Summary
Рекомбинантных ретровирусной интеграза и ДНК олигомеров, подражая вирусной ДНК концы могут образовывать ферментативно активный комплекс, известный как intasome. Intasomes может использоваться для исследования биохимических, структурных и кинетические. Этот протокол описывает собрать и очистить прототип пенистый вирус intasomes.
Abstract
A определение функции и необходимый шаг жизненного цикла ретровируса является интеграция вирусного генома в геноме принимающей. Все ретровирусы кодировать фермент интеграза (IN), который катализирует ковалентных присоединения вирусных хост ДНК, который известен как стренги передачи. Интеграция может быть моделируется в пробирке с рекомбинантным антиретровирусного лечения в и ДНК олигомеров, подражая концы вирусного генома. Для того, чтобы более тесно пилки интеграции реакции, которая происходит в естественных условиях, интеграции комплексы собираются из рекомбинантных IN и синтетические олигомеров методом диализа в буфере снижение концентрации соли. Интеграции комплекса, называется intasome, может очистить хромотографией размер исключения. В случае прототип пенистый вирус (PFV) intasome Тетрамер IN и два ДНК олигомеров и легко отделяется от мономерных IN и бесплатные олигомера ДНК. Эффективность интеграции PFV intasomes может assayed под целый ряд экспериментальных условиях, чтобы лучше понять динамику и механики ретровирусной интеграции.
Introduction
Интеграция вирусного генома в геноме хост это обязательный шаг в жизненном цикле все ретровирусы1. Вирусный фермент интеграза (IN) катализирует ковалентных присоединения каждого конца вирусной ДНК генома к хосту ДНК. Во время сотовой инфекции в является частью комплекса до интеграции, которая опосредует интеграции. В рекомбинантной complexed с двойной мель ДНК олигомеров, подражая вирусной ДНК концы можно также выполнить интеграцию целевых ДНК в пробирке2. Общей интеграции пробирного в vitro использует supercoiled плазмиды ДНАО цели. Интеграция обеих вирусной ДНК олигомеров (vDNA) для плазмида приводит в линейный продукт и называется согласованной интеграции (рисунок 2A). Интеграции пробирного в пробирке может также принести продуктов с ковалентно присоединены к целевой плазмида, что приводит к расслабленной круг только один vDNA. Этот продукт интеграции половину сайт, как представляется, артефакт пробирного в пробирке.
В рекомбинантной и vDNA могут выполнять интеграцию в пробирке, но они не являются идеальным реагенты для изучения динамики или структуры интеграции комплексов, когда мономерных в будет затушевывать соответствующие визуализации. Очищенный интеграции комплексов, или «intasomes,» необходимы для анализа или структурные исследования динамических одной молекулы. PFV IN и vDNAs могут собираться методом диализа с относительно высокой концентрации соли буфера меньше концентрация соли3,4. Во время диализа, преципитат формы. Этот осадок удаляется из диализа и увеличение концентрации соли. Более высокие концентрации соли solubilizes осадок содержащий PFV intasomes. Intasomes затем очищенная методом размер гель-проникающей хроматографии (SEC). Было показано, что рекомбинантных прототип пенистый вирус (PFV) в существование в качестве мономера в растворе в концентрациях до 225 мкм5. SEC фракционирование эффективно отделяет PFV intasomes (225.5 кДа), который включает в себя Тетрамер PFV в и два vDNAs, от мономерных PFV в (44,4 кДа) и бесплатные vDNA (24.0 кДа). PFV intasomes могут быть заморожены и удерживать интеграции деятельности по крайней мере шесть месяцев хранения на-80 градусов.
