Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Montering og rensing av Prototype skummende Virus Intasomes

Published: March 19, 2018 doi: 10.3791/57453

Summary

Rekombinant retroviral integrase og DNA oligomers etterligne viral DNA ender kan danne en enzymatisk aktive komplekset kalles en intasome. Intasomes kan brukes for biokjemiske, strukturelle og kinetisk studier. Denne protokollen detaljer kursen og rense prototype skummende virus intasomes.

Abstract

A definere funksjonen og nødvendig trinn i livssyklusen til retrovirus er integrering av viral genomet til verten genomet. Alle retroviruses kode et integrase (IN) enzym som gir kovalente sammenføyning av viral vert DNA, som er kjent som strand overføring. Integrering kan være modellert i vitro med rekombinant retroviral IN og DNA oligomers etterligne endene av viral genomet. For å nærmere recapitulate integrering reaksjonen som oppstår i vivo, integrering komplekser er satt sammen av rekombinant i og syntetisk oligomers av dialyse i en redusert saltkonsentrasjon buffer. Integrering komplekse, kalt en intasome, kan bli renset ved størrelse utelukkelse kromatografi. I prototype skummende virus (PFV), intasome er en tetramer av IN og to DNA oligomers og skilles lett fra monomerisk i og gratis oligomer DNA. Integrering effektiviteten av PFV intasomes kan være assayed under en rekke eksperimentelle forhold å bedre forstå dynamikken og mekanikken i retroviral integrering.

Introduction

Integrering av viral genomet til verten genomet er et obligatorisk trinn i livssyklusen til alle retroviruses1. Viral enzymet integrase (IN) gir kovalente sammenføyning av hver ende av viral DNA genomet til verten DNA. Under en mobilnettet infeksjon, er en del av en pre integrering kompleks som formidler integrering. Rekombinant i kompleksbundet med dobbel strandet DNA oligomers etterligne viral DNA endene kan også utføre integrering i målet DNA i vitro2. En felles integrering analysen i vitro benytter en supercoiled plasmider målet DNA. Integrasjon av både viral DNA oligomers (vDNA) til plasmider en lineær produktet og kalles felles integrering (figur 2A). Den integrering analysen i vitro kan også gi produkter med bare én vDNA covalently koblet til målet plasmider resulterer i en avslappet sirkel. Halv-site integrering produktet synes å være en gjenstand på analysen i vitro.

Rekombinant i og vDNA kan utføre integrering i vitro, men de er ikke ideelt reagensene studiet av dynamikken eller struktur av integrasjon komplekser når monomerisk IN ville skjule relevante visualisering. Renset integrering komplekser, eller "intasomes," kreves for dynamisk ett molekyl analyse eller strukturelle studier. PFV i og vDNAs kan settes sammen av dialyse fra en relativt høy saltkonsentrasjon buffer til en lavere saltkonsentrasjon3,4. Under dialyse, en utløse skjemaer. Dette utløse fjernes fra dialyse og salt konsentrasjonen er økt. Den høyere saltkonsentrasjon solubilizes bunnfall inneholder PFV intasomes. Intasomes er så renset ved størrelse utelukkelse kromatografi (SEC). Rekombinant prototype skummende virus (PFV) IN har vist å eksistere som en monomer i løsning på konsentrasjoner opptil 225 µM5. SEC fraksjoneres skiller effektivt PFV intasomes (225.5 kDa), som inkluderer en tetramer av PFV i og to vDNAs, monomerisk PFV i (44.4 kDa) og gratis vDNA (24.0 kDa). PFV intasomes kan fryses og beholde integrering aktivitet i minst seks måneder av bagasje på-80 grader.

