Summary
Integrase retroviral recombinante e oligómeros de DNA imitando extremidades de DNA virais podem formar um complexo enzimaticamente ativo conhecido como um intasome. Intasomes pode ser utilizado para estudos bioquímicos, estruturais e cinéticos. Este protocolo fornece detalhes sobre como montar e purificar o protótipo vírus espumoso intasomes.
Abstract
A definição de recurso e etapa necessária do ciclo de vida do retrovírus é a integração do genoma viral no genoma do hospedeiro. Todos os retrovírus codificam uma enzima integrase (IN) que cataliza a União covalente de viral para host de DNA, que é conhecido como transferência de vertente. Integração pode ser modelado em vitro com IN retroviral recombinante e oligómeros de DNA imitando as extremidades do genoma viral. Para recapitular mais de perto a reação de integração que ocorre na vivo, integração complexos são montados de recombinação IN e oligômeros sintéticos por diálise em um buffer de reduzida concentração de sal. A integração complexa, chamada um intasome, pode ser purificada por cromatografia de exclusão. No caso do vírus espumoso de protótipo (PFV), o intasome é um tetrâmero de IN e dois oligómeros de DNA e prontamente é separado do IN monomérico e livre oligómero de DNA. A eficiência de integração de intasomes PFV pode ser analisada sob uma variedade de condições experimentais para melhor compreender a dinâmica e mecânica de integração retroviral.
Introduction
Integração do genoma viral no genoma do hospedeiro é um passo obrigatório no ciclo de vida de todos os retrovírus1. A enzima viral integrase (IN) catalisa a União covalente de cada extremidade do genoma de DNA viral para o host de DNA. Durante uma infecção celular, faz parte de um complexo de pré-integração que medeia a integração. Recombinante em complexado com oligômeros de DNA encalhados dobro imitando as extremidades de DNA virais também pode realizar a integração em um DNA alvo em vitro2. Um comum integração ensaio em vitro utiliza um plasmídeo supercoiled como o DNA alvo. Integração de ambos os oligómeros de DNA virais (vDNA) para o plasmídeo resulta em um produto linear e é denominada integração concertada (Figura 2A). A integração do ensaio em vitro pode também produzir produtos com apenas um vDNA covalentemente unida com o plasmídeo de alvo, resultando em um círculo relaxado. Este produto de integração de meia-site parece ser um artefato de ensaio in vitro.
Recombinante em e vDNA podem realizar integração em vitro, mas eles não são reagentes ideais para o estudo da dinâmica ou estrutura de complexos de integração quando monomérico IN poderia obscurecer visualização relevante. Purificado de integração complexos, ou "intasomes", são necessários estudos estruturais ou análise de dinâmica única molécula. PFV IN e vDNAs pode ser montado por diálise de um buffer de relativamente alta concentração de sal para uma baixa concentração de sal,3,4. Durante a diálise, um precipitate formulários. Esse precipitado é removido da diálise e a concentração de sal é aumentada. A maior concentração de sal solubiliza o precipitado contendo PFV intasomes. Os intasomes são então purificados por cromatografia de exclusão (SEC). IN de vírus espumoso (PFV) recombinante protótipo foi mostrado para existe como um monômero em solução em concentrações até 225 µM5. Fracionamento de SEC efetivamente separa o intasomes PFV (225.5 kDa), que inclui um tetrâmero de PFV IN e dois vDNAs, PFV monomérico em (44,4 kDa) e enciclopédia vDNA (24,0 kDa). O intasomes PFV pode ser congelado e manter a atividade de integração pelo menos seis meses de armazenamento a-80 ˚ c.