Рекомбинантных PFV intasomes также могут быть изменены для включения в аминокислотных замен или усечение мутации или vDNAs помечены флуорофоров или биотин4,6. Очищенный intasomes PFV легко выполнить интеграцию в мишень supercoiled плазмида ДНК в пробирке. Массовых анализов биохимической интеграции с intasomes может проверить последствия в мутации, ингибиторы, или других химических добавок. Биотинилированным intasomes может использоваться для датчика близости с нуклеиновых кислот и белков. PFV intasomes функционируют при температуре окружающей среды, позволяя одной молекулы микроскопии анализа Магнитные пинцеты для измерения времени между присоединения двух концах vDNA или полное внутреннее отражение флуоресценции для визуализации intasome Поиск цели ДНК6. Кроме того PFV intasomes были первым быть структурно характеризуется значительно влияющих области антиретровирусного лечения интеграции3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. отжиг из vDNA
- Комбинат 1 X 10 буфера (10 X 10 складе: 100 мм трис-HCl, рН 8,0, 1 M NaCl, ЭДТА 10 мм), 10 мкм 1 Oligo (5' ATTGTCATGGAATTTTGTATATTGAGTGGCGCCCGAACAG 3', 100 мкм складе) и 10 мкм Oligo 2 (5' CTGTTCGGGCGCCACTCAATATACAAAATTCCATGACA 3', запас 100 мкм) в окончательном объеме 1,5 мл . Аликвота 25 мкл в шестьдесят 0,2 мл полимеразной цепной реакции (ПЦР) трубы.
Примечание: В зависимости от приложения, олигомеры может быть изменен с флуорофоров или теги в 5'-конце Oligo 2 или как внутреннего амино T в базовый 13 от 5'-конце Oligo 1. Изменение олигомеров должны быть очищены высокопроизводительных жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) до отжига. Мы нашли, что 5'-конце Cy3 и Cy5 Флюорофор маркировки Oligo 2 снижает эффективность Ассамблея intasome в 10 раз. Внутренние Флюорофор маркировки не снижать эффективность Ассамблеи. - Отжиг Термоциклер с помощью следующих раз и температуры: 1 цикл в 94.0 ˚C 3 мин., 99 циклов в (94.0 ˚C 1 мин, 93,6 ˚C 1 мин) уменьшение обоих температур 0,8 ° c за цикл (последний цикл составляет 14,8 градусов 1 мин, 14,4 ˚C 1 мин) и хранить в 4.0 ˚C.
- Объединить отжига реакции от всех шестидесяти трубы. Загрузите 500 мкл до двух 0,5 мл 3 кДа молекулярный вес отсечки (MWCO) ultracentrifugal фильтр концентрации единиц. Концентрат отожженная vDNA центрифугированием в microcentrifuge в 14.000 x g 10 мин при комнатной температуре (RT).
Примечание: Концентрируются объем должен быть ~ 50 мкл в каждом подразделении концентрации. - Слейте через поток. 250 мкл оставшихся отожженная vDNA, каждый блок фильтра. Повторите спин и отбросить через поток. Буфер обмена в буфер TE (10 мм трис-HCl, рН 8,0, 1 мм ЭДТА) путем промывания три раза с 450 мкл TE.
- Инвертировать фильтр и спина на 1000 x g на 2 мин на RT. Окончательный концентрируются объем для каждого подразделения, фильтр должен быть ~ 50 мкл. объединить retentates и передачи 1,5 мл колпачок.
- Измерьте абсорбция 260 Нм ультрафиолетового (УФ) vDNA. Это значение используется для расчета окончательного молярной концентрации ДНК. Коэффициент вымирания (260ε) этот vDNA-622,803 см-1 М-1 и его молекулярная масса является 23,972 ПДР магазина на уровне-20 ° c.
2. Intasome Ассамблея
- Если это возможно выполните Ассамблея intasome в маленькой комнате с переменной термостат. Отрегулируйте термостат до приблизительно 18-22 ˚C.
Примечание: В нашем опыте, неэффективно intasome Ассамблеи на 4 градусов. - Подготовка 1 Л диализа буфера (20 мм бис трис пропан, pH 7.5, 200 мм NaCl, 2 мм Дитиотреитол (DTT), 25 мкм ZnCl2) в 2 Л стакан с баром переполох на табличке, перемешать. Сбалансировать буфер в зале 18-22 ° c для по крайней мере 6 ч.
