Summary
Integrase الفيروسات التراجعية المؤتلف والحمض النووي ليغومرات محاكاة نهايات الحمض النووي الفيروسي يمكن أن تشكل مجمع نشطة انزيماتيكالي المعروف باسم إينتاسومي. ويمكن استخدام إينتاسوميس للدراسات الكيميائية الحيوية والهيكلية، والحركية. هذا البروتوكول تفاصيل كيفية تجميع وتنقية إينتاسوميس فيروس مزبد النموذج.
Abstract
أ تحديد الميزة وخطوة ضرورية لدورة حياة لفي هو دمج الجينوم الفيروسي في جينوم مضيف. ترميز كافة الفيروسات القهقرية إنزيم integrase (في) الذي يحفز التساهمية ضم الفيروسية للمضيف الحمض النووي، والذي يعرف باسم نقل حبلا. الاندماج قد يكون على غرار في المختبر مع المؤتلف في النسخ العكسي والحمض النووي ليغومرات محاكاة نهايات الجينوم الفيروسي. كي الخص رد فعل الاندماج التي تحدث في فيفو، تكامل أوثق مجمعات يتم تجميعها في المؤتلف وليغومرات الاصطناعية بالغسيل الكلوي في المخزن مؤقت انخفاض تركيز ملح. يمكن تنقية التكامل المعقدة، ودعا إينتاسومي، بحجم الاستبعاد اللوني. في حالة نموذج مزبد الفيروس (فف)، إينتاسومي تيترامير في وهما الحمض النووي ليغومرات وسهولة يفصل في موحودي والحرة أوليجومير الحمض النووي. قد جزيئي كفاءة التكامل إينتاسوميس فف تحت مجموعة متنوعة من الظروف التجريبية فهم أفضل لديناميات وآليات التكامل للفيروسات الرجعية.
Introduction
يتم دمج الجينوم الفيروسي في جينوم مضيف خطوة إلزامية في دورة الحياة لجميع الفيروسات القهقرية1. إينتيجراسي الإنزيم الفيروسي (في) يحفز التساهمية ضم كل نهاية لجينوم الحمض النووي الفيروسي إلى المضيف الحمض النووي. أثناء عدوى خلوية، في هو جزء من مجمع ما قبل الاندماج الذي يتوسط التكامل. في المؤتلف الرصاصية مع مزدوجة ليغومرات الحمض النووي الذين تقطعت بهم السبل محاكاة نهايات الحمض النووي الفيروسي يمكن أيضا تنفيذ الاندماج في الحمض النووي المستهدف في المختبر2. مشتركة تكامل فحص في المختبر يستخدم بلازميد سوبيركويليد كهدف الحمض النووي. التكامل بين كلا ليغومرات الحمض النووي الفيروسي (فدنا) بلازميد ينتج منتج خطي ويطلق على تكامل منسقة (الشكل 2A). إدماج التحليل في المختبر قد أيضا تعطي المنتجات مع واحد فقط فدنا تساهمي انضم إلى بلازميد المستهدفة الناتجة في دائرة استرخاء. يبدو أن هذا المنتج التكامل النصف-الموقع الحرفية للفحص في المختبر.
قد تؤدي في المؤتلف وفدنا التكامل في المختبر، لكنها ليست الكواشف مثالية لدراسة ديناميات أو هيكل المجمعات التكامل عند أحادي في أن يحجب المرئيات ذات الصلة. التكامل المنقي المجمعات، أو "إينتاسوميس"، مطلوبة من أجل دراسات تحليل أو هيكلية ديناميكية جزيء واحد. في فف وفدناس قد يتم تجميعها بالغسيل الكلوي من المخزن مؤقت تركيز ملح مرتفعة نسبيا إلى انخفاض تركيز ملح3،4. أثناء الغسيل الكلوي، متسرعا أشكال. تتم إزالة هذا متسرعا من الغسيل الكلوي وزيادة تركيز الملح. تركيز الملح العالي سولوبيليزيس إينتاسوميس فف تتضمن متعجل. ثم يتم تنقيته في إينتاسوميس بحجم الاستبعاد اللوني (ثانية). قد ثبت أولى المؤتلف فيروس مزبد (بفف) في الوجود مونومر في الحل بتركيزات تصل إلى 225 ميكرومتر5. تجزئة ثانية فعلياً يفصل بين إينتاسوميس فف (كاتشين 225.5)، الذي يتضمن تيترامير في فف وهما فدناس، فف أحادي في (44.4 كاتشين) والحر فدنا (24.0 كاتشين). إينتاسوميس بفف قد تكون مجمدة، والاحتفاظ بنشاط إدماج لمدة ستة أشهر على الأقل من التخزين في ˚C-80.
