd) i enlighet med den optiska vägen, nedsänkning medium och prova refractive index använda vetenskapliga volym Imaging Nyquist räknaren (https://svi.nl/NyquistCalculator).
Obs: Vänligen uppmärksamma här skillnaden mellan optimal pixelstorlek och z-avståndet kontra råd i avsnitt 3.4. ovan om användningen av en maximal storlek i bildpunkter.
- Beräkna optimala imaging förutsättningar (pixel storlekar och z-stegs avstånd) i enlighet med den optiska vägen, nedsänkning medium och prova refractive index använda vetenskapliga volym Imaging Nyquist räknaren (https://svi.nl/NyquistCalculator).
- Använd samma excitation och utsläpp inställningar som ovan (3.1.1.).
- Snabbt Skanna kärlväggen som beskrivs ovan för att bestämma tjockleken på z-stacken.
- Definiera z-stack start och slut djup, z-stegs avstånd och pixeltäthet (beräknat i 3.3.1.1.) och utföra z-skanningen. Spara varje kanal separat.
Obs: Bilder bör vara tillräckligt liten t.ex. 30 x 30 µm eller 50 × 50 µm beroende på fartygets storlek att undvika någon påverkan för krökning i de efterföljande bild analyserna.
- Erhålla bildstaplar genom hela väggen i artären med hjälp av en 60 X mål, NA ≥ 1, optimerad pixel storlekar och z-avståndet.
- Bestämma arteriell diameter, väggtjocklek och elastin och kollagen mikroarkitektur vid kvarvarande tryck på protokollet.
- Upprepa 3,1-3,2 på pressar 10 och 20 mmHg, upprepa 3.3 på trycket 20 mmHg.
- Upprepa 3.1 och 3.2 på trycket 40 mmHg.
- Upprepa 3,1-3,2 på trycket 60, 80 och 100 mmHg och upprepa 3.3 på 100 mmHg.
Obs: 3.1-3.3 kan upprepas för alla påtryckningar, och kombinationer av tryck (t.ex. en serie/kombination av ökande samt som minskar trycket), beroende på hypotesen att testas. Eosin i koncentration 0,3 - 1 µM läggas för att öka elastin autofluorescens vid fotoblekning. Fotoblekning kan undvikas genom att tillämpa som låg effekt excitation ljus som möjligt. - Byt ut bufferten i myograph kammaren med färska 37 ° C HBS efter varje trycket steg. Låt artären anpassas för 5 min före imaging efter varje förändring i trycket.
- Lagra kanal stackar separat för image analyser.
- Testa livskraft i artären.
- Tillämpa 10 µM U46619 i myograph kammaren följt av tillägg av 10 µM bradykinin när en stabil förträngning observeras.
- Spela in diameter och väggtjocklek som beskrivs ovan i avsnitt 3.1 efter applicering av var och en av föreningarna.
- Lägg till 3 µM natriumnitroprussid när artären inte är helt dilaterade efter tillägg av bradykinin och posten diameter och väggtjocklek.
Obs: Beroende på de farmakologiska egenskaperna hos artären av intresse (vaskulär säng och arter) andra vasokonstriktor och (endotel-beroende) vasodilaterande substanser kan användas.
- Tillval: Fix trycksatt artären eller fortsätta med avbildning av kollagen och elastin för volym tätheter (steg 7).
- Lägga till 4% formaldehyd i 1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) vid 37 ° C i 1 h.
- Tvätta den fasta artären tre gånger i 1 x PBS och försiktigt artären av de kanyler, röra endast delarna av artär utanför knutar. Inte ta bort knutar, använda dem för att hålla artären vid överföring till en lagring tube.
- Butik i 1 x PBS / 0,05% natriumazid vid 4 ° C tills imaging för elastin och kollagen volym tätheter eller andra syften.
Obs: Fast artärer kan lagras i minst 3 månader i 1 x PBS / 0,05% natriumazid vid 4 ° C.
4. beräkning av Stress stam relationer och inneboende vägg stelhet
- Följ formler och beräkningssteg för beräkning av spänningar, stammar och vägg stelhet som beskrivs av Bloksgaard, M. et al. 13 och hänvisningar häri.
5. bildanalys - (intern elastisk Lamina) IEL förgrening vinklar
- Öppna bild-stacken i Fiji. Gå till fil | öppna bild att välja bildstapel.
Obs: Max intensitet projektioner av 2-7 i följd z-sektioner som täcker IEL (1-2 µm tjocklek) används för att bestämma IEL elastin fiber förgrenade vinklarna med verktyget vinkel i Fiji28,35. Se figur 4A för illustration. - Gå till bild | stackar | z projekt... att välja bilder och ”Max intensitet projektion”.
- Spara max intensitet projektionen som TIFF.
- Välj så många IEL fiber förgrenade Poäng som möjligt med hjälp av verktyget ”vinkel” och arbeta systematiskt igenom bilderna. Klicka på ctrl + M för att mäta varje vinkel.
- Spara bladet Fiji resultat.
6. bildanalys - Adventitial kollagen vågighet
- Öppna bild-stacken i Fiji. Gå till fil | öppna bild att välja bildstapel.