- Чтобы собрать intasomes, сочетать пропан 50 мм бис трис, pH 7.5, 500 мм NaCl, 120 мкм PFV в и 50 мкм vDNA в общем объеме 150 мкл.
Примечание: PFV в должна быть свободной от загрязнения нуклеиназы деятельности7,8. Если концентрация PFV в слишком разреженных, чтобы вместить 120 мкм в объема 150 мкл, то можно увеличить окончательный объем до 200 мкл. Важнейшими факторами этого шага являются для поддержания молярное соотношение в vDNA (2.4:1) и иметь достаточно комплекс для визуализации при хроматографии. - Очистите ~ 10 см длинный кусок 10-мм 6-8 кДа MWCO диализа НКТ и клипы с двойной дистиллированной воды (ddH2O) или высокой чистоты воды. Прикрепите один конец трубки.
Примечание: Диализ труб следует рассматриваться с осторожностью во избежание любого возможного загрязнения от пространства в лаборатории. - Сделайте 15 мл буфера промывки труб диализа (пропан 50 мм бис трис, pH 7.5, 500 мм NaCl). Промывайте внутри трубы диализа три раза с 1-2 мл промывки буфера. Удалите как можно больше промойте буфера как можно с пипеткой и тонкого геля загрузки подсказки.
- При необходимости используйте чистые лезвия бритвы или скальпеля для резки труб диализа, таким образом, чтобы кончик тонкой гель загрузки может достичь к концу трубки.
- Передать intasome Ассамблеи на шаге 2.3 диализа трубки с пипетки и тонкий гель загрузки подсказки. Клип открытый конец трубы диализа, свести к минимуму количество воздуха, представил в трубку. Место труб в буфере диализа.
- Dialyze ночи (16-20 ч) с нежным перемешивания так, чтобы трубка вращается, но не в вихрь. Убедитесь, что диализа Трубы погружные и мобильных. После приблизительно одного часа наблюдать видимый преципитат внутри труб.
Примечание: С Cy3 и Cy5 дневно помечены vDNA, осадок является более очевидным. Это верно для конца помечены и внутренне помечены флуоресцентный vDNA.
3. Intasome солюбилизация
- Подготовьте две широкие родила наконечники, удалив 2-4 мм от конца 200 мкл наконечник с нового лезвия бритвы или скальпель на чистую поверхность.
Примечание: Советы будет использоваться на шаге 3.3 и 3.5. - Удаление диализа труб из буфера диализа. Для того, чтобы избежать разбавления образца intasome с диализа буфера, которые могут оставаться в конце трубки возле клипа, используйте микропипеткой с наконечником небольшой пипетку для удаления любой избыток диализа буфер. Удалите клип из одного конца трубы диализа.
- Использование широкого родила наконечник пипетки от шаг 3.1 для передачи образцов, включая осадок внутри трубы диализа для 1.5 мл на льду. Обратите внимание, общий объем изъятых материалов; Общий объем составляет обычно ~ 140 мкл.
- Образец с осадком находится на расстоянии 200 мм NaCl; увеличения соли до конечной концентрации 320 мм NaCl, добавив соответствующий объем запасов 5 М раствора NaCl. Например, для образца 150 мкл, мкл 3,9 М NaCl и 1.1 мкл ddH2O для окончательного количества 155 мкл. Передача ведро льда с образца в холодной комнате 4 градусов.
- Использование широкого родила наконечник пипетки от шаг 3.1 Ресуспензируйте и солюбилизировать последнего осадок, закупорить. Повторяйте каждые 20 мин для по крайней мере 1 h. наблюдать, что большинство осадок должен идти в раствор.