Rekombinant PFV intasomes kan også endres for å inkludere i aminosyre erstatninger eller trunkering mutasjoner eller vDNAs merket med fluorophores eller biotin4,6. De renset PFV intasomes utføre lett integrering i et supercoiled plasmider mål DNA i vitro. Bulk biokjemiske integrering analyser med intasomes kan teste effekten av i mutasjoner, hemmere eller andre kjemiske tilsetningsstoffer. Biotinylated intasomes kan brukes å undersøke slektskap med nukleinsyrer eller proteiner. PFV intasomes er funksjonelle ved omgivelsestemperatur muliggjør enkel molekyl mikroskopi analyse av magnetiske pinsetter å måle tiden mellom sammenføyning av to vDNA endene eller totale interne refleksjon fluorescens å visualisere intasome søk på målet DNA6. I tillegg var PFV intasomes først til å være strukturelt preget betydelig påvirker feltet retroviral integrering3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. annealing av vDNA

  1. Kombiner 1 X ti Buffer (10 X 10 lager: 100 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 M NaCl, 10 mM EDTA), 10 µM Oligo 1 (5' ATTGTCATGGAATTTTGTATATTGAGTGGCGCCCGAACAG 3, 100 µM lager) og 10 µM Oligo 2 (5' CTGTTCGGGCGCCACTCAATATACAAAATTCCATGACA 3, 100 µM lager) i et siste volum på 1,5 mL . Aliquot 25 µL i seksti 0,2-mL polymerase kjedereaksjon (PCR) rør.
    Merk: Avhengig av programmet, oligomers kan bli endret med fluorophores eller koder på 5'-slutten av Oligo 2 eller som en intern amino-T base 13 fra 5'-slutten av Oligo 1. Endret oligomers bør renses høyytelses flytende kromatografi (HPLC) før avspenning. Vi har funnet at 5'-end Cy3 eller Cy5 fluorophore merking av Oligo 2 reduserer intasome montering effektiviteten 10-fold. Intern fluorophore merking reduserer ikke montering effektivitet.
  2. Anneal bruker en thermocycler med følgende tider og temperaturer: 1 syklus på 94.0 grader 3 min, 99 sykluser på (94.0 grader 1 min, 93.6 grader 1 min) redusere både temperaturer med 0,8 grader per syklus (siste syklusen er 14,8 grader 1 min, 14.4 grader 1 min) , og lagre på 4.0 grader.
  3. Kombinere annealing reaksjonene fra alle seksti rør. Laste 500 µL to 0,5-mL 3 kDa molekylvekt cutoff (MWCO) ultracentrifugal filter konsentrasjon enheter. Konsentrere glødet vDNA med sentrifugering i en microcentrifuge på 14.000 x g i 10 min ved romtemperatur (RT).
    Merk: Retentate volumet skal ~ 50 µL tørkeskap konsentrasjon.
  4. Kast flyten gjennom. Legge til 250 µL av den gjenværende glødet vDNA hvert filter enhet. Gjenta spinn og forkaste flyten gjennom. Bufferen exchange i TE buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA) ved å vaske tre ganger med 450 µL TE.
  5. Inverter filter enhet og spinn på 1000 x g i 2 minutter på RT. Siste retentate volumet for hver filteret skal ~ 50 µL. kombinere retentates og overføring til en 1,5 mL skrukork rør.
  6. Måle 260-nm ultrafiolett (UV) absorbansen av vDNA. Bruk denne verdien til å beregne den siste molar DNA konsentrasjonen. Utryddelse koeffisient (ε260) denne vDNA er 622,803 cm-1 M-1 sin molekylvekt er 23,972 Da. butikken på-20 grader.