Recombinante PFV intasomes também pode ser modificado para incluir em substituições de aminoácidos ou mutações de truncamento ou vDNAs rotulado com fluorophores ou biotina4,6. Os purificado PFV intasomes executar prontamente integração em um alvo de plasmídeo supercoiled DNA em vitro. Ensaios de integração bioquímicos em massa com intasomes podem testar os efeitos de mutações, inibidores, ou outros aditivos químicos. Biotinilado intasomes pode ser usado para sondar a afinidade com os ácidos nucleicos e proteínas. PFV intasomes são funcionais à temperatura ambiente, permitindo a análise de microscopia única molécula por uma pinça magnética para medir o tempo entre juntar-se das duas extremidades vDNA ou fluorescência de reflexão interna total para visualizar a pesquisa de intasome no alvo DNA6. Além disso, PFV intasomes foram os primeiros a ser estruturalmente caracterizam afetar significativamente o campo de integração retroviral3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. recozimento de vDNA
- Combinar 1 X 10 Buffer (estoque de 10 X 10: 100 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 M NaCl, EDTA 10 mM), 10 µM 1 Oligo (5' ATTGTCATGGAATTTTGTATATTGAGTGGCGCCCGAACAG 3', 100 µM de estoque) e 10 µM 2 Oligo (5' CTGTTCGGGCGCCACTCAATATACAAAATTCCATGACA 3', 100 µM de estoque) em um volume final de 1,5 mL . Alíquota de 25 µ l para tubos de reação em cadeia (PCR) de 0,2 mL do polymerase sessenta.
Nota: Dependendo da aplicação, oligómeros podem ser modificados com fluorophores ou tags 5'-na extremidade do Oligo 2 ou como um interno amino-T na base 13 de 5' extremidade do Oligo 1. Oligómeros modificados devem ser purificados por cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) antes do recozimento. Nós achamos que 5'-final Cy3 ou Cy5 fluoróforo rotulagem de Oligo 2 reduz a eficiência de montagem de intasome 10-fold. Fluoróforo interno rotulagem não reduz eficiência de montagem. - Recoze usando um thermocycler com os seguintes tempos e temperaturas: 1 ciclo ˚ c 94.0 3 min, 99 ciclos no (˚ c 94.0 1min, 93,6 ˚ c 1min) diminuindo ambas temperaturas 0,8 ˚ c por ciclo (o último ciclo é 14,8 ˚ c 1 min, 14.4 ˚ c 1 min) e armazenar no 4.0 ˚ c.
- Combine as recozimento reações de todos os tubos de sessenta. Carrega 500 µ l para dois 0,5 mL 3 kDa peso molecular corte (MWCO) filtro ultracentrifugal concentração unidades. Concentre o recozido vDNA por centrifugação em microcentrifuga a 14.000 x g durante 10 minutos à temperatura ambiente (RT).
Nota: O volume de retentate deve ser ~ 50 µ l em cada unidade de concentração. - Descarte a fluir. Adicione 250 µ l do restante vDNA recozido para cada unidade de filtro. Repetir a centrifugação e descartar o fluxo através de. Tampão de troca em tampão TE (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA) por lavar três vezes com 450 µ l TE.
- Inverter a unidade de filtro e girar a 1.000 x g por 2 min em RT O volume final retentate para cada unidade de filtro deve ser ~ 50 µ l. Combine o retentates e transferir para um tubo de tampa de rosca de 1,5 mL.
- Medir a absorvância de 260 nm ultravioleta (UV) do vDNA. Use este valor para calcular a concentração molar final do DNA. O coeficiente de extinção (ε260) deste vDNA é 622.803 cm-1 M-1 e seu peso molecular é 23.972 promotor. loja-20 ˚ c.
2. Intasome Assembleia
- Se possível, realizar a montagem de intasome em um quarto pequeno com um termostato variável. Ajuste o termostato para aproximadamente 18-22 ˚ c.
Nota: Na nossa experiência, montagem de intasome no 4 ˚ c é ineficiente. - Prepare 1 L de tampão de diálise (Bis-tris propano de 20 mM, pH 7,5, 200 mM NaCl, 2mm ditiotreitol (DTT), 25 µM ZnCl2) num copo de 2 L com uma barra de agitação em uma placa de agitação. Equilibrar o buffer na sala 18-22 ˚ c, durante pelo menos 6 h.
- Para montar o intasomes, combine propano 50 mM tris-Bis, pH 7,5, 500 mM de NaCl, PFV IN de 120 µM e 50 µM vDNA em um volume total de 150 µ l.