Примечание: Дозирование Ресуспензируйте осадок может быть остановлена, когда становится очевидным, что осадок не заметно уменьшается между моментами времени. Когда vDNA не обозначена или внутренне помечены, осадок уменьшается ~ 90% на основе визуального осмотра. В случае Cy5 конец помечены vDNA осадок уменьшается только ~ 20%; Большая часть осадка с Флюорофор концом, помечены vDNA не будет солюбилизировать последнего. Количество осадка, который эффективно солюбилизирован является переменной и должно определяться эмпирически.
4. Intasome очистки
- Подготовка 250 мл размер гель-проникающей хроматографии (SEC) работает буфер (20 мм бис трис пропан, pH 7.5, 320 мм NaCl, 10% глицерина). Стерильные фильтр буфер с 0,2 мкм фильтр блока и хранить при 4 ° c.
Примечание: Все очистки шаги выполняются в холодной комнате 4 градусов. - Сбалансировать столбец сшитого агарозы SEC (диаметр = 10 мм; длина = 300 мм; кровать тома = 24 мл; объем пробы = 25-500 мкл; максимальное давление = 1,5 МПа; исключение предел = 4 x 107 да; отделяет молекулярным весом между 5 и 5000 кДа, см циновка таблицы erials) с SEC идущий буфер со скоростью потока 0,4 мл/мин.
Примечание: Этот очистки может быть адаптирована к разного размера исключение столбцов если они способны эффективно отделить 300 кДа от 44 кДа, например Superose 12 10/300 GL или Superose 6 увеличение. Superose 12 10/300 GL имеет более низкое разрешение, ведет к более совпадения пиков. И наоборот Superose 6 увеличение имеет высокое разрешение и предлагает лучшее разделение. - Центрифуга intasome образца в отцентрифугировать в 14.000 x g 10 мин на 4 ° c для пеллет любые оставшиеся преципитат. Осторожно удалите супернатант. Загрузите супернатант в цикл впрыска 200 мкл (трубы, который может содержать ~ 200 мкл). Примените образец к столбцу сек.
Примечание: Меньшие объемы нагрузки позволяют большее разрешение, SEC. - Элюировать с 25 мл сек работает буфер и собирать 95 фракций 270 мкл. наблюдать, что Хроматограмма SEC показывает три вершины260 A280/a (рис. 1).
Примечание: Первая должна быть агрегатную (~9.0 - элюции 11,5 мл), а затем PFV Тетрамер intasome пик (~12.0 - элюции 14.75 мл) и PFV на мономера с бесплатным vDNA пик (~15.0 - 18,0 мл).
5. Интеграция Strand передачи Assay, фракция выбора и хранения
- Объединить 2 мкл каждой фракции пик intasome и 50 нг 3 КБ supercoiled плазмидной ДНК (фондовых концентрация составляет 50 нг/мкл) в реакции буфера (10 мм бис трис пропан, pH 7.5, 110 мм NaCl, 5 мм MgSO4, 4 мкм ZnCl2, 10 мм DTT) в объеме 15 мкл окончательной реакции. Инкубируйте на 37 градусов в течение 5 мин.
- Включите отрицательный контроль с не добавлен PFV intasome. Остановить реакции с 0,75 мкл протеиназы K (Стоковый раствор 20 мг/мл) и 0,75 мкл SDS (10% раствор). Инкубируйте на 55 ° c для образцов магазина 1 ч. при необходимости на уровне-20 ° c для последующего анализа.
Примечание: Этот assay является качественной оценки деятельности по интеграции. Молярная концентрация intasome каждой фракции не определена до этот assay. Фракции, включены в assay переноса стренги интеграции могут храниться на льду (включая ночь хранения) до интеграции деятельность подтверждается и отдельных фракций aliquoted. Здесь мы используем pMP2, производные pUC199. Мы также успешно использовали 5.4 kb плазмида pcDNA 3.1. Плазмиды, которые могут быть решены спокойно круг, линейная, и supercoiled форм может использоваться в качестве целевой для интеграции. - Подготовка 120 мл 1% веса на геле агарозы тома (w/v) 1 X TAE буфера (40 мм трис ацетат, 1 ЭДТА) с 0,1 мкг/мл ethidium бромид (бромистый этидий, раствор 10 мг/мл)10. Растопить агарозы решения и налить его в лоток литья гель 15 x 10 см. Вставка 15-Ну гребень с 5-мм широкий, 0,75 мм толщиной скважин.
