Summary
Forsøgsmetoden på Immunofænotypning af murine orthotopic PDAC homografts sigter profilering tumor immuno-mikromiljø. Tumorer er orthotopically implanteret via kirurgi. Tumorer i 200-600 mm3 i størrelse blev høstet og adskilles for at forberede encellede suspensioner, efterfulgt af flere immun markør FACS analyse ved hjælp af forskellige fluorescently-mærket antistoffer.
Abstract
Homograft (syngeneic) tumorer er arbejdshest af dagens immuno-onkologi (I/O) prækliniske forskning. Tumor mikromiljø (TME), især dens immun-komponenter, er afgørende for de prognose og forudsigelse af behandlingsresultater, især dem af immunterapi. TME immun-komponenter er sammensat af forskellige delgrupper af tumor infiltrerer immunceller vurderbare af multi-farve FACS. Pancreas duktalt adenokarcinom (PDAC) er blandt de dødeligste malignances mangler gode behandlingsmuligheder, således et presserende og udækket medicinsk behov. En vigtig årsag til dens ikke reaktionsevne på forskellige behandlinger (kemo-, målrettet, I/O) har været sin rigelige TME, bestående af fibroblaster og leukocytter, der beskytter tumorceller fra disse behandlinger. Orthotopically implanterede PDAC menes at mere præcist generobre TME af menneskelige pancreascancer end konventionelle subkutan (SC) modeller.
Homograft tumorer (KPC) er transplantationer af musen spontane PDAC stammer fra gensplejsede KPC-mus (KrasG12D / +/P53- / -/Pdx1-Cre) (KPC-CLAUSS). Den primære tumor væv er skåret i små fragmenter (~ 2 mm3) og transplanteret subkutant (SC) til de syngeneic modtagere (C57BL/6, 7-9 uger gammel). Homografts blev derefter kirurgisk orthotopically transplanteret ind på bugspytkirtlen af nye C57BL/6 mus, sammen med SC-implantation, som nåede tumor mængder af 300 – 1.000 mm3 af 17 dage. Kun tumorer af 400-600 mm3 blev høstet pr. godkendt obduktion procedure og renses for at fjerne de tilstødende ikke-tumor væv. De var dissocieres per protokol ved hjælp af en væv dissociator i én celle suspensioner, efterfulgt af farvning med udpegede paneler af fluorescently mærket antistoffer til forskellige markører for forskellige immunceller (lymfoid, myeloid og NK, DCs). De farvede prøver blev analyseret ved hjælp af multi-farve FACS til at bestemme antallet af immunceller af forskellige slægter, som deres relative procentdel i tumorer. De immun profiler af orthotopic tumorer blev derefter sammenlignet med dem af SC tumorer. Den foreløbige data demonstreret betydeligt forhøjet infiltrerer TILs/TAMs i tumorer i bugspytkirtlen, og højere B-celle infiltration i orthotopic i stedet for SC tumorer.
Introduction
Pancreas duktalt adenokarcinom (PDAC) forårsager næsten halvdelen en million dødelighed over hele verden hvert år, en af top 5 cancer killers. Der er nogle effektive behandlingsmuligheder og ingen godkendte immunoterapi; Derfor er der desperat behov for nye behandlinger. Kræft er i stigende grad bliver anerkendt som immunologiske sygdomme, herunder PDAC, ud over de genetiske sygdomme, som i dag. Immunologiske og genetiske faktorer ville sandsynligvis bestemme sygdommen prognosen samt behandling resultater. Tumorer unddrage vært immun overvågning og i sidste ende fremme for at forårsage død. Mange af disse immune processer forekomme inden for tumor mikromiljø (TME)1,2,3,4 hvor forskellige typer af immunceller interagere med tumorceller, med hinanden og med andre tumor stromale komponenter, direkte eller indirekte via cytokiner, som i sidste ende bestemme sygdom resultat. Karakterisering af tumor immunkomponenter TME, og tumor Immunofænotypning, herunder subtyping, nummerering og lokalisering af forskellige slægter af immunceller, er derfor afgørende for at forstå anti-tumor immunitet. I forbindelse med PDAC, det er blevet foreslået at forhøjet tumor infiltrerer smittespredningshæmmende makrofager (TAM) og B-celler har ført til forebyggelse af T-celle infiltration og/eller aktivering og høje niveauer af fibrose5,6.
Den fælles tilgang at undersøge immun TMEs eksperimentelt ville bruge surrogat tumor prækliniske dyremodeller, hovedsageligt relevante mus tumor modeller7, især mus syngeneic (homograft) eller genetisk modificerede musemodeller (CLAUSS) af kræft, på den formodede lighed af mus og mennesker for tumorer og immunitet8,9. Det er forstået i virkeligheden, at der er iboende forskelle mellem to arter10,11.
