Summary
재조합 retroviral integrase와 바이러스 성 DNA 끝을 흉내 낸 DNA 올리고는 intasome로 알려진 복잡 한 효소 활성을 형성할 수 있다. Intasomes 생화학, 구조, 및 키네틱 연구에 대 한 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜에는 조립 및 프로토 타입 거품 바이러스 intasomes를 정화 하는 방법을 자세히 설명 합니다.
Abstract
A 기능 및 레트로 바이러스 라이프 사이클의 필요한 단계를 정의 하는 것은 주인 게놈으로 바이러스 성 게놈의 통합. 모든 레트로 바이러스는 호스트 DNA 가닥 전송으로 알려진 바이러스의 공유 결합 catalyzes integrase (IN) 효소를 인코딩합니다. 통합은 모델링 된 시험관에 재조합 retroviral in 되며 DNA 올리고 바이러스 성 게놈의 끝을 흉내 낸 수 있습니다. 더 밀접 하 게 통합 반응에서 발생 하 비보에, 통합을 정리 하기 위해 단지 감소 된 소금 농도 버퍼에서 투 석 하 여 재조합 및 합성 올리고에서 조립 된다. intasome 라는 통합 복잡 한, 크기 배제 크로마토그래피에 의해 순화 될 수 있습니다. 프로토 타입 거품 바이러스 (PFV)의 경우는 intasome에 tetramer 및 2 개의 DNA 올리고 이며 단위체에 무료 올리고 DNA 머에서 쉽게 분리 된다. PFV intasomes의 통합 효율성 다양 한 역학을 보다 잘 이해 하려면 실험 조건 및 retroviral 통합의 역학 분석 될 수 있습니다.
Introduction
호스트 게놈으로 바이러스 성 게놈의 통합 모든 레트로 바이러스1의 라이프 사이클에는 필수 단계입니다. 바이러스 성 효소 integrase (IN) catalyzes 호스트 DNA에 바이러스 성 DNA 게놈의 각 끝의 공유 결합. 세포 감염 동안에 통합을 중재 하는 사전 통합 복잡 한의 일부가입니다. 재조합에 더블 좌초 DNA 올리고 흉내 낸 바이러스 성 DNA 끝에 complexed는 대상 DNA 생체 외에서2에 통합을 수행할 수 있습니다. 일반적인 통합 분석 결과 생체 외에서 supercoiled 플라스 미드 DNA 대상으로 사용합니다. 플라스 미드를 모두 바이러스 성 DNA 올리고 (vDNA)의 통합 선형 제품 귀착되 고 공동된 통합 (그림 2A) 이라고 불린다. 통합 분석 결과 생체 외에서 covalently 편안한 원에서 결과 대상 플라스 미드에 참가 한 vDNA와 제품을 얻을 또한 수 있습니다. 이 반 사이트 통합 제품 분석 결과 체 외의 인 것 처럼 보인다.
재조합에 및 vDNA 통합에서 생체 외에서수행할 수 있습니다 하지만 그들은 역학의 연구 또는 통합 복합물의 구조에 대 한 이상적인 약 단위체에 관련 시각화 모호한 것 때. 순화 통합 복합물, 또는 "intasomes," 동적 단일 분자 분석 또는 구조 연구에 필요한 있습니다. PFV에 및 vDNAs 수 있습니다 조립 될 투 석 하 여 상대적으로 높은 소금 농도 버퍼에서 낮은 염 농도3,4. 투 석, 한 침전 동안 양식. 이 침전 물은 투 석에서 제거 되 고 소금 농도 증가. 더 높은 소금 농도 촉진 포함 PFV intasomes solubilizes. intasomes 다음 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 정화 된다. 재조합 프로토 타입 거품 바이러스 (PFV)에 225 µ M5농도에서 솔루션에 단위체로 존재 하기 위하여 보였다. 초 분류 (44.4 kDa) 단위체 PFV와 무료 vDNA (24.0 kDa)에서 효과적으로 tetramer PFV에 및 2 개의 vDNAs를 포함 하는 PFV intasomes (225.5 kDa)를 구분 합니다. PFV intasomes 냉동 수 있습니다 그리고-80 ˚C에 저장의 적어도 6 개월에 대 한 통합 활동을 유지 합니다.
