Summary
Det experimentella förfarandet på immunophenotyping av murina ortotop PDAC homografts syftar till profilering av tumör immuno-mikromiljö. Tumörer är orthotopically implanteras via kirurgi. Tumörer i 200 – 600 mm3 i storlek var skördas och skiljas för att förbereda encelliga suspensioner, följt av flera immun markör FACS analys med hjälp av olika fluorescently-märkt antikroppar.
Abstract
Homograft (syngena) tumörer är arbetshästen i dagens immunonkologiska (I/O) preklinisk forskning. Den tumör närmiljön (TME), särskilt dess immun-komponenter, är avgörande för prognos och Prediktion av behandlingsresultat, särskilt de av immunterapi. TME immun-komponenter består av olika undergrupper av tumör-infiltrera immunceller som taxeras av flerfärgade FACS. Pankreas duktal adenokarcinom (PDAC) är bland de dödligaste malignances saknar bra behandlingsalternativ, således ett brådskande och otillfredsställda medicinska behov. En viktig orsak till dess icke-lyhördhet för olika terapier (kemo-, målinriktad, I/O) har varit dess rikliga TME, bestående av fibroblaster och leukocyter som skydda tumörceller från dessa behandlingar. Orthotopically implanterade PDAC tros mer exakt återta TME av mänskliga pankreas cancer än konventionell subkutan (SC) modeller.
Homograft tumörer (KPC) är transplantationer av mus spontana PDAC härrör från genetiskt modifierade KPC-möss (KrasG12D / +/P53- / -/Pdx1-Cre) (KPC-GEMM). Den primära tumor vävnaden skärs i små fragment (~ 2 mm3) och transplanteras subkutant (SC) till syngena mottagare (C57BL/6, 7 – 9 veckor gamla). Homografts var sedan kirurgiskt orthotopically transplanteras på bukspottkörteln av nya C57BL/6 möss, tillsammans med SC-implantation, som nådde tumör volymer av 300 – 1000 mm3 av 17 dagar. Endast tumörer av 400 – 600 mm3 var skördas per godkänt obduktion förfarande och rengöras för att avlägsna de intilliggande icke-tumörvävnad. De var separerade per protokoll använder en vävnad dissociator i enskild cell suspensioner, följt av färgning med utsedda paneler av fluorescently-märkta antikroppar för olika markörer av olika immunceller (lymfoida, myeloisk och NK, DCs). De färgade proverna analyserades med flerfärgade FACS för att bestämma antalet immunceller som olika härstamningar, samt deras relativa procentandel inom tumörer. Immun profiler av ortotop tumörer jämfördes sedan med SC tumörer. De preliminära uppgifterna visade förhöjt infiltrera TILs/TAMs i tumörer över bukspottkörteln och högre B-cell infiltration i ortotop i stället för SC tumörer.
Introduction
Pankreas duktal adenokarcinom (PDAC) orsakar nästan hälften en miljon dödlighet world-wide årligen, en av de topp 5 cancer mördarna. Det finns några effektiva behandlingsalternativ och inga godkända immunterapier; Därför behövs desperat nya behandlingar. Cancer är alltmer att erkännas som immunologiska sjukdomar, inklusive PDAC, förutom de genetiska sjukdomarna som kallas idag. Immunologiska och genetiska faktorer skulle sannolikt avgöra sjukdom prognos samt behandling utfall. Tumörer undgå värd immun övervakning och så småningom avancera för att orsaka död. Många av dessa immuna processer förekommer inom den tumör närmiljön (TME)1,2,3,4 där olika typer av immunceller interagera med tumörceller, med varandra och med andra tumör stromaceller komponenter, direkt eller indirekt via cytokiner som i slutändan avgör sjukdom resultatet. Karakterisering av tumör immun komponenter av TME eller tumör immunophenotyping, inklusive subtypning, numrering och lokalisering av olika härstamningar av immunceller, är därför avgörande för att förstå anti-tumor immunitet. När det gäller PDAC, har det föreslagits att förhöjda tumör-infiltrera suppressiv makrofager (TAM) och B-celler har lett till förebyggande av T-cell infiltration eller aktivering och höga nivåer av fibros5,6.
Det gemensamma förhållningssättet till utreda immun TMEs experimentellt skulle använda surrogat tumör prekliniska djurmodeller, främst relevant mus tumör modeller7, särskilt mus syngena (homograft) eller genetiskt modifierade musmodeller (GEMM) av cancer, den förmodade likheten mellan mus och människa för tumörer och immunitet8,9. I verkligheten är det underförstått att det finns inneboende skillnader mellan två arter10,11.