Obs: Max intensitet projektioner av 2-7 i följd z-sektioner som täcker kollagen precis utanför den yttre elastiska lamina (ål, 1-4 µm tjocklek) används för att bestämma kollagen vågighet använder den Fiji NeuronJ plugin36 som beskrivs av Rezakhaniha, R . et al. 37 (Figur 4B). - Ställa in skalan. Gå till analysera | ange skala ange pixelmått.
- Gå till bild | stackar | z projekt... att välja bilder att arbeta med och ”Max intensitet projektion”.
- Byta bildtyp 8 bitt TIFF genom att klicka bild | typ | 8 bitt och spara max intensitet projektionen som TIFF.
- Mäta kollagen fiber rakhet med Fiji Neuron J Plugin.
- Öppna NeuronJ plugin genom att klicka Fiji | Plugins | Neuron J.
- Öppna den 8-bitars TIFF i NeuronJ genom att klicka belastning bild | Välj filen.
- Klicka på Lägg till tracingsoch välj fibrer att analysera genom att klicka på start och slut av varje fiber.
- Klicka på åtgärd tracings, välja Visa spårning (Lf) och vertex mätningar i dialogrutan.
- Beräkna L0/Lf i excel (eller liknande) och spara resultaten.
- Kopiera och klistra in Fiji Neuron J tracings och formhörn utdata till excel (eller liknande) och beräkna L0 använder Pythagorass sats från vertex mätningarna. Första och sista punkten på linjen anger placeringen av ändarna på hypotenusan i en 2D koordinatsystem.
Obs: En L0/Lf [kollagen fiber bunt end-to-end längd via en rak linje (L0) / full längd (Lf)] nära 1 visar en nästan rak kollagen fiber.
- Kopiera och klistra in Fiji Neuron J tracings och formhörn utdata till excel (eller liknande) och beräkna L0 använder Pythagorass sats från vertex mätningarna. Första och sista punkten på linjen anger placeringen av ändarna på hypotenusan i en 2D koordinatsystem.
7. imaging för kollagen och Elastin volym tätheter
- Tvätta den (fasta) artären 1 x i PBS och färga det i 15 min i 1 µM eosin i 1 x PBS i mörkret. För fasta artärer, utföra det här steget i rumstemperatur.
Obs: Eosin ökar elastin fluorescensen. Eosin färgar andra strukturer såsom kollagen och cellens cytoplasma om provet lämnas i färglösningen under längre tid. Om färgning av andra strukturer är alltför intensiv, sänka koncentrationen av eosin till 0,3 µM eller upprepa tvätt. - Tvätta artären 3 x 1 x PBS
- För fasta artärer: montera artären för avbildning.
Försiktighet: Avbildning av icke-trycksatt fartyg inte tillåter hämtning av geometriska kvantitativ information. När absoluta mängder krävs, bör dessa alltid erhållas på live, trycksatt artärer. Volym-nyckeltal kan erhållas på icke-trycksatt artärerna med denna metod.- Plats två bitar av dubbelhäftande tejp band 1-1,5 cm mellanrum på ett objekt glas. Dubbel tejp är ungefär 100 µm tjock. Applicera en eller flera lager av tejp för att matcha diametern på artären som ska monteras.
- Placera 10-20 µL av PBS på glaset mitt på torget och placera artären i PBS drop.
Obs: Bör vara som liten och platt som möjligt för att undvika driver artären ur position vid montering på täckglas. - Placera täckglaset och tryck på dubbel tejp.
- Fyll behållaren mellan täckglas och objektet glas med 1 x PBS. Fylla varje timme för att undvika uttorkning av provet.
- För fasta artärer: montera artären för avbildning.
- Hämta bild-stackar för kollagen och elastin volym densiteter med ett 20 X-objektiv med NA > 1 för att täcka så mycket av kärlväggen som möjligt samtidigt ha en bra optisk upplösning (figur 2D, 2 G- och 2 H).
Obs: Använd ett vatten nedsänkning mål för avbildning av fasta artärerna under ett täckglas, och en vatten doppning mål för avbildning av vitala artärer. Om målet inte har en korrigering krage att korrigera för täckglasets tjocklek, se till att matcha täckglaset till målet. Använd helst optimal pixel storlekar och z-avståndet. Beräkna dessa använder Nyquist räknaren (steg 3.3.1.1.). Alternativt använda en minsta pixelstorlek 300 nm och z-avståndet mellan 1 µm. Det rekommenderas att få tre bilder längs längden av artären till tillåta användaren att avgöra inom analysen variabilitet. - Bild elastin använder 820 nm excitation ljus och samla utsläpp använder en 30-60 nm brett bandpass filtrera centrerad på 520 nm.
- Bild kollagen med 990 nm excitation ljus undvika eventuella excitation av elastin och andra autofluorescent proteiner och samla utsläpp med 10-30 nm brett bandpass filtrera centrerad vid 495 nm.
- Spara bildstaplar från varje kanal separat som TIFF-filer
8. bildanalys för extrahering av Elastin och kollagen volym densiteter med Ilastik
- Konvertera TIFF bildstaplar till HDF5 med Fiji28,35 genom att klicka Välj filen | Spara som... Hdf5.
- Skapa två data filmappar på datorhårddisk, en för elastin, en för kollagen bildstaplar, respektive. Kopiera relevanta bildstaplar till önskad mapp.
- Skapa två nya Ilastik projekt i programvaran Ilastik, en av elastin, en för kollagen, respektive.