재조합 PFV intasomes 아미노산 대체 또는 잘림 돌연변이 또는 fluorophores 또는 biotin4,6으로 표시 하는 vDNAs에 포함 하도록 수정할 수 있습니다. 순화 PFV intasomes는 쉽게 DNA에서 생체 외에서supercoiled 플라스 미드 대상으로 통합을 수행합니다. Intasomes과 대량 생 화 확 적인 통합 분석 돌연변이, 억제제, 또는 다른 화학 첨가제에의 효과 테스트할 수 있습니다. Biotinylated intasomes는 핵 산 또는 단백질 선호도 조사를 사용할 수 있습니다. PFV intasomes는 두 vDNA 끝 또는 목표에 intasome 검색을 시각화 하기 위해 총 내부 반사 형광의 가입 사이 시간을 측정 하려면 자기 핀셋에 의해 단일 분자 현미경 분석에 대 한 허용 주위 온도에 기능적 DNA6. 또한, PFV intasomes 구조적으로 먼저 retroviral 통합3분야에 크게 영향을 미치는 특징 이었다.
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Protocol
1. 어 닐 링 vDNA의
- 결합 1 X 10 버퍼 (10 X 10 재고: 100 mM Tris HCl, pH 8.0, 1 M NaCl, 10 mM EDTA), 10 µ M (5' 3' ATTGTCATGGAATTTTGTATATTGAGTGGCGCCCGAACAG, 100 µ M 재고), 올리고 1과 10 µ M 1.5 mL의 최종 볼륨에 올리고 2 (5' 3' CTGTTCGGGCGCCACTCAATATACAAAATTCCATGACA, 100 µ M 재고) . Aliquot 25 µ L 60 0.2 mL 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 튜브로.
참고: 응용 프로그램에 따라 올리고 fluorophores 또는 5'-끝에 올리고 2의 또는 태그 기본 13 5'-끝 올리고 1에서 내부 아미노 T으로 수정할 수 있습니다. 수정 된 올리고 어 닐 링 전에 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)에 의해 정화 한다. 우리는 intasome 어셈블리 효율을 10 배 감소 5'-끝 Cy3 또는 Cy5 fluorophore의 라벨 올리고 2 나타났습니다. 내부 fluorophore 라벨 어셈블리 효율을 감소 하지 않습니다. - 다음 시간과 온도 thermocycler를 사용 하 여 anneal: 1에서 99 주기 94.0 ˚C 3 분에 주기 (94.0 ˚C 1 분, 93.6 ˚C 1 분) 주기 당 0.8 ˚C 두 온도 감소 (마지막 주기는 14.8 ˚C 1 분, 14.4 ˚C 1 분) 4.0 ˚C에 저장 하 고.
- 모든 60 튜브에서 어 닐 링 반응 결합. 2 0.5 mL 3 kDa 분자량 컷오프 (MWCO) ultracentrifugal 필터 농도 단위 500 µ L을 로드 합니다. 실 온 (RT)에서 10 분 동안 14000 x g에서 microcentrifuge 원심 분리에 의해 단련 된 vDNA을 집중 한다.
참고: retentate 볼륨 각 농도 단위 µ L ~ 50 이어야 한다. - 삭제를 통해 흐름. 각 필터 단위를 나머지 단련된 vDNA의 250 µ L를 추가 합니다. 스핀을 반복 하 고 삭제를 통해 흐름. 450 µ L 테로 세 번 세척 하 여 테 버퍼 (10 mM Tris HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA)에 exchange를 버퍼링 합니다.
- 필터 장치 및 실시간에 2 분 동안 1000 x g에서 스핀 반전 각 필터 단위에 대 한 최종 retentate 볼륨 ~ 50 µ L. retentates과 1.5 mL 스크류 캡 튜브에 결합 해야 합니다.
- vDNA의 260 nm 자외선 (UV) 흡 광도 측정 합니다. 마지막 어 금 니 DNA 농도 계산 하기 위해이 값을 사용 합니다. 이 vDNA의 소멸 계수 (ε260) 622,803 c m-1 M-1 이며 그 분자량은-20 ˚C에 23,972 검사 저장소.
2. Intasome 어셈블리
- 가능 하면 변수 온도와 작은 방에 intasome 어셈블리를 수행 합니다. 약 18-22 ˚C를 온도 조정 합니다.
참고: 우리의 경험 4 ˚C에서 intasome 어셈블리 비효율적입니다. - 저 어 접시에 볶음 바 2 리터 비 커에 투 석 버퍼 (20 mM 두번째-트리 스 프로 판, pH 7.5, 200 m NaCl, 2 m m dithiothreitol (DTT), 25 µ M ZnCl2m)의 1 리터를 준비 합니다. 적어도 6 h에 대 한 18-22 ˚C 방에 버퍼 equilibrate
- intasomes를, 50 mM 두번째-트리 스 프로 판, pH 7.5, 500 mM NaCl, 120 µ M PFV에, 및 150 µ L의 전체 볼륨에 50 µ M vDNA 결합.
참고: PFV에 오염 nuclease 활동7,8의 무료 되어야 합니다. PFV에서 농도 경우 너무 희석 120 µ M에서 150 µ L 볼륨에 맞게 다음 200 µ L 최종 볼륨을 증가 하는 것이 가능 하다. 이 단계는 중요 한 요소는 vDNA (2.4:1) 하에서의 어 금 니 비율을 유지 하 고 충분 한 복잡 한 착 색 인쇄기는 동안 시각화 있습니다. - 10 m m 6-8 kDa MWCO 투 석 튜브와 두 배 증류수 (ddH2O), 또는 높은 순도 물을 사용할 수 있는 클립의 ~ 10 cm 긴 조각을 청소. 튜브의 한쪽 끝을 클립.
참고: 투 석 배관 주의 실험실 공간에서 어떤 가능한 오염 든 지 방지 하기 위해 처리 되어야 합니다. - 투 석 배관 린스 버퍼 (50mm 두번째-트리 스 프로 판, pH 7.5, 500 mM NaCl)의 15 mL를 확인 합니다. 1-2 mL 린스 버퍼와 3 번 투 석 튜브의 내부를 헹 굴. 피 펫과 얇은 젤 팁 로드 가능한 린스 버퍼의 제거.
- 필요한 경우 사용 하 여 깨끗 한 면도날 또는 메스 얇은 젤 로드 팁 튜브의 끝에 도달할 수 있도록 투 석 튜브를 잘라.
- 피 펫 및 얇은 젤 팁 로드 투 석 튜브에 2.3 단계에서 intasome 어셈블리를 전송. 투 석 배관, 튜브 내에서 도입 하는 공기의 양을 최소화의 오픈 엔드 클립. 투 석 버퍼 튜브를 놓습니다.
- Dialyze 부드러운 교 반 튜브 회전 하지만 소용돌이와 하룻밤 (16-20 h). 투 석 배관 침수 및 모바일 인지 확인 합니다. 약 1 시간 후 튜브 안에 보이는 침전을 관찰 합니다.
참고: Cy3와 Cy5 붙일 표시 vDNA 침전 더 분명 하다. 이것은 끝 표시와 내부적으로 레이블이 형광 vDNA 마찬가지입니다.
3. Intasome 가용 화
- 2 준비 넓은 깨끗 한 표면에 새로운 메스 또는 면도칼 블레이드와 2-4 m m 200 µ L 팁의 끝에서 제거 하 여 피 펫 팁을 낳았다.
참고: 도움말 3.3-3.5 단계에서 사용 됩니다. - 투 석 버퍼에서 투 석 튜브를 제거 합니다. 클립 근처 튜빙의 끝에 남아 있을 수 있습니다 투 버퍼 intasome 샘플의 희석을 방지 하기 위해 작은 피 펫 팁는 micropipette을 사용 하 여 모든 초과 투 버퍼를 제거 하. 투 석 튜브의 한쪽 끝에서 클립을 제거 합니다.
- 사용 넓은 얼음에 1.5 mL 튜브에 투 석 배관 내부 침전 물의 포함 하 여 샘플을 전송 하려면 3.1 단계에서 피 펫 팁을 낳았다. 참고 복구 된 자료;의 총 볼륨 총 볼륨은 일반적으로 ~ 140 µ L.
- 침전 된 샘플은 200 m m NaCl; 320 mM NaCl의 최종 농도에 소금 재고 5 M NaCl 솔루션의 적절 한 볼륨을 추가 하 여 증가. 예를 들어 150 µ L의 샘플을 추가 3.9 µ L 5 M NaCl과 1.1 µ L ddH2O 155 µ L. 전송 얼음 양동이와 마지막 볼륨에 대 한 샘플 4 ˚C 찬 방으로.
- 사용 넓은 단계 resuspend를 pipetting으로 침전을 solubilize 3.1에서에서 피 펫 팁을 낳았다. 적어도 1 h. 침전의 대부분 솔루션에가 서 관찰에 대 한 모든 20 분을 반복 합니다.
참고: resuspend 침전에 Pipetting 수 중지 때 명백한 침전 시간 점 사이 더 이상 눈에 띄게 감소. VDNA는 레이블이 또는 내부적으로 분류 때 침전 육안 검사에 따라 ~ 90%로 감소 된다. Cy5 끝 vDNA를 표시, 경우 침전 감소만 ~ 20%; vDNA 라는 fluorophore 엔드와 침전의 대부분 solubilize 하지 것 이다. 효과적으로 solubilized 침전의 양 변수 이며, 실험적으로 결정 되어야 합니다.
4. Intasome 정화
- 버퍼 (20 mM 두번째-트리 스 프로 판, pH 7.5, 320 mM NaCl, 10% 글리세롤)를 실행 하는 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)의 250 mL를 준비 합니다. 살 균 필터 버퍼 0.2 µ m와 단위 필터와 4 ˚C에 저장 합니다.
참고: 모든 정화 단계 4 ˚C 차가운 방에 수행 됩니다. - 복사해올된 agarose 초 열 equilibrate (직경 = 10 밀리미터; 길이 = 300 mm; 볼륨 침대 24 mL =; 샘플 량 = 25-500 µ L, 최대 압력 = 1.5 MPa; 제외 제한 = 4 x 107 다; 분자 무게 분리 5, 5000 kDa 사이의 참조 테이블 매트 erials) 0.4 mL/min의 유량에서 초 실행 버퍼.
참고:이 정화 그들이 효과적으로 Superose 12 10/300 GL 또는 Superose 6 증가 등 44 kDa에서 300 kDa 분리 수 있다면 다른 크기 제외 열에 적응 시킬 수 있습니다. Superose 12 10/300 GL는 낮은 해상도, 봉우리의 더 많은 중복을 선도. 반대로, Superose 6 증가 높은 해상도 하 고 더 나은 분리를 제공 합니다. - 펠 렛의 모든 나머지 침전을 4 ˚C에서 10 분 동안 14000 x g에서 microfuge에서 intasome 샘플 원심 조심 스럽게 제거는 상쾌한. 200 µ L 주입 루프 (~ 200 μ를 저장할 수 있는 튜브) 상쾌한을 로드 합니다. SEC 열에 샘플을 적용 됩니다.
참고: 작은 로드 볼륨 수 초에 의해 더 큰 해상도 - 25 mL 초 실행 버퍼 및 수집 270 µ L. 95 분수와 함께 elute 관찰 SEC 크로마 세 A280/A260 봉우리 (그림 1)를 표시 합니다.
참고: 첫 번째 집계 (~9.0-11.5 mL 차입), PFV tetramer intasome 피크 (~12.0-14.75 mL 차입) 및 무료 vDNA 피크 (~15.0-18.0 mL)와 모노 머 PFV에 이어야 한다.
5. 통합 가닥 전송 분석 결과, 분수 선택 및 저장
- 각 intasome 피크 분수 및 50의 2 µ L 결합 ng 3 kb supercoiled 플라스 미드 DNA (재고 농도 50 ng / µ L) 15 µ L의 최종 반응 볼륨에서 반응 버퍼 (10 mM tris 두번째 프로 판, pH 7.5, 110 m NaCl, 5mm MgSO4, 4 µ M ZnCl2, 10 m DTT m m)에. 5 분 동안 37 ˚C에서 품 어.
- 아니 추가 PFV intasome와 부정적인 컨트롤을 포함 합니다. (20 mg/mL 재고 솔루션) 0.75 µ L 성분 K와 반응 및 0.75 µ L SDS 중지 (10% 주식 솔루션). 1 헤 게 샘플 나중 분석-20 ˚C에서 필요에 따라 55 ˚C에서 품 어.
참고:이 분석 결과 통합 활동의 질적 평가. 각 분수의 intasome 어 금 니 농도이 분석 결과 이전 결정 되지 않습니다. 분수 통합 가닥 전송 분석 결과에 포함 되어 저장 될 수 있다 통합까지 (를 포함 하 여 하룻밤 저장) 얼음에 활동은 확인 되 고 선택한 분수는 aliquoted. 여기 우리는 pMP2, pUC19 파생9를 사용합니다. 우리는 또한 성공적으로 5.4 kb 플라스 미드 pcDNA 3.1을 사용 했습니다. 으로 확인 될 수 있는 모든 플라스 미드 원형, 선형, 편안 하 고 supercoiled 형태의 통합을 위한 대상으로 사용할 수 있습니다. - 1의 X 태 버퍼 (40 m m 트리 아세테이트, 1 mM EDTA) 0.1 μ g/mL ethidium 평범한 사람 (EtBr, 10 mg/mL 재고 솔루션)10에서 볼륨 (w/v) agarose 젤 당 120 mL 1% 무게를 준비 합니다. Agarose 솔루션을 용 해 하 고 15 cm x 10 cm 젤 캐스팅 쟁반에 부 어. 5 밀리미터 넓은, 0.75 m m 두께 웰 스도 15 잘 빗을 삽입 합니다.