Transplanterade mus tumörer har betydande operativa fördelar över spontana tumörer7, nämligen synkroniserade tumörutveckling, i motsats till den föräldra GEMM spontana tumörutveckling. Homografts av spontana murina tumörer anses primära tumörer har aldrig varit manipulerade in vitro-och spegling ursprungliga mus tumör histo- / molekylär patologi7, samt möjligt immuna profiler. Dessa murina homografts anses ofta vara ”en mus version av patientderiverade xenograft (PDXs)”. De har därför sannolikt en bättre översättbarhet än konventionella syngena cell linje-derived mus tumörer12. Särskilt härrör många homografts från specifika GEMM där specifika mänskliga sjukdomsmekanismer, e.g. onkogena driver mutationer, är konstruerade, och dessa homografts bör därför ha fördelar till deras kliniska relevans. I synnerhet utveckla KPC GEMM mus PDAC inom 15 – 20 veckor ålder, som morfologiskt recapitulates mänskliga sjukdomar med huvudsakligen brunn - till måttligt-differentierade glandular arkitektur och höganrikat stroma. Denna modell recapitulates också de vanligaste genetiska särdrag av mänskliga PDAC, nämligen Kras aktiverande mutation och P53 förlust-av-funktion, som förekommer i 90% och 75% av mänskliga PDAC, respektive5,6.
Platser av transplantation har också föreslagits för att spela en roll i modell översättbarhet. Specifik vävnad omgivningen, såsom en motsvarande ortotop miljö, kan vara en nisch för specifika tumörer till framsteg, i motsats till den enhetliga subkutan (SC) miljöer för vanligen transplanterade tumörer. Det skulle vara av särskilt intresse om och/eller, vilken skillnad finns mellan de två platserna som transplantation, vad gäller immun-närmiljön och relevansen för människa cancer, t.ex. När det gäller PDAC.
En av de viktigaste aspekterna av immun profilering, eller immunophenotyping, är att fastställa tumör-infiltrera immunceller av olika härstamningar, numrerar, relativa andel inom tumörer, samt deras aktivering stater och platser. Detta inkluderar tumör-infiltratrating lymphoctyes (TILs, både T- och B-), tumör-infiltrera makrofager (TAMs), tumör-infiltrera naturliga mördarceller (NKs) och tumör-resident dendritiska celler3,13,14 , 15 , 16 , 17och subcellulär lokalisering av vissa celler18,19,20, etc. Fluorescens aktiverad Cell sortering (FACS) eller flöde flödescytometri är en encellig detection-teknik som ofta används för att mäta de specifika parametrarna i en cell. Flerfärgade flow flödescytometri åtgärder flera markörer på en enda cell3,4,21 och är den vanligaste metoden för att fastställa antal och relativa andel av olika undergrupper av immunceller, inklusive de inom tumörer.
Denna rapport beskriver procedurer för profilering tumör-infiltrera immunceller: 1) Implantation av ortotop PDAC mus tumör homografts, tillsammans med SC implantation; (2) tumör vävnad skörd och enda cell förberedelse via tumör dissociation; (3) Flödesanalys för flödescytometri av alla celler härstammar från tumörer som utgångspunkt; (4) jämförelse av baslinjen profiler både metoder för transplantation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla protokoll och tilläggsavtal eller förfaranden som inbegriper skötsel och användning av djur kommer att granskas och godkännas av Crown Bioscience institutionsvård av djur och använda kommittén (IACUC) före genomförandet av studier. Skötsel och användning av djur kommer vanligtvis att utföras enligt AAALAC (Föreningen för bedömning och ackreditering av laboratorium djur vård) internationella riktlinjer som rapporterats i Guide för vård och använda av försöksdjur, nationell forskning Rådet (2011). Alla djur experimentella rutiner kommer att vara under sterila förhållanden på SPF (specifikt patogenfria) faciliteter och utfördes i strikt överensstämmelse med Guide för skötsel och användning av försöksdjur från olika statliga institutioner (t.ex. De National institutionerna of Health). Protokollet kommer att behöva godkännas av kommittén för etik av djur experimenten vid anläggning institution (t.ex. institutionella IACUC kommittén).
1. beredning för tumör Transplantation
-
Djurstallar
- Hämta generiska C57BL/6 möss från en kommersiell avel leverantör.
- Hus möss (5) i enskilda ventilerade burar på följande villkor: temperatur: 20 – 26 ° C; luftfuktighet 30 – 70%; belysning cykel: 12 h ljus och 12 h mörk.
- Användning majs cob sängkläder som byts varje vecka.
- För kost, ge bestrålning steriliseras torr granule mat under hela studietiden.
- För vatten, ge djur fri tillgång till sterila dricksvatten.
-
Givare tumör fragment förberedelse
- Börja genom att övervaka kroppsvikt (BW), via väger med en balans och tumör volym (TV), genom bromsok mätning, av tumör-bärande givare möss.
- När TV når 500 – 1200 mm3, avliva djuret i en biohazard huva enligt protokoll.
- Sterilisera huden runt tumören med iodophor kompresser.
- Kirurgiskt avlägsna tumören (detaljer som beskrivs i avsnitt 3: obduktion och tumör skörd) och placera tumören i en petriskål innehållande 20 mL PBS (pre chill mediet eller buffert till 4 ° C före euthanizing djur).
- Om det är smittsamt blod, överför tumören till en annan petriskål och tvätta tumören med PBS.
- Skär tumören i halv, ta bort eventuella extra hud, fartyg, förkalkning eller nekros.