2. Intasome montering

  1. Hvis mulig, utføre samlingen intasome i et lite rom med en variabel termostat. Justere termostaten til ca 18-22 grader.
    Merk: I vår erfaring, intasome forsamling i 4 grader er ineffektiv.
  2. Forberede 1 L dialyse buffer (20 mM Bis-tris propan, pH 7.5 200 mM NaCl, 2 mM dithiothreitol (DTT), 25 µM ZnCl2) i en 2 liters kanne med rør bar på en rør-plate. Equilibrate bufferen i 18-22 grader rommet for minst 6 h.
  3. For å montere på intasomes, kan du kombinere 50 mM Bis-tris propan, pH 7.5 500 mM NaCl, 120 µM PFV i og 50 µM vDNA i et totalt volum på 150 µL.
    Merk: PFV i bør være fri for forurensende nuclease aktivitet7,8. Hvis konsentrasjonen av PFV i er også fortynne å innkvartere 120 µM IN i 150 µL volum, er det mulig å øke det endelige volumet til 200 µL. De kritiske faktorene av dette trinnet er å opprettholde molar forholdet mellom IN til vDNA (2.4:1) og har nok komplisert å visualisere under kromatografi.
  4. Rengjør en ~ 10 cm lang stykke 10 mm 6-8 kDa MWCO dialyse rør og klipp med dobbel destillert vann (ddH2O), eller det høyeste renhet vannet tilgjengelig. Klipp ene enden av slangen.
    Merk: Dialyse rør skal behandles med forsiktighet for å hindre enhver mulig smitte fra laboratoriet plass.
  5. Gjøre 15 mL dialyse rør skyll buffer (50 mM Bis-tris propan, pH 7.5 500 mM NaCl). Skyll innsiden av dialyse slangen tre ganger med 1-2 mL skyll buffer. Fjerne så mye skylling bufferstørrelsen som mulig med en pipette og tynn gel lasting tips.
  6. Om nødvendig kan du bruke en ren barberblad eller skalpell for å kutte dialyse rør slik at en tynn gel lasting tips kan nå slutten av slangen.
  7. Overføre samlingen intasome fra trinn 2.3 til dialyse slangen med en pipette og en tynn gel lasting tips. Klipp den åpne enden av dialyse slangen, minimere mengden luft introdusert i slangen. Sett slangen inn i dialyse buffer.
  8. Dialyze overnatting (16-20 h) med mild røring slik at slangen roterer, men er ikke i en virvel. Kontroller at dialyse slangen er neddykket og mobil. Etter ca en time, observere en synlig bunnfall inne slangen.
    Merk: Cy3 eller Cy5 fluorescently kalt vDNA, utløse er tydeligere. Dette gjelder for både slutten merket og internt merket fluorescerende vDNA.

3. Intasome Solubilization

  1. Forberede to brede bar pipette-spisser ved å fjerne 2-4 mm fra slutten av en 200 µL tips med ny barberhøvel eller skalpell blad på et rent underlag.
    Merk: Tips vil bli brukt i trinn 3.3 og 3.5.
  2. Fjern dialyse slangen fra dialyse bufferen. For å hindre fortynning av intasome prøven med dialyse buffer som finnes på slutten av slangen nær klippet, bruk brønnene med små pipette tips for å fjerne eventuelle overskytende dialyse buffer. Fjerne klippet fra den ene enden av slangen dialyse.
  3. Bruk et bredt bar pipette tips fra trinn 3.1 til å overføre prøven inkludert bunnfall inne dialyse slangen til en 1.5-mL tube på is. Merk det totale volumet av gjenvunnet materiale, det totale volumet er vanligvis ~ 140 µL.
  4. Prøven med utløse er på 200 mM NaCl; øke saltet å en final konsentrasjon av 320 mM NaCl ved å legge riktige volumet av en 5 M NaCl lagerløsning. For eksempel for et utvalg av 150 µL, legger 3,9 µL 5 M NaCl og 1.1 µL ddH2O til en endelig mengde 155 µL. overføring is bøtte med prøve inn i et kaldt 4 grader-rom.
  5. Bruk et bredt bar pipette tips fra trinn 3.1 resuspend og solubilize utløse av pipettering. Gjenta hvert 20 min for minst 1 h. observere at de fleste av utløse skulle gå i løsning.
    Merk: Pipettering å resuspend bunnfall kan bli stoppet når det er tydelig at utløse er ikke merkbart redusert mellom tidspunkt. Når vDNA ikke er merket eller kalles internt, reduseres bunnfall med ~ 90% basert på visuell inspeksjon. Ved Cy5 slutt merket vDNA, reduseres bunnfall med bare ~ 20%. de fleste utløse fluorophore ende merket vDNA vil ikke solubilize. Mengden av utløse som er effektivt solubilized er variabel og bør være empirisk bestemmes.