Примечание: Узкий скважин дают лучшее разрешение группы, по сравнению с 1,5 мм толщиной скважин. - Разрешить гель затвердевают при комнатной температуре. Погружайте гель в 1 X TAE с 0,1 мкг/мл бромистый этидий.
- Добавьте 3 мкл 50% глицерина в каждой интеграции реакции от шага 5.2. Загрузите весь реакции объем геля. Загрузить 1 мкл 10 kb ДНК размер маркера (150 нг/мкл запасов концентрации) полосы по обе стороны образцов; Иными словами размер маркера ДНК следует фланг образца полос.
- В наружной Лейн нагрузки 6 мкл G оранжевый краситель (0,25% оранжевый G, 30% глицерина). Побегите гель при постоянном напряжении, 10 V/см (100 V) при температуре окружающего воздуха за 1 ч, или до тех пор, пока краска передний оранжевый G достигает конца геля.
- Сразу же изображение агарозном геле с флуоресцентные сканера, набор для обнаружения бромистый этидий (532 нм возбуждения, 610 Нм фильтра выбросов). Если Флюорофор помечены vDNAs были использованы, также изображения с соответствующим Флюорофор параметры.
Примечание: например, для обнаружения Cy5 помечены ДНК, изображения с помощью 633 нм возбуждения и 670 нм выбросов фильтры. Согласованной интеграции продуктов (CI, линейной ДНК) следует выставить истинный размер ~ 3 КБ, непрореагировавшего supercoiled плазмиды (SC) должны быстрее (~ 2 kb), и половина сайт интеграции продуктов (HSI, расслабленной круг ДНК) должен выполняться медленнее (~3.5 kb). Непрореагировавшего vDNA следует выставить истинный размер ~ 40 bp. - Количественно полос в каждом Лейн с изображений программного обеспечения7. Рассчитать долю ДНК в каждой полосе, CI, HSI или SC; vDNA не входит в этот расчет.
Примечание: Эффективность интеграции, или часть SC, преобразованы в линейный продукт, был рассчитан путем деления пиксель объем согласованной интеграции продуктов (CI) по объему всего пиксель трех диапазонах (HSI + CI + SC). Если intasomes Флюорофор с надписью, HSI и CI продукты могут также предел по флуоресценции. - Выберите фракции, которые имеют наиболее согласованной интеграции деятельности.
Примечание: В нашем опыте, пик согласованной интеграции деятельности совпадает с пик белка, определены как tetrameric PFV intasomes. Измерить A280 каждого из этих фракций и вычислить окончательное intasome концентрации. Ε280 для Тетрамер дикого типа PFV в с двумя vDNAs, описанные здесь-908,339 см-1М-1 и молекулярная масса является 225.5 кДа. Концентрации должны следовать той же схеме, как пик Хроматограмма SEC и в assay переноса стренги. - Распространять каждой фракции в 5 мкл аликвоты и защелкните замораживание в жидком азоте. Хранить аликвоты на-80 градусов. Фракции, отобранных для хранения, как правило, между 200-600 Нм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
PFV intasomes собираются из рекомбинантных IN и vDNA. После сборки intasomes очищаются от SEC (рис. 1). Интеграция деятельности каждой фракции assayed с supercoiled цели и агарозы электрофорез геля дна (рис. 2). Этот гель образы с флуоресцентные сканера, набор для обнаружения бромистый этидий (и Флюорофор, если используется Флюорофор меченых vDNA). С помощью программного обеспечения для анализа изображений, группа пикселей тома может использоваться для расчета эффективности интеграции (рис. 3). Дроби с наивысшей эффективности интеграции являются оснастки, замороженные для последующего использования. Замороженные фракций сохраняют интеграции деятельности (рис. 4), позволяя для длительного хранения собрал intasomes. Любая молекула, этикетки и его место в vDNA может повлиять на эффективность Ассамблеи intasome (рис. 5).