يمكن تعديل المؤتلف فف إينتاسوميس أيضا أن تدرج في استبدال الأحماض الأمينية أو الطفرات الاقتطاع أو فدناس المسمى مع4،فلوروفوريس أو البيوتين6. سهولة أداء إينتاسوميس فف المنقي إدماج هدفا سوبيركويليد بلازميد الحمض النووي في المختبر. معظم فحوصات البيوكيميائية التكامل مع إينتاسوميس قد اختبار الآثار في الطفرات في مثبطات أو المضافات الكيميائية الأخرى. يمكن استخدام إينتاسوميس بيوتينيلاتيد لتحقيق تقارب مع الأحماض النووية أو البروتينات. إينتاسوميس فف وظيفية في درجة حرارة الغرفة، مما يسمح للتحليل المجهري جزيء واحد بملاقط مغناطيسية لقياس الوقت بين الانضمام إلى طرفي فدنا أو الأسفار الانعكاس الداخلي الكلي لتصور البحث إينتاسومي على الهدف 6من الحمض النووي. وباﻹضافة إلى ذلك، كانت إينتاسوميس بفف تتميز أول هيكلياً تؤثر إلى حد كبير مجال التكامل النسخ العكسي3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-الصلب من فدنا
- الجمع بين 1 X عشرة المخزن المؤقت (الأسهم عشرة X 10: 100 مم تريس-HCl، pH 8.0، 1 م كلوريد الصوديوم، يدتا 10 ملم)، 10 ميكرومتر اليغو 1 (أتتجتكاتجاتتتجتاتاتجاجتجكجكككجاكاج 3 '5'، 100 ميكرومتر الأسهم)، و 10 ميكرون 2 اليغو (كتجتكججكجككاكتكاتاتاكاااتككاتجاكا 3 '5'، 100 ميكرومتر الأسهم) في وحدة تخزين نهائي 1.5 مل . اليكووت 25 ميليلتر في أنابيب التفاعل المتسلسل (PCR) 0.2 مل بوليميريز ستين.
ملاحظة: اعتماداً على التطبيق، قد يتم تعديل ليغومرات مع فلوروفوريس أو علامات نهاية 5 '-2 اليغو أو أمينية تي داخلية في القاعدة 13 من 5'-نهاية 1 اليغو. يجب تنقية ليغومرات معدلة من كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء ([هبلك]) قبل الصلب. وقد وجدنا أن 5 '-نهاية Cy3 أو Cy5 فلوروفوري وسم 2 اليغو يقلل كفاءة الجمعية إينتاسومي عشرة إضعاف. وسم فلوروفوري الداخلية لا تقلل من كفاءة الجمعية. - يصلب استخدام ثيرموسيكلير مع درجات الحرارة والأوقات التالية: 1 دورة في ˚C 94.0 مين 3 دورات 99 في (94.0 ˚C 1 دقيقة، 93.6 ˚C 1 دقيقة) خفض درجات الحرارة على حد سواء عن طريق ˚C 0.8 في كل دورة (الدورة الأخيرة هو ˚C 14.8 1 دقيقة، 14.4 ˚C 1 دقيقة) ، وتخزينها في 4.0 ˚C.
- الجمع بين ردود فعل قوية من جميع الأنابيب ستين. تحميل 500 ميليلتر إلى 0.5 مل 3 كاتشين الوزن الجزيئي استقطاع (موكو) تصفية أولتراسينتريفوجال تركيز وحدتين. تركز فدنا ملدنة بالطرد المركزي في ميكروسينتريفوجي في 14,000 س ز لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).
ملاحظة: يجب أن يكون حجم ريتينتاتي ~ 50 ميليلتر في كل وحدة التركيز. - تجاهل في التدفق من خلال. إضافة 250 ميليلتر من فدنا ملدنة المتبقية لكل وحدة التصفية. كرر تدور وتجاهل التدفق من خلال. المخزن المؤقت exchange في المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات (10 ملم تريس-HCl، pH 8.0، 1 مم يدتا) بالغسيل ثلاث مرات مع 450 ميليلتر TE.
- عكس وحدة التصفية وتدور في 1,000 س ز 2 دقيقة في الرايت ينبغي أن يكون حجم ريتينتاتي النهائي لكل وحدة تصفية ~ 50 ميليلتر. الجمع بين ريتينتاتيس ونقل إلى أنبوب ملولبة 1.5 مل.
- قياس امتصاص 260-نانومتر الأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) فدنا. استخدم هذه القيمة لحساب تركيز الحمض النووي المولى النهائي. معامل الانقراض (اليورو260) هذا فدنا سم 622,803-1 م-1 وهو الوزن الجزيئي 23,972 da. مخزن في ˚C-20.
2-إينتاسومي الجمعية
- إذا كان ذلك ممكناً، أداء الجمعية إينتاسومي في غرفة صغيرة مع الحرارة متغيرة. ضبط الحرارة إلى ما يقرب من 18-22 ˚C.
ملاحظة: في تجربتنا، إينتاسومي الجمعية العامة في 4 ˚C غير فعالة. - تحضير 1 لتر من المخزن المؤقت للغسيل الكلوي (20 مم البروبان مكررا-تريس، درجة الحموضة 7.5، 200 ملم كلوريد الصوديوم، ديثيوثريتول 2 مم (DTT)، 25 ميكرون زنكل2) في دورق 2 لتر مع شريط إثارة على طبق من إثارة. حجته المخزن المؤقت في الغرفة ˚C 18-22 على الأقل 6 ح.