- Välj endast intakt bitar av tumör och placera dem i en steril 50 mL centrifugrör och tillsätt 20 mL PBS och transportera röret till en separat djurens utrymme för farmakologiska studier.
2. ortotop och subkutan (SC) Engraftment
-
SC inympning
- Skär tumörer i 2 mm diameter bitar med en skalpell, sätta 1 bit i varje troakar, för SC implantation eller för senare ortotop implantation (se nedan).
- Söva mottagarens djuret med 5% isofluran, som upprätthålls av en Kona på 1%. Djuret kommer att börja slappna av, att förlora sin rätande reflex och så småningom bli orörliga. Vid detta djup anestesi kan de enkelt vara väckte av smärtsamma stimuli; tillåta anestesi att fördjupa tills sådana svar på smärta är frånvarande.
- När sövda, fixa möss på ett experiment ombord i den höger sidoläge. Sterilisera musen använder iodophor kompresser, särskilt de områden som omger tumörer.
- Med en skalpell, göra en 0,5-1,0 cm huden snitt på den vänstra flanken, bara kraniala till höften.
- Tunnel under huden mot forelimb, två till tre centimeter, med trubbig pincett.
- Aseptiskt överföra en kub av tumör från medlet och placera djupt inne i subkutan tunneln.
- Visuellt bekräfta att tumören är djupt i tunneln (och inte på huden snittet).
- Nära såret med såret klipp.
- Övervaka djur post inympningen tills de återfår tillräcklig medvetandet för att upprätthålla sternala recumbence. Tillbaka djuren till deras bur endast efter deras fullständig återhämtning från anestesi. Slutföra loggen anestesi och initiera djur hälsa diagrammet. Väga mottagarens djur dagligen i tre dagar
- För ett standardförfarande, Inokulera 5-10 möss per grupp för övervakning av tumör tillväxt.
-
Bukspottskörteln ortotop implantation
- Anestesi och analgesi
- Använd en 2 mL ketamin injektering och 0,42 mL xylazin (20 mg/mL) blandas i 5.91 steril vatten eller koksaltlösning på en volym av 0,06 – 0,1 mL/20-25 g kroppsvikt.
Obs: Enligt djurskydd, analgesi är nödvändigt både pre och post operation. 0,05 – 0,1 mg buprenorfin/kg, SC. Den första dosen är före operation och sedan doseras 3 gånger varje 4 timmar efter operationen kontinuerligt.
- Använd en 2 mL ketamin injektering och 0,42 mL xylazin (20 mg/mL) blandas i 5.91 steril vatten eller koksaltlösning på en volym av 0,06 – 0,1 mL/20-25 g kroppsvikt.
- Kirurgisk operation för ortotop implantation
- Söva möss via intramuskulär injektion (I.M.) per steg 2.2.1.
- Efter djuren bedövas fullt, fixa möss på ett experiment ombord i den höger sidoläge.
- Hålla mössen i höger lateral position. Desinficera huden runt mjälte med jod då de-iodinate med 75% etylalkohol.
- Hitta den medelstora punkten av mjälte och göra ett 1 cm vertikala snitt på buken för att exponera mjälte.
- Rita ut en del av bukspottkörteln vävnad under mjälten försiktigt med platt spets pincett och sutur en mus homograft tumören bit från utsäde musen på bukspottkörteln mottagarens mus av 9-0 resorberbara kirurgiska suturer.
- Nära buken med en 6-0 silk sutur av dubbel söm. Uppnå homeostas av komprimering.
- Efter efterbehandling tumör implantation, om varken blödning eller tumör vävnad läckage uppstår, hålla djuren i en varm bur.
- Övervaka djuret tills det återfår tillräcklig medvetandet för att upprätthålla sternala koordinationsrubbning; tillbaka djuret till djur rummet efter fullständig återhämtning från anestesi. Övervaka tumören med möss av palperas i buken nära mjälte och välj ut de möss som bär ortotop tumörer.
- Anestesi och analgesi
-
Tumör-bärande möss hälsa övervakning
- Kontrollera den mat och vatten förbrukningen dagligen.
- Undersöka mus utseende för ett ovårdat hår Rock, klumpar, tunnhet, onormal andedräkt eller ascites.
- Palpera buken för att kontrollera om det finns spontana tumörer på levern eller mjälten.
- Väga möss varje vecka med hjälp av en balans.
- Om någon av följande kliniska tecken observeras, mössen offras för provinsamling och obduktion: BW förlust > 20%. nedsatt rörlighet (inte kunna äta eller dricka); oförmögen att röra sig normalt på grund av betydande ascites och förstorad buk; ansträngning i andning.
3. obduktion och tumör skörd
- Inspektera visuellt och genom palpation för förekomst av palpabla tumörer före uppsägning.
- För uppsägning, först euthanize möss enligt godkända protokoll, och öppna buken och visuellt undersöka bukspottkörteln för tumörer.
- Skär av tumören av post mortal kirurgi och lägga till kalla PBS. Placera alla djur i en ren, oladdad, genomskinlig dödshjälp kammare med särskilda lock med en port för leverans av koldioxid ska användas.