Рисунок 1: размер исключения хроматограммы. Ассамблея intasome PFV была отделена со столбцом SEC агарозы. Этот столбец позволяет для разделения совокупности (1), PFV intasome, состоящий из Тетрамер PFV IN и двух vDNA (2), и мономерных PFV в vDNA (3). В этом примере включены vDNA с внутренней Cy5 Флюорофор этикетки определяется 650 Нм возбуждения. Ось y обозначает оптической плотности (ОД) в единицах оптической плотности Милли (МАУ). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: интеграция пробирного SEC фракций. (A) схема интеграции стренги передачи реакции. Слева, мультфильм PFV intasome, включая Тетрамер о в (синие круги) и две vDNA (толстые черные линии) и целевой плазмида (тонкие черные линии). Supercoils (SC) целевой плазмида не рисуются. Центр, мультфильм половину сайт интеграции (HSI) продукта, когда один vDNA ковалентно присоединился к целевой плазмиды. Реакции присоединения вводит Ник и расслабляет supercoils. Право, мультфильм согласованной интеграции (CI) продукции, где два vDNAs присоединились к целевому ДНК. Этот продукт интеграции приводит к линейной ДНК с vDNAs на концах. (B) Supercoiled плазмида ДНК был добавлен в каждой фракции SEC #49-55. После инкубации интеграции реакции были deproteinated и отделены электрофорезом геля агарозы 1%, содержащих бромистый этидий. Отрицательный контроль был плазмида ДНК с не белка (T). Размер маркеров ДНК приведены в КБ. Указаны supercoiled плазмиды (SC), согласованной интеграции продуктов (CI), половина сайт интеграции продуктов (HSI) и vDNA. (C) агарозы гель был проверен на наличие Cy5. Только vDNA, CI и HSI продукты являются видимыми. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: количественный интеграции пробирного. Гель агарозы из рисунка 2 отсканированы и количественно на наличие бромистый этидий (A) и (B) Cy5. (A) для расчета бромистый этидий, HSI, CI и SC группы пикселей томов были получены с помощью программного обеспечения для анализа геля. Эффективность интеграции был рассчитан путем деления пиксель объем согласованной интеграции продуктов (CI) по объему всего пикселей всех трех полос (HSI + CI + SC). Например, значения пикселов в бромистый этидий канал для полосы фракции #49: 110565.2 SC, 25152.56 ди и 6313.04 HSI. Общее значение пиксела ДНК для фракция #49 является сумма этих значений, 142030.8. Эффективность интеграции является объем пикселей CI 25152.56, деленное на общее значение ДНК 142030.8, равная 0,18. (B) Cy5 CI band пиксель томов графике как условные единицы. Дроби с максимальной интеграции деятельности индивидуально aliquoted и замороженных. В этом примере были отобраны фракций #50-53. Аликвоты являются оснастки заморожены жидким азотом и температуре-80 ° c для использования в будущем.
