Summary
De experimentele procedure op de immunophenotyping van lymfkliertest orthotopic PDAC homografts is gericht op de profilering van de tumor immuno-communicatie. Tumoren zijn orthotopically geïmplanteerd via chirurgie. Tumoren van 200 – 600 mm3 in grootte werden geoogst en losgekoppeld om te bereiden eencellige schorsingen, gevolgd door multi immuun marker FACS analyse met behulp van verschillende fluorescently gelabelde antilichamen.
Abstract
Homograft (syngeneic) tumoren zijn het werkpaard van hedendaagse immuno-oncologie (I/O) preklinisch onderzoek. De tumor communicatie (TME), met name de immuun-componenten, is essentieel voor de prognose en de voorspelling van de resultaten van de behandeling, met name die van immunotherapie. TME immuun-componenten bestaan uit verschillende subgroepen van tumor-infiltreren immuuncellen verifieerbare door Multi-Color FACS. Alvleesklier ductaal adenocarcinoom (PDAC) is een van de dodelijkste malignances goede behandelingsmogelijkheden, dus een dringende en onvervulde medische noodzaak ontbreekt. Een belangrijke reden voor de niet-ontvankelijkheid aan verschillende therapieën (chemo-, doelgerichte, I/O) geweest zijn overvloedige TME, bestaande uit fibroblasten en leukocyten, die tumorcellen tegen deze therapieën beschermen. Orthotopically geïmplanteerde PDAC wordt beschouwd als meer nauwkeurig heroveren de TME van menselijke alvleesklier kanker dan conventionele onderhuidse (SC) modellen.
Homograft tumoren (KPC) zijn transplantaties van muis spontane PDAC van oorsprong uit genetisch gemanipuleerde KPC-muizen (KrasG12D / +/P53- / -/Pdx1-Cre) (KPC-GEMM). De primaire tumor weefsel is gesneden in kleine fragmenten (~ 2 mm3) en getransplanteerde subcutaan (SC) aan de syngeneic ontvangers (C57BL/6, 7-9 weken oud). De homografts werden vervolgens operatief orthotopically getransplanteerd naar de alvleesklier van nieuwe C57BL/6 muizen, samen met SC-implantatie, die tumor volumes van 300 – 1.000 mm3 bereikbaar 17 dagen. Alleen tumoren van 400-600 mm3 werden geoogst per goedgekeurde autopsie procedure en gereinigd om te verwijderen van de aangrenzende weefsels van de niet-tumor. Ze waren losgekoppeld per protocol gebruikt een dissociator weefsel in eencellige schorsingen, gevolgd door de kleuring met aangewezen panelen van fluorescently gelabelde antilichamen voor verschillende markers van verschillende immuuncellen (lymfoïde, myeloïde en NK, DCs). De gekleurde monsters werden geanalyseerd met Multi-Color FACS te bepalen aantal immuuncellen van verschillende geslachten, alsmede het relatieve aandeel ervan binnen tumoren. De immuun profielen van orthotopic tumoren werden vervolgens vergeleken met die van SC tumoren. De voorlopige gegevens aangetoond aanzienlijk verhoogde infiltreren TILs/TAMs tumoren in de alvleesklier, en hogere infiltratie van de B-cel in de orthotopic in plaats van SC tumoren.
Introduction
Alvleesklier ductaal adenocarcinoom (PDAC) zorgt ervoor dat bijna de helft een miljoen sterfgevallen wereldwijd jaarlijks, een van de top 5 kanker moordenaars. Er zijn enkele effectieve behandelingsopties en geen goedgekeurde immuuntherapie; nieuwe behandelingen zijn dan ook hard nodig. Kankers worden steeds meer erkend als immunologische ziekten, met inbegrip van PDAC, naast de genetische ziekten zoals bekend vandaag. Immunologische en genetische factoren zou waarschijnlijk bepalen prognose van de ziekte, alsmede de behandeling uitkomsten. Tumoren host immuun toezicht ontduiken en uiteindelijk verder om te leiden tot de dood. Veel van deze immuun processen die zich voordoen in de communicatie van de tumor (TME)1,,2,,3,4 waar verschillende soorten immuuncellen interactie aangaan met de tumorcellen, met elkaar en met andere tumor stromale onderdelen, direct of indirect via cytokines die uiteindelijk ziekte uitkomst bepalen. Karakterisering van de componenten tumor immuun TME, of immunophenotyping van de tumor, met inbegrip van subtypering, nummering en lokalisatie van verschillende geslachten van immune cellen, is daarom cruciaal voor het begrip anti-tumor immuniteit. In het geval van PDAC, er is voorgesteld dat verhoogde tumor-infiltreren onderdrukkende macrofagen (TAM) en B-cellen hebben geleid tot de preventie van T-cel infiltratie en/of activering en hoge niveaus van fibrose5,6.
De gemeenschappelijke aanpak van immuun TMEs experimenteel onderzoek zou worden met behulp van surrogaat tumor preklinische diermodellen, voornamelijk relevante muis tumor modellen7, bijzonder muis syngeneic (homograft) of genetisch gemodificeerde Muismodellen (GEMM) van kanker, op de veronderstelde gelijkenis van muis en mens voor tumoren en immuniteit8,9. In werkelijkheid wordt ervan uitgegaan dat er inherente verschillen tussen de twee soorten10,11 zijn.
Getransplanteerde muis tumoren hebben aanzienlijke operationele voordelen ten opzichte van spontane tumoren7, namelijk gesynchroniseerde tumor ontwikkeling, in tegenstelling tot de ouderlijke GEMM spontane tumor ontwikkeling. Homografts van spontane lymfkliertest tumoren worden beschouwd als primaire tumoren heb nooit gemanipuleerd in vitroen mirroring originele muis tumor histo- / moleculaire pathologie7, evenals mogelijke immuun profielen. Deze lymfkliertest homografts worden vaak beschouwd als "een muis versie van patiënt-afgeleide xenografts (PDXs)". Daarom hebben zij waarschijnlijk een betere vertaalbaarheid dan conventionele syngeneic cel lijn afkomstige muis tumoren12. In het bijzonder, zijn veel homografts afgeleid van specifieke GEMM waar specifieke ziekten bij de mens mechanismen, bijvoorbeeld oncogene stuurprogramma mutaties, zijn ontworpen, en deze homografts moet derhalve voordelen aan hun klinische relevantie. In het bijzonder, ontwikkelen KPC GEMM muis PDAC binnen 15 tot 20 weken van leeftijd, die morfologisch recapituleert ziekten bij de mens met overwegend goed - tot matig-gesplitste klierweefsel architectuur en hoogverrijkt stroma. Dit model ook recapituleert de meest voorkomende genetische kenmerken van menselijke PDAC, namelijk Kras activeren mutatie en P53 verlies-van-functie, die in 90% en 75% van de menselijke PDAC, respectievelijk5,6te voorkomen.
Sites van transplantatie hebben geopperd zijn een rol te spelen in model vertaalbaarheid. De specifieke omgeving weefsel, zoals een overeenkomstige orthotopic omgeving, zou een niche voor specifieke tumoren aan vooruitgang, in tegenstelling tot de uniforme onderhuidse (SC) omgevingen voor algemeen getransplanteerde tumoren. Het zou van bijzonder belang als, en/of, wat verschil bestaat tussen de twee sites van de transplantatie, in termen van immuun-communicatie, en de relevantie voor menselijke kanker, bv. in het geval van PDAC.
Een van de belangrijkste aspecten van immuun profilering, of immunophenotyping, is het bepalen van de tumor-infiltreren immune cellen van verschillende geslachten, de nummers, relatieve percentage binnen tumoren, evenals hun activering Staten en locaties. Dit omvat tumor-infiltratrating lymphoctyes (TILs, T- zowel B-), tumor-infiltreren macrofagen (TAMs), tumor-infiltreren natural killer cellen (NKs) en tumor-ingezeten dendritische cellen3,13,14 , 15 , 16 , 17en de subcellular localisatie van bepaalde cellen18,19,20, enz. Fluorescentie geactiveerd Cell Sorting (FACS) of stroom cytometry is een eencellige detectietechnologie die wordt gebruikt bij het meten van de specifieke parameters van een cel. Multi-Color stroom cytometry maatregelen meerdere markeringen op een eencellige3,4,21 en is de meest gebruikte methode om te bepalen van de aantallen en de relatieve percentage van verschillende subgroepen van immune cellen, met inbegrip van die binnen tumoren.
Dit verslag beschrijft procedures voor profilering van tumor-infiltreren immuuncellen: 1) implantatie van orthotopic PDAC muis tumor homografts, samen met SC de implantatie; 2) tumor weefsel oogst en eencellige voorbereiding via tumor dissociatie; 3) stroom cytometry analyse van alle cellen afgeleid van tumoren als een baseline; 4) vergelijking van basislijn profielen van beide benaderingen van de transplantatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle protocollen en wijziging(en) of procedures waarbij de zorg en het gebruik van dieren zal worden herzien en goedgekeurd door de kroon Bioscience dier zorginstellingen en gebruiken Comité (IACUC) vóór de uitvoering van studies. De zorg en het gebruik van dieren zal meestal worden uitgevoerd overeenkomstig AAALAC (vereniging voor de beoordeling en de accreditatie van Laboratory Animal Care) internationale richtsnoeren zoals vermeld in de gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren, nationaal onderzoek Raad (2011). Alle dierlijke experimentele procedures zal worden onder steriele omstandigheden bij SPF (specific pathogen-gratis) faciliteiten en uitgevoerd in strikte overeenstemming met de gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren uit verschillende overheidsinstellingen (b.v. De National Institutes of Health). Het protocol zal moeten worden goedgekeurd door de Commissie op de ethiek van dier experimenten bij de instelling van de faciliteit (bijvoorbeeld institutionele IACUC Comité).
1. voorbereiding voor de transplantatie van de Tumor
-
Huisvesting van dieren
- Generieke C57BL/6 muizen verkrijgen bij een commerciële fokken leverancier.
- Huis muizen (5) in individuele geventileerde kooien bij de volgende omstandigheden: temperatuur: 20-26 ° C; luchtvochtigheid 30-70%; verlichting cyclus: 12 uur licht en 12 uur donker.
- Gebruik corn cob beddengoed dat is wekelijks verschoond.
- Voor voeding, zorgen voor bestraling gesteriliseerd droge submodule voedsel tijdens de hele onderzoeksperiode.
- Voor water, dieren gratis toegang bieden tot steriele drinkwater.
-
Donor tumor fragment voorbereiding
- Allereerst toezicht lichaamsgewicht (BW), via het wegen met behulp van een evenwicht, en het volume van de tumor (TV), door meting van de remklauw, van tumor-dragende donor muizen.
- Wanneer TV 500-1.200 mm3 bereikt, euthanaseren het dier in een biohazard kap volgens protocol.
- De huid rond de tumor met behulp van iodophor swabs steriliseren.
- Chirurgisch verwijderen van de tumor (details beschreven in sectie 3: necropsie en tumor oogst) en plaats van de tumor in een petrischaal met 20 mL PBS (vooraf chill de media of de buffer tot 4 ° C vóór het euthanizing van dieren).
- Als er contaminerende bloed, breng de tumor in een petrischaal en wassen van de tumor met PBS.
- De tumor gesneden in de helft, het verwijderen van eventuele extra huid, schepen, verkalking en/of necrose.
- Kies alleen intact stukken van de tumor en plaats hen in een centrifugebuis steriele 50 mL en Voeg 20 mL PBS en vervoer van de buis aan een dier logeerkamer voor Farmacologie studies.
2. Orthotopic en Engraftment van de onderhuidse (SC)
-
SC inoculatie
- Snijd tumoren in 2 mm diameter stukken met behulp van een scalpel, 1 stuk ingebruikneming elke trocar, voor SC inplanting of later orthotopic implantatie (zie hieronder).
- Anesthetize de geadresseerden dier met 5% Isofluraan, dat wordt bijgehouden door een neus kegel op 1%. Het dier zal beginnen om te ontspannen, verliezen hun restarmen reflex en uiteindelijk immobiel. Op deze diepte van anesthesie kunnen ze gemakkelijk worden wekte door pijnlijke stimuli; het toestaan van anesthesie te verdiepen totdat dergelijke reacties op pijn afwezig zijn.
- Zodra verdoofd, bevestigen de muizen op het bord van een experiment in de rechts zijligging. Het steriliseren van de muis met iodophor wissers, met name de gebieden rond de tumoren.
- Maken met een scalpel, een 0.5-1.0 cm huid incisie op de linkerflank, gewoon cranial aan de heup.
- Tunnel onder de huid naar de voorpoot, twee tot drie centimeter, met een botte Tang.
- Aseptisch overbrengen van een kubus van tumor van het medium en plaats diep in de onderhuids tunnel.
- Visueel bevestigen dat de tumor is diep in de tunnel (en niet op de huid incisie).
- Sluit de wond met wond clips.
- Volgen de dieren post inoculatie totdat zij weer voldoende bewustzijn te handhaven sternale recumbence. Dieren terugkeren naar hun kooi pas na hun volledig herstel van de verdoving. Vul het logboek anesthesie en initiëren van de dierlijke gezondheid grafiek. Ontvangende dieren dagelijks wegen voor drie dagen
- Inoculeer 5-10 muizen per groep voor de controle van de groei van de tumor voor een standaard procedure.
-
Alvleesklier orthotopic implantatie
- Narcose en analgesie
- Gebruik een 2 mL ketamine injectie en 0,42 mL xylazine injectie (20 mg/mL) gemengd in 5.91 steriel injectie water of zoutoplossing met een dosis volume van 0,06 – 0,1 mL/20-25 g lichaamsgewicht.
Opmerking: Volgens het welzijn van dieren, analgesie is nodig beide pre en post operatie. 0.05-0.1 mg buprenorfine /kg, SC. De eerste dosis is pre-operatie en vervolgens gedoseerd 3 keer iedere 4 uur post operatie voortdurend.
- Gebruik een 2 mL ketamine injectie en 0,42 mL xylazine injectie (20 mg/mL) gemengd in 5.91 steriel injectie water of zoutoplossing met een dosis volume van 0,06 – 0,1 mL/20-25 g lichaamsgewicht.
- Chirurgische ingreep voor orthotopic implantatie
- Anesthetize muizen via intramusculaire injectie (IM) per stap 2.2.1.
- Nadat de dieren zijn volledig verdoofd, bevestigen de muizen op het bord van een experiment in de rechts zijligging.
- De muizen in de rechts zijligging te houden. Desinfecteren van de huid rond de milt met jodium dan de-iodinate met 75% ethylalcohol.
- Vind de middellange punt van de milt en een verticale insnijding van 1 cm op buik bloot van de milt te maken.
- Tekent een deel van de alvleesklier weefsel onder de milt zachtjes met een flat-tip pincet en suture een muis homograft tumor stuk uit zaad muis op de alvleesklier van geadresseerden muis door 9-0 absorbeerbare chirurgische hechtdraad.
- Sluit de buik met een 6-0 zijde hechtdraad door dubbele naad. Homeostase bereiken door compressie.
- Na afwerking tumor implantatie, als bloeden noch tumor weefsel lekkage optreedt, in een warme kooi de dieren houden.
- Volgen van het dier totdat het herwint voldoende bewustzijn te handhaven sternale lighouding; het dier terug naar de dierlijke kamer na volledig herstel van de narcose. Controleren van de tumor met muizen door Palperende de buik in de buurt van de milt en selecteer uit de muizen die orthotopic tumoren.
- Narcose en analgesie
-
Tumor-dragende muizen Health Monitoring
- Controleer de water en voedsel consumptie dagelijks.
- Onderzoeken van de verschijning van de muis voor een ungroomed haar jas, brokken, dunheid, abnormale adem of ascites.
- Palperen de buik om te controleren of er spontaan tumoren op de lever of milt.
- Weeg muizen wekelijks met behulp van een evenwicht.
- Als een van de volgende klinische symptomen worden waargenomen, de muizen worden opgeofferd voor sample collectie en necropsie: BW verlies > 20%; verminderde mobiliteit (niet bekwaam om te eten of drinken); niet kunnen verplaatsen normaal als gevolg van aanzienlijke ascites en uitgebreide buik; inspanning in de ademhaling.
3. de necropsie en Tumor oogst
- Inspecteer visueel en door palpatie voor de aanwezigheid van tastbaar tumoren vóór de beëindiging.
- Voor beëindiging, eerst euthanaseren muizen per goedgekeurde protocol, en openen van de buik en visueel onderzoeken de alvleesklier voor tumoren.
- De tumor door post sterfelijke chirurgie afgesneden en toevoegen aan koude PBS. Plaats alle dieren in een schone, ongeladen, doorschijnend euthanasie-kamer met een speciale deksel met een poort voor de levering van de kooldioxide moet worden gebruikt.
- Lozing van gas in de kamer op een debiet dat snel bewusteloosheid met minimale nood aan het dier produceert. De optimale debiet voor CO2 moeten circa 2-2,5 L/min.
- Visueel waarnemen elk dier tijdens de euthanasie procedure om alle dieren ontvangen voldoende gasconcentraties en doen niet herwinnen bewustzijn tijdens de procedure euthanaseren te verzekeren.
- Handhaven van de gasstroom voor ten minste 1 min. na schijnbare klinische dood om te minimaliseren van de mogelijkheid dat een dier kan herstellen (als apneic maar niet dood).
- Aangrenzende niet-tumor weefsel te verwijderen. Schoongemaakte tumor kan snel worden gefotografeerd.
Doe de tumor weefsels in RPMI-1640 en houd op ijs voordat dissociatie.
Opmerking: De kadavers zijn zakken en opgeslagen in de juiste vriezer af te wachten van de verwijdering.
4. tumor weefsel dissociatie en eencellige voorbereiding
-
Bereiding van het reagens
Opmerking: De Tumor dissociatie Kit bevat 2 flesjes van enzym D (gelyofiliseerd poeder), 1 flacon van enzym R (gelyofiliseerd poeder), 1 flacon van enzym A (gelyofiliseerd poeder) en 1 mL Buffer A.- Bereiden enzym D door de krachten van het gelyofiliseerd poeder in elk flesje met 3 mL RPMI-1640. Bereid hoeveelheden van een passende omvang te voorkomen van herhaalde bevriezen-ontdooien-cycli.
- Bereiden enzym R door de krachten van het gelyofiliseerd poeder in de flacon met 2,7 mL RPMI 1640. Bereid hoeveelheden van een passende omvang te voorkomen van herhaalde bevriezen-ontdooien-cycli.
- Bereiden enzym A door de krachten van het gelyofiliseerd poeder in de flacon met 1 mL Buffer A die bij de kit geleverd. Doen niet vortex. Bereid hoeveelheden van een passende omvang te voorkomen van herhaalde gratis-dooi-cycli.
- Bereid de enzym mix door toevoeging van 2,35 mL RPMI-1640, 100 µL van enzym D, 50 µL van enzym R en 12,5 µL van enzym A in elke gentleMACS C-tube.
-
Tumor dissociatie
- Voor elke tumor bereiden een C-tube met tumor spijsvertering mix, gelieve te verwijzen naar sectie 4.1 voor spijsvertering buffer verdunning en voorbereiding.
- Gebruik 3 mL spijsvertering buffer voor tumor fragmenten < 0.8 g, en ervoor te zorgen de tumor wordt volledig verteerd.
- Label met de studie code, tumor, muis ID, behandelde groep en gewicht van de tumor.
- Verzamelen van de tumor van de muis, de tumor wassen in koud PBS en leeghalen van het weefsel verbonden op de tumor (zoals bloedvaten, vet, fascia, enz.).
- Zet de tumor in spijsvertering media in een put van een steriele 6 goed plaat.
- Houd de tumor in plaats met een steriel pincet/Tang en snijd met een scalpel. Snijd de tumor goed genoeg om te breken in kleinere stukken (~ 1 mm3).
- Plaats de stukken van de tumor terug in de C-tube en gebruik de resterende spijsvertering buffer voor het wassen van de plaat en breng de vloeistof in de C-buis die wordt geplaatst op het ijs tot spijsvertering.
- Zet de dissociator met kachels.
- Plaats van de tumor dissociatie C-buizen ondersteboven in de mouwen van de vacatures en aanpassen van de status van de posities van de buis van Free aan geselecteerde. Kies een dissociatie-programma (37_c_m_TDK_1), gevolgd door de selectie van de gewenste map, waar de lijst met programma's wordt weergegeven.
- Na beëindiging van het programma, opstijgen C-buizen de dissociator en de spin kort (300 x g, 4 ° C) om het monster pellet.
- Resuspendeer monsters en zet in een cel zeef boven een tube van 50 mL. Het wassen van de cellen door de zeef van de cel met 10 mL was buffer om de schorsing van een eencellige.
- Centrifugeer de buizen bij 300 x g gedurende 5 minuten, verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen met 5 mL was buffer, levensvatbare cellen tellen met behulp van trypan blauwe en/of door cel teller en aanpassen van de concentraton van de cel naar 1 x 106 cellen per buis of per monster. Omvatten de juiste isotype controle antilichamen om ervoor te zorgen kleuring is specifiek
5. immuun deelvenster Ontwerp en stroom Data-acquisitie
-
Deelvenster Ontwerp
- Zie tabel 1.
-
Immunokleuring
- FC-Block monster cellen: resuspendeer de cellen in 200 µL van kleuring van de buffer met 1 µg/mL Fc-Block, gevolgd door incubatie op ijs of 4 ° C koeling gedurende 15 min. in het donker.
- Cellen van de vlek met behulp van de gewenste antilichaam/fluorescentie panelen (bv. T-Cell paneel, macrofaag paneel, enz.): Voeg de antilichaam-mengsel verdund in Fc blokkeerbuffer aan elk monster, vlek voor minstens 30 min op ijs in het donker.
- Voeg 1 mL ijs koud PBS aan elke buis en resuspendeer de cellen zachtjes, gevolgd door centrifugatie bij 300 x g gedurende 5 min. negeren het resulterende supernatant.
- Herhaal deze stappen om te wassen de cellen tweemaal.
- Vlek van intracellulaire markeringen, indien nodig, volgt 6-10, anders springen met stap 10.
- Resuspendeer de pellet van de cel door puls vortex en voeg 200 µL van bereide fixatie/Permeabilization werkende oplossing voor elk monster. Pulse vortex opnieuw, en vervolgens uit te broeden bij 4 ° C's nachts (bij voorkeur) of 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
- Spin down de cellen en verwijder de bovendrijvende substantie.
- Wassen tweemaal door toevoeging van 1 mL 1 x Permeabilization Buffer (gemaakt van 10 x Permeabilization Buffer, verdund met gedestilleerd H2O) gevolgd door centrifugatie en decanteren van bovendrijvende substantie.
- Voeg intracellulaire marker antilichaam in 1 x Permeabilization Buffer en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 min. in het donker.
- Wassen cellen tweemaal met 1 mL 1 x Permeabilization Buffer. Centrifugeren en decanteren van de bovendrijvende substantie.
- Resuspendeer de cellen in 150 µL van kleuring Buffer en analyseren op een cytometer. Als gevolg van de procedure voor fixatie en permeabilization, het FSC (forward-licht verstrooiing) / SSC (zijlicht spreiding) distributie van de cel bevolking zullen verschillen van levende cellen. De poort en de spanningen zal moeten worden gewijzigd.
-
FMO besturingselementen (fluorescentie Minus één besturingselement)
Opmerking: Multi-color flow analyse is vooral belangrijk voor de analyse van tumor-infiltreren immuuncellen. Dus moet er een manier vinden om te identificeren en de poort van de cellen in de context van gegevens verspreid als gevolg van de meerdere fluorochromes in een bepaald paneel. FMO (fluorescentie Mius One) controle is een belangrijke benadering voor dit doel.- Te dien einde, deelnemen aan extra muizen proces afzonderlijk voor elk weefsel en elke groep voor FMO besturingselementen (ten minste 2 per Rx). Na dissociatie, zwembad weefsels. Bijvoorbeeld, in een studie met 4 Rx groepen, moeten 8 extra tumoren afzonderlijk verwerkt en vervolgens samengevoegd in één monster voor FMO.
-
Stroom Instrument Setup
- Compensatie kralen maken terwijl de machine is warming-up (ten minste 20 min).
- Gebruik CS & T kralen om te controleren van de prestaties.
- Spanning en compensatie-instellingen: gebruik UltraComp kralen, vortex de Comp grondig vóór gebruik kralen.
- Label een aparte 12 x 75 mm2 monsterbuisje voor elke fluorescerende-geconjugeerd antilichaam.
- Voeg 100 µL van de kleuring van de buffer aan elke buis. Voeg 1 volledige druppel (ongeveer 60 µL) van de parels aan elke buis.
- Toevoegen van antilichamen en de kleuring procedure uitvoeren precies als het monster proces vermeld in punt 4.
- Voeg 0,5 mL buffer per stuk, als u wilt volledig resuspendeer kraal pellets via vortex kleuring.
- Stroom cytometer bet spanning per doelweefsel is terechtgekomen voor de gegeven experiment instellen
- Stroom cytometer voor data-acquisitie, doorlopen door gating op de singlet kraal bevolking per FSC en SSC lezingen.
- Ingestelde stroomsnelheid rond 200-300 evenementen/s.
- Instellen van de passende vergoeding voor een bepaalde fluoresceïne [FITC]-geconjugeerd antilichaam, gebruik een FL1 vs. FL2 dot plot.
- Plaats een Kwadrant poort zodat de parels van de negatieve in het lagere linker Kwadrant zijn en de positieve kralen zijn in de hogere of lagere recht Kwadrant. Waardecorrecties op compensatie totdat de intensiteit van de mediane fluorescentie (MFI's) van elke bevolking (zoals weergegeven in het venster van de stats Kwadrant) ongeveer gelijk is (dat wil zeggen voor FL2-% FL1, de MFI FL2 van beide kralen moet ongeveer gelijk zijn).
- Herhaal stap 5.4.11 en 5.4.12 voor alle buizen.
- Gaat u verder met het verwerven van de werkelijke gekleurd monsters. De compensatie-wizard uitvoert en de instellingen opslaan met de indeling "datum experiment uw initialen".
6. stroom Data analyse en betere presentatie
- Gegevens door Flowjo en/of Kaluza analyseren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Orthotopic implantatie van PDAC resulteerde in snelle tumorgroei gelijkend op dat gezien voor SC implantatie. Nadat de donor tumor fragmenten werden ingeplant ontvangende muizen, zowel subcutaan en orthotopically volgens de protocollen beschreven in stap 2.1 en 2.2, de geïmplanteerde KPC homograft tumoren aangetoond vergelijkbare snelle groei, zoals wordt weergegeven in de figuur 1A . KPC homograft tumoren geoogst op verschillende tijdstippen zijn weergegeven in figuur 1B en vertegenwoordiger H & E beelden zijn weergegeven Figuur 1 c. Onze gegevens aangetoond vergelijkbare groei van SC en orthotopic implantaten.
Levensvatbare tumorcellen en cellen in de TME, met inbegrip van tumor-infiltreren immune cellen, die afkomstig zijn van orthotopic of SC implantatie, kunnen efficiënt worden hersteld. Tumoren waren geoogst en verteerd ter voorbereiding van eencellige schorsingen op latere FACS analyse met behulp van een commerciële dissociator (figuur 2A) volgens het protocol beschreven in stap 4. We verkregen meestal redelijk hoog levensvatbare cellen opbrengsten uit de tumor monsters van beide soorten implantatie (~ 80% levensvatbaarheid op basis van Trypan Blue); de representatieve FACS plot toont levensvatbare cellen van de tumor, gescheiden van de dode cellen/cel puin (figuur 2B).
Tumor-infiltreren immune cellen van verschillende subgroepen zijn geïdentificeerd in zowel orthotopic als SC geïmplanteerd tumoren, terwijl hun profielen verschillen hebben. De schorsing van de eencellige bereid uit tumor weefsels met behulp van de methode in stap 4.2 beschreven werden onderworpen aan FACS analyse na kleuring met een panel van de 16 kleuren van markeringen weergegeven in tabel 1, dat betrekking heeft op verschillende geslachten van belangrijke immune cellen als evenals de tumorcellen. De gating strategie of immuun lineage hiërarchie samen met representatieve stroom percelen worden weergegeven in figuur 3A. CD45, een marker voor alle volwassen immune cellen, werd gebruikt voor onderscheidende tumorcellen en tumor-infiltreren immuuncellen. Alle immuun lineages werden vervolgens geanalyseerd van CD45+ populaties zoals weergegeven door het panel (tabel 1).
Naast markeringen, celgrootte wordt ook gebruikt om te onderscheiden van verschillende subpopulaties (figuur 3B links) om te kwantificeren cel subsets, met inbegrip van T-, B-lymfocyten, macrofagen en MDSCs, enz. Tumor infiltreren immuun profiel vergelijking van SC vs. orthotopic homografts van pancreatic kanker. De grote opgesomde cel populaties van verschillende belangrijke subsets van tumor infiltreren immuuncellen worden weergegeven Figuur 3 c. De gegevens blijkt dat de tumor aanzienlijk immuun cel infiltratie in vergelijking met de alvleesklier van gezonde muizen gestegen is. Bovendien werden verschillende percentages van de subset van tumor-infiltreren immune cellen gevonden in orthotopic vs. SC homografts, bijvoorbeeld aanzienlijk meer B-cellen in de orthotopic dan in SC.
| Marker | Immuun-celpopulatie |
| CD45 | Totale leukocyten |
| CD3 | Totaal aantal T-cellen |
| CD4 | CD4 + T-helper cellen |
| CD8 | Cytotoxische CD8 + T cellen |
| CD44 / CD62L * | Naïef, geheugen en effector T cellen |
| CD69/CD44/OX40/CD25 enz* | Activering markeringen |
| CD4 + CD25 + FoxP3 + | Regulatoire T-cellen |
| CD11b + Ly6c/Ly6g | G-MDSC en M-MDSC |
| CD11b + F4/80 | Macrofagen |
| IA/IE/CD206 | M1 en M2 macrofagen |
| CD3-CD335 + | NK-cellen |
| CD3 + CD335 + | NKT cellen |
| CD19 | B-cellen |
| TNF-a/IFN-r/IL-7/IL-3 enz* | Cytokines |
| PD-1/PD-L1/CTLA-4/TIM-3 enz* | Checkpoint-remmers |
| Granzym B enz* | Meestal gevraagde markeringen |
| KI67/Brd U/PNCA enz | Proliferatie |
| Live/dead (muur) | Leven/dood |
| * Opmerking: Verdere markeringen kunnen worden toegevoegd als nodig | |
Tabel 1: 16 kleuren stroom panelen ontworpen voor analyse van tumor-infiltreren muis immuuncellen.
Figuur 1: zowel orthotopic en SC (subQ) PDAC homograft tumoren in C57BL/6 muizen aangetoond vergelijkbare groei met of zonder gemcitabine behandeling geïmplanteerd. (A) groeicurve: SC-links en rechts orthotopic. Blauw: Voertuig; Goud: Gemcitabine (gestart op dag 10 post inoculatie als gemiddelde SC tumor volume 200 mm3 bereikt). (B) tumor weefsels op verschillende tijdstippen. (C) vertegenwoordiger H & E kleuring van beide soorten homografts (40 x 10). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Tumor weefsel dissociatie te bereiden enkele levensvatbare celsuspensie. (A) het gebruik van de disassociator; (B) de levensvatbare cellen, gescheiden van dode cellen, zoals blijkt uit de flow analyse. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Multi-Color flow analyse van tumor-infiltreren immuuncellen van zowel orthotopic als SC PDAC homografts. De onbewerkte gegevens van elk monster tumor overgenomen uit de stroom cytometry instrument, gevolgd door analyse met behulp van de software van de analyse van de Flowjo FACS. (A) de standaard gating strategie voor de analyse, wordt weergegeven als een voorbeeld; (B) vertegenwoordiger stroom gating en analyse gegevens met behulp van de standaard gating strategie; (C) vertegenwoordiger tumor-infiltreren immuun cellsare weergegeven als u wilt opnemen van Treg, B-cellen en macrofagen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hoewel studies met behulp van SC tumoren zijn gemakkelijker uitgevoerd, orthotopically geïmplanteerd tumoren modellen kunnen potentieel zijn relevanter voor preklinische farmacologie studies (met name I/O onderzoeken) te bieden verbeterde vertaalbaarheid. Dit verslag beoogt de interesse lezers/publiek om direct visualiseren de technische procedures die kunnen worden gebruikt in hun respectieve onderzoek te kunnen helpen. Onze protocollen aantonen dat orthotopic implantatie van PDAC kan leiden tot een efficiënte tumorgroei, vergelijkbaar met SC implantatie. Onze opmerkingen lijken ook te suggereren van de aanwezigheid van verschillende immuun profielen van TMEs uit de verschillende implantaties. De grote uitdagingen aan te passen van orthotopic, in vergelijking met de SC-implantaties, zijn dat complexe vaardigheden zijn vereist, het proces is tijdrovend, het chirurgische procedures voor innesteling zijn arbeidsintensief en ook de moeilijkheid bij het toezicht op orthotopic tumor groei in het leven.
Er zijn vier essentiële stappen om ervoor te zorgen dat orthotopic alvleesklier tumor experimenten met succes worden uitgevoerd: 1) de chirurgische procedure van implantatie; 2) het zorgvuldig en tijdig toezicht op de ontwikkeling van de tumor; 3) het belang van het uitvoeren van pre experiment test eerst vertrouwd maken met de procedure en de beoordeling van de te nemen koers en de groei van de tumor; 4) met behulp van eencellige schorsingen van gedissocieerde tumoren als een alternatieve engraftment-methode. De procedure van dit verslag is nuttig aan lezers voor het uitvoeren van onderzoek met behulp van deze specifieke homograft, evenals andere alvleesklier orthotopic modellen, en zelfs andere orthotopic modellen met betrekking tot buik-opening chirurgie.
Stroom cytometry of FACS is momenteel het belangrijkste instrument voor het uitvoeren van immunoprofiling. Immunophenotyping van tumoren door FACS aanzienlijk verschilt van die van cellen uit verschillende organen, zoals de perifere bloed, milt, lymfeklieren en beenmerg op de volgende manieren. In het algemeen is er een zeer klein percentage van immuuncellen in tumoren (de grootte van de kleine steekproef) aanwezig. De extreme heterogeniteit van tumoren en het kleine aantal immuuncellen aanwezig maken herstellende levensvatbare zeldzame immuuncellen technisch uitdagend, aangepaste ontwikkelde tumor weefsel dissociatie waarbij machines vereisen. Beide vorige punten maken gelijktijdige Multi-parameter meting met behulp van Multi-Color stroom cytometry essentieel. Multi-Color stroom vereist complexe markeringsontwerp paneel, compensatie en gating strategieën, als gevolg van de fluorescentie spectrale overlap. Dit verslag wordt ook geprobeerd om te laten zien de interesse lezers/publiek het proces van tumor immuun profilering via gedefinieerde tumor weefsel dissociatie en Multi-Color stroom cytometry analyse.
Drie kritische stappen zou met name belangrijk voor opbrengst productieve TIL analyse: ten eerste een hoog rendement van levensvatbare cellen verhaald losgekoppeld tumoren met behulp van aangepaste tumor dissociatie procedures; Ten tweede, het geoptimaliseerde ontwerp van grote multi kleur kleuring panelen op basis van beschikbare reagentia; Ten derde, een geoptimaliseerde gating strategie in de analyse. De auteurs zou willen benadrukken van de opleiding en ervaring van de exploitanten van zowel data-acquisitie en analyse zijn essentieel voor de succesvolle stroom cytometry analyse van TIL.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle auteurs zijn huidige medewerkers van Crown Bioscience, Inc.
Acknowledgments
De auteurs zou Dr. Jody Barbeau - dank voor kritisch lezen en bewerken van het manuscript, en Ralph Manuel bedanken voor het ontwerpen van kunstwerken. De auteurs ook bedank de kroon Bioscience oncologie Immuno-oncologie Biomarker team en oncologie In Vivo team, voor hun grote technische inspanningen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia machine | \ | SAS3119 | \ |
| Trocar 20 | \ | \ | 2 mm |
| Petri dish | \ | \ | 20 mm |
| 100x antibiotic and antimycotic | \ | \ | \ |
| Iodophor swabs | \ | \ | Daily pharmacy purchase |
| Alcohol swabs | \ | \ | Daily pharmacy purchase |
| Liquid nitrogen | Air chemical | \ | \ |
| Biosafety hood | AIRTECH | BSC-1300IIA2 | \ |
| FACS machine LSRFortessa X-20 | BD | LSR Fortessa | \ |
| antibodies | BD | \ | \ |
| Trevigen MD or BD Matrigel Basement Membrane Matrix High concentration | BD | 354248 | \ |
| FACS buffers | BD | 554656 | Mincing buffer |
| Brilliant Staining Buffer | BD | 563794 | \ |
| Mouse BD Fc Block | BD | 553142 | \ |
| cell filters | BD-Falcon | 352350 | 70 µm |
| routine blood tube | BD-Vacutainer | 365974 | 2 mL |
| Kaluza | Beckman | vs 1.5 | |
| 6-well plates | Corning | 3516 | \ |
| Foxp3 Fix/Perm kit | ebioscience | 00-5523-00 | \ |
| UltraComp eBeads | ebioscience | 01-2222-42 | \ |
| Centrifuge | eppendorf | 5810R,5920R | \ |
| FlowJo software | FlowJo LLC | \ | vs 10.0 |
| PBS | Hyclone | SH30256.01 | 50 mL |
| RPMI 1640 | Hyclone | SH30809.01 | \ |
| Disposable, sterile scalpels | Jin zhong | J12100 | 11# |
| knife handle | Jin zhong | J11010 | \ |
| eye scissors and tweezers | Jin zhong | Y00030 | Eye scissors 10 cm |
| eye scissors and tweezers | Jin zhong | JD1060 | Eye tweezers 10 cm with teeth |
| Portable liquid nitrogen tank | Jinfeng | YDS-175-216 | \ |
| Electronic balance | Metter Toledo | AL204 | 0-100 g |
| Miltenyi C-tubes | Miltenyi | 130-096-334 | \ |
| Miltenyi Gentle MACS with heater blocks | Miltenyi | 120-018-306 | \ |
| Tumor Dissociation Kit | Miltenyi | 130-096-730 | \ |
| Cell counter | Nexcelom | Cellometer | Cellometer Auto T4 |
| cryopreservation tube | Nunc | 375418 | 1.8 mL |
| Cultrex High Protein Concentration (HC20+) BME | PathClear | 3442-005-01 | \ |
| syringes | Shanghai MIWA medical industry | \ | 1-5 mL |
| Studylog software | Studylog | \ | software |
| Studylog-Balance and supporting USB | OHAUS | SE601F | Balance and supporting USB |
| Studylog-Data line of vernier calipers | Sylvac | 926.6721 | Data line of vernier calipers |
| Caliper | Sylvac | 910.1502.10 | Sylvac S-Cal pro |
| Sterilized centrifuge tubes | Thermo | 339653 | 50 mL |
| Sterilized centrifuge tubes | Thermo | 339651 | 15 mL |
| Ice bucket | Thermo | KLCS-288 | 4 °C |
| Ice bucket | Thermo | PLF-276 | -20 °C |
| Ice bucket | Thermo | DW-862626 | -80 °C |
| RNAlater | Thermo | am7021 | \ |
References
- Chevrier, S., et al. An Immune Atlas of Clear Cell Renal Cell Carcinoma. Cell. 169 (4), 736-749 (2017).
- Wargo, J. A., Reddy, S. M., Reuben, A., Sharma, P. Monitoring immune responses in the tumor microenvironment. Curr. Opin. Immunol. 41, 23-31 (2016).
- Mosely, S. I., et al. Rational Selection of Syngeneic Preclinical Tumor Models for Immunotherapeutic Drug Discovery. Cancer Immunol. Res. 5 (1), 29-41 (2017).
- Rühle, P. F., Fietkau, R., Gaipl, U. S., Frey, B. Development of a Modular Assay for Detailed Immunophenotyping of Peripheral Human Whole Blood Samples by Multicolor Flow Cytometry. Int. J. Mol. Sci. 17 (8), e1316 (2016).
- Jiang, H., et al. Targeting focal adhesion kinase renders pancreatic cancers responsive to checkpoint immunotherapy. Nat. Med. 22 (8), 851-860 (2016).
- Gunderson, A. J., et al. Bruton Tyrosine Kinase-Dependent Immune Cell Cross-talk Drives Pancreas Cancer. Cancer Discov. 6 (3), 270-285 (2016).
- Li, Q. X., Feuer, G., Ouyang, X., An, X. Experimental animal modeling for immuno-oncology. Pharmacol. Ther. 17, 34-46 (2017).
- Takao, K., Miyakawa, T. Genomic responses in mouse models greatly mimic human inflammatory diseases. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 112 (4), 1167-1172 (2015).
- Payne, K. J., Crooks, G. M. Immune-cell lineage commitment: translation from mice to humans. Immunity. 26 (6), 674-677 (2007).
- Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. J. Immunol. 172 (5), 2731-2738 (2004).
- von Herrath, M. G., Nepom, G. T. Lost in translation: barriers to implementing clinical immunotherapeutics for autoimmunity. J. Exp. Med. 202 (9), 1159-1162 (2005).
- Talmadge, J. E., Singh, R. K., Fidler, I. J., Raz, A. Murine models to evaluate novel and conventional therapeutic strategies for cancer. Am. J. Pathol. 170 (3), 793-804 (2007).
- Erdag, G., et al. Immunotype and immunohistologic characteristics of tumor-infiltrating immune cells are associated with clinical outcome in metastatic melanoma. Cancer Res. 72 (5), 1070-1080 (2012).
- Gutiérrez-Garcia, G., et al. Gene-expression profiling and not immunophenotypic algorithms predicts prognosis in patients with diffuse large B-cell lymphoma treated with immunochemotherapy. Blood. 117 (18), 4836-4843 (2011).
- Paiva, B., et al. PD-L1/PD-1 presence in the tumor microenvironment and activity of PD-1 blockade in multiple myeloma. Leukemia. 29 (10), 2110-2113 (2015).
- Youn, J. I., Collazo, M., Shalova, I. N., Biswas, S. K., Gabrilovich, D. I. Characterization of the nature of granulocytic myeloid-derived suppressor cells in tumor-bearing mice. J. Leukoc. Biol. 91 (1), 167-181 (2012).
- Lavin, Y., et al. Innate Immune Landscape in Early Lung Adenocarcinoma by Paired Single-Cell Analyses. Cell. 169 (4), 750-765 (2017).
- Mahoney, K. M., et al. PD-L1 Antibodies to Its Cytoplasmic Domain Most Clearly Delineate Cell Membranes in Immunohistochemical Staining of Tumor Cells. Cancer Immunol. Res. 3 (12), 1308-1315 (2015).
- Yamaki, S., Yanagimoto, H., Tsuta, K., Ryota, H., Kon, M. PD-L1 expression in pancreatic ductal adenocarcinoma is a poor prognostic factor in patients with high CD8+ tumor-infiltrating lymphocytes: highly sensitive detection using phosphor-integrated dot staining. Int. J. Clin. Oncol. 22 (4), 726-733 (2017).
- Jiang, Y., et al. ImmunoScore Signature: A Prognostic and Predictive Tool in Gastric Cancer. Ann. Surg. , (2016).
- Ribas, A., et al. PD-1 Blockade Expands Intratumoral Memory T Cells. Cancer Immunol. Res. 4 (3), 194-203 (2016).