Transplanterede mus tumorer har betydelige driftsmæssige fordele over spontane tumorer7, nemlig synkroniserede tumor udvikling i modsætning til forældrenes CLAUSS spontan tumor udvikling. Homografts af spontan murine tumorer betragtes som primære tumorer har aldrig været manipuleret i in vitro, og spejling oprindelige mus tumor Histò- / Molekylær Patologi7, samt mulige immun profiler. Disse murine homografts er ofte anset for at være "en mus version af patient-afledte xenografts (PDXs)". De har derfor sandsynligvis en bedre translatability end konventionelle syngeneic cell line-afledte mus tumorer12. Især er mange homografts afledt af specifikke CLAUSS hvor specifikke menneskelige sygdomsmekanismer, fx muterede driver mutationer, er manipuleret, og disse homografts bør derfor have fordele til deres kliniske relevans. Især udvikle KPC GEMM mus PDAC inden for 15 – 20 ugers-alderen, som morfologisk sammenfatter menneskelige sygdommen med overvejende godt - til moderat-opdelte glandulær arkitektur og højt beriget stroma. Denne model indeholder også de mest almindelige genetiske egenskaber i menneskets PDAC, nemlig Kras aktivering mutation og P53 tab af funktion, som forekommer i 90% og 75% af menneskelig PDAC, henholdsvis5,6.
Lokaliteter af transplantation er også blevet foreslået til at spille en rolle i model translatability. Det specifikke omkringliggende væv miljø, som en tilsvarende orthotopic miljø, kunne være en niche for specifikke tumorer til fremskridt, i modsætning til den ensartede subkutan (SC) miljøer for almindeligt transplanterede tumorer. Det ville være af særlig interesse, hvis og/eller, hvad forskel der findes mellem de to transplantation sites, immun-mikromiljø og relevans for menneskers kræft, fx. i forbindelse med PDAC.
En af de vigtigste aspekter af immun profilering, eller Immunofænotypning, er at bestemme tumor infiltrerer immunceller af forskellige slægter, tal, relative procentdel i tumorer, samt deres aktivering stater og steder. Dette omfatter tumor-infiltratrating lymphoctyes (TILs, både T- og B-), tumor infiltrerer makrofager (TAMs), tumor infiltrerer naturlige dræberceller (NKs) og tumor-resident dendritiske celler3,13,14 , 15 , 16 , 17, og subcellulært lokaliseringen af visse celler18,19,20, osv. Fluorescens aktiveret celle sortering (FACS) eller flow flowcytometri er en enkelt celle detection teknologi, der er almindeligt anvendt til at måle de specifikke parametre for en celle. Multi-farve flow flowcytometri foranstaltninger flere markører på en enkelt celle3,4,21 og er den mest anvendte metode til at bestemme de tal og relative procentdel af forskellige delmængder af immunceller, herunder dem, inden tumorer.
Denne rapport beskriver procedurer for profilering tumor infiltrerer immunceller: 1) Implantation af orthotopic PDAC mus tumor homografts, sammen med SC implantation; 2) tumor væv høst og enkelt celle forberedelse via tumor dissociation; 3) flow flowcytometri analyse af alle de celler, der stammer fra tumorer som en baseline; 4) sammenligning af baseline profiler af både transplantation tilgange.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle protokoller og tillægsaftaler eller procedurer, der involverer pleje og brug af dyr bliver gennemgået og godkendt af Crown Bioscience institutionelle dyrs pleje og bruge udvalg (IACUC) før gennemførelsen af undersøgelser. Pleje og brug af dyr vil normalt blive udført i overensstemmelse med internationale retningslinjer for AAALAC (Foreningen for evaluering og akkreditering af Laboratory Animal Care), som rapporteret i vejledningen for pleje og brug af forsøgsdyr, nationale forskning Rådet (2011). Alle dyr eksperimentelle procedurer vil være under sterile forhold på SPF (specifikt patogenfrie) faciliteter og udført i nøje overensstemmelse med vejledningen for pleje og anvendelse af forsøgsdyr fra forskellige offentlige institutioner (f.eks. De nationale kontorer i sundhed). Protokollen skal være godkendt af Udvalget om etik af dyr eksperimenter på anlæg institutionen (f.eks. institutionelle IACUC Udvalget).
1. forberedelse til Tumor Transplantation
-
Staldfaciliteter
- Få generiske C57BL/6 mus fra en kommerciel opdræt leverandør.
- Hus mus (5) i enkelte ventileret bure til foelgende betingelser: temperatur: 20 – 26 ° C; luftfugtighed 30-70%; belysning cyklus: 12 timer lys og 12 h mørke.
- Brug majs cob sengetøj er skiftes ugentligt.
- For kost, give bestråling steriliseret tør granulet mad under hele studieperioden.
- For vand, give dyrene fri adgang til sterile drikkevand.
-
Donor tumor fragment forberedelse
- Begynde ved at overvåge kropsvægt (BW), via vejning ved hjælp af en balance, og tumor volumen (TV), af tykkelse måling af tumor-bærende donor mus.
- Når TV når 500-1.200 mm3, aflive dyret i en biohazard hætte som per protokol.
- Sterilisere huden omkring tumor ved hjælp af iodophor svaberprøver.
- Kirurgisk fjerne tumoren (detaljer er beskrevet i afsnit 3: obduktion og tumor høst) og placere tumor i en petriskål, som indeholder 20 mL PBS (pre chill medier eller buffer til 4 ° C forud for euthanizing dyr).
- Hvis der er blod, kontaminerende, overføre tumor til en anden petriskål og vaske tumor med PBS.