Рисунок 4: эффект замораживания на активность intasome. Половина одного SEC фракции был флеш заморожены жидким азотом, температуре-80 ° c для 1 h, а затем медленно талой на льду. Остальная половина доли секунд хранилась на льду в холодной комнате во время первой половины был заморожен и разморозить. Intasomes были протестированы для деятельности без (-) и (+) замораживания/оттаивания. Эффективность интеграции была измерена как описано выше. (A) бромистый этидий окрашенных геля агарозы интеграции продуктов реакции. Supercoiled плазмиды (SC), согласованной интеграции продуктов (CI), половина сайт интеграции продуктов (HSI) и непрореагировавшего vDNA указаны. Размер маркеров ДНК приведены в КБ. (B) количественный эффективности интеграции от бромистый этидий изображения. Расчеты, описаны в легенде на рисунке 3 . Существует никаких потерь интеграции деятельности после замораживания и оттаивания. Показана эффективность средняя интеграции для 5 независимых экспериментов с 2 intasome препаратов. Планки погрешностей указать стандартное отклонение. Парный t тест анализы принесли двустороннее P = 0,011, предполагая, что замораживания/оттаивания может слегка усиленной интеграции деятельности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: этикетка молекулы и положение воздействия intasome Ассамблея. PFV intasome сборки включены vDNAs, которые были без метки (красный), конец, помечены на Oligo 2 с Cy5 (blue), внутренне помечены на Oligo 1 с Cy5 (черный) или конце Oligo 2 помечены биотин (оранжевый). Все сборки были разделены со столбцом агарозы сек. Ось y обозначает ОД в МАУ. Хроматограммы представляют по крайней мере 2 независимых сборок каждого типа intasome. Конце маркировки уменьшает доходность PFV intasomes с Cy5 10 раз и биотин 1.8-fold. Конец Cy5 и биотин сборки имеют намного больше преципитат, оставшиеся после высокой соли resolubilization (шаг 3.5), что приводит к явной утраты материалов на столбце исключения размер. Внутренняя маркировка vDNA с Флюорофор Cy5 приводит к равной доходности intasomes как немеченого vDNA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Антиретровирусные модулей образуют multimeric комплекс с вирусной геномной ДНК для выполнения интеграции и продолжить вирусный жизненного цикла. Количество в мономеров в intasome может быть тетрамера, octamers или возможно выше порядок мультимеры11,12,,1314. PFV intasomes являются Тетрамер рекомбинантного с двуцепочечной ДНК олигомеров, которые имитируют вирусный геномной ДНК заканчивается3. Эти intasomes были использованы в структурных и динамических исследований3,5,,1314.
Ассамблея PFV intasomes происходит во время диализа с относительно высокой концентрации соли буфера более низкой концентрации соли. Это приводит к образованию осадка, который включает в себя PFV intasomes. Intasomes солюбилизирован путем увеличения концентрации соли. В PFV было показано, быть мономерных в концентрациях до 225 мкм5. Комплексы затем изолированы от мономерных в и свободной vDNA, SEC. Мы изменили очистки PFV intasomes включить глицерина в буфер SEC6. Добавление глицерола позволяет PFV intasomes быть заблокированы для дальнейшего использования без потери активности (рис. 4).
Есть несколько ключевых особенностей этого протокола. Хотя очищение протеина часто выполняется при низких температурах, мы нашли эпирически что PFV intasome Ассамблея является неэффективным в 4 градусов. Вместо этого Ассамблея диализа должно происходить в диапазоне 18-22 ˚C. Это также важно для использования рекомбинантных PFV в, которое свободно от заражения бактериальной нуклеиназы7,8. Наконец соотношение в vDNA является ключевым фактором Ассамблеи. Если здесь ниже, чем рекомендованные начиная с концентрацией белка, концентрация vDNA должно быть уменьшено пропорционально. Хотя это можно собрать PFV intasomes при более низких концентрациях, комплексы должны быть на высоком достаточно концентрации для обнаружения во время разделения сек.