Nota: IN PFV deve ser livre de contaminantes nuclease atividade7,8. Se a concentração de IN PFV é demasiado diluída para acomodar 120 µM em, em volume de 150 µ l, em seguida, é possível aumentar o volume final de 200 µ l. Os fatores críticos desta etapa são para manter a proporção molar da IN para vDNA (2.4:1) e ter bastante complexo para visualizar durante a cromatografia. - Limpe um longo pedaço de ~ 10 cm de tubo de diálise 10mm 6-8 kDa MWCO e clipes com água bidestilada (ddH2O), ou a água de pureza mais alta disponível. Prenda uma extremidade do tubo.
Nota: A tubulação da diálise deve ser manipulada com cuidado para evitar qualquer possível contaminação do espaço de laboratório. - Fazer 15 mL de tampão de lavagem de tubos de diálise (propano 50 mM tris-Bis, pH 7,5, 500 mM de NaCl). Lave o interior do tubo de diálise três vezes com 1-2 mL de tampão de lavagem. Retire o máximo de buffer de enxaguamento quanto possível, com uma pipeta e gel fino de ponta de carga.
- Se necessário, utilize uma lâmina de barbear limpa ou bisturi para cortar o tubo de diálise para que uma ponta fina gel de carregamento pode chegar ao fim do tubo.
- Transferi o assembly intasome da etapa 2.3 para a tubulação da diálise com uma pipeta e um gel fino ponta de carregamento. Corte a extremidade aberta do tubo de diálise, minimizando a quantidade de ar introduzido dentro do tubo. Coloque o tubo no buffer de diálise.
- Urinar durante a noite (16-20 h) com agitação suave para que o tubo gira, mas não é em um vórtice. Verifique se a tubulação da diálise está submerso e móvel. Depois de aproximadamente uma hora, observe um precipitado visível dentro da tubulação.
Nota: Com Cy3 ou Cy5 fluorescente etiquetado vDNA, o precipitado é mais óbvio. Isto é verdadeiro para end rotulado e vDNA fluorescente etiquetado internamente.
3. Intasome solubilização
- Prepare dois furo largo pontas de pipetas, removendo 2-4 mm da extremidade de uma ponta de 200 µ l, com uma nova lâmina de barbear ou bisturi sobre uma superfície limpa.
Nota: As dicas serão usadas na etapa 3.3 e 3.5. - Remova o tubo de diálise o buffer de diálise. Para evitar a diluição da amostra intasome com buffer de diálise que pode permanecer na extremidade do tubo de perto o clip, use uma micropipeta com uma ponta de pipeta pequena para remover qualquer reserva de diálise em excesso. Retire o clipe de uma das extremidades do tubo de diálise.
- Uso uma ampla ponta da pipeta do furo do passo 3.1 para transferir a amostra, incluindo o precipitado dentro da tubulação da diálise para um tubo de 1,5 mL no gelo. Anotar o volume total do material recuperado; o volume total é tipicamente ~ 140 µ l.
- A amostra com o precipitado é a 200 mM NaCl; Aumente o sal para uma concentração final de 320 mM NaCl adicionando o volume apropriado de uma solução de NaCl 5 M. Por exemplo, para uma amostra de 150 µ l, adicionar 3.9 µ l 5 M NaCl e 1.1 µ l ddH2O para um volume final de 155 µ l. transferência balde de gelo com amostra em uma sala fria 4 ˚ c.
- Uso uma ampla furo ponta da pipeta de passo 3.1 para Ressuspender e solubilizar o precipitado por pipetagem. Repeti a cada 20 min pelo menos 1 h. observar que a maioria do precipitado deve entrar em solução.
Nota: Pipetagem para Ressuspender o precipitado pode ser interrompido quando é evidente que o precipitado é não está mais visivelmente reduzido entre pontos de tempo. Quando vDNA não é rotulado ou internamente é rotulado, o precipitado é reduzido em 90% com base na inspeção visual. No caso de fim de Cy5 rotulado vDNA, o precipitado é reduzido em apenas ~ 20%; a maioria do precipitado com fim de fluoróforo rotulado vDNA não vai solubilizar. A quantidade de precipitado que efetivamente é solubilizado é variável e deve ser determinada empiricamente.