참고: 좁은 우물 1.5 m m 두꺼운 우물에 비해 더 나은 밴드 해상도 얻을. - 허용 주위 온도에서 응고 하 젤. 0.1 μ g/mL EtBr로 1 X 태에서 젤 담가.
- 5.2 단계에서 각 통합 반응 3 µ L 50% 글리세롤을 추가 합니다. 전체 반응 볼륨 젤을 로드 합니다. 마커의 10 kb DNA 크기 (150 ng / µ L 재고 농도); 샘플의 양쪽에 차선 1 µ L 로드 즉, DNA 크기 마커 샘플 레인 측면 해야 합니다.
- 외부 레인에서 6 µ L 오렌지 G 염료 (0.25% 오렌지 G, 30% 글리세롤)을 로드 합니다. 정 전압, 1 시간, 또는 오렌지 G 염료 전면 젤의 끝에 도달할 때까지 주위 온도에 10 V/cm (100 V)에서 젤을 실행 합니다.
- 바로 형광 스캐너 (532 nm 여기, 610 nm 방출 필터) EtBr을 감지로 설정 agarose 젤 이미지. Fluorophore vDNAs 라는 사용 된 경우 또한 해당 fluorophore 설정으로 이미지.
참고: 예를 들어 감지 Cy5 DNA, 633 nm 여기 및 670 nm 방출 필터를 사용 하 여 이미지 표시. 공동된 통합 제품 (CI, 선형 DNA) ~ 3 kb 크기 true로 실행 한다, unreacted supercoiled 플라스 미드 (SC) 빠른 (~ 2 kb), 실행 해야 하 고 반 사이트 통합 제품 (HSI, 편안한 원형 DNA) 느린 (~3.5 kb)를 실행 해야 합니다. Unreacted vDNA ~ 40 크기 true로 실행 해야 혈압. - 이미징 소프트웨어7각 레인에서 밴드를 계량. CI, HSI, 또는 SC; 각 레인에 DNA의 분수를 계산 vDNA이이 계산에 포함 되지 않습니다.
참고: 통합 효율성, 또는 선형 제품으로 변환 하는 SC의 분수 3 밴드 (HSI + CI + SC)의 총 픽셀 볼륨에 의해 공동된 통합 제품 (CI)의 픽셀 볼륨을 나누어 계산 했다. Intasomes 라는 fluorophore 있다면, HSI와 CI 제품 형광으로 quantitated 또한 수 있습니다. - 가장 공동 통합 활동 분수를 선택 합니다.
참고: 우리의 경험에서 공동으로 행 한 피크 통합 활동 tetrameric PFV intasomes로 식별 단백질 피크와 일치 합니다. 이 분수의 각각의 A280 을 측정 하 고 최종 intasome 농도 계산. Ε280 의 야생 PFV에 여기에 설명 된 두 개의 vDNAs tetramer에 대 한 908,339 c m-1M-1 이며 분자 무게는 225.5 kDa. 농도 SEC 크로마 피크로 가닥 전송 분석 결과에 같은 패턴을 따라야 한다. - 5 µ L aliquots 각 분수를 배포 하 고 스냅 액체 질소에서 동결. Aliquots-80 ˚C에 저장 합니다. 저장을 위해 선택 하는 분수는 일반적으로 200-600 nM 사이.
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Representative Results
PFV intasomes 재조합 및 vDNA에서 조립 된다. 조립 후 intasomes 초 (그림 1)에 의해 정화 된다. 각 분수의 통합 활동을 supercoiled DNA 대상과 agarose 젤 전기 이동 법 (그림 2)와 분석 이다. 이 젤은 감지 EtBr (fluorophore, fluorophore 표시 vDNA 사용 하는 경우)로 설정 하는 형광 스캐너와 몇 군데. 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여, 밴드 픽셀 볼륨 통합 효율성 (그림 3)를 계산 하기 위해 사용할 수 있습니다. 높은 통합 효율성과 분수는 나중에 사용에 대 한 고정 스냅. 냉동된 분수 통합 활동 (그림 4), 조립된 intasomes의 장기 저장에 대 한 수 있도록 유지 합니다. 어떤 레이블 분자와는 vDNA 내의 그것의 위치 intasome 어셈블리 효율 (그림 5) 영향을 미칠 수 있습니다.