4. Intasome rensing

  1. Forberede 250 mL størrelse utelukkelse kromatografi (SEC) kjører buffer (20 mM Bis-tris propan, pH 7.5 320 mM NaCl, 10% glyserol). Sterilt filteret buffer med en 0,2-µm filtrere enhet og lagre på 4 grader.
    Merk: Alle rensing trinnene utføres i en 4 grader kjølerom.
  2. Equilibrate en krysskoblet agarose SEC kolonne (diameter = 10 mm; lengde = 300 mm; seng volum = 24 mL, prøve volum = 25-500 µL; maksimalt Trykk = 1,5 MPa; utelukkelse grense = 4 x 107 Da, skiller molekylvekt mellom 5 og 5000 kDa, se av spisebrikke erials) med SEC kjører buffer på en strømningshastighet på 0,4 mL/min.
    Merk: Denne renselsen kan tilpasses til ulike størrelse utelukkelse kolonner hvis de er i stand til å effektivt skille 300 kDa fra 44 kDa, som Superose 12 10/300 GL eller Superose 6 øke. Superose 12 10/300 GL har lavere oppløsning, fører til mer overlapping av toppene. Derimot Superose 6 øke har høyere oppløsning og tilbyr bedre separasjon.
  3. Sentrifuge intasome prøven i en microfuge på 14.000 x g i 10 min på 4 grader til pellets eventuelle gjenværende utløse. Fjern forsiktig nedbryting. Last nedbryting til en 200 µL injeksjon loop (rør som kan holde ~ 200 μL). Eksemplet gjelde kolonnen sek.
    Merk: Mindre belastning volumer tillater større oppløsning av SEC.
  4. Elute med 25 mL SEC kjører buffer og samle 95 fraksjoner av 270 µL. observere at SEC chromatogram viser tre A280/A260 topper (figur 1).
    Merk: Først skal være en aggregasjon (~9.0 - 11,5 mL elueringsrør), etterfulgt av PFV tetramer intasome peak (~12.0 - 14.75 mL elueringsrør) og PFV i monomer med gratis vDNA peak (~15.0 - 18,0 mL).