4. Intasome purificação
- Prepare 250 mL de cromatografia de exclusão (SEC) executando o tampão (propano 20 mM tris-Bis, pH 7,5, 320 mM NaCl, 10% de glicerol). Filtro estéril o buffer com um 0,2 µm-unidade de filtragem e armazene a 4 ˚ c.
Nota: Todas as etapas de purificação são realizadas em uma sala fria 4 ˚ c. - Equilibrar uma coluna de agarose reticulado SEC (diâmetro = 10 mm; comprimento = 300 mm; cama volume = 24 mL; volume de amostra = 25-500 µ l; pressão máxima = 1,5 MPa; limite de exclusão = 4 x 107 Da; separa os pesos moleculares entre 5.000 e 5 kDa, consulte o de esteira erials) com SEC executando em uma taxa de fluxo de 0,4 mL/min.
Nota: Esta purificação pode ser adaptada para colunas de exclusão de tamanho diferente se eles são capazes de efetivamente separar 300 kDa 44 kDa, tais como Superose 12 10/300 GL ou Superose 6 aumentar. Superose 12 10/300 GL tem resolução menor, levando a mais sobreposição de picos. Por outro lado, Superose 6 aumentar tem maior resolução e oferece a melhor separação. - Centrifugar a amostra de intasome em uma microcentrífuga a 14.000 x g durante 10 minutos a 4 ˚ c para qualquer precipitado restante de Pelotas. Remova cuidadosamente o sobrenadante. Carrega o sobrenadante para um loop de injeção de 200 µ l (tubulação que pode conter ~ 200 μL). Aplique a amostra para a coluna do SEC.
Nota: Volumes menores de carga permitem maior resolução por seg. - Eluir com 25 mL SEC executando o buffer e coleta 95 frações de 270 µ l. Observe que o cromatograma SEC exibe três A280/A260 picos (Figura 1).
Nota: O primeiro deve ser um agregado (~9.0 - eluição de 11,5 mL), seguido do pico de intasome PFV tetrâmero (~12.0 - eluição 14,75 mL) e monômero PFV IN com pico vDNA livre (~15.0 - 18,0 mL).
5. integração Strand ensaio de transferência, seleção de fração e armazenamento
- Combinar 2 µ l de cada fração de pico intasome e 50 ng 3KB supercoiled plasmídeo (concentração das ações é de 50 ng / µ l) em tampão de reação (10 mM tris Bis propano, pH 7,5, 110 mM de NaCl, 5 mM de MgSO4, 4 µM ZnCl2, 10 mM DTT) em um volume final de reação de 15 µ l. Incube a 37 ˚ c por 5 min.
- Inclua um controle negativo com nenhum intasome PFV adicionado. Parar a reação com 0,75 proteinase µ l K (20 mg/mL de solução) e 0,75 µ l SDS (solução a 10% das ações). Incube a 55 ˚ c para amostras de loja h. 1 conforme necessário em-20 ˚ c para posterior análise.
Nota: Este ensaio é uma avaliação qualitativa da atividade de integração. A concentração molar de intasome de cada fração não é determinada antes neste ensaio. Incluído no ensaio de transferência da vertente de integração de fracções podem ser armazenadas no gelo (incluindo armazenamento durante a noite) até a integração atividade é confirmada e frações selecionadas são aliquotadas. Aqui usamos o pMP2, um derivado de pUC199. Usamos também com êxito a 5,4 kb do plasmídeo pcDNA 3.1. Qualquer plasmídeo que pode ser resolvido em relaxado círculo, linear, e formas supercoiled podem ser usadas como um destino para integração. - Prepare um peso de 1% de 120 mL por gel de agarose de volume (p/v) em 1-tampão TAE X (40 mM Tris-Acetato, 1 mM EDTA) com 0,1 μg/mL ethidium brometo (EtBr, 10 mg/mL de solução)10. Derreter a solução de agarose e despeje em uma bandeja de fundição de gel 15 cm x 10 cm. Inserir um pente 15-bem com 5 mm largo, 0,75 mm espesso poços.