- Ansvarsfrihet gas in i kammaren med en flödeshastighet som producerar snabbt medvetslöshet med minimal lidande för djuret. Det optimala flödet för CO2 bör vara cirka 2 – 2,5 L/min.
- Visuellt Observera varje djur under förfarandet dödshjälp för att försäkra alla djur får adekvat gaskoncentrationerna och inte återfår medvetandet under förfarandet euthanize.
- Upprätthålla gasflödet för minst 1 minut efter uppenbara kliniska död att minimera möjligheten att ett djur kan återställa (om apneic men inte död).
- Ta bort intilliggande icke-tumörvävnad. Rengjorda tumör kan fotograferas snabbt.
Sätta tumörvävnad i RPMI-1640 och hålla på is innan dissociation.
Obs: Djurkroppar är säckar och förvaras i lämpliga frysen att invänta borttagning.
4. tumör vävnad Dissociation och enda Cell förberedelse
-
REAGENSBEREDNING
Obs: Tumör Dissociation Kit innehåller 2 injektionsflaskor av enzymet D (frystorkat pulver), 1 injektionsflaska med enzym R (frystorkat pulver), 1 injektionsflaska av enzym A (frystorkat pulver) och 1 mL buffert A.- Förbereda enzym D genom beredning av det frystorkade pulvret i en injektionsflaska med 3 mL RPMI-1640. Förbereda alikvoter av en lämplig volym att undvika upprepade frys-tö-cykler.
- Förbereda enzym R genom beredning av det frystorkade pulvret i injektionsflaskan med 2,7 mL RPMI 1640. Förbereda alikvoter av en lämplig volym att undvika upprepade frys-tö-cykler.
- Förbereda enzym A genom beredning av det frystorkade pulvret i injektionsflaskan med 1 mL buffert A som levereras med setet. Gör inte vortex. Förbereda alikvoter av en lämplig volym att undvika upprepade gratis-Tina-cykler.
- Förbereda enzym mixen genom att lägga till 2,35 mL RPMI-1640, 100 µL av enzymet D, 50 µL av enzymet R och 12,5 µL av enzym A till varje gentleMACS C-röret.
-
Tumör Dissociation
- För varje tumör förbereda ett C-rör med tumör matsmältningen mix, se avsnitt 4.1 för matsmältningen buffert utspädning och förberedelser.
- Använd 3 mL matsmältningen buffert för tumör fragment < 0,8 g, och se till att tumören är helt smält.
- Märka med den studien kod, tumör, mus-ID, behandlingsgrupp och tumör vikt.
- Samla in tumören från musen, tvätta tumören i kalla PBS och rensa ut vävnaden fäst på tumören (t.ex. blodkärl, fett, fascia, etc.).
- Lägg tumören i matsmältningen media i en brunn i en steril 6 väl platta.
- Hålla tumören i plats med steril pincett/peang och skiva med en skalpell. Skiva tumören tillräckligt väl för att bryta i mindre bitar (~ 1 mm3).
- Placera tumör bitar tillbaka in i C-röret och använda återstående matsmältningen bufferten att tvätta plattan och sedan överföra vätskan i C-röret som är placerad på is tills matsmältning.
- Slå på dissociator med värmare.
- Placera tumör dissociation C-rör uppochner i ärmar av lediga positioner och justera tube positioner från kostnadsfri till vald status. Välj en dissociation program (37_c_m_TDK_1), följt av valet till den här mappen, där listan med program visas.
- Efter avslutande av programmet, ta C-rör utanför dissociator och spinn kort (300 x g, 4 ° C) till pellet provet.
- Återsuspendering prover och sätta i en cell SIL ovanför en 50 mL tub. Tvätta cellerna genom cell silen med 10 mL tvättbuffert att tillhandahålla en encellig suspension.
- Centrifugera rören vid 300 x g i 5 min, avlägsna supernatanten och Slamma upp cellerna med 5 mL av tvättbuffert, greve viabla celler med trypan blå eller cell counter och justera den cell concentraton till 1 x 106 celler per rör eller per prov. Inkludera rätt isotypen kontroll antikropparna för att säkerställa färgning är specifik
5. immun Panel Design och flöde datainsamling
-
Panel design
- Se tabell 1.
-
Immunfärgning
- FC-Block prov celler: Slamma upp cellerna i 200 µL färgning buffert med 1 µg/mL Fc-Block, följt av inkubering på is eller 4 ° C kylning för 15 min i mörker.
- Färga celler med panelerna önskad antikropp/fluorescens (t.ex. T-cell panel, makrofag panel, etc.): Tillsätt antikropp blandning späds i Fc blockerande buffert till varje prov, fläcken för minst 30 min på is i mörkret.
- Tillsätt 1 mL is kallt PBS i varje rör och Slamma upp cellerna försiktigt, följt av centrifugering vid 300 x g för 5 min. Kassera resulterande supernatanten.
- Upprepa för att tvätta cellerna två gånger.
- Fläcken för intracellulära markörer om det behövs, följande steg 6-10, hoppa annars till steg 10.