5. integrasjon Strand overføring analysen, brøkdel utvalg og lagring

  1. Kombinere 2 µL av hver intasome peak fraksjon og 50 ng 3 kb supercoiled plasmider DNA (lager konsentrasjon er 50 ng/µL) reaksjon buffer (10 mM Bis-tris propan, pH 7.5, 110 mM NaCl, 5 mM MgSO4, 4 µM ZnCl2, 10 mM DTT) i et siste reaksjon volum på 15 µL. Ruge på 37 grader i 5 min.
  2. Inkluder en negativ kontroll med ingen ekstra PFV intasome. Stoppe reaksjon med 0,75 µL proteinasen K (20 mg/mL lagerløsning) og 0,75 µL SDS (10% lager løsning). Ruge på 55 grader for 1 h. butikken prøver etter behov på-20 grader for senere analyser.
    Merk: Denne analysen er en kvalitativ vurdering av integrasjon aktivitet. Intasome molar konsentrasjonen av hver fraksjon bestemmes ikke før denne analysen. Brøker i integrering strand overføring analysen kan lagres på is (inkludert overnatting lagring) inntil integrasjon aktivitet er bekreftet og valgte fraksjoner er aliquoted. Her bruker vi pMP2, en pUC19 derivat9. Vi har også brukt 5.4 kb plasmider pcDNA 3.1. Noen plasmider som kan løses til avslappet sirkel, lineære, og supercoiled skjemaer kan brukes som et mål for integrering.
  3. Forberede en 120 mL 1% vekt per volum (w/v) agarose gel i 1 X TAE buffer (40 mM Tris-acetate, 1 mM EDTA) med 0,1 μg/mL ethidium bromide (EtBr, 10 mg/mL lagerløsning)10. Smelt agarose løsningen og hell den i et 15 cm x 10 cm gel avstøpning brett. Sett inn en 15-vel kam med 5 mm brede, 0,75 mm tykk brønner.
    Merk: Smalere brønner gi bedre bandet oppløsning sammenlignet med 1.5 mm tykk brønner.
  4. Tillate gel å stivne ved omgivelsestemperatur. Fordype gel i 1 X TAE med 0,1 μg/mL EtBr.
  5. Legge til 3 µL 50% glyserol hver integrering reaksjon fra trinn 5.2. Laste inn hele reaksjon volumet gel. Laste 1 µL av 10 kb DNA størrelse merketråden (150 ng/µL lager konsentrasjon) til kjørefelt på hver side av prøvene; med andre ord, skal DNA størrelse markøren flanke eksempel banene.
  6. I en ytre kjørefelt, laste 6 µL Orange G fargestoff (0,25% Orange G, 30% glyserol). Kjør gel ved konstant spenning, 10 V/cm (100 V) ved omgivelsestemperatur 1t eller til Orange G fargestoff foran når slutten av gel.
  7. Umiddelbart bilde agarose gel med et fluorescerende skanner sette å oppdage EtBr (532 nm eksitasjon, 610 nm utslipp filter). Hvis fluorophore kalt vDNAs ble brukt, også bilde med riktig fluorophore innstillinger.
    Merk: For eksempel å oppdage Cy5 merket DNA, bildet med 633 nm eksitasjon og 670 nm utslipp filtre. Felles integrering produkter (CI, lineær DNA) skal kjøre riktig størrelse på ~ 3 kb Ureagert supercoiled plasmider (SC) bør kjøre raskere (~ 2 kb) og halv-site integrering produkter (HSI, avslappet sirkel DNA) bør kjøre tregere (~3.5 kb). Ureagert vDNA skal kjøre riktig størrelse på ~ 40 bp.
  8. Kvantifisere bandene i hver bane med bildebehandling programvare7. Beregn brøkdelen av DNA i hver bane som CI, HSI eller SC; vDNA er ikke inkludert i denne beregningen.
    Merk: Integrering effektivitet eller brøkdel av SC konvertert til en lineær produkt, beregnet ved å dele pixel volumet av felles integrering produkter (CI) av totale pixel volumet av tre band (HSI + CI + SC). Hvis intasomes er fluorophore merket, kan du også quantitated HSI og CI produktene av fluorescens.
  9. Velg brøker som har mest felles integrering aktiviteten.
    Merk: I vår erfaring, topp felles integrering aktiviteten sammenfaller med protein toppen identifisert som tetramerisk PFV intasomes. Måle A280 av hver av disse fraksjoner og beregne den endelige intasome konsentrasjonen. Molekylvekten er 225.5 kDa ε280 for en tetramer med wild type PFV i med to vDNAs som er beskrevet her er 908,339 cm-1M-1 . Konsentrasjonen bør følge samme mønster som sek chromatogram toppen og strand overføring analysen.
  10. Distribuere hver fraksjon i 5 µL dele og fest fryse i flytende nitrogen. Lagre dele på-80 grader. Brøker valgt for lagring er vanligvis mellom 200-600 nM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

PFV intasomes er satt sammen av rekombinant i og vDNA. Etter forsamling, er intasomes renset sekund (figur 1). Integrering aktivitet av hver fraksjon er assayed med en supercoiled DNA målet og agarose gel geleelektroforese (figur 2). Denne gel er avbildet med en fluorescerende skanner sette å oppdage EtBr (og fluorophore, hvis fluorophore-merket vDNA brukes). Bruker analyseprogramvare, kan bandet pixel volumer brukes til å beregne integrering effektiviteten (Figur 3). Fraksjoner med høyeste integrering effektivitet er snapin fryses for senere bruk. Frosne fraksjoner beholde integrering aktivitet (Figur 4), slik at langsiktig lagring av sammensatte intasomes. Alle etikett-molekylet og sin posisjon innen vDNA kan påvirke intasome montering effektivitet (figur 5).