Nota: Mais estreitos poços rendem melhor resolução de banda, em comparação com poços de espesso 1,5 mm. - Permitir que o gel solidificar à temperatura ambiente. Imergir o gel em 1 X TAE com 0,1 μg/mL EtBr.
- Adicione 3 µ l 50% glicerol para cada reação de integração da etapa 5.2. Carrega o volume inteiro de reação para o gel. Carregar de 1 µ l de marcador de tamanho de DNA 10 kb (concentração das ações de 150 ng / µ l) para pistas de cada lado das amostras; em outras palavras, o marcador de tamanho de DNA deve flanquear as pistas de amostra.
- Em uma faixa exterior, carrega tintura de laranja G 6 µ l (0,25% G laranja, 30% de glicerol). Funcione o gel em constante tensão, 10 V/cm (100 V) à temperatura ambiente por 1 h, ou até a frente de corante laranja G chega ao fim do gel.
- O gel de agarose imediatamente da imagem com um scanner fluorescente definido para detectar EtBr (532 nm de excitação, filtro de emissão 610 nm). Se fluoróforo rotulado vDNAs foram usado, também da imagem com as configurações adequadas fluoróforo.
Nota: por exemplo detectar Cy5 rotulado DNA, imagem usando 633 nm de excitação e filtros de emissão 670 nm. Produtos de integração concertada (CI, DNA linear) devem ser executado fiel tamanho em kb ~ 3, não tenha reagido supercoiled plasmídeo (SC) deve ser executado mais rápido (~ 2 kb) e produtos de integração meia-site (HSI, círculo relaxado DNA) devem executar mais lento (~3.5 kb). Não tenha reagido vDNA deve ser executado fiel tamanho em ~ 40 bp. - Quantificar as bandas em cada raia com software de imagem7. Calcular a fração de DNA em cada pista que é CI, HSI ou SC; vDNA não está incluído no cálculo.
Nota: Eficiência de integração, ou a fração de SC, convertido em um produto linear, foi calculada dividindo o volume de pixel de produtos de integração concertada (CI) pelo volume total de pixel de três bandas (HSI + CI + SC). Se intasomes são fluoróforo rotulado, os HSI e CI produtos também podem ser quantificados por fluorescência. - Selecione frações que têm a atividade de integração mais concertada.
Nota: Na nossa experiência, a atividade de integração concertada de pico coincide com o pico de proteína identificado como tetramérica PFV intasomes. Medir a um280 de cada uma dessas fracções e calcular a concentração final de intasome. O ε280 para um tetrâmero de tipo selvagem PFV IN com dois vDNAs descrito aqui é 908.339 cm-1M-1 e o peso molecular é 225.5 kDa. As concentrações devem seguir o mesmo padrão, como o pico do cromatograma SEC e no ensaio de transferência de fio. - Distribuir a cada fração em 5 alíquotas µ l e snap freeze em nitrogênio líquido. Loja alíquotas no-80 ˚ c. Selecionado para o armazenamento de frações são tipicamente entre 200-600 nM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
PFV intasomes são montados de recombinação IN e vDNA. Após a montagem, intasomes são purificados pela SEC (Figura 1). Atividade de integração de cada fração é analisada com um supercoiled DNA alvo e agarose electroforese do gel (Figura 2). Este gel é fotografado com um scanner fluorescente definido para detectar EtBr (e fluoróforo, se rotulado de fluoróforo vDNA é usado). Volumes de pixel de banda usando o software de análise de imagem, podem ser usados para calcular a eficiência de integração (Figura 3). Fracções com a mais alta eficiência de integração são snap congelado para uso posterior. Fracções congeladas mantém atividade de integração (Figura 4), permitindo a conservação a longo prazo de intasomes montado. Qualquer molécula de rótulo e sua posição dentro do vDNA podem afetar a eficiência de montagem de intasome (Figura 5).