- Öppna Ilastik | Skapa nytt projekt | pixel klassificering | nytt projekt | lägga till data och välj bild-mappen som skapades i steg 8,2.
Obs: Följ guiden Ilastik.
- Öppna Ilastik | Skapa nytt projekt | pixel klassificering | nytt projekt | lägga till data och välj bild-mappen som skapades i steg 8,2.
- Importera en 3D-bild stack för att utbilda programvaran.
- Markera indata applet | huvudarbetsytan område | Raw Data fliken | Lägg till ny... | Lägga till separata bilder och välja önskad bilddata
- Välj relevanta funktioner i programvaran.
- Öppna Funktionsurval applet | Välj funktionen som öppnar en ny dialogruta. Se figur 5A för detaljer.
- Lägga till minst två etiketter med knappen Lägg till etikett under utbildning appleten.
Obs: Varje etikett motsvarar en objekttyp som behöver skiljas åt. I detta arbete används tre etiketter för elastin: elastin själv, ljusa fläckar (ska uteslutas), och bakgrunden (ska uteslutas). - Rita etiketter ovanpå raw-bild stacken med den pensel som stylade anteckningsverktyg.
- Välj lämplig etikett: Klicka på penseln och börja rita.
- Snabb Ilastik att analysera bildstapel och leta efter liknande funktioner genom att klicka på Aktivera Live Update.
- Kontrollera noggrant prognos kartan (figur 5 d).
Obs: Processen från raw-bild till en fullständig prognos karta visas i figur 5. Ilastik använder prognos karta att segmentera bilden stack enligt vilken etikett en pixel är mer sannolikt att vara associerade (figur 5 d). - Tillämpa ett tröskelvärde.
- Välj tröskelvärde applet, välja en lämplig metod, ingångsetikett, slät, tröskel och storlek filterparametrar och slutligen klicka på Verkställ.
Obs: Detta segregerar likaså märkta delarna av bilden i diskreta objekt. Mycket anslutna vävnad, som elastin och kollagen behöver inte hållas åtskilda, tillämpas därför ett tröskelvärde på 0,4 (standard är 0,5). Figur 5E och 5F illustrerar resultatet av tillämpar en tröskel.
- Välj tröskelvärde applet, välja en lämplig metod, ingångsetikett, slät, tröskel och storlek filterparametrar och slutligen klicka på Verkställ.
- Upprepa utbildning av Ilastik tills resultatet är tillfredsställande (endast elastin, kollagen respektive redovisas för respektive analyser).
- Ofta växla mellan utbildningen och segmentering (och ibland också tröskelvärde) appletar under denna process. Ett exempel på effekten av omskolning Ilastik visas i figur 6.
- Batch analysera liknande bilddata: Välj batch förutsägelse Ingångsval och lägga till relevanta filer.
Obs: Ilastik utgång är en samling av 3D bildstaplar i pseudo - 1 bit (Bildmasker) med 0 (noll) som betecknar frånvaron av elastin (eller kollagen) och 1 (en) som betecknar närvaron härav (faktiska bitdjupet är 8-bitars). - Verifiera resultaten för varje bildstapel genom att visuellt jämföra Bildmasker och raw-bildfilerna.
- Optimera Ilastik masken (steg 8,4-8,9) och åter analysera eventuella bildstaplar med otillfredsställande resultat.
- Beräkna elastin och kollagen densitet volym från Ilastik Bildmasker med hjälp av MATLAB
- Öppna MATLAB.
- Välj mapp med ilastik Bildmasker i MATLAB ”nuvarande mapp” fönster.
- Kopiera skriptet MATLAB från kompletterande fil 1 till redigeraren för MATLAB och spara kod som volumeCalculator.m i MATLAB-mappen på datorhårddisk.
- Ange pixel storlekar och pixelhöjd i raderna skript
pixelSize = 0.1230000 * 0.1230000; % micron * micron
pixelHeight = 0,9; % micron - Spara skriptet.
- Gå till MATLAB kommandofönstret och ange ”volumeCalculator (' väg-till-data')” att ladda skriptet.
- Klicka på RETUR. Varje Bildmask är nu summeras och multipliceras volymen (kända) pixel/voxel (fysiska dimensioner en pixel multiplicerat med z-resolutionen). Utdata från MATLAB är den totala volymen av elastin och kollagen i varje bildstapel.
- Spara resultaten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den specialbyggda trycket myograph för avbildning som används i detta arbete visas i figur 1. Särskild uppmärksamhet för utformningen av myograph betalades till i) kammaren med en liten volym (2 mL) och ii) möjligheten för positionering av kanyler nära till, och parallellt med glas botten (figur 1B). I kammarens botten passar ett 50 × 24 mm #1.5 täckglas (utbytbara). Tryckregulator byggdes från en standard 1 L glasflaska och en blodtrycksmätare (manschetten tagits bort). För en myograph installation med flöde krav rekommenderas användning av en servo tryckregulator.