Figure 1
Figur 1: størrelse utelukkelse chromatogram. En PFV intasome forsamling ble skilt med en agarose SEC kolonne. Denne kolonnen tillater separasjon av summen (1), PFV intasome som består av en tetramer PFV i og to vDNA (2), og monomerisk PFV i vDNA (3). I dette eksemplet følger vDNA med en intern Cy5 fluorophore etikett oppdaget av 650 nm eksitasjon. Y-aksen angir optisk tetthet (OD) i milli-absorbansen enheter (mAU). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: integrering analysen av SEC fraksjoner. (A) skjematisk av integrasjon strand overføring reaksjon. Venstre, tegneserie av en PFV intasome som en tetramer av i (blå sirkler) og to vDNA (tykke svarte streker) og en mål plasmider (tynne svarte linjer). Supercoils (SC) av målet plasmider er ikke tegnet. Center, tegneserie av en halv-site integrering (HSI) produktet når en vDNA har fått covalently med å målrette plasmider. Begynte reaksjonen introduserer et nick og slapper av supercoils. Høyre, tegneserie av et felles integrering (CI) produkt der to vDNAs har fått med seg til målet DNA. Integrering produktet resulterer i en lineær DNA med vDNAs i endene. (B) Supercoiled plasmider DNA ble lagt til hver SEC fraksjon #49-55. Etter inkubasjon integrering reaksjonene var deproteinated og atskilt med 1% agarose gel geleelektroforese som inneholder EtBr. Negativ kontroll var plasmider DNA med ingen protein (T). DNA størrelse indikatorer vises i kb. Supercoiled plasmider (SC), felles integrering produkter (CI), halv-site integrering produkter (HSI) og vDNA er angitt. (C) av agarose gel ble skannet for tilstedeværelsen av Cy5. Bare vDNA, CI og HSI produkter er synlig. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: kvantifisering av integrasjon analysen. Agarose gel fra figur 2 ble skannet og kvantifisert for både (A) EtBr og (B) Cy5. (A) For beregning av EtBr, HSI, CI og SC bandet pixel volumer ble hentet ved hjelp av gel analyseprogramvare. Integrering effektivitet ble beregnet ved å dele pixel volumet av felles integrering produkter (CI) av det totale pixel volumet av alle tre feltene (HSI + CI + SC). For eksempel bildepunktverdiene i EtBr kanal for bånd brøkdel #49: 110565.2 SC, 25152.56 CI og 6313.04 HSI. DNA pixel totalverdien for brøkdel #49 er summen av disse verdiene, 142030.8. Integrering effektiviteten er CI pixel volumet av 25152.56 delt totalverdien DNA 142030.8 tilsvarer 0,18. (B) Cy5 CI bandet pixel volumer er grafisk som vilkårlig enheter. Fraksjoner med topp integrering aktivitet er individuelt aliquoted og frossen. I dette eksemplet ble fraksjoner #50-53 valgt. Dele er snapin frosset med flytende nitrogen og lagret på-80 grader for fremtidig bruk.