Figura 1: cromatograma de exclusão de tamanho. Um conjunto de intasome PFV foi separado com uma coluna de SEC de agarose. Esta coluna permite a separação do agregado (1), PFV intasome consistindo de um tetrâmero de PFV IN e vDNA dois (2) e monomérico PFV IN e vDNA (3). Este exemplo incluído vDNA com um rótulo de fluoróforo Cy5 interno detectado pela excitação de nm 650. O eixo y denota a densidade óptica (OD) em unidades de milli-absorvância (mAU). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: ensaio de integração de fracções de SEC. (A) esquema de reação de transferência de vertente de integração. Esquerda, dos desenhos animados de um intasome PFV incluindo um tetrâmero de em (círculos azuis) e dois vDNA (linhas pretas espessas) e um plasmídeo de alvo (linhas pretas finas). Os supercoils (SC), do plasmídeo de destino não são desenhados. Centro, dos desenhos animados de um produto de integração meia-site (HSI) quando um vDNA covalentemente ingressou para o plasmídeo de alvo. A reação de ingresso introduz um nick e relaxa os supercoils. Bem, dos desenhos animados de um produto de integração concertada (CI), onde dois vDNAs se uniram ao ADN do alvo. Este produto de integração resulta em um DNA linear com vDNAs nas extremidades. (B) plasmídeo Supercoiled DNA foi adicionado a cada fração de SEC #49-55. Após incubação, as reações de integração foram desproteínado e separaram por eletroforese em gel de agarose 1% contendo EtBr. Controlo negativo foi Plasmídeo com nenhuma proteína (T). Marcadores de tamanho de DNA são mostrados em kb. Produtos de integração de supercoiled plasmídeo (SC), concertado (CI), produtos de integração meia-site (HSI) e vDNA são indicados. (C) o agarose gel foi digitalizada para a presença de Cy5. Só o vDNA, CI e HSI produtos são visíveis. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: quantificação de ensaio integração. O gel de agarose da Figura 2 foi digitalizado e quantificar a presença de EtBr (A) e (B) Cy5. (A) para o cálculo de EtBr, volumes de pixel de banda HSI, CI e SC foram obtidos usando software de análise de gel. Eficiência de integração foi calculada dividindo o volume de pixel de produtos de integração concertada (CI) pelo volume total de pixel de todas as três bandas (HSI + CI + SC). Por exemplo, os valores de pixel no EtBr canalizar para as bandas da fração #49 são: 110565.2 SC, 25152.56 CI e 6313.04 HSI. O valor de pixel de DNA total para fração #49 é a soma desses valores, 142030.8. A eficiência de integração é o volume de pixel de CI da 25152.56 dividido pelo valor de DNA total 142030.8 igualando 0.18. (B) Cy5 CI volumes de pixel de banda são graficamente como unidades arbitrárias. Fracções com atividade de integração de pico são individualmente aliquotadas e congelados. Neste exemplo, frações #50-53 foram selecionadas. Alíquotas são snap congelado com nitrogênio líquido e armazenado a-80 ˚ c para uso futuro.