- Återsuspendering cellpelleten av puls virvel och tillsätt 200 µL av beredda fixering/permeabilisering fungerande lösning för varje prov. Puls vortex igen, och sedan Inkubera vid 4 ° C över natten (rekommenderad) eller 30 min i rumstemperatur i mörkret.
- Snurra ner cellerna och avlägsna supernatanten.
- Tvätta två gånger genom att lägga till 1 mL 1 x permeabilisering buffert (tillverkad av 10 x permeabilisering buffert, utspädd med destillerat H2O) följt av centrifugering och dekantering av supernatanten.
- Lägg till intracellulära markör antikropp 1 x permeabilisering buffert och odla i rumstemperatur i 30 min i mörker.
- Tvätta cellerna två gånger med 1 mL 1 x permeabilisering buffert. Centrifugera och Dekantera supernatanten.
- Omsuspendera cellerna i 150 µL färgning buffert och analysera på en cytometer. På grund av fixering och vilket förfarandet, FSC (framåt-ljus punktdiagram) / SSC (sidoljus punktdiagram) distribution av cell befolkningen kommer att vara olika till levande celler. Därför kommer att den gate och spänningar behöva ändras.
-
FMO kontroller (fluorescens Minus en kontroll)
Obs: Flerfärgade Flödesanalys är särskilt viktigt för analysen av tumören-infiltrera immunceller. Därför finns det ett behov av att hitta ett sätt att identifiera och utfärda utegångsförbud för celler i samband med uppgifter spridda på grund av de flera fluorokromer i en viss panel. FMO (fluorescens Minus One) kontroll är en viktig strategi för detta ändamål.- I detta syfte inkludera ytterligare möss i varje grupp för FMO kontroller (minst 2 per Rx) och processen individuellt för varje vävnad. Efter dissociation, pool vävnader. Till exempel i en studie med 4 Rx grupper, bör 8 ytterligare tumörer vara behandlas individuellt och sedan samman till ett prov för ram av ömsesidiga åtaganden.
-
Flöde Instrument Setup
- Gör ersättning pärlor medan maskinen värms upp (minst 20 min).
- Använda CS & T pärlor för att kontrollera prestanda.
- Spänning och ersättning inställningar: Använd UltraComp pärlor, vortex Comp pärlor grundligt före användning.
- Märka en separat 12 x 75 mm2 prov tub för varje fluorokrom-konjugerad antikropp.
- Tillsätt 100 µL av färgning buffert till varje rör. Tillsätt 1 full droppe (cirka 60 µL) av pärlor i varje rör.
- Lägga till antikroppar och utföra färgningsproceduren exakt som provet processen anges i avsnitt 4.
- Tillsätt 0,5 mL av färgning buffert varje, för att helt återsuspendering pärla pellets via vortex.
- Ställa in flödet cytometer PMT spänning per målvävnaden för viss experimentet.
- Kör genom flödescytometer för datainsamling, av gating på singlet pärla befolkningen per FSC och SSC avläsningar.
- Ställ in flödet runt 200 – 300 evenemang/s.
- Ange lämplig ersättning för en given fluorescein [FITC]-konjugerad antikropp, Använd en FL1 vs. FL2 dot tomt.
- Placera en kvadranten-porten så att negativa pärlor är inom nedre vänstra kvadranten och positiva pärlorna är i övre eller nedre höger kvadrant. Justera kompensationsvärden tills median fluorescensintensiteten (MFI) av varje befolkning (som visas i fönstret kvadrant statistik) är ungefär lika stora (dvs. för FL2-% FL1 FL2 MFI av båda pärlor bör vara liknande).
- Upprepa steg 5.4.11 och 5.4.12 för alla rör.
- Fortsätt att förvärva den faktiska målat prover. Kör guiden ersättning och spara inställningarna med formatet ”datum experiment dina initialer”.
6. flöde Data analys och Presentation
- Analysera data genom Flowjo eller Kaluza.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ortotop implantation av PDAC resulterade i snabb tumörtillväxt liknar den som ses för SC implantation. Efter givaren tumör fragment var implanteras i mottagarens möss, både subkutant och orthotopically enligt protokoll som beskrivs i steg 2.1 och 2.2, inopererad KPC homograft tumörer visade liknande snabba tillväxt som visas i figur 1A . KPC homograft tumörer skördas vid olika tidpunkter visas i figur 1B och representant H & E bilder visas figur 1 c. Våra data visar liknande tillväxt av SC och ortotop implantat.
Livskraftiga tumörcellerna och celler i den TME, inklusive tumör-infiltrera immunceller, med ursprung från antingen ortotop eller SC implantation, kan återvinnas effektivt. Tumörer var skördas och rötas för att förbereda enda cellsuspensioner för efterföljande FACS analys med en kommersiell dissociator (figur 2A) enligt protokollet beskrivs i Steg4. Vi fick oftast rimligt hög livskraftig cell avkastning tumör prover av båda typer av implantation (~ 80% lönsamhet baserat på Trypan blå). representativa FACS tomten visar viabla celler från tumören, skild från den döda celler/cellfragment (figur 2B).
Tumör-infiltrera immunceller av olika undergrupper har identifierats i både ortotop och SC implanteras tumörer, medan deras profiler har skillnader. Enda cellsuspensionen beredd från tumörvävnad med hjälp av metoden som beskrivs i steg 4,2 utsattes för FACS analys efter färgning med en 16 färgpanelen av markörer visas i tabell 1, som omfattar olika härstamningar av viktiga immunceller som samt tumörceller. Usenets strategi eller immun härstamning hierarkin tillsammans med representativa flöde tomter visas i figur 3A. CD45, en markör för alla mogna immunceller, användes för särskiljande tumörceller och tumör-infiltrera immunceller. Alla immun härstamningar analyserades därefter från CD45+ populationer som visas av panelen (tabell 1).
Bredvid markörer, Cellstorlek används också för att skilja olika subpopulations (figur 3B vänster) för att kvantifiera cell delmängder, inklusive T-, B-lymfocyter, makrofager och MDSCs, etc. Tumören infiltrerar immun profil jämförelse av SC vs. ortotop homografts av pankreas cancer. De stora uppräknade cellpopulationer av flera viktiga delmängder av tumören infiltrerar immunceller visas figur 3 c. Data visar tydligt att tumören har ökat betydligt immunceller infiltration jämfört med bukspottkörteln av friska möss. Dessutom hittades olika procentsatser av delmängd av tumör-infiltrera immunceller i ortotop vs. SC homografts, t ex betydligt mer B-celler i ortotop än i SC.
| Markör | Immunceller befolkningen |
| CD45 | Totala leukocyter |
| CD3 | Total T-celler |
| CD4 | CD4 + T-hjälpare celler |
| CD8 | CD8 + cytotoxiska T-celler |
| CD44 / CD62L * | Naiv, minne och effektor T-celler |
| CD69/CD44/OX40/CD25 etc* | Aktivering markörer |
| CD4 + CD25 + FoxP3 + | Regulatoriska T-celler |
| CD11b + Ly6c/Ly6g | G-MDSC och M-MDSC |
| CD11b + F4/80 | Makrofager |
| IA/IE/CD206 | M1 och M2 makrofager |
| CD3-CD335 + | NK-celler |
| CD3 + CD335 + | NKT-celler |
| CD19 | B-celler |
| TNF-a/IFN-r/IL-7/IL-3 etc* | Cytokiner |
| PD-1/PD-L1/CTLA-4/TIM-3 etc* | Checkpoint-hämmare |
| Granzym B etc* | Efterfrågade markörer |
| KI67/Brd U/PNCA etc | Spridning |
| Live/dead (fixeras) | Live/dead |
| * Obs: Ytterligare markörer kan läggas som behövs | |
Tabell 1: 16-färg flödet paneler avsedd för analys av tumör-infiltrera mus immunceller.
Figur 1: både ortotop och SC (subQ) implanteras PDAC homograft tumörer i C57BL/6 möss visat liknande tillväxt med eller utan gemcitabin behandling. (A) tillväxtkurvan: SC-vänster och ortotop-rätt. Blå: Fordonet. Guld: Gemcitabin (initierad på dag 10 inlägg inympning när genomsnittliga SC tumör volym nått 200 mm3). (B) tumör vävnader vid olika tidpunkter. (C) representant H & E färgning av båda typerna av homografts (40 x 10). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: tumör vävnad dissociation att förbereda livskraftig enda cellsuspension. (A) användning av avassociator; (B) den livskraftiga celler, skild från döda celler, som framgår av analysen av handelsflödet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: flerfärgade Flödesanalys av tumör-infiltrera immunceller både ortotop och SC PDAC homografts. Raw-data från varje tumör prov förvärvades från instrumentet flöde flödescytometri, följt av analys med Flowjo FACS analysprogram. (A) standard Usenets strategin för analysen, visas som ett exempel; (B) representativa gating och analys flödesdata använder standarden gating strategi; (C) representativa tumör-infiltrera immun cellsare visas om du vill inkludera Treg, B-celler och makrofager. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Även om studier med SC tumörer görs lättare, kan orthotopically implanteras tumörer modeller potentiellt vara mer relevant för prekliniska farmakologiska studier (särskilt I/O utredningar) att ge förbättrad översättbarhet. Denna rapport syftar till att hjälpa intresserade läsare/publiken för att kunna direkt visualisera de tekniska förfaranden som kan användas i deras respektive forskning. Våra protokoll visar att ortotop implantation av PDAC kan leda till effektiv tumörtillväxt, liknar SC implantation. Våra observationer verkar också tyder på förekomst av olika immun profiler av TMEs från de olika implantationer. De stora utmaningarna att anpassa ortotop, jämfört med SC implantationer, är att komplexa kunskaper som krävs, processen är tidskrävande, de kirurgiska ingrepp för implantation är arbetskrävande och också svårigheten att övervaka ortotop tumör tillväxt i livet.
Det finns fyra viktiga steg för att säkerställa att ortotop bukspottskörteln tumör experiment utförs framgångsrikt: 1) det kirurgiska ingreppet för implantation; (2) noggrann och aktuell övervakning av tumörutveckling; (3) vikten av att utföra före experimentet testar först att bekanta med förfarandet och bedöma ta ränta och tumör tillväxt; (4) med enda cellsuspensioner av dissocierade tumörer som en alternativ engraftment metod. Proceduren betänkande är bra att läsarna för att utföra forskning som använder denna specifika homograft, liksom andra bukspottskörteln ortotop modeller, och även andra ortotop modeller där buken-öppning kirurgi.
Flödescytometri eller FACS är för närvarande det viktigaste verktyget för att utföra immunoprofiling. Immunophenotyping av tumörer av FACS skiljer sig avsevärt från celler från olika organ, såsom perifert blod, mjälte, lymfkörtel och benmärg på följande sätt. Generellt finns det en mycket liten procent av immunceller i tumörer (liten provstorlek). Tumörer och det lilla antalet immunceller nuvarande extrema heterogenitet gör återhämta livskraftig sällsynta immunceller tekniskt utmanande, kräver egen utvecklad tumör vävnad dissociation som involverar maskiner. Båda tidigare punkter göra samtidiga multi-parameter mätning med flerfärgade flödescytometri väsentliga. Flerfärgade flöde kräver komplexa markör panel design, ersättning och gating strategier, på grund av fluorescens spektrala överlappning. Detta betänkande också försökt att visa för intresserade läsare/publiken processen av tumör immun profilering via definierade tumör vävnad dissociation och flerfärgade flödescytometri Flödesanalys.
Tre kritiska steg kan vara särskilt viktigt att ge produktiva TIL analys: först en hög avkastning av viabla celler återhämtat sig från differentierade tumörer med anpassade tumör dissociation förfaranden. andra, optimerad design för stora multi-färg färgning paneler baserat på tillgängliga reagenser. tredje, en optimerad Usenets strategi i analysen. Författarna vill understryka utbildningen och erfarenhet av operatörerna av både datainsamling och analys är viktiga för framgångsrik flöde flödescytometri analys av TIL.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Samtliga författare är nuvarande heltidsanställda av Crown Bioscience, Inc.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Dr Jody Barbeau - för kritisk läsning och redigering av manuskriptet och tacka Ralph Manuel för utformning av konstverk. Författarna vill även tacka Crown Bioscience onkologi immunonkologiska biomarkör laget och onkologi I Vivo team, för deras stora tekniska insatser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia machine | \ | SAS3119 | \ |
| Trocar 20 | \ | \ | 2 mm |
| Petri dish | \ | \ | 20 mm |
| 100x antibiotic and antimycotic | \ | \ | \ |
| Iodophor swabs | \ | \ | Daily pharmacy purchase |
| Alcohol swabs | \ | \ | Daily pharmacy purchase |
| Liquid nitrogen | Air chemical | \ | \ |
| Biosafety hood | AIRTECH | BSC-1300IIA2 | \ |
| FACS machine LSRFortessa X-20 | BD | LSR Fortessa | \ |
| antibodies | BD | \ | \ |
| Trevigen MD or BD Matrigel Basement Membrane Matrix High concentration | BD | 354248 | \ |
| FACS buffers | BD | 554656 | Mincing buffer |
| Brilliant Staining Buffer | BD | 563794 | \ |
| Mouse BD Fc Block | BD | 553142 | \ |
| cell filters | BD-Falcon | 352350 | 70 µm |
| routine blood tube | BD-Vacutainer | 365974 | 2 mL |
| Kaluza | Beckman | vs 1.5 | |
| 6-well plates | Corning | 3516 | \ |
| Foxp3 Fix/Perm kit | ebioscience | 00-5523-00 | \ |
| UltraComp eBeads | ebioscience | 01-2222-42 | \ |
| Centrifuge | eppendorf | 5810R,5920R | \ |
| FlowJo software | FlowJo LLC | \ | vs 10.0 |
| PBS | Hyclone | SH30256.01 | 50 mL |
| RPMI 1640 | Hyclone | SH30809.01 | \ |
| Disposable, sterile scalpels | Jin zhong | J12100 | 11# |
| knife handle | Jin zhong | J11010 | \ |
| eye scissors and tweezers | Jin zhong | Y00030 | Eye scissors 10 cm |
| eye scissors and tweezers | Jin zhong | JD1060 | Eye tweezers 10 cm with teeth |
| Portable liquid nitrogen tank | Jinfeng | YDS-175-216 | \ |
| Electronic balance | Metter Toledo | AL204 | 0-100 g |
| Miltenyi C-tubes | Miltenyi | 130-096-334 | \ |
| Miltenyi Gentle MACS with heater blocks | Miltenyi | 120-018-306 | \ |
| Tumor Dissociation Kit | Miltenyi | 130-096-730 | \ |
| Cell counter | Nexcelom | Cellometer | Cellometer Auto T4 |
| cryopreservation tube | Nunc | 375418 | 1.8 mL |
| Cultrex High Protein Concentration (HC20+) BME | PathClear | 3442-005-01 | \ |
| syringes | Shanghai MIWA medical industry | \ | 1-5 mL |
| Studylog software | Studylog | \ | software |
| Studylog-Balance and supporting USB | OHAUS | SE601F | Balance and supporting USB |
| Studylog-Data line of vernier calipers | Sylvac | 926.6721 | Data line of vernier calipers |
| Caliper | Sylvac | 910.1502.10 | Sylvac S-Cal pro |
| Sterilized centrifuge tubes | Thermo | 339653 | 50 mL |
| Sterilized centrifuge tubes | Thermo | 339651 | 15 mL |
| Ice bucket | Thermo | KLCS-288 | 4 °C |
| Ice bucket | Thermo | PLF-276 | -20 °C |
| Ice bucket | Thermo | DW-862626 | -80 °C |
| RNAlater | Thermo | am7021 | \ |
References
- Chevrier, S., et al. An Immune Atlas of Clear Cell Renal Cell Carcinoma. Cell. 169 (4), 736-749 (2017).