Figure 4
Figur 4: effekten av frysing intasome aktivitet. Halvparten av en SEC brøkdel var flash frossen med flytende nitrogen, lagret på-80 grader 1t, og deretter sakte tint på is. Den resterende halvdelen av SEC brøken ble holdt på isen i et kaldt rom mens første halvår var frosset og tint. Intasomes testet for aktivitet uten (-) og (+) fryse/tining. Integrering effektivitet ble målt som beskrevet ovenfor. (A) EtBr farget agarose gel integrering reaksjon produkter. Supercoiled plasmider (SC), felles integrering produkter (CI), halv-site integrering produkter (HSI) og Ureagert vDNA er angitt. DNA størrelse indikatorer vises i kb. (B) kvantifisering av integrasjon effektiviteten fra EtBr bildet. Beregninger er beskrevet i Figur 3 legende. Det er ikke tap av integrasjon aktivitet etter fryses. Gjennomsnittlig integrering effektiviteten vises for 5 uavhengige eksperimenter med 2 intasome forberedelser. Feilfelt viser standardavviket. T-test for analyser gitt en tosidige P = 0,011, antyder at fryse/Tin kan ha litt forbedret integrasjon aktivitet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: Label molekylet og posisjon konsekvenser intasome montering. PFV intasome samlinger inkludert vDNAs som var umerkede (rød), slutten merket på Oligo 2 med Cy5 (blå), internt merket på Oligo 1 med Cy5 (svart), eller slutten merket på Oligo 2 med biotin (oransje). Alle samlinger ble skilt med en agarose SEC-kolonne. Y-aksen angir OD i mAU. Chromatograms er representant for minst 2 uavhengige samlinger av hver intasome. Slutten merking reduserer avkastningen av PFV intasomes med Cy5 10-fold og biotin 1.8-fold. Slutten Cy5 og biotin samlinger har merkbart mer utløse igjen etter høy salt resolubilization (trinn 3,5), som resulterer i tilsynelatende tap av materiale på kolonnen størrelse eksklusjon. Intern merking av vDNA med Cy5 fluorophore fører til en lik avkastning på intasomes som umerket vDNA. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Retroviral moduler danner en multimeric kompleks med viral genomisk DNA å utføre integrering og fortsette viral livssyklusen. Antall i monomerer per intasome kan være tetramers, octamers eller muligens høyere orden multimers11,12,13,14. PFV intasomes er en tetramer av rekombinant med double-strandet DNA oligomers som etterligner viral genomisk DNA ender3. Disse intasomes har blitt brukt i strukturelle og dynamisk studier3,5,13,14.

Montering av PFV intasomes oppstår under dialyse fra en relativt høy saltkonsentrasjon buffer til en lavere saltkonsentrasjon. Dette resulterer i dannelsen av en utløse som inkluderer PFV intasomes. Intasomes er solubilized ved å øke saltkonsentrasjon. PFV i har vist seg å være monomerisk i konsentrasjoner opptil 225 µM5. Komplekser er så isolert fra monomerisk i og gratis vDNA av SEC. Vi har endret rensing av PFV intasomes med glyserol i SEC buffer6. Tillegg av glyserol lar PFV intasomes å bli frosset for fremtidig bruk uten tap av aktivitet (Figur 4).

Det er flere viktige funksjoner i denne protokollen. Selv om protein rensing utføres ofte ved lave temperaturer, har vi funnet empirisk at PFV intasome montering er ineffektivt på 4 grader. I stedet skal montering dialyse oppstå mellom 18-22 grader. Det er også viktig å bruke rekombinant PFV i vedkommende uten forurensende bakteriell nuclease7,8. Endelig, forholdet mellom IN til vDNA er en viktig faktor for samlingen. Hvis start i protein konsentrasjon er lavere enn anbefalt her, må vDNA konsentrasjonen reduseres proporsjonalt. Det er mulig å montere PFV intasomes i lave konsentrasjoner, må komplekser være på et høyt nok konsentrasjon for maskinvaresøk under SEC separasjon.

