Summary
Fare orthotopic PDAC homografts immunophenotyping deneysel ameliyat tümör IMMUNO-microenvironment profil oluşturma amaçlamaktadır. Tümör ameliyat ile implante orthotopically vardır. Tümör boyutu 200-600 mm3 hasat ve tek hücreli süspansiyonlar, çok bağışıklık marker FACS analizi farklı fluorescently etiketli antikorlar tarafından takip hazırlamak için ayrışmış.
Abstract
Homogref (syngeneic) tümör beygir bugünün IMMUNO-Onkoloji (g/ç) preklinik araştırma vardır. Tümör microenvironment (TME), özellikle bağışıklık-bileşenleri, teşhis ve tedavi sonuçları, özellikle de immünoterapi tahmini için hayati önem taşımaktadır. TME bağışıklık-bileşenleri farklı bağışıklık hücreleri değerlendirilebilir tümör infiltre kümelerine çok renkli FACS tarafından oluşur. Pankreas duktal adenokarsinom (PDAC) iyi tedavi seçenekleri, böylece bir acil ve karşılanmayan tıbbi ihtiyaç eksik en ölümcül malignances arasında olduğunu. Sigara-yanıt verdiğini çeşitli terapiler (kemoterapi hedef,-, I/O) için bir önemli nedeni onun bol TME, fibroblastlar ve bu tedaviler tümör hücreleri korumak lökosit oluşan olmuştur. İmplante PDAC için daha doğru bir şekilde inanılır Orthotopically TME insan pankreas kanserlerinin daha geleneksel cilt altı (SC) modelleri yeniden ele geçirmek.
Homogref tümörler (KPC) çoğu fare spontan PDAC genetiği KPC-fareler kaynaklanan nakli (KrasG12D / +/P53- / -/Pdx1-Cyeniden) (KPC-et). Birincil tümör doku küçük parçalara (~ 2 mm3) kesme ve subkutan nakledilen (SC) syngeneic alıcılara (C57BL/6, 7-9 haftalık). Homografts cerrahi olarak o zamanlar pankreas tümörü birimleri 300-1000 mm3 tarafından 16 gün ulaştı SC-implantasyon ile birlikte yeni C57BL/6 farelerin üzerine nakledilen orthotopically. Sadece tümör 400-600 mm3 onaylanmış otopsi yordamı hasat ve bitişik olmayan tümör doku kaldırmak için temizledim. Bir doku dissociator tek hücreli süspansiyonlar, çeşitli işaretleri farklı bağışıklık hücrelerinin fluorescently etiketli antikorların belirlenen panelleri ile boyama tarafından takip içine iletişim kuralı'nı başına ayrışmış (lenfoid, myeloid ve NK, DCs). Lekeli örnekleri farklı soy, hem de onların göreli yüzde tümörleri içinde bağışıklık hücrelerinin numaraları belirlemek için çok renkli FACS kullanarak analiz edildi. Orthotopic tümörlerin bağışıklık profilleri sonra o SC tümörler için karşılaştırıldı. İlk veri pankreas ve daha yüksek B-hücre infiltrasyonu SC tümör yerine orthotopic içine üzerinde önemli ölçüde yükseltilmiş infiltre TILs/TAMs tümörler olarak gösterdi.
Introduction
Pankreas duktal adenokarsinom (PDAC) yaklaşık yarım bir milyon Scotlan dünya çapında her yıl, ilk 5 kanser katillerden biri neden olur. Orada kaç etkili tedavi seçenekleri ve onaylanmış hiçbir immunotherapies; Bu nedenle, yeni tedaviler umutsuzca ihtiyaç vardır. Kanser giderek PDAC, bugün bilinen genetik hastalıklara ek olarak dahil immünolojik hastalıklar olarak tanınan ediliyor. İmmünolojik ve genetik faktörlerin yanı sıra tedavi hastalığı prognoz büyük olasılıkla belirlemek sonuçları. Tümörlerin konak immün gözetim evade ve sonunda ölüme neden ilerlemek. Bu bağışıklık süreçlerin pek çok farklı bağışıklık hücrelerinin tümör hücreleri ile birbirleriyle ve diğer tümör ile etkileşimde bulunduğu (TME)1,2,3,4 tümör microenvironment içinde meydana stromal bileşenleri, doğrudan veya dolaylı olarak sonuçta hastalık sonucu belirleyen sitokinler aracılığıyla. Bu nedenle, TME veya tümör immunophenotyping, subtyping, numaralama ve bağışıklık hücrelerinin farklı soy lokalizasyonu gibi tümör bağışıklık bileşenlerinin karakterizasyonu anti-tümör dokunulmazlık anlamak için önemlidir. PDAC söz konusu olduğunda, bu teklif edildi süpresif makrofajlar (TAM) tümör infiltre yüksek de B-hücreleri T-hücre infiltrasyonu ve/veya etkinleştirme önleme ve fibrozis5,6yüksek düzeyde yol açmıştır.
Bağışıklık br deneysel olarak araştırılması için ortak bir yaklaşım-cekti var olmak istimal vekil tümör preklinik hayvan modelleri, esas olarak ilgili fare tümör7, özellikle fare syngeneic (Homogref) ya da genetik fare modelleri (et) modelleri kanserleri, fare ve insan tümörler ve bağışıklık8,9için varsayılan benzerliği. Bu gerçekte iki tür10,11arasında içsel farklılıklar vardır anlaşılmaktadır.
Transplante fare tümörler spontan tümör7, yani eşitlenmiş tümör gelişimi, ebeveyn et spontan tümör geliştirme aksine önemli operasyonel üstünlükleri vardır. Homografts spontan fare tümörlerin birincil tümörleri asla edilerek manipüle vitrove yansıtma orijinal fare tümör histo - olarak kabul edilir / moleküler patoloji7yanı sıra olası bağışıklık profilleri. Bu fare homografts kez "hasta elde edilen xenografts (PDXs) bir fare sürüm" olarak kabul edilir. Bu nedenle büyük olasılıkla geleneksel syngeneic hücre satırı kaynaklı fare tümörler12' den daha iyi bir translatability var. Özellikle, birçok homografts nerede belirli insan hastalık mekanizmaları, Örneğin oncogenic sürücü mutasyonlar, mühendislik ve bu homografts bu nedenle onların klinik önemi avantajları olmalıdır belirli et türetilir. Özellikle, KPC et içinde 15-20 hafta-in yaş, hangi morfolojik insan hastalığı çoğunlukla iyi - için orta-Ayrıştırılan glandüler mimarisi ile recapitulates ve son derece stroma zenginleştirilmiş fare PDAC geliştirmek. Bu model Ayrıca insan PDAC, yani % 90 ve insan PDAC, sırasıyla5,%675'i de ortaya mutasyon ve P53 kaybı, işlev, aktive Kras en yaygın genetik özelliklerinin beyannamedir.
Nakli sitelerin de bir rol modeli translatability oynamak için önerilmiştir. Belirli doku çevreye, karşılık gelen bir orthotopic ortamı gibi bir niş sık transplante tümörler için Tekdüzen subkutan (SC) karşı ilerleme ortamlara belirli tümör olabilir. Bu özel ilgi olurdu eğer, ve/veya, e.gbağışıklık-microenvironment ve insan kanser, alaka düzeyi açısından iki nakli siteler arasında ne fark var. PDAC durumunda.
Bağışıklık profil oluşturma veya immunophenotyping, en önemli yönlerinden biri tümör infiltre bağışıklık hücreleri farklı soy, sayı, tümörler içinde göreli yüzde yanı sıra onların harekete geçirmek Birleşik ve yerleri tespit etmektir. Bu tümör-infiltratrating lymphoctyes içerir (TILs, hem T - ve B-), tümör infiltre makrofajlar (TAMs), tümör infiltre doğal katil hücreler (NKs) ve tümör yerleşik dendritik hücreleri3,13,14 , 15 , 16 , 17ve belirli hücreleri18,19,20, vbhücre altı lokalizasyonu. Floresans aktif hücre sıralama (FACS) veya akış sitometresi bir hücre belirli parametrelerini ölçmek için kullanılan bir tek hücre algılama teknolojisidir. Çok renkli bir tek hücre3,4,21 birden çok işaretçileri sitometresi önlemler akış ve numaraları ve bağışıklık hücrelerinin farklı alt kümelerini göreli yüzdesini belirlemek için en sık kullanılan yöntemdir, Bu tümörler içinde dahil.
Bu rapor bağışıklık hücreleri tümör infiltre profil oluşturma yordamları açıklar: 1) ile birlikte SC implantasyon; orthotopic PDAC fare tümör homografts implantasyonu 2) tümör doku hasat ve tek hücre hazırlık tümör ayrılma ile; 3) temel olarak tümör türetilmiş hücrelerin tümünü Akış Sitometresi Analizi; 4) temel profilleri her iki nakli yaklaşımın karşılaştırılması.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm iletişim kuralları ve tadilat (lar) veya yordamlar içeren bakım ve hayvanların kullanımı incelenmeli ve Crown Bioscience kurumsal hayvan bakım ve kullanmak Komitesi (IACUC) tarafından çalışmalar yürütülmesi önce onaylanmalıdır. Bakım ve hayvanların kullanımı genellikle AAALAC (değerlendirme ve akreditasyon laboratuvar hayvan bakım Derneği) uluslararası kurallara uygun olarak bakım ve kullanmak of Laboratory Animals, ulusal araştırma için Kılavuzu'nda rapor olarak yapılacaktır Konseyi (2011). Tüm hayvan deneysel yordamlar SPF (özel patojen içermeyen) tesislerinde Steril koşullar altında olacak ve Kılavuzu ile farklı hükümet kurumları (Örneğin sıkı uygun bakım ve kullanım Laboratuvar hayvanları için yürütülen Ulusal Sağlık Enstitüleri). Protokol tesis Kurumu hayvan deneyleri Etik Komitesi tarafından onaylanmış olması gerekir (Örneğin kurumsal IACUC Komitesi).
1. tümör ekimi için hazırlık
-
Hayvan konut
- Genel C57BL/6 fareler bir ticari üreme satıcısından edinin.
- Aşağıdaki koşullar, bireysel havalandırılmış kafeslerde ev fare (5): sıcaklık: 20-26 ° C; nem oranı % 30-70; döngüsü aydınlatma: 12 h ışık ve 12 h karanlık.
- Kullanım Mısır koçanı Yani yatak takımları haftalık değişti.
- Diyet için tüm çalışma döneminde sterilize ışınlama Kuru granül besin içerir.
- Su için hayvanlar steril içme suyu ücretsiz erişim sağlar.
-
Donör tümör parçası hazırlama
- Vücut ağırlığı (BW), izleyerek bir denge ve tümör hacmi (TV), tarafından Halife ölçüm tümörü taşıyan donör fare kullanarak Tartı ile başlar.
- TV 500-1200 mm3ulaştığında, hayvan bir biohazard başlıklı Protokolü göre ötenazi.
- İodophor temizleme bezi kullanarak tümör çevresindeki deri sterilize.
- Cerrahi tümörü (3 bölümünde açıklanan ayrıntıları: Nekropsi ve tümör hasat) ve tümör PBS 20 mL içeren bir petri içinde yer (önceden medya veya arabellek hayvanlara ötenazi önce 4 ° c soğuk).
- Bulaşıcı kan varsa, tümör başka bir Petri kabına aktarın ve tümör PBS ile yıkayın.
- Tümör herhangi bir ilave cilt, gemiler, kalsifikasyon ve/veya nekroz kaldırma, yarıya.
- Tümör sadece sağlam parçalarını seçmek ve onları bir steril 50 mL santrifüj tüpüne yeri ve PBS 20 mL ekleyin sonra Farmakoloji araştırmaları ayrı bir hayvan odası tüp taşıma.
2. Orthotopic ve subkutan (SC) Engraftment
-
SC aşı
- Tümör çapı parçalar her trokar, daha sonra orthotopic implantasyon (aşağıya bakın) veya SC implantasyon için 1 parça koyarak bir neşter kullanarak 2 mm kesilmiş.
- % 1'adlı bir burun konisi tarafından tutulan %5 isoflurane alıcı hayvanla anestezi. Hayvan dinlenmek, kendi iyileştiren refleks kaybetme başlar ve sonunda hareketsiz olur. Anestezi bu derinlikte onlar-kolayca var roused ağrılı uyaranlara tarafından; acı böyle yanıt yok olana derinleştirmek anestezi sağlar.
- Bir kez anestezi, fareler bir deneme tahtası değil lateral pozisyonda gidermek. Fare iodophor temizleme bezi, tümör çevresindeki alanlarda özellikle kullanılarak sterilize.
- Bir neşter ile sol kanatta, kalça için sadece kafatası 0.5-1.0 cm cilt kesi yapmak.
- Forelimb, 2-3 santimetre, doğru cilt altında künt forseps ile tünel.
- Aseptik tümör bir küp ortamından aktarmak ve derin subkutan tünel içinde yer.
- Görsel olarak tümörün derin tünel (ve değil belgili tanımlık deri kesme) olduğunu doğrulayın.
- Yara yara kliplerle kapatın.
- Onlar sternal recumbence korumak için yeterli kendine gelmek kadar hayvanlar sonrası aşılama izlemek. Onların kafes anestezi onların tam kurtarma sonra geri dönüş hayvanlara. Anestezi günlük tamamlamak ve hayvan sağlık grafik işlemini başlatın. Alıcı hayvan her gün üç gün boyunca tartmak
- Standart bir prosedür için 5-10 farelerde tümör büyüme izleme grubu başına aşılamak.
-
Pankreas orthotopic implantasyon
- Anestezi ve analjezi
- Kullanma a 2 mL ketamin enjeksiyon ve 5,91 steril enjeksiyon su veya serum fizyolojik bir doz seste 0,06-0.1 karışık 0,42 mL xylazine enjeksiyon (20 mg/mL) mL/20-25 g vücut ağırlığı.
Not: hayvan refahı için analjezi gereklidir According her iki öncesi ve işlem sonrası. 0,05-0,1 mg buprenorfin /kg, SC İlk doz öncesi bir işlemdir ve 3 kez her 4 saat post işlemi sürekli ilaç.
- Kullanma a 2 mL ketamin enjeksiyon ve 5,91 steril enjeksiyon su veya serum fizyolojik bir doz seste 0,06-0.1 karışık 0,42 mL xylazine enjeksiyon (20 mg/mL) mL/20-25 g vücut ağırlığı.
- Orthotopic implantasyon için cerrahi operasyon
- Kas içi enjeksiyon (IM) adım 2.2.1 başına üzerinden fare anestezi.
- Hayvanlar tam anestezi sonra fareyi sağ lateral pozisyonda bir deneme tahtası gidermek.
- Fareyi sağa yatay konumda tutun. Dalak iyot ile sonra de-iodinate % 75 etil alkol ile çevresindeki deri dezenfekte.
- Dalak orta nokta bulmak ve dalak ortaya çıkarmak için karın bölgesinde 1 cm dikey kesi yapmak.
- Dalak altında pankreas dokusunun bir parçası dışarı hafifçe düz uçlu cımbız ile çizin ve bir fare Homogref tümör parça pankreas üzerinde tohum fareden alıcı fare 9-0 tarafından absorbe Cerrahi dikiş dikiş.
- 6-0 ipek sütür ile karın tarafından çift dikiş kapatın. Homeostasis sıkıştırma tarafından elde.
- Ne kanama ne tümör doku sızıntı meydana gelirse, bitirme tümör implantasyon sonra hayvanlar sıcak bir kafeste tutmak.
- Sternal recumbency korumak için yeterli bilincinin tekrar yerine geleceğinden hayvan izlemek; hayvan anestezi tam kurtarma sonra hayvan odasına dönün. Tümör karın dalak yakınındaki palpating tarafından fareler taşıyan izlemek ve orthotopic tümörü taşıyan fareler seçin.
- Anestezi ve analjezi
-
Tümörü taşıyan fareler sağlık izleme
- Su ve yiyecek tüketimi her gün kontrol edin.
- Fare görünüm bir koşusu saç ceket, topaklar, inceliği, anormal nefes veya asit için inceleyin.
- Karaciğer ve dalak spontan tümörler olup olmadığını denetlemek için karın muayene et.
- Haftalık bir denge kullanarak fare tartın.
- Eğer herhangi bir aşağıdaki klinik belirtiler gözlenir, fareler örnek toplama ve Nekropsi için feda: BW kaybı > % 20; Engelliler hareketlilik (yemek veya içmek mümkün değil); yapamaz-e doğru normalde önemli asit ve genişlemiş karın nedeniyle hareket eder; Solunum çaba.
3. Nekropsi ve tümör hasat
- Görsel ve sona ermeden önce elle tutulur tümörlerin varlığı için palpasyonla tarafından bakarak kontrol edin.
- Fesih, ilk ötenazi başı olarak onaylanmış protokolü, fareler ve karın açın ve pankreas tümörleri için görsel olarak inceleyin.
- Yazı ölümlü cerrahi ile tümör kesti ve soğuk PBS'ye ekleyin. Bütün hayvanlar bir bağlantı noktasıyla'dır karbondioksit kullanılmak üzere özel bir kapak ile temiz, doldurulmamış, yarı saydam ötenazi odası yerleştirin.
- Gaz odasına hayvan için en az sıkıntı ile hızlı bilinçsizlik üreten bir akış hızı, akıntı. CO2 için optimum akış hızı yaklaşık 2-2.5 L/dak olmalıdır.
- Görsel olarak her hayvan bütün hayvanlar yeterli gaz konsantrasyonları almak ve kendine euthanize işlem sırasında gelmek değil sağlamak için ötenazi yordamı sırasında gözlemlemek.
- Gaz akışı için en az 1 dk bir hayvan kurtarmak olasılığını en aza indirmek için belirgin klinik ölümünden sonra bakımını (Eğer apneic ama ölmedi).
- Bitişik olmayan tümör doku kaldırın. Temizlenmiş tümör hızlı bir şekilde fotoğrafı olabilir.
Tümör doku RPMI-1640 koymak ve ayrılma önce buz üzerinde tutun.
Not: Hayvan leşleri Torbalı ve kaldırma beklemek üzere uygun dondurucu içinde depolanır.
4. tümör doku ayrılma ve tek hücre hazırlık
-
Reaktif hazırlık
Not: Tümör ayrılma seti 2 şişe enzim d (liyofilize toz), enzim R (liyofilize toz), 1 şişe enzim A (liyofilize toz) ve arabellek A. 1 mL 1 şişe içerir.- Enzim D her flakon RPMI-1640 3 mL ile lyophilized toz başlamaktan tarafından hazırlayın. Aliquots tekrarlanan donma-çözülme-döngüsü önlemek için uygun bir farenin hazırlayın.
- Enzim R ile RPMI 1640 2.7 mL flakon lyophilized toz başlamaktan tarafından hazırlayın. Aliquots tekrarlanan donma-çözülme-döngüsü önlemek için uygun bir farenin hazırlayın.
- Enzim A ile arabellek kiti ile birlikte A 1 mL flakon lyophilized toz başlamaktan tarafından hazırlayın. Değil girdap yapmak. Aliquots tekrarlanan ücretsiz tezcan-döngülerini önlemek için uygun bir farenin hazırlayın.
- Enzim karışımı her gentleMACS C-tüp 2.35 mL RPMI-1640, enzim d 100 µL, enzim r 50 µL ve enzim a 12.5 µL ekleyerek hazırlayın.
-
Tümör ayrılma
- Bir C-tüp tümör sindirim karışımı ile her tümör için hazırlamak, sindirim arabellek seyreltme ve hazırlık için 4.1 bölümüne bakınız.
- Kullanım 3 mL sindirim arabellek tümör parçaları için < 0.8 g ve tümör tamamen sindirilmiş emin olun.
- Çalışma kodu, tümör, fare Kımlığı, tedavi grubunda ve tümör ağırlık ile etiketleyin.
- Tümör fare toplamak, tümör soğuk PBS yıkama ve tümör (örneğin, kan damarları, yağ, fasya, vb) üzerinde bağlı doku temizlemek.
- Tümör sindirim medya steril 6 iyi plaka bir iyi koymak.
- Tümör steril cımbız/forseps ile yer ve dilim bir neşter ile tutun. Tümör yeterince küçük parçalar halinde (~ 1 mm3) kırmak için dilim.
- Geri C-tüpün içine tümör alin ve kalan sindirim arabellek plaka yıkayın ve ardından buza kadar sindirim yerleştirilir C-tüp içine sıvı aktarmak için kullanın.
- Dissociator üzerinde ısıtıcılar ile geçin.
- Boş pozisyonların tümör ayrılma C-tüpler kollu baş aşağı içine yerleştirin ve tüp pozisyonlardan serbest seçili durumunu ayarlayın. Programlar listesinde görüntülendiği gerekli klasör seçerek takip bir ayrılma programı (37_c_m_TDK_1) seçin.
- Program sona ermesi sonra C-tüpler dissociator ve spin kısaca (300 x g, 4 ° C) örnek cips alır.
- Örnekleri yeniden askıya alma ve bir hücre süzgeç yukarıda 50 mL tüp içine koyun. Hücreleri tek hücre süspansiyon sağlamak için yıkama arabellek 10 mL ile hücre süzgeç ile yıkayın.
- 300 x g 5 min için de tüpler santrifüj kapasitesi, süpernatant atmak ve yıkama arabelleği, 5 mL hücrelerle trypan mavi ve/veya hücre sayaç tarafından kullanarak sayısı hücrelerin yeniden askıya alma ve tüp ya da örnek başına 1 x 106 hücrelere hücre concentraton ayarlayın. Boyama belirli olduğundan emin olmak için doğru izotip kontrol antikorları içerir
5. bağışıklık Panel Tasarım ve akış veri toplama
-
Panel Tasarım
- Lütfen bkz. Tablo 1.
-
Immunostaining
- FC-blok örnek hücreleri: 1 µg/mL Fc-taş, kuluçka karanlıkta 15 dakika buz veya 4 ° C soğutma üzerinde takip ile tampon boyama 200 µL hücrelerde yeniden askıya alma.
- Leke hücreleri kullanarak istenen antikor/floresan panelleri (Örn. T-Cell panel, makrofaj paneli, vb.): Fc engelleme arabelleği her örnek için en az 30 dk içinde belgili tanımlık karanlık buzda leke için seyreltilmiş antikor karışımı ekleyin.
- Buz soğuk PBS 1 mL her tüpün ekleyin ve hücreleri nazikçe, 300 x g 5 dk. atma elde edilen süpernatant de Santrifüjü ardından yeniden askıya alma.
- Hücreleri iki kez yıkamak için yineleyin.
- Leke gerekirse hücre içi işaretçileri için aşağıdaki adımları 6-10, aksi takdirde adım 10'a geçin.
- Hücre Pelet darbe girdap tarafından yeniden askıya alma ve her örnek için hazırlanan fiksasyon/Permeabilization çalışma çözümü 200 µL ekleyin. Nabız girdap tekrar ve daha sonra 4 ° C'de kuluçkaya (tercih edilen) bir gecede veya karanlık oda sıcaklığında 30 dakika.
- Hücreleri aşağı spin ve süpernatant kaldırın.
- İki kez 1 mL 1 x (10 x Permeabilization arabellek, distile H2ile O seyreltilmiş yapılmış) Permeabilization arabellek Santrifüjü tarafından takip ekleme ve süpernatant ile decanting yıkayın.
- Hücre içi marker antikor 1 x Permeabilization arabellek ekleyin ve 30 dk içinde belgili tanımlık karanlık oda sıcaklığında kuluçkaya.
- Hücreleri iki kez 1 mL 1 x Permeabilization arabellek ile yıkayın. Santrifüj kapasitesi ve süpernatant dikkatle boşaltmak.
- Boyama arabelleği 150 µL hücrelerde resuspend ve bir sitometresi çözümleyebilirsiniz. Fiksasyon ve permeabilization yordamı, FSC (ileri-ışık dağılım) nedeniyle / hücre nüfus dağılımı SSC (sidelight dağılım) hücreleri yaşamak için farklı olacak. Bu nedenle, kapı ve gerilimleri değiştirilmesi gerekecektir.
-
FMO denetimleri (floresan bir denetim eksi)
Not: Çok renkli akışı analizi özellikle bağışıklık hücreleri tümör infiltre analiz için önemlidir. Bu nedenle, tanımlamak ve hücreleri belirli bir panel birden çok fluorochromes nedeniyle yayılan veri bağlamında kapı için bir yol bulmak için bir ihtiyaç vardır. FMO (floresan eksi bir) denetim bu amaç için önemli bir yaklaşımdır.- Bu amaçla, her grup için FMO denetimleri (en az 2 Rx başına) ve işlem her doku için tek tek ek farelerin bulunur. Ayrılma sonra havuzu dokular. Örneğin, 4 Rx gruplarla bir çalışmada, 8 ek tümörleri ayrı ayrı işlenir ve FMOs için bir örnek havuza alınmış.
-
Akış Aracı Kurulum
- Tazminat boncuk yaparken, makine (en az 20 dk kadar) ısınıyor.
- CS & T boncuk performans denetlemek için kullanın.
- Gerilim ve tazminat ayarları: UltraComp boncuk, girdap Comp boncuk iyice kullanmadan önce kullanın.
- Her fluorochrome Birleşik antikor için ayrı 12 x 75 mm2 örnek tüp etiketleyin.
- Her tüpün arabelleğe boyama 100 µL ekleyin. 1 tam damla (yaklaşık 60 µL) her tüp boncuk ekleyin.
- Antikorlar ekleyin ve tam olarak 4 bölümünde belirtilen örnek işlem olarak boyama yordamı gerçekleştirin.
- Tamamen boncuk granül yeniden girdap ile askıya alma arabellek her, boyama 0.5 mL ekleyin.
- Akış Sitometresi Devresel_ödeme gerilim başına hedef doku verilen deney için ayarlayın.
- Akış Sitometresi veri toplama, FSC ve SSC okuma başına singlet boncuk nüfus çoğunluğuna tarafından çalıştırın.
- Set akış oranı çevresinde 200 – 300 olaylar/s.
- Ayarlamak için verilen floresein [FITC] uygun tazminat-Konjüge antikor, kullan bir FL1 vs FL2 nokta arsa.
- Dörtgen Bölümlü kapısı böylece negatif boncuk içinde sol alt çeyrekte ve olumlu boncuk üst ya da alt yer değil çeyreği. (MFI) medyan floresan yoğunluğu (çeyreği İstatistikleri penceresinde gösterildiği gibi) her nüfus yaklaşık olarak eşit olana tazminat değerlerini ayarlayın (yani FL2-% FL1 için her iki boncuk FL2 MFI-meli var olmak benzer).
- Adım 5.4.11 ve 5.4.12 tüm tüpler için yineleyin.
- Gerçek elde etmek örnekleri lekeli devam edin. Tazminat sihirbazını çalıştırın ve ayarları "tarihi deney adınızın baş harfleri" biçimiyle kaydetmek.
6. akış veri analizi ve sunum
- Flowjo ve/veya Kaluza veri analiz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hızlı tümör büyümesi için SC implantasyon görülen benzer PDAC implantasyonu Orthotopic sonuçlandı. Donör tümör parçaları alıcı fareler implante edildi sonra hem subkutan ve orthotopically iletişim kurallarına göre açıklanan adımları 2,1 ve 2,2, implante KPC Homogref tümörler Şekil 1A'gösterildiği gibi benzer hızlı büyüme gösterdi . Farklı zaman noktalarda hasat KPC Homogref tümör Şekil 1B adımında gösterilir ve temsilcisi H & E imge Şekil 1 cgösterilir. Bizim veri SC benzer büyüme gösterdi ve orthotopic implantları.
Canlı tümör hücreleri ve orthotopic ve SC implantasyonu,'tümör infiltre bağışıklık hücreleri de dahil olmak üzere TME, hücrelerde verimli bir şekilde elde edilebilir. Tümör hasat ve adım 4'te açıklanan protokolüne göre ticari dissociator (Şekil 2A) kullanarak daha sonraki FACS analiz tek hücre süspansiyonlar hazırlamak için sindirilmiş. Biz genellikle makul yüksek uygun hücre verimleri implantasyon (~ %80 canlılığı Trypan mavi dayalı); her iki tür tümör örneklerinden elde edilen temsilcisi FACS Arsa hücrelerin tümör, ölü hücreleri/hücre artıkları (Şekil 2B) ayrılmış gelen gösterir.
Kendi profillerini farklar varken bağışıklık hücrelerinin tümör infiltre farklı alt kümelerini hem orthotopic hem de implante SC tümörler, tespit edilmiştir. 4.2. adımda açıklanan yöntemi kullanarak tümör dokulardan hazırlanmış tek hücre süspansiyon işaretleri farklı soy önemli bağışıklık hücreleri kapsayan Tablo 1, gösterilen 16 renk paneliyle boyama sonra FACS analize tabi tümör hücreleri iyi. Perdeleme strateji veya bağışıklık lineage hiyerarşi temsilcisi akışı araziler ile birlikte Şekil 3Aiçinde gösterilir. CD45, tüm olgun bağışıklık hücreleri, avans ayırt edici tümör hücreleri ve bağışıklık hücreleri tümör infiltre için kullanıldı. Tüm bağışıklık soy daha sonra CD45 analiz edildi+ (Tablo 1) panel tarafından görüntülendiği gibi nüfus.
İşaretleri, hücre boyutunu da farklı altgrupları (Şekil 3B sol) T, B lenfosit, makrofaj ve MDSCs, dahil olmak üzere hücre alt kümelerini ölçmek için ayırt etmek için kullanılan vs. SC vs orthotopic homografts pankreas kanserlerinin karşılaştırılması bağışıklık profil infiltre tümör. Birkaç anahtar alt kümeleri bağışıklık hücrelerinin infiltre tümör büyük numaralandırılmış hücre popülasyonlarının Şekil 3 cgösterilir. Verileri açıkça tümör bağışıklık hücre infiltrasyonu sağlıklı fareler pankreas ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde arttığını gösterir. Buna ek olarak, bağışıklık hücrelerinin tümör infiltre alt kümesini farklı oranlarda orthotopic vsbulundu. SC homografts, Örneğin orthotopic SC içinde önemli ölçüde daha fazla B-hücreleri
| Marker | Bağışıklık hücre nüfus |
| CD45 | Toplam lökosit |
| CD3 | Toplam T hücreleri |
| CD4 | CD4 + T yardımcı hücreleri |
| CD8 | CD8 + sitotoksik T hücreleri |
| CD44 / CD62L * | Saf, bellek ve efektör T hücreleri |
| CD69/CD44/OX40/CD25 vb* | Harekete geçirmek işaretleri |
| CD4 + CD25 + FoxP3 + | Düzenleyici T hücreleri |
| CD11b + Ly6c/Ly6g | G-MDSC ve M-MDSC |
| CD11b + F4/80 | Makrofajlar |
| IA/IE/CD206 | M1 ve M2 makrofajlar |
| CD3-CD335 + | NK hücreleri |
| CD3 + CD335 + | NKT hücreleri |
| CD19 | B hücreleri |
| TNF-a/IFN-r/IL-7/IL-3 vb* | Sitokinler |
| PD-1/PD-L1/CTLA-4/TIM-3 vb* | Denetim noktası inhibitörleri |
| Granzym B vb* | Sık istenen işaretleri |
| KI67/Brd U/PNCA vb | Nükleer silahların yayılmasına karşı |
| Canlı/ölü (tamir edilebilir) | Canlı/ölü |
| * Not: Daha fazla belirteçleri gerektiğinde eklenebilir | |
Tablo 1: 16-renk panelleri fare bağışıklık hücreleri tümör infiltre analizi için tasarlanmış.
Şekil 1: hem orthotopic ve SC (subQ) implante PDAC Homogref tümörler C57BL/6 gösterdi fareler benzer büyüme ile veya gemcitabine tedavi olmadan. (A)büyüme eğrisi: SC-sola ve sağa orthotopic. Mavi: Araç; Altın: Gemcitabine (ortalama SC tümör hacmi 200 mm3ulaştığında başlatıldı gün 10 sonrası aşı üzerinde). (B) tümör doku farklı zaman noktalarda. (C) temsilcisi H & E homografts (40 x 10) her iki tür boyama. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: uygun tek hücre süspansiyon hazırlamak için tümör doku ayrılma. (A) disassociator kullanımı; (B) uygun hücreleri, ölü hücreleri, akışı analizi tarafından gösterildiği gibi ayrılmış. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: çok renkli akış analizi tümör infiltre bağışıklık hücreleri orthotopic ve SC PDAC homografts. Her tümör örnekten ham veri akış sitometresi aracından Flowjo FACS analiz yazılımı kullanarak analiz tarafından takip satın alınan. (A) standart gating stratejisi analiz için bir örnek olarak; görüntülenir Strateji çoğunluğuna standardını kullanarak (B) temsilcisi akışı geçişi ve analiz veri; B-hücreleri, Treg ve makrofajlar içerecek şekilde görüntülenen (C) temsilcisi tümör infiltre bağışıklık cellsare. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
SC tümörler kullanarak çalışmaları daha kolay yapılmaktadır rağmen implante orthotopically tümör modelleri potansiyel olarak gelişmiş translatability sağlamak için preklinik Farmakoloji çalışmalar (özellikle I/O araştırmalar) için daha alakalı olabilir. Bu rapor baktılar okuyucu/izleyici-doğrudan ilgili kendi araştırmalarında kullanılan teknik prosedürler görselleştirmek için yardımcı olmayı amaçlamaktadır. Bizim iletişim kuralları bu orthotopic göstermektedir PDAC implantasyonu verimli tümör büyüme, SC implantasyon için benzer neden olur. Gözlemlerimiz da br farklı bağışıklık profilleri farklı takılan üzerinden varlığını işaret ediyor. Orthotopic, SC takılan, karşılaştırıldığında adapte büyük sorunlar nelerdir karmaşık becerileri gereklidir, zaman alıcı bir süreçtir, cerrahi implantasyon için emek yoğun ve aynı zamanda orthotopic tümör izleme zorluk vardır büyüme hayat.
Orthotopic pankreas tümörü deneyleri başarılı bir şekilde gerçekleştirilmesini sağlamak için dört kritik adım vardır: 1) cerrahi implantasyon; 2) dikkatli ve zamanında tümör gelişimi izleme; 3) öncesi deneme gerçekleştirme önemini ilk yordamı ile hakkında bilgi edinin ve almak ve tümör büyüme oranı değerlendirmek için testler; 4) tek hücre süspansiyonlar Disosiye tümörlerin bir alternatif engraftment yöntemi olarak kullanılması. Bu rapor bu belirli Homogref yanı sıra diğer pankreas orthotopic modelleri kullanarak araştırma gerçekleştirmek için okuyucular için yararlı bir işlemdir ve hatta diğer orthotopic içeren karın-açılış cerrahi modeller.
Akış Sitometresi veya FACS Şu anda immunoprofiling gerçekleştirmek için en önemli bir araçtır. Immunophenotyping tümörlerde FACS tarafından önemli ölçüde bu farklı organlar, periferik kan, dalak, lenf nodu ve kemik iliği aşağıdaki yollarla gibi hücre farklıdır. Genel olarak, bağışıklık hücrelerinin tümör (küçük örnek boyutu) mevcut çok küçük bir yüzdesi vardır. Tümörler ve bağışıklık hücreleri mevcut az sayıda aşırı heterojen Teknik olarak zor, özel geliştirilen tümör doku ayrılma içeren makineleri gerektiren kurtarma kalıcı nadir bağışıklık hücreleri olun. Önceki iki puan çok renkli akış sitometresi kullanarak aynı anda çok parametreli ölçüm temel olun. Çok renkli akış karmaşık işaret panel tasarım, tazminat ve stratejileri, floresans spektral çakışma nedeniyle geçişi gerektirir. Bu rapor ayrıca baktılar okuyucu/izleyiciye tümör bağışıklık tanımlanmış tümör doku ayrılma ve çok renkli Akış Sitometresi Analizi profil oluşturma işlemi göstermek çalıştı.
Üç kritik adım analiz verimli verim özellikle önemli olabilir: ilk olarak, özelleştirilmiş tümör ayrılma yordamları; kullanarak tümör kurtarıldı hücrelerin yüksek bir verim ayrışmış İkincisi, büyük çok renkli boyama panelleri üzerinde kullanılabilir reaktifler tabanlı en iyi duruma getirilmiş tasarım; üçüncü, en iyi duruma getirilmiş bir perdeleme stratejisi analiz. Yazarlar eğitim vurgulamak istiyorum ve deneyim veri toplama ve analiz işleçlerin TIL başarılı Akış Sitometresi Analizi için önemlidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geçerli tam zamanlı çalışan Crown Bioscience, Inc tüm yazarlar vardır
Acknowledgments
Yazarlar Dr Jody Barbeau - kritik okuma yazması düzenleme için teşekkür ve Ralph Manuel sanat tasarlamak için teşekkür ederim. Yazarlar ayrıca taç Bioscience Onkoloji IMMUNO-Onkoloji biyomarker ekibi ve onkoloji In Vivo takımı, büyük teknik çabaları için teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia machine | \ | SAS3119 | \ |
| Trocar 20 | \ | \ | 2 mm |
| Petri dish | \ | \ | 20 mm |
| 100x antibiotic and antimycotic | \ | \ | \ |
| Iodophor swabs | \ | \ | Daily pharmacy purchase |
| Alcohol swabs | \ | \ | Daily pharmacy purchase |
| Liquid nitrogen | Air chemical | \ | \ |
| Biosafety hood | AIRTECH | BSC-1300IIA2 | \ |
| FACS machine LSRFortessa X-20 | BD | LSR Fortessa | \ |
| antibodies | BD | \ | \ |
| Trevigen MD or BD Matrigel Basement Membrane Matrix High concentration | BD | 354248 | \ |
| FACS buffers | BD | 554656 | Mincing buffer |
| Brilliant Staining Buffer | BD | 563794 | \ |
| Mouse BD Fc Block | BD | 553142 | \ |
| cell filters | BD-Falcon | 352350 | 70 µm |
| routine blood tube | BD-Vacutainer | 365974 | 2 mL |
| Kaluza | Beckman | vs 1.5 | |
| 6-well plates | Corning | 3516 | \ |
| Foxp3 Fix/Perm kit | ebioscience | 00-5523-00 | \ |
| UltraComp eBeads | ebioscience | 01-2222-42 | \ |
| Centrifuge | eppendorf | 5810R,5920R | \ |
| FlowJo software | FlowJo LLC | \ | vs 10.0 |
| PBS | Hyclone | SH30256.01 | 50 mL |
| RPMI 1640 | Hyclone | SH30809.01 | \ |
| Disposable, sterile scalpels | Jin zhong | J12100 | 11# |
| knife handle | Jin zhong | J11010 | \ |
| eye scissors and tweezers | Jin zhong | Y00030 | Eye scissors 10 cm |
| eye scissors and tweezers | Jin zhong | JD1060 | Eye tweezers 10 cm with teeth |
| Portable liquid nitrogen tank | Jinfeng | YDS-175-216 | \ |
| Electronic balance | Metter Toledo | AL204 | 0-100 g |
| Miltenyi C-tubes | Miltenyi | 130-096-334 | \ |
| Miltenyi Gentle MACS with heater blocks | Miltenyi | 120-018-306 | \ |
| Tumor Dissociation Kit | Miltenyi | 130-096-730 | \ |
| Cell counter | Nexcelom | Cellometer | Cellometer Auto T4 |
| cryopreservation tube | Nunc | 375418 | 1.8 mL |
| Cultrex High Protein Concentration (HC20+) BME | PathClear | 3442-005-01 | \ |
| syringes | Shanghai MIWA medical industry | \ | 1-5 mL |
| Studylog software | Studylog | \ | software |
| Studylog-Balance and supporting USB | OHAUS | SE601F | Balance and supporting USB |
| Studylog-Data line of vernier calipers | Sylvac | 926.6721 | Data line of vernier calipers |
| Caliper | Sylvac | 910.1502.10 | Sylvac S-Cal pro |
| Sterilized centrifuge tubes | Thermo | 339653 | 50 mL |
| Sterilized centrifuge tubes | Thermo | 339651 | 15 mL |
| Ice bucket | Thermo | KLCS-288 | 4 °C |
| Ice bucket | Thermo | PLF-276 | -20 °C |
| Ice bucket | Thermo | DW-862626 | -80 °C |
| RNAlater | Thermo | am7021 | \ |
References
- Chevrier, S., et al. An Immune Atlas of Clear Cell Renal Cell Carcinoma. Cell. 169 (4), 736-749 (2017).
- Wargo, J. A., Reddy, S. M., Reuben, A., Sharma, P. Monitoring immune responses in the tumor microenvironment. Curr. Opin. Immunol. 41, 23-31 (2016).
- Mosely, S. I., et al. Rational Selection of Syngeneic Preclinical Tumor Models for Immunotherapeutic Drug Discovery. Cancer Immunol. Res. 5 (1), 29-41 (2017).
- Rühle, P. F., Fietkau, R., Gaipl, U. S., Frey, B. Development of a Modular Assay for Detailed Immunophenotyping of Peripheral Human Whole Blood Samples by Multicolor Flow Cytometry. Int. J. Mol. Sci. 17 (8), e1316 (2016).
- Jiang, H., et al. Targeting focal adhesion kinase renders pancreatic cancers responsive to checkpoint immunotherapy. Nat. Med. 22 (8), 851-860 (2016).
- Gunderson, A. J., et al. Bruton Tyrosine Kinase-Dependent Immune Cell Cross-talk Drives Pancreas Cancer. Cancer Discov. 6 (3), 270-285 (2016).
- Li, Q. X., Feuer, G., Ouyang, X., An, X. Experimental animal modeling for immuno-oncology. Pharmacol. Ther. 17, 34-46 (2017).
- Takao, K., Miyakawa, T. Genomic responses in mouse models greatly mimic human inflammatory diseases. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 112 (4), 1167-1172 (2015).
- Payne, K. J., Crooks, G. M. Immune-cell lineage commitment: translation from mice to humans. Immunity. 26 (6), 674-677 (2007).
- Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. J. Immunol. 172 (5), 2731-2738 (2004).
- von Herrath, M. G., Nepom, G. T. Lost in translation: barriers to implementing clinical immunotherapeutics for autoimmunity. J. Exp. Med. 202 (9), 1159-1162 (2005).
- Talmadge, J. E., Singh, R. K., Fidler, I. J., Raz, A. Murine models to evaluate novel and conventional therapeutic strategies for cancer. Am. J. Pathol. 170 (3), 793-804 (2007).
- Erdag, G., et al. Immunotype and immunohistologic characteristics of tumor-infiltrating immune cells are associated with clinical outcome in metastatic melanoma. Cancer Res. 72 (5), 1070-1080 (2012).
- Gutiérrez-Garcia, G., et al. Gene-expression profiling and not immunophenotypic algorithms predicts prognosis in patients with diffuse large B-cell lymphoma treated with immunochemotherapy. Blood. 117 (18), 4836-4843 (2011).
- Paiva, B., et al. PD-L1/PD-1 presence in the tumor microenvironment and activity of PD-1 blockade in multiple myeloma. Leukemia. 29 (10), 2110-2113 (2015).
- Youn, J. I., Collazo, M., Shalova, I. N., Biswas, S. K., Gabrilovich, D. I. Characterization of the nature of granulocytic myeloid-derived suppressor cells in tumor-bearing mice. J. Leukoc. Biol. 91 (1), 167-181 (2012).
- Lavin, Y., et al. Innate Immune Landscape in Early Lung Adenocarcinoma by Paired Single-Cell Analyses. Cell. 169 (4), 750-765 (2017).
- Mahoney, K. M., et al. PD-L1 Antibodies to Its Cytoplasmic Domain Most Clearly Delineate Cell Membranes in Immunohistochemical Staining of Tumor Cells. Cancer Immunol. Res. 3 (12), 1308-1315 (2015).
- Yamaki, S., Yanagimoto, H., Tsuta, K., Ryota, H., Kon, M. PD-L1 expression in pancreatic ductal adenocarcinoma is a poor prognostic factor in patients with high CD8+ tumor-infiltrating lymphocytes: highly sensitive detection using phosphor-integrated dot staining. Int. J. Clin. Oncol. 22 (4), 726-733 (2017).
- Jiang, Y., et al. ImmunoScore Signature: A Prognostic and Predictive Tool in Gastric Cancer. Ann. Surg. , (2016).
- Ribas, A., et al. PD-1 Blockade Expands Intratumoral Memory T Cells. Cancer Immunol. Res. 4 (3), 194-203 (2016).