그림 1: 크기 배제 크로마. PFV intasome 어셈블리는 agarose 초 열으로 분리 되었다. 이 열은 집계 (1), PFV에 및 2 vDNA (2), 및 vDNA (3) 단위체 PFV에 tetramer 구성 된 PFV intasome의 분리에 대 한 수 있습니다. 이 예제에서는 650 nm 여기에서 검색 하는 내부 Cy5 fluorophore 레이블 vDNA 포함. Y 밀리-흡 광도 단위 (mAU) 광학 밀도를 (OD)를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 통합 분석 결과 초 분수의. 통합 물가 이동 반응의 (A) 회로도 왼쪽, PFV intasome (파란색 동그라미)에서 tetramer, 대상 플라스 미드 (검은 선)와 두 개의 vDNA (두꺼운 검은 줄), 등의 만화. 대상 플라스 미드의 supercoils (SC) 하지 그려집니다. 센터, 한 vDNA는 covalently 대상 플라스 미드에 조인 하는 때 반 사이트 통합 (HSI) 제품의 만화. 합류 반응 별명을 소개 하 고는 supercoils를 완화. 오른쪽, 표적 DNA에 합류 했습니다 두 vDNAs 공동된 통합 (CI) 제품의 만화. 이 통합 제품 끝에 vDNAs와 선형 DNA에서 발생합니다. (B) Supercoiled 플라스 미드 DNA 각 초 분수 #49-55에 추가 되었습니다. 부 화, 다음 통합 반응 deproteinated 그리고 1 %agarose 젤 전기 이동 법 EtBr을 포함 하 여 분리. 부정적인 통제가 했다 아무 단백질 (T)와 플라스 미드 DNA. DNA 크기 마커 kb에서 같습니다. Supercoiled 플라스 미드 (SC), 협정 된 통합 제품 (CI), 하프-사이트 통합 제품 (HSI), 및 vDNA가 표시 됩니다. (C)는 agarose 젤 Cy5의 존재에 대 한 검색 했다. VDNA, CI, 및 HSI 제품 볼 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 통합 분석 결과의 정량. 그림 2 에서 agarose 젤 스캔 되었고 (A) EtBr와 Cy5 (B)의 존재에 대 한 계량. (A) EtBr 계산에 대 한 HSI, CI, 및 사우스 캐롤라이나 밴드 픽셀 볼륨 젤 분석 소프트웨어를 사용 하 여 얻은 했다. 통합 효율성의 모든 3 밴드 (HSI + CI + SC) 총 픽셀 볼륨에 의해 공동된 통합 제품 (CI)의 픽셀 볼륨을 나누어 계산 됩니다. 예를 들어는 EtBr에 픽셀 값 분수 # 49의 밴드에 대 한 채널: 110565.2 SC, 25152.56 CI, 및 6313.04 HSI. 분수 # 49에 대 한 총 DNA 픽셀 값은 142030.8,이 값의 합계입니다. 통합 효율 25152.56 총 DNA 값 142030.8 0.18 인으로 나눈 CI 픽셀 볼륨입니다. (B) Cy5 CI 밴드 픽셀 볼륨 임의의 단위로 그래프로. 피크 통합 활동 분수는 개별적으로 aliquoted 냉동. 이 예제에서는 분수 #50-53 선정 됐다. Aliquots는 액체 질소로 냉동 고 나중에 사용-80 ˚C에 저장 된 스냅인.
그림 4: intasome 활동에 동결의 효과. 1 초 분수의 절반은 액체 질소, 1 h-80 ˚C에 저장 하 고 천천히 얼음 해 동 냉동 플래시. 나머지는 초 분수의 절반은 상반기 동결 해 동 동안 추운 방에 얼음에 유지 되었다. Intasomes (-) 없이 활동에 대 한 테스트와 (+) 동결/녹고. 위에서 설명한 대로 통합 효율성 측정 했다. (A) EtBr 통합 반응 제품의 agarose 젤 스테인드. Supercoiled 플라스 미드 (SC), 협정 된 통합 제품 (CI), 하프-사이트 통합 제품 (HSI), 및 unreacted vDNA 표시 됩니다. DNA 크기 마커 kb에서 같습니다. (B) EtBr 이미지에서 통합 효율의 정량. 계산 그림 3 전설에 설명 되어 있습니다. 다음 중지 및 재개 하는 통합 활동의 손실이입니다. 평균 통합 효율성 2 intasome 준비 5 독립적인 실험에 대 한 표시 됩니다. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 쌍체 t-검정 분석 나왔고 양측 P = 0.011, 그 동결/동결 해제 수 있습니다 약간 향상 통합 활동 제안. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 라벨 분자와 위치 영향 intasome 어셈블리. PFV intasome 어셈블리 포함 레이블된 (빨간색), 올리고 2 Cy5 (파란색), 내부에 레이블이 Cy5 올리고 1 (검정)에 표시 끝 또는 끝 biotin (주황색)으로 올리고 2에 표시 했다 vDNAs. 모든 어셈블리는 agarose 초 열으로 분리 되었다. Y는 mAU에서 OD를 나타냅니다. Chromatograms는 각 intasome 타입의 2 독립적인 어셈블리의 대표. 10 배와 Cy5 PFV intasomes의 수확량을 감소 시킨다 끝 라벨 및 biotin 1.8-fold. 끝 Cy5 및 biotin 어셈블리 크기 제외 열에 물자의 명백한 손실 결과로, 높은 소금 resolubilization (3.5 단계) 후 남은 눈에 띄게 더 침전 하는. 내부 라벨 Cy5 fluorophore와 vDNA의 intasomes의 동등한 수확량 레이블이 없는 vDNA로 연결 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
Retroviral 기능 통합을 수행 하 고 바이러스 성 수명 주기를 계속 하는 바이러스 성 게놈 DNA와 복잡 한 multimeric를 형성 한다. Intasome 당 단위체에의 수는 tetramers, octamers, 또는 가능 하 게 더 높은 순서 multimers11,12,,1314수 있습니다. PFV intasomes는 모방 하는 바이러스 성 게놈 DNA 이중 가닥 DNA 올리고도 재조합 tetramer 종료3. 이러한 intasomes 구조와 동적 연구3,5,13,14에서 사용 되었습니다.
PFV intasomes의 어셈블리 낮은 소금 농도에 상대적으로 높은 소금 농도 버퍼에서 투 석 하는 동안 발생합니다. PFV intasomes를 포함 하는 침전의 형성 결과. intasomes 소금 농도 증가 시켜 solubilized는. PFV에 225 µ M5농도에서 단위체 되도록 표시 되었습니다. 복합물에 단위체에서 고립 그리고 초에서 vDNA를 무료 우리 초 버퍼6글리세롤을 포함 하도록 PFV intasomes의 정화를 수정 했습니다. 글리세롤의 활동 (그림 4)의 손실 없이 나중에 사용에 대 한 동결 수를 PFV intasomes를 수 있습니다.
이 프로토콜의 몇 가지 주요 기능을 확인 하 고 있습니다. 단백질 정화는 종종 낮은 온도에서 수행 됩니다, 하지만 우리는 발견 실험적으로 PFV intasome 어셈블리 4 ˚C에서 효율적입니다. 대신, 어셈블리 투 18-22 ˚C의 범위에서 발생 한다. 그것은 또한 재조합 하 오염 세균 nuclease7,8의 PFV에 사용 하는 것이 중요. 마지막으로, vDNA에 비율이 어셈블리의 핵심 요소입니다. 단백질 농도에서 시작 보다 작은 경우 권장 여기, vDNA 농도 비례적으로 감소 합니다. 그것은 낮은 농도에서 PFV intasomes 조립 가능, SEC 분리 하는 동안 탐지에 대 한 충분 한 농도 단지 높은 되어야 합니다.
이 메서드는 레이블 또는 레이블 vDNA와 PFV intasomes에 대 한 사용할 수 있습니다. 우리는 vDNA fluorophore 또는 biotin6효율적으로 표시 될 수 있습니다 것으로 나타났습니다. 다른 작은 분자 레이블 또한 수 있습니다. Cy5 fluorophore의 경우 우리는 vDNA 라는 최종 10 배 감소 피크 농도와 조립된 intasomes의 수확량 감소 찾으십시오. 그러나, 내부 Cy5 vDNA 라는 레이블이 없는 vDNA에 동등한 수확량이 있다. 이 어셈블리 방법 점 돌연변이 또는 PFV에4의 잘림 돌연변이 함께 사용할 수 있습니다. PFV에 저해 이후 임상 관련에 의해 물가 V-1에서 대상으로 전송 억제제 (INSTI) 약물를 사용 하 여 이러한 PFV intasomes INSTIs3의 메커니즘 연구 가능 하다. 또한, V-1에 일부 INSTI 내성 돌연변이 약물 저항 설계 PFV intasomes와의 연구를 수 있도록 PFV에 보존된 잔류물에서 발생 합니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 NIH AI099854 및 AI126742 키에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNA Oligomers | IDT | N/A | Custom DNA Oligos |
| Tris Ultra Pure | Gojira Fine Chemicals | UTS1003 | |
| NaCl | P212121 | RP-S23020 | |
| UltraPure EDTA | Invitrogen/Gibco | 15575 | |
| Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filters | Sigma-Aldrich | Z677094-24EA | 3 kDa MWCO |
| DTT | P212121 | SV-DTT | |
| BIS-TRIS propane,>=99.0% (titration) | Sigma-Aldrich | B6755-500G | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | 208086 | |
| MgSO4 | Amresco | 0662 | |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | G37-20 | |
| Gel-loading tips, 1 - 200 μL | Corning | CLS4853-400EA | |
| Razor blade; Single-edged; 100/Pk.; Pack of 100 | Fisher Scientific | 12-640 | |
| Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane > 250mL | Thermo Fisher Scientific | 568-0020 | |
| Dialysis tubing clips | Spectrum Labs | 132734 | |
| 6-8 kDa 10 mm Dialysis Tubing | Spectrum Medical | 132645 | |
| Superose 6 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | 17517201 | |
| Hi-Res Standard Agarose | AGTC Bioproducts | AG500D1 | |
| Ethidium bromide | Thermo Fisher Scientific | BP1302 | |
| Orange G | Fisher Scientific | 0-267 | |
| Hyladder 10kb, 500 lanes | Denville Scientific | CB4225-4 |
References
- Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. Retroviruses. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1997).
- Valkov, E., et al. Functional and structural characterization of the integrase from the prototype foamy virus. Nucleic Acids Res. 37 (1), 243-255 (2009).
- Hare, S., Gupta, S. S., Valkov, E., Engelman, A., Cherepanov, P. Retroviral intasome assembly and inhibition of DNA strand transfer. Nature. 464 (7286), 232-236 (2010).
- Li, M., Lin, S., Craigie, R. Outer domains of integrase within retroviral intasomes are dispensible for catalysis of DNA integration. Protein Sci. 25 (2), 472-478 (2016).
- Gupta, K., et al. Solution conformations of prototype foamy virus integrase and its stable synaptic complex with U5 viral DNA. Structure. 20 (11), 1918-1928 (2012).
- Jones, N. D., et al. Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration. Nat Commun. 7, 11409 (2016).
- Lopez, M. A., Mackler, R. M., Altman, M. P., Yoder, K. E. Detection and removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase. J Vis Exp. , (2017).
- Lopez, M. A., Mackler, R. M., Yoder, K. E. Removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase. J Virol Methods. 235, 134-138 (2016).
- Poirier, M. G., Bussiek, M., Langowski, J., Widom, J. Spontaneous access to DNA target sites in folded chromatin fibers. J Mol Biol. 379 (4), 772-786 (2008).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).
- Ballandras-Colas, A., et al. Cryo-EM reveals a novel octameric integrase structure for betaretroviral intasome function. Nature. 530 (7590), 358-361 (2016).
- Ballandras-Colas, A., et al. A supramolecular assembly mediates lentiviral DNA integration. Science. 355 (6320), 93-95 (2017).
- Passos, D. O., et al. Cryo-EM structures and atomic model of the HIV-1 strand transfer complex intasome. Science. 355 (6320), 89-92 (2017).
- Yin, Z., et al. Crystal structure of the Rous sarcoma virus intasome. Nature. 530 (7590), 362-366 (2016).
- Maertens, G. N., Hare, S., Cherepanov, P. The mechanism of retroviral integration from X-ray structures of its key intermediates. Nature. 468 (7321), 326-329 (2010).
- Maskell, D. P., et al. Structural basis for retroviral integration into nucleosomes. Nature. 523 (7560), 366-369 (2015).