- لتجميع إينتاسوميس، الجمع بين 50 مم مكررا-تريس البروبان ودرجة الحموضة 7.5، 500 ملم كلوريد الصوديوم، 120 ميكرومتر في فف و 50 ميكرون فدنا في إجمالي حجم 150 ميليلتر.
ملاحظة: يجب أن يكون "في فف" خالية من تلويث نوكلاس النشاط7،8. إذا كان التركيز في فف مخفف جداً لاستيعاب 120 ميكرومتر في 150 ميليلتر حجم، ثم أنه من الممكن زيادة حجم النهائي إلى 200 ميليلتر. العوامل الحاسمة لهذه الخطوة هي الحفاظ على النسبة في المولى إلى فدنا (2.4:1) وأن يكون مجمع ما يكفي لتصور خلال الفصل اللوني. - تنظيف قطعة طويلة ~ 10 سم من 6-8 ملم 10 كاتشين موكو أنابيب الغسيل الكلوي ومقاطع مع الماء المقطر مزدوجة (ddH2س)، أو أعلى نقاء المياه المتاحة. قصاصة واحدة من نهاية الأنبوب.
ملاحظة: يجب التعامل مع الرعاية لمنع أي تلوث ممكن من مساحة معمل أنابيب الغسيل الكلوي. - جعل 15 مل للغسيل الكلوي أنابيب شطف من المخزن المؤقت (50 مم مكررا-تريس البروبان، درجة الحموضة 7.5، 500 ملم كلوريد الصوديوم). شطف داخل أنابيب الغسيل الكلوي ثلاث مرات مع المخزن المؤقت شطف مل 1-2. إزالة قدر من المخزن المؤقت شطف قدر الإمكان مع ماصة وجل رقيقة تحميل تلميح.
- إذا لزم الأمر، استخدم شفرة حلاقة نظيفة أو مشرط لقطع أنابيب الغسيل الكلوي حيث أن تلميح تحميل جل رقيقة قد تصل إلى نهاية الأنبوب.
- نقل الجمعية إينتاسومي من الخطوة 2، 3 إلى أنابيب الغسيل الكلوي مع ماصة وهلام رقيقة تحميل تلميح. مقطع النهاية المفتوحة لأنابيب الغسيل الكلوي، تقليل كمية الهواء وعرض داخل الأنبوب. ضع الأنابيب في المخزن المؤقت للغسيل الكلوي.
- دياليزي بين عشية وضحاها (16-20 ح) مع التحريك اللطيف حيث أن الأنبوب بالتناوب ولكن ليس في دوامة. تأكد من أن أنابيب الغسيل الكلوي المغمورة والمتنقلة. بعد حوالي ساعة واحدة، التقيد ترسبات مرئية داخل الأنبوب.
ملاحظة: مع Cy3 أو Cy5 فلوريسسينتلي المسمى فدنا، متسرعا أكثر وضوحاً. وهذا صحيح بالنسبة لنهاية المسمى والمسمى داخليا فدنا نيون.
3-إينتاسومي سولوبيليزيشن
- إعداد اثنين واسعة تتحمل نصائح الماصة عن طريق إزالة 2-4 مم من نهاية طرف 200 ميليلتر بشفرة الحلاقة أو مشرط جديد على سطح نظيف.
ملاحظة: سيتم استخدام التلميحات في الخطوة 3-3 و 3.5. - إزالة أنابيب الغسيل الكلوي من المخزن المؤقت الغسيل الكلوي. للحيلولة دون إضعاف العينة إينتاسومي مع المخزن المؤقت لغسيل الكلي التي قد تبقى في نهاية الأنبوب قرب القصاصة، استخدام ميكروبيبيتي مع تلميح ماصة صغيرة لإزالة أي مخزن مؤقت الديال الزائدة. إزالة المقطع من واحدة من نهاية الأنبوب الغسيل الكلوي.
- استخدام مجموعة واسعة تتحمل نصيحة ماصة من الخطوة 3.1 لنقل العينة بما فيها ترسبات داخل أنابيب الغسيل الكلوي إلى أنبوب 1.5 مل على الجليد. علما بأن إجمالي حجم المواد المستردة؛ عادة ما يكون هو الحجم الإجمالي ميليلتر ~ 140.
- تكون العينة مع ترسبات في 200 ملم كلوريد الصوديوم؛ زيادة الملح بتركيز نهائي 320 مم كلوريد الصوديوم بإضافة حجم حلاً كلوريد الصوديوم 5 م الأوراق المالية المناسبة. على سبيل المثال، على عينة من 150 ميليلتر، إضافة ميليلتر 3.9 م 5 كلوريد الصوديوم و 1.1 ميليلتر ddH2س لوحدة تخزين نهائي من 155 ميليلتر. نقل الجليد دلو مع العينة في غرفة باردة 4 ˚C.
- استخدام مجموعة واسعة تتحمل نصيحة ماصة من الخطوة 3.1 ريسوسبيند وجعل متسرعا واسطة بيبيتينج. كرر كل 20 دقيقة على الأقل 1 حاء ملاحظة أن معظم متسرعا يجب أن تذهب إلى الحل.
ملاحظة: بيبيتينج إلى ريسوسبيند في ترسبات يمكن إيقاف عندما يتضح أن متسرعا شكل ملحوظ لم يعد خفض بين النقاط الزمنية. عندما لم يسمى فدنا أو يسمى داخليا، هو خفض ترسبات ~ 90% استناداً إلى الفحص البصري. في حالة انتهاء Cy5 المسمى فدنا، يتم تقليل متسرعا واسطة ~ 20% فقط؛ وسوف لا جعل معظم متسرعا مع نهاية فلوروفوري المسمى فدنا. مقدار ترسبات هو فعالية solubilized متغير ويجب أن تكون مصممة تجريبيا.
4. تنقية إينتاسومي
- تحضير 250 مل من حجم الاستبعاد اللوني (SEC) تشغيل المخزن المؤقت (البروبان 20 مم مكررا-تريس، درجة الحموضة 7.5، 320 مم كلوريد الصوديوم، والغليسيرول 10%). تصفية وحدة تصفية العقيمة المخزن المؤقت مع 0.2-ميكرومتر وتخزين في 4 ˚C.
ملاحظة: يتم تنفيذ جميع خطوات تنقية في غرفة باردة 4 ˚C. - حجته عمود cross-linked [اغروس] ثانية (قطرها = 10 مم؛ طول = 300 مم؛ وحجم السرير = 24 مل؛ وحجم العينة = 25-500 ميليلتر؛ والضغط الأقصى = 1.5 الآلام والكروب الذهنية؛ والحد من الاستبعاد = 4 × 107 دا؛ ويفصل بين الأوزان الجزيئية بين 5 و 5000 كاتشين، انظر "الجدول حصيرة" اريالس) مع المخزن المؤقت قيد التشغيل ثانية بمعدل تدفق 0.4 مل/دقيقة.
ملاحظة: قد تكييف هذا التنقية على أعمدة مختلفة الحجم الاستبعاد إذا كانوا قادرين على فصل كاتشين 300 فعالية من 44 كاتشين، مثل سبيروس 12 10/300 GL أو زيادة 6 سبيروس. وقد سبيروس 12 10/300 GL دقة أقل، مما يؤدي إلى تداخل أكثر من القمم. على العكس من ذلك، سبيروس 6 زيادة دقة أعلى ويوفر أفضل الانفصال. - الطرد المركزي عينة إينتاسومي في [ميكروفوج] في س 14,000 ز لمدة 10 دقيقة في ˚C 4 بيليه أي ترسبات المتبقية. بعناية إزالة المادة طافية. تحميل المادة طافية إلى حلقة حقن 200 ميليلتر (الأنابيب التي يمكن أن تعقد ~ 200 ميكروليتر). تطبيق النموذج على العمود ثانية.
ملاحظة: حجم تحميل أصغر تسمح القرار أكبر من ثانية - الوت مع 25 مل ثانية تشغيل المخزن المؤقت وجمع الكسور 95 من 270 ميليلتر. نلاحظ أن chromatogram ثانية يعرض ثلاثة ألف280&/A260 قمم (الشكل 1).
ملاحظة: يجب أن يكون الأول تجميع (~9.0-شطف مل 11.5)، تليها فف تيترامير إينتاسومي الذروة (~12.0-شطف مل 14.75) ومركب في فف مع ذروة فدنا الحرة (~15.0-مل 18.0).
5-إدماج حبلا نقل المقايسة، واختيار الكسر، والتخزين
- الجمع بين 2 ميليلتر لكل جزء ذروة إينتاسومي و 50 نانوغرام 3 كيلو بايت سوبيركويليد بلازميد الحمض النووي (تركيز المخزون 50 نانوغرام/ميليلتر) في رد فعل المخزن المؤقت (10 ملم مكررا-تريس البروبان، درجة الحموضة 7.5، 110 مم كلوريد الصوديوم، 5 مم MgSO4، 4 ميكرون زنكل2، 10 مم DTT) في وحدة تخزين رد نهائي من 15 ميليلتر. احتضان في ˚C 37 لمدة 5 دقائق.
- تضمين عنصر تحكم سلبية مع لا إينتاسومي فف المضافة. وقف رد الفعل مع 0.75 ميليلتر بروتيناز ك (حل الأسهم 20 ملغ/مل) والحزب الديمقراطي الصربي ميليلتر 0.75 (حل الأسهم 10%). احتضان في 55 ˚C 1 h. مخزن العينات حسب الحاجة في ˚C-20 لتحليلات لاحقة.