Denne metoden kan brukes til PFV intasomes med umerkede eller merket vDNA. Vi har funnet at vDNA kan være effektivt merket med en fluorophore eller biotin6. Andre små molekyl etiketter kan også være mulig. Ved Cy5 fluorophore finner vi at slutten merket vDNA reduserer avkastningen av sammensatte intasomes med topp konsentrasjonen redusert 10-fold. Men har internt Cy5 merket vDNA en tilsvarende avkastning til umerket vDNA. Denne samlingen metoden kan også brukes med punkt mutasjoner eller trunkering mutasjoner av PFV i4. Siden PFV i er hemmet av klinisk relevant IN tråd overføring hemmer (som er) narkotika målretting HIV-1 i, er det mulig å bruke disse PFV intasomes for å studere mekanismen av INSTIs3. Dessuten, forekommer noe som er motstandsdyktig mutasjoner i HIV-1 i bevarte rester i PFV, slik at studier av resistens med utviklet PFV intasomes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av NIH AI099854 og AI126742 til nøkkelen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DNA Oligomers IDT N/A Custom DNA Oligos
Tris Ultra Pure Gojira Fine Chemicals UTS1003
NaCl P212121 RP-S23020
UltraPure EDTA Invitrogen/Gibco 15575
Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filters Sigma-Aldrich Z677094-24EA 3 kDa MWCO
DTT P212121 SV-DTT
BIS-TRIS propane,>=99.0% (titration) Sigma-Aldrich B6755-500G
ZnCl2 Sigma-Aldrich 208086
MgSO4 Amresco 0662
Glycerol Thermo Fisher Scientific G37-20
Gel-loading tips, 1 - 200 μL Corning CLS4853-400EA
Razor blade; Single-edged; 100/Pk.; Pack of 100 Fisher Scientific 12-640
Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane > 250mL Thermo Fisher Scientific 568-0020
Dialysis tubing clips Spectrum Labs 132734
6-8 kDa 10 mm Dialysis Tubing Spectrum Medical 132645
Superose 6 10/300 GL GE Healthcare Life Sciences 17517201
Hi-Res Standard Agarose AGTC Bioproducts AG500D1
Ethidium bromide Thermo Fisher Scientific BP1302
Orange G Fisher Scientific 0-267
Hyladder 10kb, 500 lanes Denville Scientific CB4225-4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. Retroviruses. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1997).
  2. Valkov, E., et al. Functional and structural characterization of the integrase from the prototype foamy virus. Nucleic Acids Res. 37 (1), 243-255 (2009).
  3. Hare, S., Gupta, S. S., Valkov, E., Engelman, A., Cherepanov, P. Retroviral intasome assembly and inhibition of DNA strand transfer. Nature. 464 (7286), 232-236 (2010).
  4. Li, M., Lin, S., Craigie, R. Outer domains of integrase within retroviral intasomes are dispensible for catalysis of DNA integration. Protein Sci. 25 (2), 472-478 (2016).
  5. Gupta, K., et al. Solution conformations of prototype foamy virus integrase and its stable synaptic complex with U5 viral DNA. Structure. 20 (11), 1918-1928 (2012).
  6. Jones, N. D., et al. Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration. Nat Commun. 7, 11409 (2016).
  7. Lopez, M. A., Mackler, R. M., Altman, M. P., Yoder, K. E. Detection and removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase. J Vis Exp. , (2017).
  8. Lopez, M. A., Mackler, R. M., Yoder, K. E. Removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase. J Virol Methods. 235, 134-138 (2016).
  9. Poirier, M. G., Bussiek, M., Langowski, J., Widom, J. Spontaneous access to DNA target sites in folded chromatin fibers. J Mol Biol. 379 (4), 772-786 (2008).
  10. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).
  11. Ballandras-Colas, A., et al. Cryo-EM reveals a novel octameric integrase structure for betaretroviral intasome function. Nature. 530 (7590), 358-361 (2016).
  12. Ballandras-Colas, A., et al. A supramolecular assembly mediates lentiviral DNA integration. Science. 355 (6320), 93-95 (2017).
  13. Passos, D. O., et al. Cryo-EM structures and atomic model of the HIV-1 strand transfer complex intasome. Science. 355 (6320), 89-92 (2017).
  14. Yin, Z., et al. Crystal structure of the Rous sarcoma virus intasome. Nature. 530 (7590), 362-366 (2016).
  15. Maertens, G. N., Hare, S., Cherepanov, P. The mechanism of retroviral integration from X-ray structures of its key intermediates. Nature. 468 (7321), 326-329 (2010).
  16. Maskell, D. P., et al. Structural basis for retroviral integration into nucleosomes. Nature. 523 (7560), 366-369 (2015).

Tags

Immunologi og infeksjon utstede 133 Retrovirus Prototype skummende Virus Intasome Integrase Protein kompleks sammenstilling Protein kompleks rensing
Montering og rensing av Prototype skummende Virus Intasomes
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mackler, R. M., Lopez Jr., M. A.,More

Mackler, R. M., Lopez Jr., M. A., Yoder, K. E. Assembly and Purification of Prototype Foamy Virus Intasomes. J. Vis. Exp. (133), e57453, doi:10.3791/57453 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter