Summary
ההליך ניסיוני-immunophenotyping של orthotopic מאתר PDAC homografts שמטרתה יצירת פרופיל חיסונית-microenvironment את הגידול. גידולים הם orthotopically מושתל באמצעות ניתוח. גידולים של 200-600 מ מ3 בגודל היו קוצרים, הפומבית להכין המתלים מתא בודד, שלאחריה יבוא ניתוח רב המערכת החיסונית סמן FACS באמצעות נוגדנים שונים עם התווית fluorescently.
Abstract
גידולים מאותו מין (syngeneic) הם סוס עבודה של מחקר פרה חיסונית-אונקולוגיה (i/O) של היום. הגידול microenvironment (טיים), במיוחד את החיסון-מרכיביו, חיוני הפרוגנוזה ותחזית של תוצאות הטיפול, בעיקר אלה של חיסוני. טיים החיסון-רכיבים מורכבים שונים קבוצות משנה של גידולים הסתננות התאים החיסוניים למהירים על ידי צבע רב FACS. אדנוקרצינומה ductal הלבלב (PDAC) נמנית malignances הקטלני חסר אפשרויות טיפול טוב, ובכך קליניות ודחופים צורך רפואי. אחת הסיבות שלה ללא-ההיענות לטיפולים שונים (כימותרפיה-, ממוקד, קלט/פלט) חשוב כבר טיים שלו שופע, המורכב fibroblasts ו לויקוציטים להגן על תאים סרטניים של טיפולים אלה. Orthotopically מושתל PDAC הוא האמין יותר במדויק לשחזר את טיים ממקרי סרטן הלבלב האנושית מאשר קונבנציונאלי מודלים (SC) תת עורית.
גידולים מאותו מין (KPC) הם השתלות של העכבר ספונטנית PDAC שמקורם KPC-עכברים מהונדסים גנטית (KrasG12D / +/ /Pdx1-53- / -PCre) (KPC-GEMM). רקמת הגידול העיקרי הוא חתוך לחלקים קטנים (3~ 2 מ מ), מושתלים subcutaneously (SC) לנמענים syngeneic (C57BL/6, 7 – 9 שבועות). Homografts היו אז בניתוח orthotopically מושתלים לתוך הלבלב של עכברים C57BL/6 חדשים, יחד עם SC-השרשה, אשר הגיעו הגידול כרכים של 300-1000 מ מ3 ימים 17. רק גידולים של 400 – 600 מ מ3 היו שנקטפו לכל הליך הנתיחה שאושרו וניקה להסיר רקמות הגידול שאינם סמוכים. הם היו הפומבית לכל פרוטוקול באמצעות dissociator של הרקמה לתוך תא בודד המתלים, ואחריו מכתים עם לוחות המיועדים שכותרתו fluorescently נוגדנים עבור סמנים שונים של תאים חיסוניים שונים (הלימפה, מיאלואידית ו NK, בקרי קבוצת מחשבים). הדגימות מוכתם נותחו באמצעות צבע רב FACS כדי לקבוע מספרים של תאים חיסוניים של שושלות שונות, כמו גם את האחוזים היחסיים שלהם בתוך גידולים. הפרופילים המערכת החיסונית של גידולים orthotopic הושוו לאלה של גידולים SC. המידע הראשוני הפגינו גבוהות באופן משמעותי שחדר הפדגוגי/תאמי גידולים של הלבלב, ושל חדירה B-cell גבוה יותר orthotopic מאשר גידולים SC.
Introduction
אדנוקרצינומה ductal הלבלב (PDAC) גורמת כמעט חצי מיליון בהירושימה ברחבי העולם מדי שנה, אחד הרוצחים סרטן ראש 5. ישנם כמה אפשרויות טיפול יעיל, אין immunotherapies שאושרו; לכן, טיפולים חדשים נדרשים נואשות. הם יותר ויותר להכרה סרטן מחלות חיסוניות, כולל PDAC, בנוסף מחלות גנטיות כפי הידוע כיום. גורמים גנטיים אימונולוגי היה סביר לקבוע פרוגנוזה מחלת, כמו גם טיפול תוצאות. גידולים להתחמק מעקב המערכת החיסונית המארח, בסופו של דבר לקדם לגרימת מוות. רבים של תהליכים חיסוניים אלה מתרחשות בתוך microenvironment הגידול (טיים)1,2,3,4 איפה סוגים שונים של תאים חיסוניים אינטראקציה עם תאים סרטניים, אחד עם השני ועם הגידול אחרים רכיבים סטרומה, ישירות או בעקיפין באמצעות ציטוקינים, אשר בסופו של דבר לקבוע התוצאה המחלה. לכן, אפיון מרכיבי מערכת החיסון של הגידול של טיים או גידול immunophenotyping, כולל subtyping, ספירה, לוקליזציה של שושלות שונות של תאים חיסוניים, חיוני להבנת אנטי הגידול חסינות. במקרה של PDAC, שהוא הוצע כי גבוהות גידולים הסתננות מדכאים מקרופאגים (TAM), תאי-B הובילו למניעת הסתננות T-cell ו/או הפעלה של רמות גבוהות של פיברוזיס5,6.
הגישה הנפוצה חוקרים TMEs המערכת החיסונית השפעול יהיה להשתמש במודלים בבעלי חיים פרה הגידול הפונדקאית, רלוונטי בעיקר העכבר הגידול מודלים7, במיוחד העכבר syngeneic (מאותו מין) או מודלים מהונדס גנטית עכבר (GEMM) סוגי סרטן, על הדמיון המשוערת של האדם עבור גידולים, חסינות8,9של עכבר. . זה מובן במציאות כי ישנם ההבדלים הטבועים בין שני המינים10,11
גידולים העכבר המושתלים יש יתרונות תפעוליים על פני גידולים ספונטניים7, כלומר גידול מסונכרן פיתוח, בניגוד התפתחות הגידול ספונטנית GEMM הורים. Homografts של גידולים מאתר ספונטנית נחשבים גידולים העיקרי שהיה מעולם לא מניפולציה במבחנה, שיקוף המקורי העכבר הגידול היסטו- / מולקולרי פתולוגיה7, כמו גם פרופיל החיסונית אפשרי. Homografts מאתר אלה נחשבים לעתים קרובות "גרסה העכבר של החולה, נגזר xenografts (PDXs)". לכן סביר להניח להם translatability טוב יותר מאשר קונבנציונאלי תא syngeneic העכבר קו-derived גידולים12. בפרט, homografts רבות נגזרות GEMM ספציפי שבו מנגנוני מחלות אנושיות מסוימות, למשל הנהג oncogenic מוטציות, מתוכננים, homografts אלה כדאי לכן יש יתרונות הרלוונטיות הקלינית שלהם. בפרט, KPC GEMM לפתח העכבר PDAC תוך 15-20 שבועות של גיל, אשר מורפולוגית recapitulates מחלות אנושיות האדריכלות יוכפל לאחר המרתו טוב - עד בינוני-הבדיל הבלוטות והעשירו מאד משתית. מודל זה recapitulates גם את התכונות גנטי הנפוצים ביותר של PDAC אנושי, כלומר קראס. מפעיל את המוטציה ותפקוד P53 אובדן-של-, אשר מתרחשים 90% ו 75% של PDAC אנושי, בהתאמה5,6.
אתרים של השתלת גם שהוצעו כדי לשחק תפקיד דגם translatability. ספציפיים לרקמות הסביבה, כגון סביבת orthotopic המתאימים, יכול להיות נישה אקולוגית עבור גידולים ספציפיים לסביבות התקדמות, בניגוד אחיד תת עורית (SC) עבור גידולים מושתל בדרך כלל. זה יהיה עניין מיוחד אם, ו/או, מה ההבדל הקיים בין שני האתרים השתלת, במונחים של החיסון-microenvironment, ועולה סרטן אנושי, למשל. במקרה של PDAC.
אחד ההיבטים החשובים ביותר של פרופיל החיסונית או immunophenotyping, הוא לקבוע גידולים הסתננות התאים החיסוניים של שושלות שונות, המספרים, האחוז היחסי בתוך גידולים, כמו גם שלהם הפעלה מצבים ומיקומים. זה כולל את הגידול-infiltratrating lymphoctyes (הפדגוגי, T - וגם B-), גידולים הסתננות מקרופאגים (תאמי), גידולים הסתננות תאים הרוצח הטבעי (NKs), גידול תושב הדנדריטים תאים3,13,14 , 15 , 16 , 17, לוקליזציה subcellular של תאים18,19,20מסויימים, וכו '. קרינה פלואורסצנטית מופעל התא מיון (FACS) או זרימה cytometry היא טכנולוגיה זיהוי תא בודד המשמש בדרך כלל כדי למדוד את הפרמטרים הספציפיים של תא. צבע רב flow cytometry אמצעים מספר סמני ב4,3,תא בודד21 , היא השיטה הנפוצה ביותר כדי לקבוע את המספרים ואת האחוז היחסי של קבוצות משנה שונים של תאים חיסוניים, כולל אלה בתוך גידולים.
הדו ח מתאר הליכים עבור פרופיל גידולים הסתננות התאים החיסוניים: 1) השתלה של orthotopic PDAC העכבר גידול homografts, יחד עם ההשתלה SC; 2) גידול רקמות הקציר והכנות תא בודד באמצעות הגידול דיסוציאציה; 3) ניתוח cytometry זרימה של כל התאים נגזר גידולים כקו; 4) השוואה של פרופילים בסיסית של שתי הגישות השתלת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הפרוטוקולים, amendment(s) או הליכים הכוללים את הטיפול ואת השימוש בבעלי חיים נבדקו ואושרו על-ידי הכתר Bioscience מוסדיים בעלי חיים והטיפול הוועדה להשתמש (IACUC) לפני התנהלות של מחקרים. הטיפול ואת השימוש בבעלי חיים בדרך כלל תיעשה בהתאם להנחיות בינלאומיות AAALAC (האגודה הערכה וטיפול הסמכה של מעבדה חיה) כפי שדווח במדריך עבור טיפול ו להשתמש של חיות מעבדה, המחקר הלאומי המועצה (2011). כל ההליכים ניסויים בבעלי חיים יהיה בתנאים סטריליים במתקני SPF (ספציפי פתוגן-חופשית), שנערכו בהתאמה קפדנית עם המדריך על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה של מוסדות ממשלתיים שונים (למשל המכונים הלאומיים לבריאות). הפרוטוקול יהיה צורך באישור ועדת האתיקה לניסויים בבעלי חיים במוסד מתקן (למשל הוועדה המוסדית IACUC).
1. הכנה השתלת הגידול
-
דיור בעלי חיים
- להשיג עכברים C57BL/6 גנרית מיצרן רבייה מסחריות.
- הבית עכברים (5) בכלובים מאוורר בודדים על התנאים הבאים: טמפרטורה: 20 – 26 ° C; לחות 30-70%; תאורה מחזור: אור 12 h ו- 12 h כהה.
- שימוש תירס קלח מצעים זה משתנה מדי שבוע.
- עבור דיאטה, לספק מזון יבש גרגר הקרנה לעקר במהלך תקופת המחקר כולו.
- מים, לספק בעלי גישה חופשית סטרילי שתיית מים.
-
התורם הגידול פרגמנט הכנה
- התחל על-ידי ניטור משקל הגוף (BW), באמצעות שקילה באמצעות איזון, נפח הגידול (טלוויזיה), על ידי מדידה caliper, של עכברים נושאות התורם.
- טלוויזיה מגיעה 500 – 1,200 מ מ3, להרדימו בשכונה חומרים מסוכנים לפי פרוטוקול.
- לחטא את העור סביב הגידול באמצעות מטליות iodophor.
- ניתוח להסרת הגידול (הפרטים המתוארים בסעיף 3: קציר Necropsy ואת הגידול) ומניחים את הגידול בצלוחית המכילה 20 מ של PBS (chill מראש את המדיה או מאגר עד 4 ° C לפני המתות חסד חיות).
- אם יש דם מזהמים, להעביר את הגידול לתוך צלחת פטרי עוד ולשטוף את הגידול עם PBS.
- חותכים את הגידול במחצית, הסרת כל העור המיותר, ספינות, הסתיידות ו/או נמק.
- לבחור רק שלם חתיכות של הגידול, למקם אותם לתוך שפופרת צנטרפוגה סטרילי 50 מ ל, להוסיף 20 מ של PBS ואז להעביר צינור כדי חדר בעלי חיים נפרד ללימודי פרמקולוגיה.
2. Orthotopic ו- Engraftment תת עורית (SC)
-
חיסון SC
- חותכים גידולים 2 מ מ קוטר חתיכות באמצעות אזמל, מכניסים גוש 1 כל הנקז, להשתלה SC או להשתלה orthotopic מאוחר יותר (ראה להלן).
- עזים ומתנגד החיה הנמען עם 5% איזופלוריין, המתוחזק ע י קונוס האף ב- 1%. החיה להתחיל להירגע, מאבד את רפלקס שקמה בעצמה אחרי שמפילים שלהם, בסופו של דבר להיות משותק. בעומק הזה של הרדמה הם יכולים בקלות למשמע לגירויי כאב; לאפשר הרדמה להעמיק עד כה התגובות כאב נעדרים.
- ברגע מרדימים, לתקן את העכברים על לוח ניסוי התנוחה הימנית. לחטא את העכבר באמצעות מטליות iodophor, במיוחד באזורים סביב הגידולים.
- עם איזמל, עושים חתך בעור 0.5 עד 1.0 ס מ בצד שמאל, רק הגולגולת באיזור המותן.
- מנהרה מתחת לעור לכיוון forelimb, 2-3 ס מ, עם מלקחיים בוטה.
- גילוח ורחיצה כירורגית להעביר קוביה אחת של גידול של המדיום ומקם עמוק בתוך המנהרה התת עורית.
- מבחינה ויזואלית לאשר כי הגידול הוא עמוק בתוך המנהרה (ולא ליד החתך בעור).
- לסגור את הפצע עם קטעי הפצע.
- לפקח על חיסון פוסט חיות עד שהם ישובו להכרה מספקת כדי לשמור על recumbence בחזה ובצלעות. להחזיר חיות בחזרה לכלוב שלהם רק לאחר שלהם התאוששות מלאה מן ההרדמה. להשלים את יומן הרדמה, וליזום התרשים בריאות בעלי חיים. שוקל נמענים בעלי חיים מדי יום למשך שלושה ימים
- עבור הליך סטנדרטי, לחסן 5-10 עכברים לכל קבוצה לניטור צמיחת הגידול.
-
הלבלב orthotopic-השרשה
- הרדמה, שיכוך כאבים
- שימוש בסיסמה הזרקת קטמין 2 mL מ"ל 0.42 חריגות השירותים הווטרינריים הזרקה (20 מ"ג/מ"ל) מעורב 5.91 הזרקה סטרילי במים או תמיסת מלח בווליום במינון של 0.06 – 0.1 מ"ל/20-25 גרם משקל.
הערה: על פי בעלי חיים רווחה, שיכוך כאבים יש צורך בשני טרום ולפרסם את המבצע. 0.05 – 0.1 מ"ג. הבופרנורפין /kg, SC. המנה הראשונה טרום הניתוח, ואז עצומות 3 פעמים כל פעולה פוסט 4 שעות ללא הרף.
- שימוש בסיסמה הזרקת קטמין 2 mL מ"ל 0.42 חריגות השירותים הווטרינריים הזרקה (20 מ"ג/מ"ל) מעורב 5.91 הזרקה סטרילי במים או תמיסת מלח בווליום במינון של 0.06 – 0.1 מ"ל/20-25 גרם משקל.
- הפעולה הכירורגית עבור orthotopic-השרשה
- עזים ומתנגד עכברים באמצעות זריקה תוך שרירית (IM) לכל שלב 2.2.1.
- לאחר החיות הן מורדם לחלוטין, לתקן את העכברים על לוח ניסוי התנוחה הימנית.
- שמור את העכברים העמדה הימנית. לחטא את העור מסביב לטחול עם יוד ואז דה-iodinate עם 75% אתיל אלכוהול.
- למצוא את נקודת בינונית של הטחול, עושים חתך אנכי 1 ס מ על הבטן כדי לחשוף את הטחול.
- למשוך חלק רקמת הלבלב תחת הטחול בעדינות עם פינצטה שטוח-עצה, תפר העכבר מאותו מין הגידול חתיכה מכל זרע עכבר על הלבלב של העכבר הנמען על ידי תפירה שנספג 9-0.
- לסגור את הבטן בתפר משי 6-0 על ידי התפר כפולה. להשיג הומאוסטזיס על ידי דחיסה.
- לאחר ההשתלה גימור הגידול, אם לא מדמם ולא גידול רקמות זליגת מתרחשת, להרחיק את החיות בתוך כלוב חמים.
- לנטר את החיה עד זה להכרה מספקת כדי לשמור על recumbency בחזה ובצלעות; להחזיר את החיה לחדר בעלי חיים לאחר התאוששות מלאה מן ההרדמה. לפקח על הגידול הנושאת עכברים מאת palpating הבטן ליד הטחול ובחר את העכברים הנושאת גידולים orthotopic.
- הרדמה, שיכוך כאבים
-
נושאות עכברים לבריאות ניטור
- בדוק את צריכת מים ומזון מדי יום.
- לבחון את המראה העכבר על המעיל שיער מסבך, גושים, הרזון, נשימה חריג או מיימת.
- ימשש את הבטן כדי לבדוק אם קיימים גידולים ספונטניים על הכבד או הטחול.
- שוקלים עכברים שבועי באמצעות איזון.
- אם כל אחד הסימנים הקליניים הבאים הם נצפו, העכברים מוקרבים על איסוף הדגימה של necropsy: אובדן BW > 20%; ליקויי ניידות (אינם מסוגלים לאכול או לשתות); אין אפשרות להעביר בדרך כלל עקב מיימת המשמעותית והבטן מוגדל; מאמץ בנשימה.
3. necropsy ו הגידול הקציר
- בדוק חזותית ועל ידי מישוש לנוכחות של גידולים מוחשי לפני סיום.
- הסיום, לראשונה המתת חסד עכברים לפי פרוטוקול שאושר, לפתוח את הבטן, בחנו ויזואלית הלבלב גידולים.
- לכרות את הגידול באמצעות ניתוח בן תמותה פוסט ולהוסיף אותו PBS קר. מקם כל החיות תא המתת חסד נקי, לא טעונים, שקוף עם מכסה מיוחד עם יציאת למסירה של הפחמן הדו חמצני כדי לשמש.
- פריקה גז אל החדר בספיקה שמייצר הכרה מהירה עם מצוקה מינימלי לחיה. קצב הזרימה האופטימלי עבור CO2 אמור להיות בסביבות 2 – 2.5 L/min.
- מבחינה ויזואלית להתבונן כל חיה במהלך ההליך המתת חסד כדי להבטיח כל בעלי החיים מקבלים ריכוזי גזים נאותה, לא ישוב להכרה במהלך ההליך euthanize.
- לשמור על זרימת הגז לפחות 1 דקות אחרי מוות קליני לכאורה כדי למזער את האפשרות כי חיה ההחזר (אם apneic אבל לא מת).
- להסיר את אי-גידול לרקמות סמוכות. גידול נקי יכול להיות צולם במהירות.
מכניסים את רקמות הגידול RPMI-1640 ולשמור על הקרח לפני דיסוציאציה.
הערה: פגרי בעלי חיים ארוז הינם לאחסן במקפיא המתאים כדי מחכים להסרת.
4. גידול רקמות דיסוציאציה והכנות תא בודד
-
ריאגנט הכנה
הערה: ערכת דיסוציאציה הגידול מכיל שני בקבוקונים של אנזים D (אבקת lyophilized), מבחנה 1 של אנזים R (אבקת lyophilized), 1 בקבוקון של אנזים A (אבקת lyophilized) ו 1 מ"ל של מאגר א- הכן אנזים D על ידי לשחזר את האבקה lyophilized בתוך כל בקבוקון עם 3 מ של RPMI-1640. להכין את aliquots של אמצעי אחסון המתאים כדי להימנע חוזרות ההקפאה-הפשרה-מחזורים.
- הכן אנזים R על ידי לשחזר את האבקה lyophilized בבקבוקון עם 2.7 מ של RPMI 1640. להכין את aliquots של אמצעי אחסון המתאים כדי להימנע חוזרות ההקפאה-הפשרה-מחזורים.
- הכן אנזים A על ידי לשחזר את האבקה lyophilized בבקבוקון עם 1 מ"ל של מאגר A מסופק עם הקיט. לא מערבולת. להכין את aliquots של אמצעי אחסון המתאים כדי להימנע חוזרות חינם-הפשרה-מחזורים.
- מכינים את תערובת אנזימים על-ידי הוספת מ 2.35 ל RPMI-1640, 100 µL של אנזים D, 50 µL של אנזים R ו- 12.5 µL של אנזים A לתוך כל gentleMACS C-שפופרת.
-
הגידול דיסוציאציה
- לגידול כל הכנת C-שפופרת אחת עם תערובת הגידול עיכול, נא עיין בסעיף 4.1 עיכול מאגר דילול והכנות.
- שימוש 3 מ ל מערכת העיכול למאגר הגידול שברי < 0.8 g, ולהבטיח הגידול באופן מלא מתעכל.
- תווית עם קוד מחקר, הגידול, זיהוי העכבר, קבוצת הטיפול, הגידול במשקל.
- לאסוף את הגידול של העכבר, לשטוף את הגידול ב- PBS קר, לנקות את הרקמה המצורפת את הגידול (כגון כלי דם, שומן, fascia, וכו '.).
- הכניסו את הגידול המדיה עיכול טוב אחד של צלחת סטרילי טוב 6.
- החזק את הגידול במקום עם פינצטה סטרילי/מלקחיים ואת פרוסה עם אזמל. פורסים את הגידול מספיק טוב כדי לשבור לחתיכות קטנות יותר (3~ 1 מ"מ).
- הצב את החלקים הגידול בחזרה לתוך הצינור C והשתמש המאגר עיכול הנותרים כדי לשטוף את הצלחת ולאחר מכן להעביר את הנוזל לתוך C-הצינור מושם על הקרח עד לעיכול.
- . הפעילי את dissociator עם חימום
- מקום גידול דיסוציאציה C-צינורות במהופך לתוך השרוולים של העמדות פנויות ולהתאים את המצב של עמדות צינור מחופשית כדי שנבחר. בחר בתוכנית דיסוציאציה (37_c_m_TDK_1), ואחריו את הבחירה של התיקיה הנדרשים, שבו מוצגת רשימת התוכניות.
- לאחר סיום התוכנית, להוריד C-צינורות dissociator ואת ספין בקצרה (x 300 גרם, 4 ° C) כדי הצניפה המדגם.
- מחדש להשעות דגימות והכניסו לתוך מסננת תא לעיל שפופרת 50 מ. לשטוף את התאים דרך מסננת התא עם 10 מ"ל שטיפת המאגר לספק השעיה תא בודד.
- Centrifuge הצינורות ב x 300 גרם במשך 5 דקות, למחוק את תגובת שיקוע ו להשעות מחדש את התאים 5 מ ל מאגר לשטוף, ספירת התאים קיימא באמצעות trypan כחול ו/או על-ידי תא המונה ולהתאים את concentraton התא לתאים6 עונה 1 פרק 10 למחזור או לדגימה. כוללים הנוגדנים שליטה isotype הנכון כדי להבטיח מכתים הוא ספציפי
5. לוח המערכת החיסונית ועיצוב זרימה קירור והקפאה
-
לוח תכנון
- אנא ראו טבלה 1.