Figura 4: efeito do congelamento na atividade de intasome. Metade da fração de um segundo foi flash congelado com nitrogênio líquido, armazenado a-80 ˚ c por 1h e então lentamente descongeladas no gelo. A metade restante da fração SEC foi mantido no gelo em uma sala fria, enquanto o primeiro semestre foi congelado e descongelado. Intasomes foram testados para a atividade sem (-) e com (+) congelamento/descongelamento. Eficiência de integração foi medida conforme descrito acima. (A) EtBr manchada de gel de agarose dos produtos da reacção de integração. Supercoiled plasmídeo (SC), concertado integração produtos (CI), metade-site de integração (HSI) e não tenha reagido vDNA são indicados. Marcadores de tamanho de DNA são mostrados em kb. (B) a quantificação da eficiência da imagem EtBr integração. Cálculos são descritos na legenda da Figura 3 . Não há nenhuma perda de atividade de integração após congelação e descongelação. A eficiência média de integração é mostrada para 5 experimentos independentes com 2 intasome preparações. Barras de erro indicam o desvio padrão. Teste t pareado análises renderam um P bicaudal = 0.011, sugerindo que o congelamento/descongelamento pode ligeiramente realçaram atividade de integração. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: rotular impactos molécula e posição de montagem intasome. Conjuntos de intasome PFV incluíam vDNAs que estavam sem rótulo (vermelho), final rotulado na Oligo 2 com Cy5 (azul), internamente rotulados em Oligo 1 com Cy5 (preto) ou fim rotulado na Oligo 2 com biotina (laranja). Todos os assemblies foram separados com uma coluna de agarose SEC. O eixo y denota OD em mAU. Cromatogramas são representativas de pelo menos 2 conjuntos independentes de cada tipo de intasome. Rotulagem final reduz o rendimento do PFV intasomes com Cy5 10-fold e biotina 1.8-fold. Conjuntos de Cy5 e biotina final ter precipitado visivelmente mais restante após alta sal resolubilization (passo 3.5), resultando em perda aparente do material na coluna de exclusão de tamanho. Rotulagem interna do vDNA com o fluoróforo Cy5 leva a um rendimento igual de intasomes como vDNA sem rótulo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Retroviral INs formam uma complexo com DNA genômico viral para realizar a integração e continuar o ciclo de vida viral de multiméricas. O número de em monômeros por intasome pode ser tetrâmeros, octamers ou possivelmente maior ordem oriundas de11,12,13,14. PFV intasomes são um tetrâmero de recombinante com oligômeros de DNA dupla-hélice que imitam o DNA genômico viral termina3. Esses intasomes têm sido utilizados em estudos estruturais e dinâmico3,5,13,14.
A montagem de PFV intasomes ocorre durante a diálise de um buffer de relativamente alta concentração de sal para uma baixa concentração de sal. Isso resulta na formação de um precipitado que inclui o intasomes PFV. Os intasomes são solubilizados, aumentando a concentração de sal. PFV IN tem demonstrado ser monomérica em concentrações até 225 µM5. Os complexos são então isolaram do monoméricos em e livre vDNA pela SEC. Modificamos a purificação do PFV intasomes para incluir o glicerol no SEC reserva6. A adição de glicerol permite o intasomes PFV ser congelado para uso futuro sem perda de atividade (Figura 4).
Existem várias características-chave do presente protocolo. Apesar de purificação de proteínas é frequentemente realizada a baixas temperaturas, encontramos empiricamente que a montagem de intasome PFV é ineficiente no 4 ˚ c. Em vez disso, a diálise de montagem deve ocorrer na faixa de 18 a 22 ˚ c. Também é importante usar recombinante PFV em que está livre de contaminação bacteriana da nuclease7,8. Finalmente, a relação da IN para vDNA é um factor-chave do assembly. Se o arranque na concentração da proteína é menor do que o recomendado aqui, a concentração de vDNA deve ser reduzida proporcionalmente. Enquanto é possível montar PFV intasomes em concentrações inferiores, os complexos devem ser em alta bastante concentração para detecção durante a separação do SEC.
Esse método pode ser usado para PFV intasomes com vDNA sem rótulo ou rotulado. Nós achamos que o vDNA pode eficientemente ser etiquetado com um fluoróforo ou biotina6. Outros rótulos pequena molécula também podem ser possíveis. No caso de fluoróforo Cy5, encontramos o efeito rotulado vDNA reduz o rendimento de intasomes montado com a pico de concentração reduzida 10-fold. No entanto, internamente Cy5 rotulado vDNA tem um rendimento equivalente a vDNA sem rótulo. Esse método de montagem também pode ser usado com mutações de ponto ou mutações de truncamento de PFV em4. Desde que em PFV é inibida por IN clinicamente relevante vertente transferência inibidor (INSTI) drogas visando IN HIV-1, é possível usar estes intasomes PFV para estudar o mecanismo de INSTIs3. Além disso, algumas mutações INSTI resistentes de HIV-1 IN ocorrem em resíduos conservados em IN PFV, permitindo estudos de resistência de droga com engenharia PFV intasomes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo NIH AI099854 e AI126742 a chave.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNA Oligomers | IDT | N/A | Custom DNA Oligos |
| Tris Ultra Pure | Gojira Fine Chemicals | UTS1003 | |
| NaCl | P212121 | RP-S23020 | |
| UltraPure EDTA | Invitrogen/Gibco | 15575 | |
| Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filters | Sigma-Aldrich | Z677094-24EA | 3 kDa MWCO |
| DTT | P212121 | SV-DTT | |
| BIS-TRIS propane,>=99.0% (titration) | Sigma-Aldrich | B6755-500G | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | 208086 | |
| MgSO4 | Amresco | 0662 | |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | G37-20 | |
| Gel-loading tips, 1 - 200 μL | Corning | CLS4853-400EA | |
| Razor blade; Single-edged; 100/Pk.; Pack of 100 | Fisher Scientific | 12-640 | |
| Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane > 250mL | Thermo Fisher Scientific | 568-0020 | |
| Dialysis tubing clips | Spectrum Labs | 132734 | |
| 6-8 kDa 10 mm Dialysis Tubing | Spectrum Medical | 132645 | |
| Superose 6 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | 17517201 | |
| Hi-Res Standard Agarose | AGTC Bioproducts | AG500D1 | |
| Ethidium bromide | Thermo Fisher Scientific | BP1302 | |
| Orange G | Fisher Scientific | 0-267 | |
| Hyladder 10kb, 500 lanes | Denville Scientific | CB4225-4 |
References
- Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. Retroviruses. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1997).
- Valkov, E., et al. Functional and structural characterization of the integrase from the prototype foamy virus. Nucleic Acids Res. 37 (1), 243-255 (2009).
- Hare, S., Gupta, S. S., Valkov, E., Engelman, A., Cherepanov, P. Retroviral intasome assembly and inhibition of DNA strand transfer. Nature. 464 (7286), 232-236 (2010).
- Li, M., Lin, S., Craigie, R. Outer domains of integrase within retroviral intasomes are dispensible for catalysis of DNA integration. Protein Sci. 25 (2), 472-478 (2016).
- Gupta, K., et al. Solution conformations of prototype foamy virus integrase and its stable synaptic complex with U5 viral DNA. Structure. 20 (11), 1918-1928 (2012).
- Jones, N. D., et al. Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration. Nat Commun. 7, 11409 (2016).
- Lopez, M. A., Mackler, R. M., Altman, M. P., Yoder, K. E. Detection and removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase. J Vis Exp. , (2017).
- Lopez, M. A., Mackler, R. M., Yoder, K. E. Removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase. J Virol Methods. 235, 134-138 (2016).
- Poirier, M. G., Bussiek, M., Langowski, J., Widom, J. Spontaneous access to DNA target sites in folded chromatin fibers. J Mol Biol. 379 (4), 772-786 (2008).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).
- Ballandras-Colas, A., et al. Cryo-EM reveals a novel octameric integrase structure for betaretroviral intasome function. Nature. 530 (7590), 358-361 (2016).
- Ballandras-Colas, A., et al. A supramolecular assembly mediates lentiviral DNA integration. Science. 355 (6320), 93-95 (2017).
- Passos, D. O., et al. Cryo-EM structures and atomic model of the HIV-1 strand transfer complex intasome. Science. 355 (6320), 89-92 (2017).
- Yin, Z., et al. Crystal structure of the Rous sarcoma virus intasome. Nature. 530 (7590), 362-366 (2016).
- Maertens, G. N., Hare, S., Cherepanov, P. The mechanism of retroviral integration from X-ray structures of its key intermediates. Nature. 468 (7321), 326-329 (2010).
- Maskell, D. P., et al. Structural basis for retroviral integration into nucleosomes. Nature. 523 (7560), 366-369 (2015).