ملاحظة: هذا الفحص تقييم نوعي لنشاط الإدماج. لم يتم تحديد تركيز كل جزء مولى إينتاسومي قبل هذا الفحص. ويمكن تخزين الكسور المدرجة في التحليل نقل حبلا التكامل على الجليد (بما في ذلك التخزين بين عشية وضحاها) حتى التكامل هو تأكيد النشاط وأجزاء مختارة من اليكووتيد. هنا نستخدم pMP2، مشتقات pUC199. وقد استخدمنا أيضا بنجاح بكدنا بلازميد 5.4 kb 3.1. أي بلازميد قد يمكن حلها باسترخاء دائرة، والخطية، وأشكال سوبيركويليد قد تستعمل كهدف للتكامل. - إعداد وزن 1% 120 مل كل وحدة التخزين (w/v) [اغروس] هلام في المخزن "تاي س" 1 (40 مم تريس-خلات، 1 مم يدتا) مع 0.1 ميكروغرام/مل اثيديوم بروميد (أتبر، حل الأسهم 10 ملغ/مل)10. تذوب الحل [اغروس] وأنه صب في درج صب جل 15 سم × 10 سم. إدراج مشط 15-جيدا مع الآبار 5 مم سميكة واسعة، 0.75 ملم.
ملاحظة: الآبار أضيق تسفر عن قرار الفرقة أفضل مقارنة بالآبار سميكة 1.5 ملم. - السماح الهلام يصلب في درجة حرارة الغرفة. تزج الهلام في تاي س 1 مع 0.1 ميكروغرام/مل أتبر.
- إضافة 3 والغليسيرول 50% ميليلتر لكل رد فعل التكامل من الخطوة 5، 2. تحميل حجم رد فعل أسرة إلى الهلام. تحميل 1 ميليلتر 10 كيلو بايت الحمض النووي حجم علامة (150 نانوغرام/ميليلتر الأسهم تركيز) للممرات على جانبي العينات؛ وبعبارة أخرى، ينبغي أن الجناح علامة حجم الحمض النووي الحارات عينة.
- في لين خارجي، تحميل صبغ "برتقالي ز" ميليلتر 6 (0.25% البرتقال ز، والغليسيرول 30%). تشغيل الهلام في الجهد المستمر، 10 V/سم (100 V) في درجة حرارة الغرفة لح 1، أو حتى الجبهة صبغ "برتقالي ز" يصل إلى نهاية الهلام.
- فورا صورة [اغروس] هلام مع ماسح ضوئي فلورسنت للكشف عن أتبر (532 nm الإثارة، 610 تصفية الانبعاثات nm). إذا استخدمت فلوروفوري المسمى فدناس، أيضا صورة مع الإعدادات المناسبة فلوروفوري.
ملاحظة: على سبيل المثال، للكشف عن Cy5 المسمى الحمض النووي، والصورة باستخدام 633 نانومتر الإثارة وعوامل الانبعاث نانومتر 670. يجب تشغيل منتجات التكامل منسقة (CI، الحمض النووي الخطي) وفيا للحجم في ~ 3 كيلو بايت وبلازميد سوبيركويليد الممتص (SC) ينبغي تشغيل أسرع (~ 2 كيلو بايت) وتكامل الموقع نصف المنتجات (الجمعيتان، خففت دائرة الحمض النووي) ينبغي تشغيل أبطأ (~3.5 كيلو بايت). يجب تشغيل فدنا الممتص وفيا للحجم في ~ 40 شركة بريتيش بتروليوم. - التحديد الكمي للعصابات في كل حارة مع التصوير البرمجيات7. حساب الجزء من الحمض النووي في كل حارة CI، الجمعيتان، أو اتفاقية استكهولم؛ لا يتم تضمين فدنا في هذا الحساب.
ملاحظة: كفاءة التكامل، أو الجزء من اتفاقية استكهولم تحويلها إلى منتج خطي، تم حسابها بقسمة حجم بكسل من تكامل منسقة المنتجات (CI) بحجم بكسل مجموع ثلاثة نطاقات (الجمعيتان + CI + SC). أيضا إذا كان إينتاسوميس فلوروفوري المسمى، قد يكون quantitated المنتجات الجمعيتان و CI بالأسفار. - حدد الكسور التي تحتوي على نشاط الاندماج الأكثر متضافرة.
ملاحظة: في تجربتنا، يتزامن النشاط التكامل الذروة متضافرة مع ذروة بروتين اسمه تيتراميريك فف إينتاسوميس. قياس أ280 كل من هذه الكسور وحساب تركيز إينتاسومي النهائية. اليورو280 تيترامير نوع المتوحش في فف مع اثنين من فدناس الموصوفة هنا هو سم 908,339-1م-1 والوزن الجزيئي كاتشين 225.5. التركيزات ينبغي أن تتبع نفس النمط كذروة chromatogram ثانية، وفي تحليل نقل حبلا. - توزيع كل جزء في 5 ميليلتر مختبرين والمفاجئة تجميد في نيتروجين سائل. تخزين مختبرين في ˚C-80. الكسور المحددة للتخزين عادة ما بين 200-600 نانومتر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
إينتاسوميس فف يتم تجميعها في المؤتلف وفدنا. بعد التجميع، يتم تنقية إينتاسوميس قبل ثانية (الشكل 1). هو جزيئي نشاط الإدماج لكل جزء مع سوبيركويليد الحمض النووي الهدف و [اغروس] هلام التفريد (الشكل 2). هو تصوير هذا جل مع الماسح ضوئي فلورسنت للكشف عن أتبر (وفلوروفوري، إذا تم استخدام المسمى فلوروفوري فدنا). استخدام برنامج تحليل الصور، يمكن استخدام وحدات بكسل الفرقة لحساب كفاءة التكامل (الشكل 3). الكسور بتكامل أعلى من الكفاءة هي الأداة المجمدة لاستخدامها في وقت لاحق. الكسور المجمدة تحتفظ بإدماج النشاط (الشكل 4)، مما يسمح للتخزين على المدى الطويل من إينتاسوميس المجمعة. أي جزيء التسمية وموقعها داخل فدنا قد تؤثر على كفاءة الجمعية إينتاسومي (الشكل 5).