-
Immunostaining
- Fc-בלוק דגימת תאים: מחדש להשעות את התאים µL 200 של צביעת מאגר עם 1 µg/mL Fc-בלוק, ואחריו דגירה על קירור קרח או 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות בחושך.
- כתם תאים באמצעות לוחות הנוגדן הרצוי/קרינה פלואורסצנטית (למשל. T-cell לוח, לוח macrophage, וכו '.): להוסיף את התערובת נוגדן מדולל במאגר חסימה Fc כדי כל דגימה, הכתם במשך לפחות 30 דקות על קרח בחושך.
- להוסיף 1 מ"ל של PBS קר קרח כל שפופרת, מחדש להשעות את התאים בעדינות, ואחריו צנטריפוגה ב x 300 גרם במשך 5 דק. להשליך תגובת שיקוע וכתוצאה מכך.
- חזור על שטוף את התאים פעמיים.
- הכתם לסמני תאיים במידת הצורך, השלבים הבאים 6-10, לקפוץ אחרת לשלב 10.
- מחדש להשעות בגדר תא על-ידי דופק מערבולת ולהוסיף 200 µL של הפתרון עובד פיקסציה/Permeabilization מוכן עבור כל דגימה. דופק מערבולת שוב ולאחר מכן דגירה ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה (מועדף) או 30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
- ספין למטה התאים ולהסיר את תגובת שיקוע.
- לשטוף פעמיים על-ידי הוספת 1 מ"ל של 1 x Permeabilization מאגר (עשוי מ- 10 x מאגר Permeabilization, מדולל עם מזוקקים H2O) ואחריו צנטריפוגה ולאחר decanting של תגובת שיקוע.
- מוסיפים נוגדן סמן תאיים 1 x Permeabilization מאגר, דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות בחושך.
- רחץ תאים פעמיים עם 1 מ"ל של 1 x Permeabilization מאגר. צנטריפוגה, decant תגובת שיקוע.
- Resuspend תאים µL 150 מאגר מכתים ולנתח על cytometer. בשל ההליך קיבעון, permeabilization, FSC (פיזור אור קדימה) / האס (פיזור כשהתרחש) התפלגות האוכלוסייה התא יהיה שונה לחיות תאים. לכן, השער ואת המתחים תצטרך להיות שונה.
-
FMO פקדים (זריחה מינוס פקד אחד)
הערה: ניתוח תזרים צבע רב חשוב במיוחד לניתוח של תאים חיסוניים גידולים הסתננות. לכן, יש צורך למצוא דרך כדי לזהות שער תאים בהקשר של נתונים התפשט. עקב fluorochromes מרובות בלוח נתון. שליטה FMO (קרינה פלואורסצנטית מינוס אחד) היא גישה חשובה למטרה זו.- לשם כך, כוללים עכברים נוספים לכל קבוצה של פקדים FMO (לפחות 2 לכל Rx) ותהליך בנפרד עבור כל רקמות. לאחר דיסוציאציה, בריכת רקמות. לדוגמה, במחקר עם 4 קבוצות Rx, גידולים נוספים 8 צריך להיות מעובד בנפרד, ואז איחדו לתוך דוגמא אחת עבור FMOs.
-
זרימת כלי ההתקנה
- להפוך חרוזים פיצוי בזמן המכשיר מתחמם (לפחות 20 דקות).
- להשתמש חרוזים CS & T לבדיקת ביצועים.
- מתח והגדרות פיצוי: להשתמש UltraComp חרוזים, מערבולת הפקודה Comp חרוזים ביסודיות לפני השימוש.
- תווית צינור מדגם2 מ מ 12 x 75 נפרד עבור כל נוגדן fluorochrome מצומדת.
- להוסיף 100 µL של צביעת המאגר כדי כל שפופרת. להוסיף טיפה מלאה 1 (כ-60 µL) של החרוזים כל שפופרת.
- להוסיף נוגדנים, בצע את ההליך מכתימים בדיוק כמו תהליך הדגימה צוין בסעיף 4.
- להוסיף 0.5 מ של צביעת מאגר כל, לגמרי מחדש להשעות חרוז כדורי דרך מערבולת.
- הגדר זרימת cytometer PMT מתח לכל רקמת המטרה לניסוי נתון.
- לרוץ דרך זרימת cytometer עבור ייבוא נתונים, על ידי gating על האוכלוסייה חרוז גופיה לכל הקריאות FSC של האס.
- הגדרת קצב הזרימה סביב 200 – 300 אירועים/s.
- הגדר המתאימה פיצוי fluorescein נתון [FITC]-נוגדן מצומדת, שימוש FL1 לעומת FL2 נקודה עלילה.
- המקום שער רביע כך חרוזים שליליים נמצאים במרחק רביע השמאלית התחתונה, החרוזים חיובי העליונה או להוריד נכון רביע. התאימו את ערכי הפיצויים עד עוצמת קרינה פלואורסצנטית החציוני (MFI) לכל האוכלוסייה (כפי שמוצג בחלון הנתונים הסטטיסטיים רבעים) שווה כ (קרי עבור FL2-% FL1, MFI FL2 של שני חרוזים צריך להיות דומה).
- חזור על הצעדים 5.4.11 ו- 5.4.12 לכל הצינורות.
- המשך רכישת בפועל צבעונית דגימות. הפעל את אשף פיצוי ושמור את ההגדרות עם התבנית "תאריך ניסוי ראשי התיבות של שמך".
6. זרימת הנתונים ניתוח והצגת
- ניתוח נתונים באמצעות Flowjo ו/או קלוצה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Orthotopic השרשה של PDAC הביא הגידול מהיר דומה כי ראיתי להשתלה SC. אחרי השברים הגידול התורם שהיו מושתלים לתוך עכברים הנמען, הן subcutaneously orthotopically לפי הפרוטוקולים שתואר בשלבים 2.1 ו- 2.2, גידולים מאותו מין KPC מושתל הפגינו דומה צמיחה מהירה כפי שמוצג איור 1A . גידולים מאותו מין KPC שנקטפו בנקודות זמן שונות מוצגות באיור איור 1B , נציג H & E תמונות מוצגות באיור 1C. הנתונים שלנו הראו צמיחה דומה של SC, orthotopic שתלים.