Этот метод может использоваться для intasomes PFV с неподписанных или метками vDNA. Мы обнаружили, что vDNA может быть эффективно помечены Флюорофор или биотин6. Возможно также другие малые молекулы этикетки. В случае Флюорофор Cy5 мы находим, что конец, помечены vDNA снижает урожай собран intasomes с пик концентрации в 10 раз сократить. Однако внутри Cy5 помечены vDNA имеет эквивалентную доходность к немеченому vDNA. Этот метод Ассамблея может также использоваться с точечные мутации или усечение мутации PFV в4. Так как в PFV ингибируется, клинически значимых в прядь передачи ингибитора (INSTI) лекарств против ВИЧ-1 в, можно использовать эти intasomes PFV для изучения механизма INSTIs3. Кроме того некоторые INSTI резистентных мутаций ВИЧ-1 в происходят на сохранившихся остатков в PFV, позволяя исследования лекарственной устойчивости с инженерии PFV intasomes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана низ AI099854 и AI126742 к ключу.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNA Oligomers | IDT | N/A | Custom DNA Oligos |
| Tris Ultra Pure | Gojira Fine Chemicals | UTS1003 | |
| NaCl | P212121 | RP-S23020 | |
| UltraPure EDTA | Invitrogen/Gibco | 15575 | |
| Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filters | Sigma-Aldrich | Z677094-24EA | 3 kDa MWCO |
| DTT | P212121 | SV-DTT | |
| BIS-TRIS propane,>=99.0% (titration) | Sigma-Aldrich | B6755-500G | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | 208086 | |
| MgSO4 | Amresco | 0662 | |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | G37-20 | |
| Gel-loading tips, 1 - 200 μL | Corning | CLS4853-400EA | |
| Razor blade; Single-edged; 100/Pk.; Pack of 100 | Fisher Scientific | 12-640 | |
| Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane > 250mL | Thermo Fisher Scientific | 568-0020 | |
| Dialysis tubing clips | Spectrum Labs | 132734 | |
| 6-8 kDa 10 mm Dialysis Tubing | Spectrum Medical | 132645 | |
| Superose 6 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | 17517201 | |
| Hi-Res Standard Agarose | AGTC Bioproducts | AG500D1 | |
| Ethidium bromide | Thermo Fisher Scientific | BP1302 | |
| Orange G | Fisher Scientific | 0-267 | |
| Hyladder 10kb, 500 lanes | Denville Scientific | CB4225-4 |
References
- Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. Retroviruses. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1997).
- Valkov, E., et al. Functional and structural characterization of the integrase from the prototype foamy virus. Nucleic Acids Res. 37 (1), 243-255 (2009).
- Hare, S., Gupta, S. S., Valkov, E., Engelman, A., Cherepanov, P. Retroviral intasome assembly and inhibition of DNA strand transfer. Nature. 464 (7286), 232-236 (2010).
- Li, M., Lin, S., Craigie, R. Outer domains of integrase within retroviral intasomes are dispensible for catalysis of DNA integration. Protein Sci. 25 (2), 472-478 (2016).
- Gupta, K., et al. Solution conformations of prototype foamy virus integrase and its stable synaptic complex with U5 viral DNA. Structure. 20 (11), 1918-1928 (2012).
- Jones, N. D., et al. Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration. Nat Commun. 7, 11409 (2016).
- Lopez, M. A., Mackler, R. M., Altman, M. P., Yoder, K. E. Detection and removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase. J Vis Exp. , (2017).
- Lopez, M. A., Mackler, R. M., Yoder, K. E. Removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase. J Virol Methods. 235, 134-138 (2016).
- Poirier, M. G., Bussiek, M., Langowski, J., Widom, J. Spontaneous access to DNA target sites in folded chromatin fibers. J Mol Biol. 379 (4), 772-786 (2008).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).
- Ballandras-Colas, A., et al. Cryo-EM reveals a novel octameric integrase structure for betaretroviral intasome function. Nature. 530 (7590), 358-361 (2016).
- Ballandras-Colas, A., et al. A supramolecular assembly mediates lentiviral DNA integration. Science. 355 (6320), 93-95 (2017).
- Passos, D. O., et al. Cryo-EM structures and atomic model of the HIV-1 strand transfer complex intasome. Science. 355 (6320), 89-92 (2017).
- Yin, Z., et al. Crystal structure of the Rous sarcoma virus intasome. Nature. 530 (7590), 362-366 (2016).
- Maertens, G. N., Hare, S., Cherepanov, P. The mechanism of retroviral integration from X-ray structures of its key intermediates. Nature. 468 (7321), 326-329 (2010).
- Maskell, D. P., et al. Structural basis for retroviral integration into nucleosomes. Nature. 523 (7560), 366-369 (2015).