رقم 1: حجم الاستبعاد chromatogram. كان فصل من جمعية إينتاسومي فف مع عمود ثانية [اغروس]. ويتيح هذا العمود فصل الكلية (1)، فف إينتاسومي تتكون من تيترامير في فف وهما فدنا (2)، وأحادي فف في فدنا (3). إدراج هذا المثال فدنا مع تسمية فلوروفوري Cy5 داخلية الكشف عنها بواسطة 650 نانومتر الإثارة. المحور الصادي يدل على الكثافة البصرية (OD) في وحدات امتصاص المجلس الملي (ماو). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: تحليل التكامل من كسور ثانية. (أ) التخطيطي للتكامل حبلا نقل رد فعل. اليسار، والكرتون إينتاسومي فف بما في ذلك تيترامير من (الدوائر الزرقاء) وهما فدنا (خطوط سوداء سميكة)، وبلازميد مستهدفة (خطوط سوداء رقيقة). لا يتم رسمها سوبيركويلس (SC) من بلازميد المستهدفة. مركز, الكرتون منتج النصف-موقع تكامل (HSI) عند أحد فدنا وقد انضمت إلى تساهمي إلى بلازميد المستهدفة. رد فعل الانضمام يدخل نك ويرتاح سوبيركويلس. الحق، والرسوم متحركة نتاج تضافر التكامل (CI) حيث انضموا إلى الهدف الحمض النووي فدناس اثنين. ويؤدي هذا المنتج التكامل الحمض النووي خطي مع فدناس في النهايات. (ب) سوبيركويليد بلازميد الحمض النووي أضيفت إلى كل جزء ثانية #49-55. بعد الحضانة، ردود فعل التكامل ديبروتيناتيد ومفصولة 1% [اغروس] هلام التفريد المحتوية على أتبر. وكانت المراقبة السلبية بلازميد الحمض النووي مع لا بروتين (T). وتظهر علامات حجم الحمض النووي في كيلو بايت. يتم الإشارة إلى بلازميد سوبيركويليد (SC)، متضافرة التكامل المنتجات (CI)، وإدماج الموقع نصف المنتجات (HSI) وفدنا. (ج) [اغروس] هلام تم تفحصها بحثاً عن وجود Cy5. إلا فدنا CI والجمعيتان منتجات مرئية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: كوانتيتيشن لفحص التكامل. [اغروس] هلام من الشكل 2 تم مسحها ضوئياً وكمياً لوجود أتبر (A) و (ب) Cy5. (أ) لحساب أتبر، تم الحصول على وحدات بكسل الفرقة الجمعيتان، كاريتاس الدولية، واتفاقية استكهولم باستخدام برمجيات التحليل هلام. تم حساب الكفاءة التكامل بقسمة حجم بكسل من تكامل منسقة المنتجات (CI) بحجم بكسل مجموع كل ثلاثة نطاقات (الجمعيتان + CI + SC). على سبيل المثال، قيم بكسل في أتبر قناة لعصابات الكسر #49: 110565.2 اتفاقية استكهولم، 25152.56 CI والجمعيتان 6313.04. مجموع قيمة بكسل الحمض النووي للكسر #49 هو مجموع هذه القيم، 142030.8. كفاءة التكامل هو حجم بكسل CI 25152.56 مقسوماً على إجمالي قيمة الحمض النووي 142030.8 تساوي 0.18. (ب) Cy5 CI الفرقة وحدات بكسل هي رسوم بيانية كوحدات التعسفي. الكسور مع ذروة نشاط الإدماج منفردة الكوتيد والمجمدة. في هذا المثال، تم تحديد الكسور #50-53. مختبرين هي الأداة المجمدة بالنتروجين السائل وتخزينها في-80 ˚C لاستخدامها في المستقبل.