תאים סרטניים קיימא ותאים ב טיים, כולל גידולים הסתננות תאים חיסוניים, שמקורם orthotopic או SC השרשה, ניתן ביעילות לשחזר. גידולים היו קוצרים, מתעכל להתכונן תא בודד המתלים חשפה FACS באמצעות dissociator מסחרי (איור 2 א) לפי הפרוטוקול המתואר בשלב 4. בדרך כלל השגנו תא קיימא גבוהה יחסית התשואות בין דגימות הגידול של שני סוגי השרשה (הכדאיות ~ 80% בהתבסס על Trypan Blue); העלילה FACS נציג מראה התאים קיימא מהגידול, הופרדו ההריסות תא תאים מתים (איור 2B).
גידולים הסתננות התאים החיסוניים של קבוצות משנה שונים זוהו orthotopic והן גידולים SC מושתל, בעוד את הפרופילים שלהם יש הבדלים. התליה תא בודד שהוכנו גידול רקמות באמצעות השיטה המתוארת בשלב 4.2 היו נתונים FACS ניתוח לאחר צביעת עם פאנל 16 הצבעים של סמני שמוצג בטבלה 1, אשר מכסה שושלות שונות של תאים חיסוניים חשוב כמו כמו תאים סרטניים. חסימה אסטרטגיה או החיסון שושלת היוחסין ההירארכיה יחד עם נציג זרימה חלקות מוצגים באיור 3 א. CD45, סמן כל בוגר תאים חיסוניים, שימש הבחנה תאים סרטניים ותאים חיסוניים גידולים הסתננות. כל שושלות המערכת החיסונית נותחו לאחר מכן מן CD45+ אוכלוסיות כפי שהוא מוצג על ידי הפאנל (טבלה 1).
לצד סמנים, גודל תא משמש גם כדי להבדיל בין subpopulations שונים (3B באיור משמאל) לכמת תא קבוצות משנה, כולל T, לימפוציטים B, מקרופאגים, MDSCs, ועוד. גידול שחדר פרופיל החיסונית השוואה של SC לעומת orthotopic homografts של סרטן הלבלב. האוכלוסיות הגדולות תא ספורים של מספר קבוצות של מפתח משנה של הגידול שחדר תאים חיסוניים מוצגים באיור 3C. הנתונים מראים בבירור כי הגידול גדל באופן משמעותי הסתננות תא החיסון לעומת הלבלב של עכברים בריאים. בנוסף, נמצאו אחוזים שונים של משנה של גידולים הסתננות התאים החיסוניים orthotopic vs. SC homografts, למשל B-תאים משמעותי יותר orthotopic מאשר ב- SC.
| סמן | אוכלוסיית תאים חיסוניים |
| CD45 | לויקוציטים סה |
| CD3 | סה כ תאי T |
| CD4 | תאי CD4 + T helper |
| CD8 | CD8 + T ציטוטוקסיים |
| CD44 / CD62L * | תאי T נאיביים, זיכרון, אפקטור |
| CD69/CD44/OX40/CD25 ועוד* | הפעלת סמנים |
| CD4 + CD25 + FoxP3 + | תאי T רגולטוריים |
| CD11b + Ly6c/Ly6g | G-MDSC ו- M-MDSC |
| CD11b + F4/80 | מקרופאגים |
| IA/IE/CD206 | מקרופאגים M1 ו- M2 |
| CD3-CD335 + | תאי NK |
| CD3 + CD335 + | NKT תאים |
| CD19 | בתאי B |
| TNF-/ IFN-r/IL-7/IL-3 ועוד* | ציטוקינים |
| PD-1/PD-L1/CTLA-4/טים-3 ועוד* | מחסום מעכבי |
| Granzym B ועוד* | סמני ביקשו |
| KI67/Brd U/PNCA וכו | התפשטות |
| חי/מת (שניתן לתקן) | חי/מת |
| * הערה: סמנים נוספים שניתן להוסיף לפי הצורך | |
טבלה 1: 16 צבעים זרימה לוחות המיועדים ניתוח של גידולים הסתננות התאים החיסוניים העכבר.
איור 1: הן orthotopic ו- SC (ישנה) מושתל PDAC גידולים מאותו מין בצמיחה C57BL/6 עכברים הדגימו דומה עם או בלי טיפול gemcitabine. עקומת גדילה (A): SC-, orthotopic-ימין ושמאל. כחול: רכב; זהב: Gemcitabine (ביוזמתה על חיסון פוסט יום 10 בכמות ממוצעת של הגידול SC הגיעו 200 מ"מ3). (B) גידול רקמות בנקודות זמן שונות. (ג) נציג H & E מכתים של שני סוגי homografts (40 x 10). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: גידול רקמות דיסוציאציה להכין תא בודד קיימא ההשעיה. (א) השימוש disassociator; תאים (B) קיימא, הופרדו תאים מתים, כפי שמוצג על ידי ניתוח תזרים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: ניתוח תזרים צבע רב של תאים חיסוניים גידולים הסתננות של orthotopic ושל homografts SC PDAC- הנתונים הגולמיים של כל מדגם הגידול נרכשו מן המכשיר cytometry זרימה, ואחריו ניתוח באמצעות תוכנת ניתוח Flowjo FACS. (א) האסטרטגיה המגביל סטנדרטיים לניתוח, מוצג בתור דוגמה; (B) נציג זרימת gating וניתוח הנתונים באמצעות תקן gating אסטרטגיה; (ג) נציג גידולים הסתננות המערכת החיסונית cellsare שיוצגו כוללים תאי-B, Treg, המקרופאגים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
למרות מחקרים באמצעות גידולים SC מתנהלים יותר בקלות, orthotopically מושתל גידולים מודלים עלולה להיות רלוונטיים יותר ללימודי פרמקולוגיה פרה (במיוחד חקירות קלט/פלט) כדי לספק translatability משופר. דו ח זה מטרתו לעזור לקוראים/הקהל מעוניין להיות מסוגל לבצע את ההליכים טכני יכול לשמש במחקר שלהם בהתאמה. הפרוטוקולים שלנו להפגין את orthotopic השרשה של PDAC עלולה לגרום גדילת הגידול יעיל, הדומה SC השרשה. התצפיות שלנו נראה גם להציע את הנוכחות של פרופילים חיסוניים שונים של TMEs מ השתלות שונות. האתגרים הגדולים להסתגל orthotopic, בהשוואה ל SC השתלות, הם כי מיומנויות מורכבות נדרשים, התהליך הוא זמן רב, הניתוחים להשתלה הן עבודה אינטנסיבית וגם הקושי ניטור orthotopic גידול הצמיחה בחיים.
קיימים ארבעה שלבים קריטיים כדי להבטיח כי orthotopic בלבלב הניסויים מתבצעים בהצלחה: 1) הליך כירורגי של השרשה; 2) זהיר ובזמן ניטור של התפתחות גידולים; 3) את החשיבות של ביצוע ניסוי טרום בדיקות קודם כדי להכיר ההליך ולהעריך את לקחת שיעור וקצב הגידול צמיחה; 4) באמצעות תא בודד המתלים של חלופה מועדפת גידולים כמו שיטת engraftment חלופי. הליך זה הדוח שימושי לקוראים לביצוע מחקר באמצעות הזה מאותו מין ספציפי, כמו גם מודלים אחרים orthotopic הלבלב, orthotopic אפילו אחרים מודלים המצריכות ניתוח פתיחת בטן.
Flow cytometry או FACS כיום הכלי החשוב ביותר כדי לבצע immunoprofiling. Immunophenotyping של גידולים על ידי FACS שונה באופן משמעותי מזו של תאים של איברים שונים, כגון דם היקפיים, הטחול, לימפה, מח עצם בדרכים הבאות. באופן כללי, יש אחוז קטן מאוד של תאים חיסוניים נוכח גידולים (גודל מדגם קטן). הטרוגניות קיצונית של גידולים ומספר קטן של תאים חיסוניים נוכח להפוך בגמילה קיימא נדיר תאים חיסוניים טכנית מאתגר, הדורשים רקמת הגידול התפתח מנהג דיסוציאציה מכונות מעורבים. בשתי נקודות קודמות לבצע מדידה רב פרמטר בו זמנית באמצעות cytometry זרימה צבע רב חיוני. צבע רב זרימה דורש עיצוב לוח הסמן מורכבים, פיצוי ו- gating אסטרטגיות, בשל חפיפה ספקטרלי זריחה. דו ח זה גם ניסה להפגין בפני הקוראים/הקהל גם התהליך של גידול החיסון פרופיל דרך הדיסוציאציה רקמת הגידול מוגדר וניתוח cytometry זרימה צבע רב.
שלושה שלבים קריטיים יכול להיות חשוב במיוחד להניב פרודוקטיבי TIL ניתוח: ראשית, תשואה גבוהה של התאים קיימא התאוששה הפומבית גידולים באמצעות הליכים דיסוציאציה הגידול מותאמים אישית; שנית, העיצוב אופטימיזציה של צבע רב גדול לוחות מכתימים בהתבסס על נוגדנים זמינים; השלישי, אסטרטגיית המגביל ממוטבת בניתוח. המחברים רוצה להדגיש את האימונים, החוויה של מפעילי חדרי קירור והקפאה וניתוח חיוניים לניתוח cytometry זרימה מוצלחת של TIL.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
כל המחברים הם עובדים במשרה מלאה הנוכחי של הכתר Bioscience, inc.
Acknowledgments
המחברים מודים ד ר ג'ודי בארבו - קריאה ועריכה ביקורתית של כתב היד, ותודה ראלף מנואל לעיצוב יצירות אמנות. המחברים רוצה גם להודות את הכתר Bioscience אונקולוגיה חיסונית-אונקולוגיה סמן צוות וצוות אונקולוגיה Vivo ב , על מאמציהם טכני נהדר.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia machine | \ | SAS3119 | \ |
| Trocar 20 | \ | \ | 2 mm |
| Petri dish | \ | \ | 20 mm |
| 100x antibiotic and antimycotic | \ | \ | \ |
| Iodophor swabs | \ | \ | Daily pharmacy purchase |
| Alcohol swabs | \ | \ | Daily pharmacy purchase |
| Liquid nitrogen | Air chemical | \ | \ |
| Biosafety hood | AIRTECH | BSC-1300IIA2 | \ |
| FACS machine LSRFortessa X-20 | BD | LSR Fortessa | \ |
| antibodies | BD | \ | \ |
| Trevigen MD or BD Matrigel Basement Membrane Matrix High concentration | BD | 354248 | \ |
| FACS buffers | BD | 554656 | Mincing buffer |
| Brilliant Staining Buffer | BD | 563794 | \ |
| Mouse BD Fc Block | BD | 553142 | \ |
| cell filters | BD-Falcon | 352350 | 70 µm |
| routine blood tube | BD-Vacutainer | 365974 | 2 mL |
| Kaluza | Beckman | vs 1.5 | |
| 6-well plates | Corning | 3516 | \ |
| Foxp3 Fix/Perm kit | ebioscience | 00-5523-00 | \ |
| UltraComp eBeads | ebioscience | 01-2222-42 | \ |
| Centrifuge | eppendorf | 5810R,5920R | \ |
| FlowJo software | FlowJo LLC | \ | vs 10.0 |
| PBS | Hyclone | SH30256.01 | 50 mL |
| RPMI 1640 | Hyclone | SH30809.01 | \ |
| Disposable, sterile scalpels | Jin zhong | J12100 | 11# |
| knife handle | Jin zhong | J11010 | \ |
| eye scissors and tweezers | Jin zhong | Y00030 | Eye scissors 10 cm |
| eye scissors and tweezers | Jin zhong | JD1060 | Eye tweezers 10 cm with teeth |
| Portable liquid nitrogen tank | Jinfeng | YDS-175-216 | \ |
| Electronic balance | Metter Toledo | AL204 | 0-100 g |
| Miltenyi C-tubes | Miltenyi | 130-096-334 | \ |
| Miltenyi Gentle MACS with heater blocks | Miltenyi | 120-018-306 | \ |
| Tumor Dissociation Kit | Miltenyi | 130-096-730 | \ |
| Cell counter | Nexcelom | Cellometer | Cellometer Auto T4 |
| cryopreservation tube | Nunc | 375418 | 1.8 mL |
| Cultrex High Protein Concentration (HC20+) BME | PathClear | 3442-005-01 | \ |
| syringes | Shanghai MIWA medical industry | \ | 1-5 mL |
| Studylog software | Studylog | \ | software |
| Studylog-Balance and supporting USB | OHAUS | SE601F | Balance and supporting USB |
| Studylog-Data line of vernier calipers | Sylvac | 926.6721 | Data line of vernier calipers |
| Caliper | Sylvac | 910.1502.10 | Sylvac S-Cal pro |
| Sterilized centrifuge tubes | Thermo | 339653 | 50 mL |
| Sterilized centrifuge tubes | Thermo | 339651 | 15 mL |
| Ice bucket | Thermo | KLCS-288 | 4 °C |
| Ice bucket | Thermo | PLF-276 | -20 °C |
| Ice bucket | Thermo | DW-862626 | -80 °C |
| RNAlater | Thermo | am7021 | \ |
References
- Chevrier, S., et al. An Immune Atlas of Clear Cell Renal Cell Carcinoma. Cell. 169 (4), 736-749 (2017).
- Wargo, J. A., Reddy, S. M., Reuben, A., Sharma, P. Monitoring immune responses in the tumor microenvironment. Curr. Opin. Immunol. 41, 23-31 (2016).
- Mosely, S. I., et al. Rational Selection of Syngeneic Preclinical Tumor Models for Immunotherapeutic Drug Discovery. Cancer Immunol. Res. 5 (1), 29-41 (2017).
- Rühle, P. F., Fietkau, R., Gaipl, U. S., Frey, B. Development of a Modular Assay for Detailed Immunophenotyping of Peripheral Human Whole Blood Samples by Multicolor Flow Cytometry. Int. J. Mol. Sci. 17 (8), e1316 (2016).
- Jiang, H., et al. Targeting focal adhesion kinase renders pancreatic cancers responsive to checkpoint immunotherapy. Nat. Med. 22 (8), 851-860 (2016).
- Gunderson, A. J., et al. Bruton Tyrosine Kinase-Dependent Immune Cell Cross-talk Drives Pancreas Cancer. Cancer Discov. 6 (3), 270-285 (2016).
- Li, Q. X., Feuer, G., Ouyang, X., An, X. Experimental animal modeling for immuno-oncology. Pharmacol. Ther. 17, 34-46 (2017).
- Takao, K., Miyakawa, T. Genomic responses in mouse models greatly mimic human inflammatory diseases. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 112 (4), 1167-1172 (2015).
- Payne, K. J., Crooks, G. M. Immune-cell lineage commitment: translation from mice to humans. Immunity. 26 (6), 674-677 (2007).
- Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. J. Immunol. 172 (5), 2731-2738 (2004).
- von Herrath, M. G., Nepom, G. T. Lost in translation: barriers to implementing clinical immunotherapeutics for autoimmunity. J. Exp. Med. 202 (9), 1159-1162 (2005).
- Talmadge, J. E., Singh, R. K., Fidler, I. J., Raz, A. Murine models to evaluate novel and conventional therapeutic strategies for cancer. Am. J. Pathol. 170 (3), 793-804 (2007).
- Erdag, G., et al. Immunotype and immunohistologic characteristics of tumor-infiltrating immune cells are associated with clinical outcome in metastatic melanoma. Cancer Res. 72 (5), 1070-1080 (2012).
- Gutiérrez-Garcia, G., et al. Gene-expression profiling and not immunophenotypic algorithms predicts prognosis in patients with diffuse large B-cell lymphoma treated with immunochemotherapy. Blood. 117 (18), 4836-4843 (2011).
- Paiva, B., et al. PD-L1/PD-1 presence in the tumor microenvironment and activity of PD-1 blockade in multiple myeloma. Leukemia. 29 (10), 2110-2113 (2015).
- Youn, J. I., Collazo, M., Shalova, I. N., Biswas, S. K., Gabrilovich, D. I. Characterization of the nature of granulocytic myeloid-derived suppressor cells in tumor-bearing mice. J. Leukoc. Biol. 91 (1), 167-181 (2012).
- Lavin, Y., et al. Innate Immune Landscape in Early Lung Adenocarcinoma by Paired Single-Cell Analyses. Cell. 169 (4), 750-765 (2017).
- Mahoney, K. M., et al. PD-L1 Antibodies to Its Cytoplasmic Domain Most Clearly Delineate Cell Membranes in Immunohistochemical Staining of Tumor Cells. Cancer Immunol. Res. 3 (12), 1308-1315 (2015).
- Yamaki, S., Yanagimoto, H., Tsuta, K., Ryota, H., Kon, M. PD-L1 expression in pancreatic ductal adenocarcinoma is a poor prognostic factor in patients with high CD8+ tumor-infiltrating lymphocytes: highly sensitive detection using phosphor-integrated dot staining. Int. J. Clin. Oncol. 22 (4), 726-733 (2017).
- Jiang, Y., et al. ImmunoScore Signature: A Prognostic and Predictive Tool in Gastric Cancer. Ann. Surg. , (2016).
- Ribas, A., et al. PD-1 Blockade Expands Intratumoral Memory T Cells. Cancer Immunol. Res. 4 (3), 194-203 (2016).