Figur 2 illustrerar de rekommenderade positionerna för att få inre bilder och bildstaplar under experimentet beskrivs i protokollet. I illustrationssyfte ingår en överföring ljusmikroskopi bild av monterade artär i figur 2A. Knut-till-Knut längden på den monterade artären är cirka 1,6 mm. Artären är skannas tills den bredaste diametern observeras (figur 2B), och vid denna punkt, den diameter och väggtjocklek är beslutsamt (figur 2 c). Likaså en överföring ljus bild av artär ingår i figur 2D, visar position och Rekommenderad bredd på bildstaplar för att bestämma microarchitectures av kollagen (figur 2E) och elastin (figur 2F, små torget i figur 2D) samt bildstaplar för bestämning av kollagen (figur 2 g) och elastin (figur 2 H) volym tätheter (större square, figur 2D). Använder denna metod, kan data för att konstruera diameter tryckkurvor, följt av beräkningen av de motsvarande spännings-töjningskurvor erhållas från trycket, diameter och vägg tjocklek mätningar (figur 2 c).
En enkel exponentiell passform av stress-anstränga relationen enligt Bloksgaard et al. 13 och hänvisningar häri, ger de β-värdet, ett geometri oberoende mått på väggen stelhet proportionell mot den inkrementella elasticitetsmodulen, Einc. Beräkna Einc på olika trycket på vilka bilder för kollagen och elastin erhölls microarchitectures, tillåter en direkt analys av förhållandet mellan de inducerade tryckförändringar i microarchitectures av kollagen och elastin och de inkrementella elasticitetsmodulen vid olika tryck (figur 3). Mätning av IEL förgrenade vinklar och kollagen rakhet illustreras i figur 4.
Viktigt för tolkningen av mekaniska data som jämför två eller flera grupper av intresse, t.ex. hypertensiva vs normotensiva patienter, är en bestämning av halten av elastin och kollagen. För detta utvecklades en automatisk analysmetod i Ilastik, en freeware bild analys programvara som kan tränas att känna igen vissa funktioner för bild. Arbete-flödet i Ilastik illustreras i figur 5.
För automatisk identifiering av elastin och kollagen för den volym täthet är det viktigt att det finns en bra signal-brus-förhållande i de bilder som erhållits. I mänskliga prover, är betydande autofluorescens från kollagen ofta observeras förutom kollagen SHG signalen. Detta minskar signal-brus-förhållandet för detektion av elastin. Figur 6 visar hur omskolning av programmet Ilastik kan resultera i bättre erkännande av tunn elastin fibrer i ett prov med betydande kollagen autofluorescens i den ”gröna” / elastin kanal. Om genomlysningseffekten autofluorescens signalen in i kollagen SHG kanal är ett problem, kan att erhålla SHG signalen med en längre excitation våglängd hjälpa. Om kanalen blöda igenom inträffar efter färgning med eosin, koncentrationen av tillämpad lösningen av eosin bör sänkas. Eosin tvättas enkelt ut, så upprepade tvättar av färgas provet kan minska signalen också.
Figur 1 . Specialbyggda trycket myograph för fluorescens imaging. (A) perfusion kammare med glas kapillärer bifogas micromanipulators, som är monterad på en kraftgivare (längsgående kraft). (B) 2 mL imaging kammare. 45° böjning av kanyler underlättar imaging använder ett inverterat Mikroskop. (C) tryckregulator. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 . Kombinerade trycket myography och fluorescens imaging strategi. (A) överföring ljus bild av artären med illustration av (B) skanning av hela bredden av artären. Kollagenet SHG visas i grönt och elastin autofluorescens i magenta. (C). arteriell lumen diameter (här 238 µm) och väggtjocklekar (här 17 och 18 µm topp och botten, respektive) bestäms vid ekvatorn regionen (största diameter observerades) av artären. (D) överföring ljus bild av artären med illustrationen av position i z-stackar som erhålls vid en 10-50 µm skala för att bestämma (E) kollagen rakhet, (F) förgrenade vinklar av de inre elastiska bladskivan och (G) z-stackar erhålls vid ett 50-100 µm skala för att erhålla kollagen och elastin (H) volym tätheter. Bilder B/C: höjd 300 µm (bar 20 µm), E/F: 50 x 50 µm (bar 10 µm), G/H 130 × 130 × 30 µm (bar = 30 µm). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 . Microstructural förändringar i adventitial kollagen och den interna elastisk lamina (IEL) och deras relation till de perifera inkrementell elastiska moduli på 20, 40 och 100 mmHg. (A) Branching vinklar elastin fibrer i IEL. (B) rakhet av adventitial kollagenfibrer nära den yttre elastiska lamina. p-värden och enligt F-värden bestämdes med hjälp av upprepade mätningar one-way ANOVA: p/F-values s: 0.0014/24.18, B: 0.0002/37.38. (C) IEL förgrening vinkel korrelerar nonlinearly med Einc. (D) kollagen rakhet korrelerar linjärt med Einc. Uppgifterna presenteras som menar ± SE. Microstructural förändringar (A och B och x-axes av C och D) bestämdes för 6 motstånd artärer utsätts för vitala imaging medan Einc (C och D) beräknades för 20 andra artärer som utsätts för påtryckningar myography i en standard Tryck myograph. Varje artär studerade var från en annan person. Denna siffra har ändrats från Bloksgaard et al. 13. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 4 . Illustration av mätningar av IEL förgrenade vinklar och kollagen rakhet i Fiji. (A) IEL förgrenade vinklar markeras manuellt och mätt med verktyget Fiji vinkel. (B) kollagen rakhet bestäms med hjälp av Fiji Neuron J plugin som förhållandet av end-to-end längd en enda kollagen fiber via en rak linje (vit) dividerat med faktiska slutpunkt till slutpunkt längden av fiber (orange). Bar storlek: 20 µm.