الشكل 4: تأثير تجميد نشاط إينتاسومي- وكان نصف كسر ثانية واحدة فلاش المجمدة بالنتروجين السائل، المخزنة في ˚C-80 ح 1 ومن ثم تحسنت ببطء على الجليد. النصف المتبقي من كسر ثانية الذي أبقى على الجليد في غرفة باردة بينما النصف الأول كان تجميد وإذابة. تم اختبار إينتاسوميس للنشاط دون (-) مع (+)، وتجميد/ذوبان الجليد. وتم قياس كفاءة التكامل كما هو موضح أعلاه. (أ) أتبر الملون [اغروس] هلام من نواتج التفاعل التكامل. يتم الإشارة إلى بلازميد سوبيركويليد (SC)، متضافرة تكامل المنتجات (CI) وتكامل الموقع نصف المنتجات (HSI) فدنا الممتص. وتظهر علامات حجم الحمض النووي في كيلو بايت. (ب) كوانتيتيشن كفاءة التكامل من الصورة أتبر. يتم وصف العمليات الحسابية في 3 الشكل وسيلة إيضاح. لا يكون هناك فقدان نشاط الإدماج بعد التجميد والذوبان. يتم إظهار كفاءة التكامل المتوسط للتجارب المستقلة 5 مع 2 إينتاسومي الاستعدادات. أشرطة الخطأ تشير إلى الانحراف المعياري. تحليل اختبار t المزدوجة أسفرت عن أ ف ثنائي الطرف = 0.011، مما يوحي بأن التجميد/ذوبان الجليد قد قليلاً وعززت النشاط التكامل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 5: تسمية الآثار الجزيء وموقف الجمعية إينتاسومي- وشملت جمعيات إينتاسومي فف فدناس التي كانت غير مسمى (أحمر)، ونهاية المسمى حول اليغو 2 مع Cy5 (الأزرق)، المسمى داخليا حول اليغو 1 مع Cy5 (أسود)، أو نهاية المسمى حول اليغو 2 مع البيوتين (برتقالي). وتم فصل كافة التجميعات مع عمود [اغروس] ثانية. المحور الصادي يدل OD في ماو. تشروماتوجرامس ممثل جمعيات مستقلة 2 على الأقل لكل نوع من أنواع إينتاسومي. نهاية الوسم يقلل عائد إينتاسوميس بفف مع Cy5 10 إضعاف والبيوتين 1.8-fold. تملك التجميعات نهاية Cy5 والبيوتين متسرعا ملحوظ أكثر المتبقية بعد ريسولوبيليزيشن الملح عالية (الخطوة 3، 5)، مما يؤدي إلى فقدان واضح من المواد في العمود حجم الاستبعاد. العلامات الداخلية من فدنا مع فلوروفوري Cy5 يؤدي إلى غلة متساوية من إينتاسوميس فدنا غير مسمى. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وظائف النسخ العكسي تشكل مولتيميريك معقدة مع الحمض النووي الفيروسي لتنفيذ التكامل ومواصلة دورة الحياة الفيروسية. قد يكون العدد في مونومرات كل إينتاسومي تيتراميرس أو أوكتاميرس، أو ربما أعلى ترتيب مولتيميرس11،12،،من1314. إينتاسوميس بفف هي تيترامير المؤتلف مع ليغومرات الحمض النووي المزدوج-الذين تقطعت بهم السبل التي تحاكي الحمض النووي الفيروسي وينتهي3. وقد استخدمت هذه إينتاسوميس في الدراسات الهيكلية والديناميكية3،5،،من1314.
جمعية إينتاسوميس فف يحدث أثناء الغسيل الكلوي من المخزن مؤقت تركيز ملح مرتفعة نسبيا إلى انخفاض تركيز ملح. هذه النتائج في تشكيل ترسبات الذي يشمل إينتاسوميس فف. يتم سولوبيليزيد في إينتاسوميس بزيادة تركيز الملح. في فف قد ثبت أن يكون أحادي بتركيزات تصل إلى 225 ميكرومتر5. المجمعات ثم تعزل من أحادي في والحرة فدنا بثانية وقد قمنا بتعديل تنقية إينتاسوميس فف تشمل والغليسيرول في المخزن المؤقت في الثانية6. يسمح إضافة الجلسرين إينتاسوميس فف ستجمد للاستخدام في المستقبل دون فقدان النشاط (الشكل 4).
وهناك العديد من الميزات الرئيسية لهذا البروتوكول. على الرغم من أن كثيرا ما تتم تنقية البروتين عند درجات حرارة منخفضة، وجدنا تجريبيا أن الجمعية إينتاسومي فف غير فعال في 4 ˚C. بدلاً من ذلك، يجب أن تحدث الغسيل الكلوي الجمعية في نطاق ˚C 18-22. كما أنه من المهم استخدام المؤتلف في فف خالية من تلويث نوكلاس البكتيرية7،8. أخيرا، أن نسبة في إلى فدنا عامل رئيسي للجمعية. في حالة البدء في تركيز البروتين أقل من الموصى به هنا، يجب إنقاصه تركيز فدنا نسبيا. في حين أنه من الممكن لتجميع إينتاسوميس بفف في تركيزات أقل، يجب أن تكون المجمعات في ارتفاع تركيز كاف للكشف أثناء فصل ثانية.