- Wargo, J. A., Reddy, S. M., Reuben, A., Sharma, P. Monitoring immune responses in the tumor microenvironment. Curr. Opin. Immunol. 41, 23-31 (2016).
- Mosely, S. I., et al. Rational Selection of Syngeneic Preclinical Tumor Models for Immunotherapeutic Drug Discovery. Cancer Immunol. Res. 5 (1), 29-41 (2017).
- Rühle, P. F., Fietkau, R., Gaipl, U. S., Frey, B. Development of a Modular Assay for Detailed Immunophenotyping of Peripheral Human Whole Blood Samples by Multicolor Flow Cytometry. Int. J. Mol. Sci. 17 (8), e1316 (2016).
- Jiang, H., et al. Targeting focal adhesion kinase renders pancreatic cancers responsive to checkpoint immunotherapy. Nat. Med. 22 (8), 851-860 (2016).
- Gunderson, A. J., et al. Bruton Tyrosine Kinase-Dependent Immune Cell Cross-talk Drives Pancreas Cancer. Cancer Discov. 6 (3), 270-285 (2016).
- Li, Q. X., Feuer, G., Ouyang, X., An, X. Experimental animal modeling for immuno-oncology. Pharmacol. Ther. 17, 34-46 (2017).
- Takao, K., Miyakawa, T. Genomic responses in mouse models greatly mimic human inflammatory diseases. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 112 (4), 1167-1172 (2015).
- Payne, K. J., Crooks, G. M. Immune-cell lineage commitment: translation from mice to humans. Immunity. 26 (6), 674-677 (2007).
- Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. J. Immunol. 172 (5), 2731-2738 (2004).
- von Herrath, M. G., Nepom, G. T. Lost in translation: barriers to implementing clinical immunotherapeutics for autoimmunity. J. Exp. Med. 202 (9), 1159-1162 (2005).
- Talmadge, J. E., Singh, R. K., Fidler, I. J., Raz, A. Murine models to evaluate novel and conventional therapeutic strategies for cancer. Am. J. Pathol. 170 (3), 793-804 (2007).
- Erdag, G., et al. Immunotype and immunohistologic characteristics of tumor-infiltrating immune cells are associated with clinical outcome in metastatic melanoma. Cancer Res. 72 (5), 1070-1080 (2012).
- Gutiérrez-Garcia, G., et al. Gene-expression profiling and not immunophenotypic algorithms predicts prognosis in patients with diffuse large B-cell lymphoma treated with immunochemotherapy. Blood. 117 (18), 4836-4843 (2011).
- Paiva, B., et al. PD-L1/PD-1 presence in the tumor microenvironment and activity of PD-1 blockade in multiple myeloma. Leukemia. 29 (10), 2110-2113 (2015).
- Youn, J. I., Collazo, M., Shalova, I. N., Biswas, S. K., Gabrilovich, D. I. Characterization of the nature of granulocytic myeloid-derived suppressor cells in tumor-bearing mice. J. Leukoc. Biol. 91 (1), 167-181 (2012).
- Lavin, Y., et al. Innate Immune Landscape in Early Lung Adenocarcinoma by Paired Single-Cell Analyses. Cell. 169 (4), 750-765 (2017).
- Mahoney, K. M., et al. PD-L1 Antibodies to Its Cytoplasmic Domain Most Clearly Delineate Cell Membranes in Immunohistochemical Staining of Tumor Cells. Cancer Immunol. Res. 3 (12), 1308-1315 (2015).
- Yamaki, S., Yanagimoto, H., Tsuta, K., Ryota, H., Kon, M. PD-L1 expression in pancreatic ductal adenocarcinoma is a poor prognostic factor in patients with high CD8+ tumor-infiltrating lymphocytes: highly sensitive detection using phosphor-integrated dot staining. Int. J. Clin. Oncol. 22 (4), 726-733 (2017).
- Jiang, Y., et al. ImmunoScore Signature: A Prognostic and Predictive Tool in Gastric Cancer. Ann. Surg. , (2016).
- Ribas, A., et al. PD-1 Blockade Expands Intratumoral Memory T Cells. Cancer Immunol. Res. 4 (3), 194-203 (2016).