Figur 5 . Ilastik arbetsflöde. (A) funktionen urval fönster med indikeringen av valda funktioner. (B) exempel raw-bild med (C) etiketter för elastin fibrer, ljusa fläckar (oönskade) och bakgrunden markeras i rött, grönt och blått, respektive. (D) leder till prognos karta för bilden (B) med etiketter som anges i (C). (E) segmentering utifrån prognos karta i (D) innan (E) och efter (F) tillämpar ett tröskelvärde på 0,5. Gul färg visar de anslutna pixlar motsvarar funktionen segregerade (elastin). Bar storlek: 25 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 6 . Exempel bilder före och efter optimering av Ilastik prognos karta som visar effekten av omskolning Ilastik för erkännande av elastin fibrer i ett prov med hög bakgrund fluorescens från kollagen (optimal signal-brusförhållandet). (A) originalbilden, (B) resultatet av första Ilastik analysen, där särskilt tunn elastin fibrerna (vänster sida av bilden B) inte ingår i segmentering och (C) slutresultatet efter optimering av prognos karta. Bar storlek: 25 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Kompletterande fil Vänligen klicka här för att hämta den här filen
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta arbete representerar vårt förslag ett standardiserat, kombinerade imaging och trycket myography strategi, värdefullt för samtidig bedömning av de mekaniska egenskaperna hos motstånd artärer och tryck-relaterade förändringar i strukturen av arterial väggen över ett tryckområde från 0 till 100 mmHg. Den presenterade metoden utvecklades med hjälp av anpassade inbyggd utrustning, dock något tryck myograph som passar på en två-photon excitation fluorescens Mikroskop kan användas, när utformningen av både utrustning möjliggör avbildning av kärlväggen. Särskild uppmärksamhet bör ägnas form, bredd och arbetsavstånd av målet, och de villkor under vilka avbildning kommer att utföras. Upprätt Mikroskop kräver användning av vatten doppning mål, medan användningen av vatten nedsänkning mål rekommenderas för omvänt Mikroskop att undvika skillnader i refractive index mellan provet och målsättningen. Dessutom bör uppmärksammas täckglas tjockleken, antingen genom en korrigering för en obalans mellan målet och täckglas med korrigering kragen på målet (i förekommande fall) eller matchande täckglas tjockleken med målet används.
I protokollet beskrivs tas fördelen av låg energi, nära infrarött ljus för imaging elastin autofluorescens och kollagen SHG. Detta tillåter tänkbar för längre tidsperioder. I mänskliga motstånd artärerna används i denna studie, består IEL av ett longitudinellt justerad fiber-liknande nätverk av sammankopplade elastin fibrer13,33, liknar strukturen hos IEL av mänskliga subkutan motstånd artärerna (hSCA)38,39. Förändringar i förgrenade vinklar av elastin fibrerna i IEL utvärderades och används tillsammans med åtgärder av den gradvisa uncoiling adventitial kollagen fibrer med ökande trycket37 för att bedöma förändringar i mikroarkitekturen av elastin och kollagen respektive. Bilder för bedömning av elastin och kollagen microarchitectures erhölls på samma område av intresse i kärlväggen vid olika tryck. Detta tillåter upprepade-mätningar analyser. När det är möjligt kan utredaren syftar till att få bilder i minst 3 regioner av intresse, med bild storlek 10-50 µm i varje dimension. En kompromiss har dock beroende på provet, särskilt tjockleken i kärlväggen, göras mellan antalet skannade regioner av intresse och genomförbart varaktigheten av experimentet. Vid mänskliga perikardiell motstånd artärerna återstod artärer vid liv för minst 8-12 h experimenterande. Skanna flera regioner av intresse gör utvärdering av intra-kontra mellan prov variation och därmed stöder ingåendet av erhållna resultaten.
Det är viktigt att notera att för att undvika inducerande fototoxisk skador, bildåtergivning med hög effekt excitation ljus bör undvikas när man arbetar på levande vävnad exemplar. Mot bakgrund av detta, det rekommenderas att få de stora bildstaplar för kollagen och elastin volym tätheter i slutet av det experimentella protokollet, alternativt på fasta prover. När absolut kvantiteter av ECM komponenter krävs bör någon effekt av fixativ på volym densiteter kvantifieras och beaktas. Fixering och permeabilisering av artärerna tillåter dessutom färgning av intracellulära mål av intresse när det behövs. I detta protokoll utförs färgning för elastin med eosin på den levande artären. Färgning av elastin genom särskilda sonder (t.ex. alexa 633 maleinhydrazid40) och kollagen (t.ex. CNA3541), kan tillämpas tillsammans med andra fläckar (t.ex. phalloidin42) eller DNA, för att underlätta bedömningen med volymetrisk kapacitet och strukturella organisationen av andra strukturer av intresse i kärlväggen. Denna möjlighet kan ge forskningslaboratorier med singel-photon confocal Mikroskop en möjlighet att undersöka Mikrostrukturens förändringar i motstånd artärer. Segment från samma artär kan behandlas under olika förhållanden, fast under tryck och avbildas i ett senare skede att jämföra effekten av tillämpad behandling. Mål av intresse bör visualiseras av imaging åter kanylerade, nytt trycksatt och färgade fartygen. Re kanylering och förnyad trycksättning krävs när strukturella förändringar anses, elastin inte kan fastställas och därmed kommer rekyl och ändra 3D-strukturen för de fasta artär43,44. Nackdelen med att fastställa strukturförändringar i fasta artärer är att flera segment har fastställas för jämförelse och upprepade-mätning analyser kan inte utföras.
Data som erhållits med hjälp av imaging kan användas direkt att beräkna vägg stress och påfrestningar, och stödja förstå mekaniken i kärlväggen, som beskrivs i Bloksgaard, M. et al13. I detta arbete, en matematisk modell tillämpades för att karakterisera den inneboende styvheten av elastin och kollagen komponenter i kärlväggen och uppskatta de kollagen rekrytering stammar45,46 på grundval av beräknade stress stam relationer. Imaging stöds resultaten från matematisk modellering, att kollagenet i mänskliga motstånd artärer rekryterades redan vid låga omkretsriktningen stam och vägg stress. De kvantitativa åtgärderna av mikroarkitekturen av elastin och kollagen som beskrivs i detta protokoll kan vara ytterligare extended, inspirerad av det omfattande arbete som utförts på halspulsåder6,8,47, 48 , 49 och aorta7,9,10,50,51: ytterligare analyser kan omfatta bedömning av rumsliga fördelning och mikroarkitektur av kollagen och elastin fibrer inom de olika lagren av de kärlväggen samt fiber orientering vinklar (orientering med avseende på den längsgående axeln). Bell et al. 15 upp trycket inducerad omorganiseringen av IEL och adventitial kollagen inklusive en multi-layer analytisk modell för att beräkna stelhet och stress i varje lager i kärlväggen. Dessa författare15 används mänskliga subkutan motstånd artärer erhållits från friska frivilliga och relaterade struktur och vägg betonar på 3 och 30 mmHg, respektive.
Den föreslagna metoden i detta protokoll som förhoppningsvis motiverar ytterligare undersökningar och utveckling av microstructurally motiverade matematiska modeller för att förstå de mekaniska egenskaperna av mänskliga motstånd artärerna i hälsa och sjukdom. Med ytterligare ändringar av metoden att inkludera också kollagen och elastin orientering vinklar längs den längsgående axeln, smidig muskel cell volym densitet, rumslig fördelning och orientering i arteriell vägg, kollagen och elastin distribution och orientering i tunica media, och elastin organisation och distribution i tunica adventitia, tänkbar data kan mata fram utveckling av matematiska modeller, att underlätta förståelsen av den remodeling processen som hypertoni, diabetes och metabola syndromet. På samma sätt som föreslagits av Chen och Kassab för koronar mikrocirkulationen52,53, kan mikrostruktur-baserade modeller av mänskliga motstånd artärer ge förutsägelser av arteriell mekaniska svaren på makro-(hela artär) och micro-(structure) mekaniska nivåer för varje beståndsdel. Sådana modeller måste baseras på kvantitativa data av strukturella parametrar och mekaniska egenskaper hos enskilda lager och väljare i kärlväggen av artärerna med ursprung från både friska frivilliga och patienter som lider av olika sjukdomar, emot olika farmakologiska behandlingar. Data samlas på ett standardiserat sätt och jämförelse mellan individer med olika riskfaktor, sjukdom och behandling profiler. Metoden har potential att hjälpa förstå hur sjukdom och behandlingar påverkar mänskliga mikrocirkulationen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka danska molekylär medicinsk Imaging centrum vid fakulteten för naturvetenskap, Syddansk Universitet, för användning av laboratorier och Mikroskop. Kristoffer Rosenstand och Ulla Melchior är erkända för utmärkt teknisk hjälp med trycket myography och bildbehandling.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fine Science Tools | 15401-12 | ||
| Fine Science Tools | 11251-23 | ||
| Nikon | SMZ800N | ||
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | 761028 | for dissection purpose | |
| Vitrex Medical A/S, Herlev, Denmark | 1.63, 2.13, 210mm | ||
| Smiths medical Intl, UK | |||
| Ethicon | Ethilon 11-0 | ||
| Custom built | DK patent number 201200167, University of Southern Denmark, J. Schoubo V. Jensen, F. Jensen. T.R. Uhrenholt | ||
| Mettler toledo | |||
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | B3259 | ||
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | A7030 | ||
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | C5670 | ||
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | G7021 | ||
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | E3889 | ||
| Merck Millipore, Hellerup, Denmark | 1.00496.9010 | Phosphate buffered (pH 6.9) 4% formaldehyde solution | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | H3784 | ||
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | P9666 | ||
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | P5655 | ||
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | M2643 | ||
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | S2002 | ||
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | S5886 | ||
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | S5761 | ||
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | 1.06462 | ||
| Gibco, ThermoFisher Scientific | 10010015 | ||
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | PHR1423 | ||
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | Z370525 | ||
| Tocris Bioscience, Bristol, UK | 538944 | ||
| Nikon | Custom built | ||
| Spectra Physics, Mountain View, CA | |||
| Nikon | CFI Plan Apo IR SR 60XWI NA 1.27 | ||
| Nikon | CFI Plan Fluor 20XMI (multi-immersion) NA 0.75 | ||
| Hamamatsu, Ballerup, Denmark | H7422P-40 | ||
| AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany). | ChromaET 460 nm long pass dichroic | ||
| AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany). | Semrock FF01-520/35-25 BrightLine filter | ||
| AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany). | Chroma ET402/15X | ||
| Scotch TM | |||
| coverslip thickness should match used objective on microscope (#1 or #1.5), alternatively, set adjustment collar to match coverslip |
References
- Briones, A. M., Arribas, S. M., Salaices, M. Role of extracellular matrix in vascular remodeling of hypertension. Curr Opin Nephrol Hy. 19 (2), 187-194 (2010).
- Heagerty, A. M., Heerkens, E. H., Izzard, A. S. Small artery structure and function in hypertension. J Cell Mol Med. 14 (5), 1037-1043 (2010).
- van den Akker, J., Schoorl, M. J., Bakker, E. N., Vanbavel, E. Small artery remodeling: current concepts and questions. J Vasc Res. 47 (3), 183-202 (2010).
- Rizzoni, D., Agabiti-Rosei, E. Structural abnormalities of small resistance arteries in essential hypertension. Intern Emerg Med. 7 (3), 205-212 (2012).
- Schiffrin, E. L. Vascular remodeling in hypertension: mechanisms and treatment. Hypertension. 59 (2), 367-374 (2012).
- Fonck, E., et al. Effect of elastin degradation on carotid wall mechanics as assessed by a constituent-based biomechanical model. Am J Physiol-Heart C. 292 (6), H2754-H2763 (2007).
- Chow, M. J., Turcotte, R., Lin, C. P., Zhang, Y. Arterial extracellular matrix: a mechanobiological study of the contributions and interactions of elastin and collagen. Biophys J. 106 (12), 2684-2692 (2014).
- Chen, H., et al. Biaxial deformation of collagen and elastin fibers in coronary adventitia. J Appl Physiol (1985). 115 (11), 1683-1693 (2013).
- Schriefl, A. J., Schmidt, T., Balzani, D., Sommer, G., Holzapfel, G. A. Selective enzymatic removal of elastin and collagen from human abdominal aortas: uniaxial mechanical response and constitutive modeling. Acta Biomater. 17, 125-136 (2015).
- Zeinali-Davarani, S., Wang, Y., Chow, M. J., Turcotte, R., Zhang, Y. Contribution of collagen fiber undulation to regional biomechanical properties along porcine thoracic aorta. J Biomech Eng. 137 (5), 051001 (2015).
- Mattson, J. M., Turcotte, R., Zhang, Y. Glycosaminoglycans contribute to extracellular matrix fiber recruitment and arterial wall mechanics. Biomech Model Mechan. 16 (1), 213-225 (2017).
- Schriefl, A. J., Zeindlinger, G., Pierce, D. M., Regitnig, P., Holzapfel, G. A. Determination of the layer-specific distributed collagen fibre orientations in human thoracic and abdominal aortas and common iliac arteries. J R Soc Interface. 9 (71), 1275-1286 (2012).
- Bloksgaard, M., et al. Imaging and modeling of acute pressure-induced changes of collagen and elastin microarchitectures in pig and human resistance arteries. Am J Physiol-Heart C. , (2017).
- Dora, K. A., et al. Isolated Human Pulmonary Artery Structure and Function Pre- and Post-Cardiopulmonary Bypass Surgery. J Am Heart Assoc. 5 (2), (2016).
- Bell, J. S., et al. Microstructure and mechanics of human resistance arteries. Am J Physiol-Heart C. 311 (6), H1560-H1568 (2016).
- Roque, F. R., et al. Aerobic exercise reduces oxidative stress and improves vascular changes of small mesenteric and coronary arteries in hypertension. Brit J Pharmacol. 168 (3), 686-703 (2013).
- Briones, A. M., et al. Alterations in structure and mechanics of resistance arteries from ouabain-induced hypertensive rats. Am J Physiol-Heart C. 291 (1), H193-H201 (2006).
- Briones, A. M., et al. Role of elastin in spontaneously hypertensive rat small mesenteric artery remodelling. J Physiol. 552 (Pt 1), 185-195 (2003).
- Arribas, S. M., et al. Confocal myography for the study of hypertensive vascular remodelling. Clin Hemorheol Micro. 37 (1-2), 205-210 (2007).
- Gonzalez, J. M., et al. Postnatal alterations in elastic fiber organization precede resistance artery narrowing in SHR. Am J Physiol-Heart C. 291 (2), H804-H812 (2006).
- Spronck, B., Megens, R. T., Reesink, K. D., Delhaas, T. A method for three-dimensional quantification of vascular smooth muscle orientation: application in viable murine carotid arteries. Biomech Model Mechan. 15 (2), 419-432 (2015).
- Megens, R. T., et al. In vivo high-resolution structural imaging of large arteries in small rodents using two-photon laser scanning microscopy. J Biomed Opt. 15 (1), 011108 (2010).
- Megens, R. T., oude Egbrink, M. G., Merkx, M., Slaaf, D. W., van Zandvoort, M. A. Two-photon microscopy on vital carotid arteries: imaging the relationship between collagen and inflammatory cells in atherosclerotic plaques. J Biomed Opt. 13 (4), 044022 (2008).
- Bender, S. B., et al. Regional variation in arterial stiffening and dysfunction in Western diet-induced obesity. Am J Physiol-Heart C. 309 (4), H574-H582 (2015).
- Clifford, P. S., et al. Spatial distribution and mechanical function of elastin in resistance arteries: a role in bearing longitudinal stress. Arterioscler Thromb. 31 (12), 2889-2896 (2011).
- Martinez-Revelles, S., et al. Lysyl Oxidase Induces Vascular Oxidative Stress and Contributes to Arterial Stiffness and Abnormal Elastin Structure in Hypertension: Role of p38MAPK. Antioxid Redox Sign. 27 (7), 379-397 (2017).
- Foote, C. A., et al. Arterial Stiffening in Western Diet-Fed Mice Is Associated with Increased Vascular Elastin, Transforming Growth Factor-beta, and Plasma Neuraminidase. Front Physiol. 7, 285 (2016).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Sommer, C., Straehle, C., Kothe, U., Hamprecht, F. A. Ilastik: Interactive Learning and Segmentation Toolkit. 2011 8th Ieee International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro, , 230-233 (2011).
- Campagnola, P. J., et al. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophys J. 82 (1 Pt 1), 493-508 (2002).
- Intengan, H. D., Deng, L. Y., Li, J. S., Schiffrin, E. L. Mechanics and composition of human subcutaneous resistance arteries in essential hypertension. Hypertension. 33 (1 Pt 2), 569-574 (1999).
- Saatchi, S., et al. Three-dimensional microstructural changes in murine abdominal aortic aneurysms quantified using immunofluorescent array tomography. J Histochem Cytochem. 60 (2), 97-109 (2012).
- Bloksgaard, M., et al. Elastin Organization in Pig and Cardiovascular Disease Patients' Pericardial Resistance Arteries. J Vasc Res. 52 (1), 1-11 (2015).
- World Medical Association. World Medical Association Declaration of Helsinki: ethical principles for medical research involving human subjects. JAMA. 310 (20), 2191-2194 (2013).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry A. 58 (2), 167-176 (2004).
- Rezakhaniha, R., et al. Experimental investigation of collagen waviness and orientation in the arterial adventitia using confocal laser scanning microscopy. Biomech Model Mechan. 11 (3-4), 461-473 (2012).
- Green, E. M., Mansfield, J. C., Bell, J. S., Winlove, C. P. The structure and micromechanics of elastic tissue. Interface Focus. 4 (2), 20130058 (2014).
- Bell, J. S., et al. Microstructure and mechanics of human resistance arteries. Am J Physiol-Heart C. 311 (6), H1560-H1568 (2016).
- Shen, Z., Lu, Z., Chhatbar, P. Y., O'Herron, P., Kara, P. An artery-specific fluorescent dye for studying neurovascular coupling. Nat Methods. 9 (3), 273-276 (2012).
- Megens, R. T., et al. Imaging collagen in intact viable healthy and atherosclerotic arteries using fluorescently labeled CNA35 and two-photon laser scanning microscopy. Mol Imaging. 6 (4), 247-260 (2007).
- Staiculescu, M. C., et al. Prolonged vasoconstriction of resistance arteries involves vascular smooth muscle actin polymerization leading to inward remodelling. Cardiovasc Res. 98 (3), 428-436 (2013).
- Fung, Y. C., Sobin, S. S. The retained elasticity of elastin under fixation agents. J Biomech Eng. 103 (2), 121-122 (1981).
- Fung, Y. C. Biomechanics : mechanical properties of living tissues. , 2nd, Springer-Verlag. (1993).
- Bakker, E. N., et al. Heterogeneity in arterial remodeling among sublines of spontaneously hypertensive rats. PLoS One. 9 (9), e1107998 (2014).
- VanBavel, E., Siersma, P., Spaan, J. A. Elasticity of passive blood vessels: a new concept. Am J Physiol-Heart C. 285 (5), H1986-H2000 (2003).
- Chen, H., et al. Microstructural constitutive model of active coronary media. Biomaterials. 34 (31), 7575-7583 (2013).
- Saez, P., Garcia, A., Pena, E., Gasser, T. C., Martinez, M. A. Microstructural quantification of collagen fiber orientations and its integration in constitutive modeling of the porcine carotid artery. Acta Biomater. 33, 183-193 (2016).
- Bellini, C., Ferruzzi, J., Roccabianca, S., Di Martino, E. S., Humphrey, J. D. A microstructurally motivated model of arterial wall mechanics with mechanobiological implications. Ann Biomed Eng. 42 (3), 488-502 (2014).
- Schriefl, A. J., Wolinski, H., Regitnig, P., Kohlwein, S. D., Holzapfel, G. A. An automated approach for three-dimensional quantification of fibrillar structures in optically cleared soft biological tissues. J R Soc Interface. 10 (80), 20120760 (2013).
- Weisbecker, H., Unterberger, M. J., Holzapfel, G. A. Constitutive modelling of arteries considering fibre recruitment and three-dimensional fibre distribution. J R Soc Interface. 12 (105), 20150111 (2015).
- Chen, H., Kassab, G. S. Microstructure-based biomechanics of coronary arteries in health and disease. J Biomech. 49 (12), 2548-2559 (2016).
- Chen, H., Kassab, G. S. Microstructure-based constitutive model of coronary artery with active smooth muscle contraction. Sci Rep. 7 (1), 9339 (2017).