- Skære svulsten i halv, at fjerne eventuelle ekstra hud, fartøjer, forkalkning og nekrose.
- Vælg kun intakt stykker af tumor og placere dem i en steril 50 mL-centrifugerør og tilsættes 20 mL PBS så transport rør til en separat dyrs plads til farmakologiske undersøgelser.
2. Orthotopic og subkutane (SC) Engraftment
-
SC podning
- Skær tumorer i 2 mm diameter stykker ved hjælp af en skalpel, sætte 1 luns i hver trokar, SC implantation eller senere orthotopic implantation (se nedenfor).
- Bedøver modtager dyret med 5% isofluran, som vedligeholdes af en næsen kegle på 1%. Dyret vil begynde at slappe af, mister deres oprettende refleks og i sidste ende blive immobile. I denne dybde af anæstesi kan de nemt vækkes af smertefulde stimuli; Tillad anæstesi til at uddybe indtil sådanne reaktioner på smerte er fraværende.
- Når bedøvede, lave mus på en eksperiment bord i den højre laterale holdning. Sterilisere musen bruger iodophor podninger, især områderne omkring tumorer.
- Med en skalpel, gøre en 0,5 til 1,0 cm hud indsnit på venstre flanke, bare kranie til hoften.
- Tunnel under huden mod forelimb, to til tre centimeter, med stump pincet.
- Aseptisk overføre én terning af tumor fra medium og sted dybt inde i det subkutane tunnel.
- Bekræft visuelt, at tumor er dybt inde i tunnelen (og ikke på hud indsnittet).
- Lukke såret med sår klip.
- Overvåge dyr post podning, indtil de genvinde tilstrækkelig bevidsthed for at opretholde brystbenet recumbence. Vende dyr tilbage til deres bur kun efter deres fuld helbredelse fra anæstesi. Komplet anæstesi Log og indlede dyrs sundhed diagram. Veje modtager dyr dagligt i tre dage
- En standardprocedure, podes 5-10 mus pr. gruppe for overvågning af tumor vækst.
-
Pancreas orthotopic implantation
- Anæstesi og analgesi
- Bruger en 2 mL ketamin injektion og 0,42 mL xylazin injektion (20 mg/mL) blandes i 5,91 sterile injektion vand eller saltvand ved dosis lydstyrke på 0,06 – 0,1 mL/20-25 g kropsvægt.
Bemærk: Ifølge dyrevelfærd, analgesi er nødvendige både præ og bogføre operation. 0,05-0,1 mg buprenorphin /kg, SC. Den første dosis før operation og derefter doseret 3 gange hver 4 timer post-handlingen hele tiden.
- Bruger en 2 mL ketamin injektion og 0,42 mL xylazin injektion (20 mg/mL) blandes i 5,91 sterile injektion vand eller saltvand ved dosis lydstyrke på 0,06 – 0,1 mL/20-25 g kropsvægt.
- Kirurgisk operation for orthotopic implantation
- Bedøver mus via intramuskulær injektion (IM) pr. trin 2.2.1.
- Når dyrene er fuldt bedøvede, lave mus på en eksperiment bord i den højre laterale holdning.
- Holde mus i den højre laterale holdning. Desinficere huden omkring milten med jod derefter de-iodinate med 75% ethanol.
- Find det medium punkt af milten og lave en 1 cm lodret snit på maven til at udsætte milten.
- Trække ud en del af bugspytkirtlen vævet under milten forsigtigt med flad spids pincet, og sutur en mus homograft tumor stykke fra frø musen på bugspytkirtlen recipient mus af 9-0 resorberbar kirurgisk sutur.
- Luk maven med en 6-0 silke sutur af dobbelt søm. Opnå homeostase af komprimering.
- Efter efterbehandling tumor implantation, hvis hverken blødning eller tumor væv lækage opstår, holde dyrene i en varm bur.
- Overvåge dyret indtil det genvinder tilstrækkelig bevidsthed for at opretholde brystbenet recumbency; returnere dyret til den animalsk værelse efter fuld helbredelse fra anæstesi. Overvåge tumoren forsynet med mus ved føles maven i nærheden af milten og vælg de mus, forsynet med orthotopic tumorer.
- Anæstesi og analgesi
-
Tumor-bærende mus sundhed overvågning
- Tjek vand og mad forbruget dagligt.
- Undersøge mus udseende for en ungroomed hår jakke, klumper, tynd, unormal åndedræt eller ascites.
- Palpere maven for at kontrollere, om der er spontane tumorer i leveren eller milten.
- Veje mus hver uge bruger en balance.
- Hvis nogen af følgende kliniske tegn er observeret, at musene er ofret for prøvetagning og obduktion: BW tab > 20%; nedsat mobilitet (ikke stand til at spise eller drikke); stand til at flytte normalt på grund af betydelig ascites og udvidet maven; indsats i respiration.
3. obduktion og Tumor høst
- Inspicér visuelt og ved palpation for tilstedeværelsen af håndgribelig tumorer før afslutning.
- Opsigelse, først euthanize mus som godkendte protokol, og åbne maven og visuelt undersøge bugspytkirtlen for tumorer.
- Afbrød tumor af post mortal kirurgi og føje den til koldt PBS. Placere alle dyr i en ren, tomt, gennemskinnelige eutanasi kammer med en speciel låg med en port til levering af kuldioxid skal anvendes.
- Losse gas ind i salen på en strømningshastighed, der producerer hurtige bevidstløshed med minimal nød til dyret. Den optimale flow for CO2 bør være omkring 2-2,5 L/min.
- Visuelt observere hvert dyr under proceduren dødshjælp til at forsikre alle dyr modtager tilstrækkelige koncentrationer og ikke genvinde bevidsthed under proceduren aflive.
- Vedligeholde gasflow i mindst 1 minut efter tilsyneladende klinisk død at minimere muligheden for, at et dyr kan inddrive (hvis apneic men ikke død).
- Fjerne tilstødende ikke-tumor væv. Renset tumor kan være fotograferet hurtigt.
Sætte tumor væv i RPMI-1640 og holde på is før dissociation.
Bemærk: Dyrs kroppe er sække og gemt i passende fryseren at afvente fjernelse.
4. tumor væv Dissociation og enkelt celle forberedelse
-
Af reagens
Bemærk: Tumor Dissociation Kit indeholder 2 hætteglas med enzymet D (frysetørret pulver), 1 hætteglas af enzymet R (frysetørret pulver), 1 hætteglas af enzymet A (frysetørret pulver) og 1 mL Buffer A.- Forbered enzymet D ved at retablere den frysetørrede pulver i hvert hætteglas med 3 mL af RPMI-1640. Forberede delprøver af en passende mængde at undgå gentagne fryse-tø-cykler.
- Forbered enzym R ved at retablere den frysetørrede pulver i hætteglas med 2,7 mL af RPMI 1640. Forberede delprøver af en passende mængde at undgå gentagne fryse-tø-cykler.
- Forbered enzym A ved at retablere den frysetørrede pulver i hætteglas med 1 mL Buffer A leveres med kittet. Gør ikke vortex. Forberede delprøver af en passende mængde at undgå gentagne gratis-tø-cykler.
- Forbered enzym mix ved at tilføje 2,35 mL af RPMI-1640, 100 µL af enzymet D, 50 µL af enzymet Rasmussen og 12,5 µL af enzymet A i hver gentleMACS C-rør.
-
Tumor Dissociation
- For hver tumor forberede en C-tube med tumor fordøjelsen mix, henvises til afsnit 4.1 for fordøjelsen buffer fortynding og forberedelse.
- Brug 3 mL fordøjelsen buffer for tumor fragmenter < 0,8 g, og sikre, at tumor er fuldt fordøjet.
- Etiket med undersøgelse kode, tumor, mus ID, behandling gruppe og tumor vægt.
- Indsamle tumor fra musen, vaske tumor i kolde PBS og rense ud i vævet fastgjort på tumor (såsom blodkar, fedt, fascia, osv.).
- Sætte tumor i fordøjelsen medier i et godt af en steril 6 godt plade.
- Hold tumor i sted med sterile pincetter/pincet og skive med en skalpel. Skær tumor godt nok til at bryde ind i mindre stykker (~ 1 mm3).
- Placer tumor stykker tilbage ind i C-rør og bruge den resterende fordøjelsen buffer til at vaske pladen og derefter overføre væske ind i C-rør, der er placeret på is indtil fordøjelsen.
- Tænd dissociator med varmeapparater.
- Placer tumor dissociation C-rør hovedet ind i ærmerne af de ledige stillinger og justere status for tube positioner fra gratis til udvalgte. Vælg en dissociation program (37_c_m_TDK_1), efterfulgt af udvælgelse af den krævede mappe, hvor listen over programmer vises.
- Tag C-rør dissociator og spin kort (300 x g, 4 ° C) til pellet prøven efter afslutning af programmet.
- Genopslæmmes prøver og sætte ind i en celle si over en 50 mL tube. Cellerne vaskes gennem celle si med 10 mL af wash buffer til at give en enkelt celle suspension.
- Centrifugeres rør på 300 x g i 5 min, supernatanten og cellerne genopslæmmes med 5 mL af vaskebuffer, grev levedygtige celler benytter trypan blå og/eller af celle counter og justere celle concentraton til 1 x 106 celler pr. tube eller pr. prøve. Omfatte de korrekte isotype kontrol antistoffer for at sikre farvning er specifikke
5. immun Panel Design og Flow dataopsamling
-
Panel design
- Se tabel 1.
-
Immunfarvning
- FC-blok prøve celler: genopslæmmes celler i 200 µL af farvning buffer med 1 µg/mL Fc-blok, efterfulgt af inkubation på is eller 4 ° C køle i 15 min. i mørke.
- Pletten celler ved hjælp af de ønskede antistof/fluorescens paneler (fx. T-Cell panel, makrofag panel, osv.): tilføje antistof blandingen fortyndes i Fc blokerende buffer til hver prøve, pletten i mindst 30 min på is i mørke.
- Der tilsættes 1 mL af is kold PBS til hver tube og cellerne genopslæmmes forsigtigt, efterfulgt af centrifugering ved 300 x g i 5 min. kassere den resulterende supernatanten.
- Gentag for at cellerne vaskes to gange.
- Pletten for intracellulære markører hvis nødvendigt, følgende trin 6-10, ellers springe til trin 10.
- Genopslæmmes celle pellet ved puls vortex og tilføje 200 µL af rede fiksering/Permeabilization brugsopløsning for hver prøve. Puls vortex igen, og derefter inkuberes ved 4 ° C natten over (foretrukne) eller 30 min ved stuetemperatur i mørke.
- Spin ned celler og Fjern supernatanten.
- Vaskes to gange ved tilføjelse af 1 mL af 1 x Permeabilization Buffer (lavet af 10 x Permeabilization Buffer, fortyndes med destilleret H2O) efterfulgt af centrifugering og afpresning af supernatanten.
- Tilføje intracellulære markør antistof i 1 x Permeabilization Buffer og inkuberes ved stuetemperatur i 30 min. i mørke.
- Vaske cellerne to gange med 1 mL af 1 x Permeabilization Buffer. Der centrifugeres og dekanteres.
- Resuspend celler i 150 µL af farvning Buffer og analysere på et Flowcytometret. På grund af fiksering og permeabilization proceduren, FSC (forward-lys scatter) / SSC (sidelys scatter) distribution af cellen befolkningen vil være anderledes end levende celler. Derfor skal gate og spændinger ændres.
-
FMO kontrolelementer (Fluorescens Minus én kontrol)
Bemærk: Multi-farve flow analyse er særlig vigtige for analysen af tumor infiltrerer immunceller. Derfor er der behov for at finde en måde at identificere og gate celler i forbindelse med data spredes på grund af de flere fluorokromer i en given panel. FMO (Fluorescens Minus én) kontrol er en vigtigt tilgang til dette formål.- Med henblik herpå omfatte yderligere mus i hver gruppe for FMO kontrolelementer (mindst 2 pr. Rx) og processen individuelt til hver enkelt væv. Efter dissociation, pool væv. For eksempel i en undersøgelse med 4 Rx grupper, skal 8 yderligere tumorer behandles individuelt og derefter samles i én prøve for FMO'er.
-
Flow Instrument Setup
- Gøre kompensation perler, mens maskinen er opvarmning (mindst 20 min).
- Brug CS & T perler til at tjekke performance.
- Spænding og udligning indstillinger: Brug UltraComp perler, vortex Comp perler grundigt før brug.
- Mærke en separat 12 x 75 mm2 prøveglas for hver fluorokrom-konjugeret antistof.
- Tilsæt 100 µL af farvning buffer til hver tube. Tilføje 1 fuld dråbe (ca. 60 µL) af perlerne til hver tube.
- Tilføje antistoffer og udføre proceduren farvnings-præcis som prøve processen angivet i afsnit 4.
- Der tilsættes 0,5 mL farvning buffer hver, for at helt genopslæmmes perle pellets via vortex.
- Angiv flow forskellige ydelse spænding pr. målvæv for den givne eksperiment.
- Køre gennem flow forskellige til dataopsamling, af gating på singlet perle befolkning pr. FSC og SSC aflæsninger.
- Sæt strømningshastighed omkring 200-300 begivenheder/s.
- Indstille passende erstatning for en given fluorescein [FITC]-konjugeret antistof, brug en FL1 vs FL2 dot plot.
- Placere en kvadrant gate så negative perler er i nederste venstre kvadrant og positive perlerne er i øverst eller lavere højre kvadrant. Justere kompensation værdier indtil median fluorescens intensitet (MFI) af hver befolkning (som vist i vinduet kvadrant statistik) er ca lig (dvs. for FL2-% FL1, FL2 MFI for både perler bør være ens).
- Gentag trin 5.4.11 og 5.4.12 for alle rør.
- Gå videre til at erhverve den faktiske farves prøver. Kør guiden kompensation og gemme indstillingerne med formatet "dato eksperimentere dine initialer".
6. flow Data analyse og præsentation
- Analysere data af Flowjo og/eller Kaluza.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Orthotopic implantation af PDAC resulterede i hurtige tumorvækst svarende til den, set for SC implantation. Når donor tumor fragmenter blev implanteret i modtagerens mus, både subkutant og orthotopically efter protokoller er beskrevet i trin 2.1 og 2.2, indopererede KPC homograft tumorer viste lignende hurtige vækst, som vist i figur 1A . KPC homograft tumorer høstet på forskellige tidspunkter er vist i figur 1B og repræsentant H & E billeder er vist figur 1 c. Vores data viste lignende vækst af SC og orthotopic implantater.
Levedygtige tumorceller og celler i TME, herunder tumor infiltrerer immunceller, stammer fra enten orthotopic eller SC implantation, kan inddrives effektivt. Tumorer blev høstet og fordøjet for at forberede enkelt celle suspensioner for efterfølgende FACS analyse ved hjælp af en kommerciel dissociator (figur 2A) efter den protokol, der er beskrevet i trin 4. Vi opnået normalt rimelig høj levedygtige celle udbytter fra tumor prøver af begge typer af implantation (~ 80% levedygtighed baseret på Trypan blå); de repræsentative FACS plot viser levedygtige celler fra tumor, adskilt fra døde celler/celle debris (figur 2B).
Tumor infiltrerer immunceller af forskellige delmængder er blevet identificeret i både orthotopic og SC implanteret tumorer, mens deres profiler har forskelle. De enkelt cellesuspension fremstillet af tumor væv ved hjælp af metoden beskrevet taktfast 4.2 blev udsat for FACS analyse efter farvning med en 16 farvepanel af markører, der er vist i tabel 1, der dækker forskellige slægter af vigtige immunceller som samt tumorceller. Gating strategi eller immun lineage hierarkiet sammen med repræsentative flow parceller er vist i figur 3A. CD45, en markør for alle modne immunceller, blev brugt til karakteristiske tumorceller og tumor infiltrerer immunceller. Alle immun lineages blev efterfølgende analyseret fra CD45+ populationer, som vises i panelet (tabel 1).
Ved siden af markører, Cellestørrelse bruges også til at skelne mellem forskellige delpopulationer (figur 3B venstre) for at kvantificere celle subsets, herunder T, B-lymfocytter, makrofager og MDSCs, osv. Tumor infiltrerer immun profil sammenligning af SC vs. orthotopic homografts af pancreascancer. De store optalt cellepopulationer af flere vigtige delmængder af tumor infiltrerer immunceller er vist figur 3 c. Data viser klart, at tumor steget betydeligt immun celle infiltration sammenlignet med bugspytkirtlen af sunde mus. Derudover blev forskellige procentdele af undersæt af tumor infiltrerer immunceller fundet i orthotopic vs. SC homografts, fx betydeligt flere B-celler i orthotopic end i SC.
| Markør | Immun celle Population |
| CD45 | Samlede leukocytter |
| CD3 | Samlede T celler |
| CD4 | CD4 + T helper celler |
| CD8 | CD8 + cytotoksiske T-celler |
| CD44 / CD62L * | Naiv, hukommelse og effektor T celler |
| CD69/CD44/OX40/CD25 osv* | Aktivering markører |
| CD4 + CD25 + FoxP3 + | Regulerende T-celler |
| CD11b + Ly6c/Ly6g | G-MDSC og M-MDSC |
| CD11b + F4/80 | Makrofager |
| IA/IE/CD206 | M1 og M2 makrofager |
| CD3-CD335 + | NK-celler |
| CD3 + CD335 + | NKT celler |
| CD19 | B-celler |
| TNF-a/IFN-r/IL-7/IL-3 osv* | Cytokiner |
| PD-1/PD-L1/CTLA-4/TIM-3 osv* | Checkpoint hæmmere |
| Granzym B etc* | Almindeligt ønskede markører |
| KI67/Brd U/PNCA etc | Spredning |
| Live/dead (fixable) | Live/døde |
| * Bemærk: Yderligere markører kan tilføjes efter behov | |
Tabel 1: 16-farvers flow paneler designet til analyse af tumor infiltrerer mus immunceller.
Figur 1: både orthotopic og SC (subQ) implanteret PDAC homograft tumorer i C57BL/6 mus viste lignende vækst, med eller uden Gemcitabin behandling. (A) vækstkurve: SC-venstre, og orthotopic-ret. Blå: Køretøjet; Guld: Gemcitabin (indledt på dag 10 indlæg podning når gennemsnitlige SC tumor volumen nået 200 mm3). (B) tumor væv på forskellige tidspunkter. (C) repræsentant H & E farvning af begge typer af homografts (40 x 10). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Tumor væv dissociation at udarbejde levedygtige enkelt cellesuspension. (A) brugen af disassociator; (B) den levedygtige celler, adskilt fra døde celler, som det fremgår af analysen af handelsstrømmen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: multi-farve flow analyse af tumor infiltrerer immunceller af både orthotopic og SC PDAC homografts. De rå data fra hver tumor prøve blev erhvervet fra flow flowcytometri instrument, efterfulgt af en analyse ved hjælp af Flowjo FACS analyse software. (A) den standard gating strategi for analysen, der vises som et eksempel; (B) repræsentative flow gating og analyse data ved hjælp af standard gating strategi; (C) repræsentative tumor infiltrerer immun cellsare vises for at medtage B-celler, langsomme og makrofager. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Selv om undersøgelser ved hjælp af SC tumorer er mere let udført, orthotopically implanteret tumorer modeller kan potentielt være mere relevante for prækliniske farmakologiske undersøgelser (især I/O undersøgelser) at give øget translatability. Denne betænkning sigter mod at hjælpe interesserede læsere/publikum til at være i stand til direkte visualisere de tekniske procedurer, der kan bruges i deres respektive forskning. Vores protokoller viser denne orthotopic implantation af PDAC kan resultere i effektiv tumorvækst, svarende til SC implantation. Vores observationer også synes at antyde tilstedeværelsen af forskellige immun profiler af TMEs fra de forskellige implantations. De største udfordringer at tilpasse orthotopic, i forhold til SC implantations, er at komplekse færdigheder er påkrævet, processen er tidskrævende, de kirurgiske procedurer til implantation er arbejdskrævende og også vanskelighederne ved at overvåge orthotopic tumor vækst i livet.
Der er fire vigtige skridt til at sikre, at orthotopic pancreas tumor forsøg udføres med succes: 1) den kirurgiske procedure af implantation; 2) den omhyggelige og rettidig overvågning af tumor udvikling; 3) betydningen af udfører før eksperiment prøver først at orientere om proceduren og vurdere de tage og tumor vækst sats; 4) ved hjælp af enkelt celle suspensioner af dissocierede tumorer som en alternativ engraftment metode. Denne betænkning procedure er nyttigt at læserne til at udføre forskning ved hjælp af denne særlige homograft, samt andre bugspytkirtlen orthotopic modeller, og endnu andre orthotopic modeller der involverer maven-åbning kirurgi.
Flow flowcytometri eller FACS er i øjeblikket den vigtigste redskab til at udføre immunoprofiling. Immunofænotypning af tumorer af FACS væsentligt adskiller sig fra celler fra forskellige organer, såsom perifert blod, milt, lymfeknude og knoglemarv på følgende måder. Generelt, er der en meget lille procent af immunceller i tumorer (lille stikprøvestørrelse). Den ekstreme heterogenitet af tumorer og det lille antal af immunceller nuværende gøre inddrive de levedygtige sjældne immunceller teknisk udfordrende, der kræver brugerdefineret-udviklet tumor væv dissociation involverer maskiner. Begge tidligere punkter gøre samtidige multi-parameter måling ved hjælp af multi-farve flowcytometri væsentlige. Multi-farve flow kræver komplekse markør panel konstruktion, kompensation og gating strategier, på grund af fluorescens spektrale overlapning. Denne betænkning forsøgte også at vise interesserede læsere/publikum processen med tumor immun profilering via definerede tumor væv dissociation og multi-farve flow flowcytometri analyse.
Tre kritiske trin kunne være særlig vigtigt at give produktive TIL analyse: for det første et højt udbytte af levedygtige celler inddrives fra dissocieres tumorer ved hjælp af tilpassede tumor dissociation procedurer; andet, optimeret design af store multi-farve farvnings-paneler baseret på tilgængelige reagenser; for det tredje en optimeret gating strategi i analysen. Forfatterne vil gerne understrege træningen og erfaring af operatørerne af både dataopsamling og analyse er afgørende for en vellykket flow flowcytometri analyse af TIL.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle forfattere er aktuelle fuldtidsansatte Crown Bioscience, Inc.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Dr. Jody Barbeau - kritisk læsning og redigering af håndskriftet, og takke Ralph Manuel for at designe kunstværker. Forfatterne vil også gerne takke Crown Bioscience onkologi Immuno-onkologi biomarkør team og onkologi In Vivo team, for deres store tekniske indsats.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia machine | \ | SAS3119 | \ |
| Trocar 20 | \ | \ | 2 mm |
| Petri dish | \ | \ | 20 mm |
| 100x antibiotic and antimycotic | \ | \ | \ |
| Iodophor swabs | \ | \ | Daily pharmacy purchase |
| Alcohol swabs | \ | \ | Daily pharmacy purchase |
| Liquid nitrogen | Air chemical | \ | \ |
| Biosafety hood | AIRTECH | BSC-1300IIA2 | \ |
| FACS machine LSRFortessa X-20 | BD | LSR Fortessa | \ |
| antibodies | BD | \ | \ |
| Trevigen MD or BD Matrigel Basement Membrane Matrix High concentration | BD | 354248 | \ |
| FACS buffers | BD | 554656 | Mincing buffer |
| Brilliant Staining Buffer | BD | 563794 | \ |
| Mouse BD Fc Block | BD | 553142 | \ |
| cell filters | BD-Falcon | 352350 | 70 µm |
| routine blood tube | BD-Vacutainer | 365974 | 2 mL |
| Kaluza | Beckman | vs 1.5 | |
| 6-well plates | Corning | 3516 | \ |
| Foxp3 Fix/Perm kit | ebioscience | 00-5523-00 | \ |
| UltraComp eBeads | ebioscience | 01-2222-42 | \ |
| Centrifuge | eppendorf | 5810R,5920R | \ |
| FlowJo software | FlowJo LLC | \ | vs 10.0 |
| PBS | Hyclone | SH30256.01 | 50 mL |
| RPMI 1640 | Hyclone | SH30809.01 | \ |
| Disposable, sterile scalpels | Jin zhong | J12100 | 11# |
| knife handle | Jin zhong | J11010 | \ |
| eye scissors and tweezers | Jin zhong | Y00030 | Eye scissors 10 cm |
| eye scissors and tweezers | Jin zhong | JD1060 | Eye tweezers 10 cm with teeth |
| Portable liquid nitrogen tank | Jinfeng | YDS-175-216 | \ |
| Electronic balance | Metter Toledo | AL204 | 0-100 g |
| Miltenyi C-tubes | Miltenyi | 130-096-334 | \ |
| Miltenyi Gentle MACS with heater blocks | Miltenyi | 120-018-306 | \ |
| Tumor Dissociation Kit | Miltenyi | 130-096-730 | \ |
| Cell counter | Nexcelom | Cellometer | Cellometer Auto T4 |
| cryopreservation tube | Nunc | 375418 | 1.8 mL |
| Cultrex High Protein Concentration (HC20+) BME | PathClear | 3442-005-01 | \ |
| syringes | Shanghai MIWA medical industry | \ | 1-5 mL |
| Studylog software | Studylog | \ | software |
| Studylog-Balance and supporting USB | OHAUS | SE601F | Balance and supporting USB |
| Studylog-Data line of vernier calipers | Sylvac | 926.6721 | Data line of vernier calipers |
| Caliper | Sylvac | 910.1502.10 | Sylvac S-Cal pro |
| Sterilized centrifuge tubes | Thermo | 339653 | 50 mL |
| Sterilized centrifuge tubes | Thermo | 339651 | 15 mL |
| Ice bucket | Thermo | KLCS-288 | 4 °C |
| Ice bucket | Thermo | PLF-276 | -20 °C |
| Ice bucket | Thermo | DW-862626 | -80 °C |
| RNAlater | Thermo | am7021 | \ |
References
- Chevrier, S., et al. An Immune Atlas of Clear Cell Renal Cell Carcinoma. Cell. 169 (4), 736-749 (2017).
- Wargo, J. A., Reddy, S. M., Reuben, A., Sharma, P. Monitoring immune responses in the tumor microenvironment. Curr. Opin. Immunol. 41, 23-31 (2016).
- Mosely, S. I., et al. Rational Selection of Syngeneic Preclinical Tumor Models for Immunotherapeutic Drug Discovery. Cancer Immunol. Res. 5 (1), 29-41 (2017).
- Rühle, P. F., Fietkau, R., Gaipl, U. S., Frey, B. Development of a Modular Assay for Detailed Immunophenotyping of Peripheral Human Whole Blood Samples by Multicolor Flow Cytometry. Int. J. Mol. Sci. 17 (8), e1316 (2016).
- Jiang, H., et al. Targeting focal adhesion kinase renders pancreatic cancers responsive to checkpoint immunotherapy. Nat. Med. 22 (8), 851-860 (2016).
- Gunderson, A. J., et al. Bruton Tyrosine Kinase-Dependent Immune Cell Cross-talk Drives Pancreas Cancer. Cancer Discov. 6 (3), 270-285 (2016).
- Li, Q. X., Feuer, G., Ouyang, X., An, X. Experimental animal modeling for immuno-oncology. Pharmacol. Ther. 17, 34-46 (2017).
- Takao, K., Miyakawa, T. Genomic responses in mouse models greatly mimic human inflammatory diseases. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 112 (4), 1167-1172 (2015).
- Payne, K. J., Crooks, G. M. Immune-cell lineage commitment: translation from mice to humans. Immunity. 26 (6), 674-677 (2007).
- Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. J. Immunol. 172 (5), 2731-2738 (2004).
- von Herrath, M. G., Nepom, G. T. Lost in translation: barriers to implementing clinical immunotherapeutics for autoimmunity. J. Exp. Med. 202 (9), 1159-1162 (2005).
- Talmadge, J. E., Singh, R. K., Fidler, I. J., Raz, A. Murine models to evaluate novel and conventional therapeutic strategies for cancer. Am. J. Pathol. 170 (3), 793-804 (2007).
- Erdag, G., et al. Immunotype and immunohistologic characteristics of tumor-infiltrating immune cells are associated with clinical outcome in metastatic melanoma. Cancer Res. 72 (5), 1070-1080 (2012).
- Gutiérrez-Garcia, G., et al. Gene-expression profiling and not immunophenotypic algorithms predicts prognosis in patients with diffuse large B-cell lymphoma treated with immunochemotherapy. Blood. 117 (18), 4836-4843 (2011).
- Paiva, B., et al. PD-L1/PD-1 presence in the tumor microenvironment and activity of PD-1 blockade in multiple myeloma. Leukemia. 29 (10), 2110-2113 (2015).
- Youn, J. I., Collazo, M., Shalova, I. N., Biswas, S. K., Gabrilovich, D. I. Characterization of the nature of granulocytic myeloid-derived suppressor cells in tumor-bearing mice. J. Leukoc. Biol. 91 (1), 167-181 (2012).
- Lavin, Y., et al. Innate Immune Landscape in Early Lung Adenocarcinoma by Paired Single-Cell Analyses. Cell. 169 (4), 750-765 (2017).
- Mahoney, K. M., et al. PD-L1 Antibodies to Its Cytoplasmic Domain Most Clearly Delineate Cell Membranes in Immunohistochemical Staining of Tumor Cells. Cancer Immunol. Res. 3 (12), 1308-1315 (2015).
- Yamaki, S., Yanagimoto, H., Tsuta, K., Ryota, H., Kon, M. PD-L1 expression in pancreatic ductal adenocarcinoma is a poor prognostic factor in patients with high CD8+ tumor-infiltrating lymphocytes: highly sensitive detection using phosphor-integrated dot staining. Int. J. Clin. Oncol. 22 (4), 726-733 (2017).
- Jiang, Y., et al. ImmunoScore Signature: A Prognostic and Predictive Tool in Gastric Cancer. Ann. Surg. , (2016).
- Ribas, A., et al. PD-1 Blockade Expands Intratumoral Memory T Cells. Cancer Immunol. Res. 4 (3), 194-203 (2016).