يمكن استخدام هذا الأسلوب فف إينتاسوميس مع فدنا غير مسمى أو مسماة. وقد وجدنا أن فدنا قد يكون المسمى كفاءة مع فلوروفوري أو البيوتين6. قد يكون من الممكن أيضا تسميات جزيء صغيرة أخرى. وفي حالة فلوروفوري Cy5، نجد ذلك المسمى فدنا يقلل عائد إينتاسوميس تجميعها مع تركيز الذروة خفضت 10 إضعاف. ومع ذلك، داخليا قد Cy5 المسمى فدنا غلة مكافئ إلى فدنا غير مسمى. يمكن أيضا استخدام هذا الأسلوب الجمعية مع الطفرات أو اقتطاع الطفرات في بفف4. نظراً لتحول دون في فف بذات الصلة سريرياً في نقل المخدرات مثبط (المؤسسة) استهداف "في" فيروس نقص المناعة البشرية-1 حبلا، فمن الممكن استخدام هذه إينتاسوميس فف لدراسة إليه إينستيس3. وبالإضافة إلى ذلك، تحدث بعض الطفرات المقاومة للمؤسسة في فيروس نقص المناعة البشرية-1 في المخلفات المصانة في فف، السماح للدراسات لمقاومة المخدرات مع المهندسة فف إينتاسوميس.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
أيد هذا العمل AI099854 المعاهد الوطنية للصحة، و AI126742 إلى المفتاح.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNA Oligomers | IDT | N/A | Custom DNA Oligos |
| Tris Ultra Pure | Gojira Fine Chemicals | UTS1003 | |
| NaCl | P212121 | RP-S23020 | |
| UltraPure EDTA | Invitrogen/Gibco | 15575 | |
| Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filters | Sigma-Aldrich | Z677094-24EA | 3 kDa MWCO |
| DTT | P212121 | SV-DTT | |
| BIS-TRIS propane,>=99.0% (titration) | Sigma-Aldrich | B6755-500G | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | 208086 | |
| MgSO4 | Amresco | 0662 | |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | G37-20 | |
| Gel-loading tips, 1 - 200 μL | Corning | CLS4853-400EA | |
| Razor blade; Single-edged; 100/Pk.; Pack of 100 | Fisher Scientific | 12-640 | |
| Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane > 250mL | Thermo Fisher Scientific | 568-0020 | |
| Dialysis tubing clips | Spectrum Labs | 132734 | |
| 6-8 kDa 10 mm Dialysis Tubing | Spectrum Medical | 132645 | |
| Superose 6 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | 17517201 | |
| Hi-Res Standard Agarose | AGTC Bioproducts | AG500D1 | |
| Ethidium bromide | Thermo Fisher Scientific | BP1302 | |
| Orange G | Fisher Scientific | 0-267 | |
| Hyladder 10kb, 500 lanes | Denville Scientific | CB4225-4 |
References
- Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. Retroviruses. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1997).
- Valkov, E., et al. Functional and structural characterization of the integrase from the prototype foamy virus. Nucleic Acids Res. 37 (1), 243-255 (2009).
- Hare, S., Gupta, S. S., Valkov, E., Engelman, A., Cherepanov, P. Retroviral intasome assembly and inhibition of DNA strand transfer. Nature. 464 (7286), 232-236 (2010).
- Li, M., Lin, S., Craigie, R. Outer domains of integrase within retroviral intasomes are dispensible for catalysis of DNA integration. Protein Sci. 25 (2), 472-478 (2016).
- Gupta, K., et al. Solution conformations of prototype foamy virus integrase and its stable synaptic complex with U5 viral DNA. Structure. 20 (11), 1918-1928 (2012).
- Jones, N. D., et al. Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration. Nat Commun. 7, 11409 (2016).
- Lopez, M. A., Mackler, R. M., Altman, M. P., Yoder, K. E. Detection and removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase. J Vis Exp. , (2017).
- Lopez, M. A., Mackler, R. M., Yoder, K. E. Removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase. J Virol Methods. 235, 134-138 (2016).
- Poirier, M. G., Bussiek, M., Langowski, J., Widom, J. Spontaneous access to DNA target sites in folded chromatin fibers. J Mol Biol. 379 (4), 772-786 (2008).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).
- Ballandras-Colas, A., et al. Cryo-EM reveals a novel octameric integrase structure for betaretroviral intasome function. Nature. 530 (7590), 358-361 (2016).
- Ballandras-Colas, A., et al. A supramolecular assembly mediates lentiviral DNA integration. Science. 355 (6320), 93-95 (2017).
- Passos, D. O., et al. Cryo-EM structures and atomic model of the HIV-1 strand transfer complex intasome. Science. 355 (6320), 89-92 (2017).
- Yin, Z., et al. Crystal structure of the Rous sarcoma virus intasome. Nature. 530 (7590), 362-366 (2016).
- Maertens, G. N., Hare, S., Cherepanov, P. The mechanism of retroviral integration from X-ray structures of its key intermediates. Nature. 468 (7321), 326-329 (2010).
- Maskell, D. P., et al. Structural basis for retroviral integration into nucleosomes. Nature. 523 (7560), 366-369 (2015).
