Summary
La procédure expérimentale sur l’immunophénotypage des homogreffes ACPE orthotopique murine vise à présenter le profil immuno-microenvironnement tumoral. Les tumeurs sont orthotopically implanté par la chirurgie. Tumeurs de 200 à 600 mm3 de taille ont été récoltés et dissociées pour préparer des suspensions unicellulaires, suivies d’analyse multi-immunitaire marqueur FACS à l’aide de différents anticorps fluorescent marqués.
Abstract
Homogreffe tumeurs (syngéniques) sont le produit phare de la recherche préclinique d’aujourd'hui immuno-oncologie (e/s). Le microenvironnement tumoral (TME), particulièrement ses composantes immunitaires, est essentiel pour le pronostic et la prévision des résultats du traitement, en particulier ceux de l’immunothérapie. TME immunitaire-composants sont composés de différents sous-ensembles de cellules immunitaires infiltrant de tumeur évaluables par FACS multicolore. Adénocarcinome canalaire pancréatique (CCPP) est parmi les plus meurtrières malignances manque d’options de traitement bon, donc un besoin médical urgent et non satisfait. Une des grandes raisons pour sa non-réponse aux divers traitements (chimio-et ciblé, I/O) a été sa TME abondante, composée de fibroblastes et de leucocytes qui protègent les cellules tumorales de ces thérapies. Orthotopically ACPE implanté est censé plus précisément reprendre la TME des cancers du pancréas humains que les modèles conventionnels de sous-cutanée (SC).
Homogreffe tumeurs (KPC) sont des greffes de souris spontanée ACPE originaires de KPC-souris génétiquement modifiées (KrasG12D / +/P53- / -/Pdx1-Cre) (CPK-GEMM). Le tissu de la tumeur primitive est coupé en petits fragments (~ 2 mm3) et transplanté par voie sous-cutanée (SC) aux destinataires syngéniques (C57BL/6, 7-9 semaines). Les homogreffes ont ensuite étaient chirurgicalement orthotopically transplanté sur le pancréas de nouvelles souris C57BL/6, ainsi que de la SC-implantation, qui atteint des volumes de 300 à 1 000 mm3 tumeur de 17 jours. Seulement des tumeurs de 400 – 600 mm3 ont été récoltés per opératoire agréé autopsie et nettoyés pour enlever les tissus non-tumeur adjacentes. Ils sont dissociés par protocole utilisant un dissociator tissus dans des suspensions unicellulaires, suivies par la souillure avec panneaux désigné d’anticorps fluorescent marqués pour les différents marqueurs de différentes cellules immunitaires (lymphoïdes, myéloïde et NK, DCs). Les échantillons colorés ont été analysées à l’aide multicolore FACS de déterminer le nombre de cellules immunitaires de lignées différentes, ainsi que leur pourcentage relatif dans les tumeurs. Les profils immunitaires des tumeurs orthotopique sont ensuite comparés à ceux des tumeurs SC. Les données préliminaires ont démontré significativement élevés TILs/TAMs infiltrantes dans les tumeurs sur le pancréas et supérieure infiltration de lymphocytes B orthotopique plutôt que les tumeurs SC.
Introduction
Adénocarcinome canalaire pancréatique (ACPE) provoque près de la moitié un million mortalités dans le monde entier chaque année, le top 5 du cancer meurtrière. Il y a peu d’options thérapeutiques efficaces et aucune immunothérapies approuvés ; par conséquent, les nouveaux traitements sont absolument nécessaires. Les cancers sont plus en plus reconnus comme des maladies immunologiques, incluant ACPE, outre les maladies génétiques, tel que connu aujourd'hui. Facteurs génétiques, immunologiques et déterminerait probablement pronostic de la maladie ainsi que le traitement résultats. Les tumeurs soustraire à la surveillance immunitaire hôte et finalement avancement pour causer la mort. Plusieurs de ces processus immunitaires produisent dans le microenvironnement tumoral (TME)1,2,3,4 où différents types de cellules immunitaires interagissent avec les cellules tumorales, entre eux et avec les autres tumeurs les composants stromales, directement ou indirectement par l’intermédiaire de cytokines qui déterminent en dernier ressort issue de la maladie. Caractérisation des composantes immunitaires tumeur de la TME, ou tumeur immunophénotypage, y compris le sous-typage, la numération et la localisation des différentes lignées de cellules immunitaires, est donc essentielle pour comprendre l’immunité anti-tumorale. Dans le cas de l’ACPE, il a été proposé qu’élevé tumeur-infiltration de macrophages suppressives (TAM) et les lymphocytes B ont conduit à la prévention de l’infiltration de lymphocytes et/ou l’activation et des niveaux élevés de fibrose5,6.
L’approche commune pour enquêter sur le système immunitaire eut expérimentalement utiliserait des modèles animaux précliniques de substitution tumeur, tumeur de souris principalement aux modèles7, particulièrement des souris syngénique (homogreffe) ou des modèles de souris génétiquement modifiées (GEMM) des cancers, sur la ressemblance présumée de la souris et l’homme pour les tumeurs et immunité8,9. En réalité, il est entendu qu’il y a des différences inhérentes entre les deux espèces10,11.
Les tumeurs de souris transplantées ont un avantage significatif sur des tumeurs spontanées7, à savoir le développement de tumeurs synchronisée, par contraste avec le développement de tumeurs spontanées GEMM parental. Homogreffes de tumeurs murines spontanées sont considérés comme des tumeurs primaires n’ayant jamais été manipulé in vitroet mise en miroir original souris tumeur histo- / moléculaire pathologie7, ainsi que des profils de système immunitaires possibles. Ces homogreffes murins sont souvent considérés comme « une version de souris des xénogreffes dérivés de patient (PDXs) ». Par conséquent, ils ont probablement une meilleure traduisibilité de cellule syngénique classiques dérivé souris tumeurs12. En particulier, nombreux homogreffes sont dérivés de GEMM spécifique où des mécanismes spécifiques de la maladie humaine, par exemple les mutations oncogéniques pilote, ont été conçus, et ces homogreffes devraient donc avoir des avantages à leur pertinence clinique. En particulier, la KPC GEMM développer souris ACPE dans 15 à 20 semaines d’âge, qui récapitule morphologiquement des maladies humaines avec architecture glandulaire de surtout bien à modérément-dissociés et hautement enrichi stroma. Ce modèle reprend également les fonctions génétiques les plus courantes du CCPP humaine, à savoir Kras en activant la mutation et la perte de fonction P53, qui se produisent à 90 % et 75 % des humain ACPE, respectivement de5,6.
Sites de transplantation ont également été suggérés à jouer un rôle dans la traduisibilité modèle. L’environnement tissulaire spécifique, comme dans un environnement orthotopique correspondante, pourrait être une niche pour les tumeurs spécifiques aux environnements de progrès, par opposition à l’uniform sous-cutanée (SC) pour les tumeurs couramment greffés. Il serait particulièrement intéressant if, et/ou, quelle différence existe entre les deux sites de transplantation, sur le plan immunitaire-microenvironnement et la pertinence de cancer chez l’humain, par exemple. dans le cas de l’ACPE.
Un des aspects plus importants de profilage immunitaire ou immunophénotypage, est de déterminer les cellules immunitaires infiltrant de tumeur différentes lignées, les nombres, pourcentage relatif dans les tumeurs, ainsi que leurs États d’activation et les emplacements. Cela inclut la tumeur-infiltratrating lymphoctyes (TILs, tant T - B-), tumeur-infiltration de macrophages (EAPV), tumeur-infiltration des cellules tueuses naturelles (NKs) et tumeur non-résidents dendritiques cellules3,13,14 , 15 , 16 , 17et la localisation subcellulaire de certaines cellules18,19,20, etc.. Fluorescence tri cellulaire activé (FACS) ou écoulement cytometry est une technologie de détection de la cellule unique qui est couramment utilisée pour mesurer les paramètres spécifiques d’une cellule. Multi-color flow cytometry mesures des marqueurs multiples sur une seule cellule3,4,21 et est la méthode la plus couramment utilisée pour déterminer le nombre et le pourcentage relatif des différents sous-ensembles de cellules immunitaires, notamment dans les tumeurs.
Ce rapport décrit les procédures pour le profilage des cellules immunitaires infiltrant de tumeur : 1) l’Implantation des homogreffes tumeur orthotopique ACPE souris, ainsi que l’implantation de SC ; 2) tumeur tissulaire récolte et préparation de cellule unique par l’intermédiaire de dissociation de la tumeur ; 3) analyse en cytométrie en flux de toutes les cellules dérivées de tumeurs comme point de départ ; 4) Comparaison des profils de la base de ces deux approches de la transplantation.
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Protocol
Tous les protocoles et modifications ou procédures mettant en cause le soin et l’utilisation d’animaux seront examinées et approuvées par la Couronne Bioscience Institutional Animal Care et utiliser Comité (IACUC) avant la réalisation d’études. Le soin et l’utilisation des animaux seront généralement menées conformément aux lignes directrices internationales AAALAC (Association pour l’évaluation et l’accréditation du laboratoire Animal Care) comme indiqué dans le Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire, National Research Conseil (2011). Toutes les procédures expérimentales animales seront dans des conditions stériles dans les installations de SPF (spécifique exempts de micro-organismes pathogènes) et mené en stricte conformité avec le Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire des établissements gouvernementaux (p. ex. Les National Institutes of Health). Le protocole devra être approuvé par le Comité sur l’éthique de l’expérimentation animale à l’établissement d’installations (p. ex. Commission IACUC institutionnelle).
1. préparation à la Transplantation de la tumeur
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Logement des animaux
- Obtenir des souris C57BL/6 génériques d’un vendeur d’élevage commercial.
- Souris domestiques (5) dans des cages ventilées individuelles aux conditions suivantes : température : 20 à 26 ° C ; humidité de 30 à 70 % ; cycle d’éclairage : 12 h de lumière et 12 h d’obscurité.
- Utilisation corn cob literie qui est changée toutes les semaines.
- Pour alimentation, fournir de la nourriture sèche granule irradiation stérilisée pendant toute la période témoin.
- Pour l’eau, donner animaux librement accès à l’eau potable stérile.
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Préparation de fragment tumoral donneur
- Commencer par poids corporel (PC), une surveillance par pesée à l’aide d’un équilibre et le volume des tumeurs (TV), par mesure de calibre, des souris de tumeur-roulement donneur.
- Lorsque TV atteint 500 – 1 200 mm3, euthanasier l’animal sous une hotte de biohazard conformément au protocole.
- Stériliser la peau autour de la tumeur à l’aide d’écouvillons iodophore.
- Enlever chirurgicalement la tumeur (détail décrit à la section 3 : autopsie et tumeur de récolte) et placer la tumeur dans une boîte de Pétri contenant 20 mL de PBS (pré refroidissement le support ou le tampon à 4 ° C avant d’euthanasier les animaux).
- S’il y a contamination sanguine, transférer la tumeur dans une autre boîte de Pétri et laver la tumeur avec du PBS.
- Couper la tumeur en deux, en enlevant les peau supplémentaire, la navires, la calcification et la nécrose.
- Choisir seulement des pièces intactes de tumeur et placez-les dans un tube à centrifuger stérile de 50 mL et ajouter 20 mL de PBS alors transporter le tube à une animalerie distinct pour les études de pharmacologie.
2. orthotopique et greffe sous-cutanée (SC)
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Inoculation de SC
- Couper les tumeurs en 2 mm diamètre morceaux à l’aide d’un scalpel, mettre 1 morceau dans chaque trocart, pour l’implantation de SC ou pour une implantation orthotopique plus tard (voir ci-dessous).
- Anesthésier l’animal receveur avec 5 % isoflurane, qui est maintenue par un cône de nez à 1 %. L’animal commencera à se détendre, perdre leur réflexe de redressement et finissent par devenir immobile. À cette profondeur de l’anesthésie, ils peuvent facilement être réveillés par des stimuli douloureux ; permettre l’anesthésie d’approfondir jusqu'à ce que de telles réactions à la douleur sont absentes.
- Une fois anesthésié, fixer les souris sur une planche de l’expérience dans le poste de latéral droit. Stérilisez la souris à l’aide d’écouvillons iodophore, notamment dans les zones entourant les tumeurs.
- Avec un scalpel, faire une incision cutanée de 0,5 à 1,0 cm sur le flanc gauche, juste crânien à la hanche.
- Tunnel sous la peau vers la patte avant, deux à trois centimètres, avec une pince émoussée.
- Transférer un cube de tumeur du milieu de façon aseptique et placer à l’intérieur du tunnel sous-cutané.
- Vérifier visuellement que la tumeur est profondément dans le tunnel (et non à l’incision de la peau).
- Refermer la plaie avec des clips de la plaie.
- Surveiller l’animaux après l’inoculation jusqu'à ce qu’ils reprennent conscience suffisante pour maintenir la recumbence sternal. Ramenez les animaux sur leur cage qu’après leur restauration complète de l’anesthésie. Compléter le journal de l’anesthésie et lancer le tableau de la santé animale. Peser les animaux receveurs par jour pendant trois jours
- Une procédure standard, inoculer 5-10 souris par groupe pour la surveillance de la croissance de tumeur.
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Implantation orthotopique du pancréas
- Anesthésie et analgésie
- Utiliser une injection de kétamine 2 mL et une injection de xylazine 0,42 mL (20 mg/mL) mélangé à 5,91 de l’eau d’injection stérile ou de sérum physiologique à un volume de la dose de 0,06 à 0,1 mL/20-25 g de poids corporel.
NOTE : Conformément au bien-être des animaux, l’analgésie est nécessaire avant et après l’opération. 0,05 à 0,1 mg /kg de buprénorphine, SC. La première dose est pré opération et puis dosés 3 fois chaque 4 heures post opération continuellement.
- Utiliser une injection de kétamine 2 mL et une injection de xylazine 0,42 mL (20 mg/mL) mélangé à 5,91 de l’eau d’injection stérile ou de sérum physiologique à un volume de la dose de 0,06 à 0,1 mL/20-25 g de poids corporel.
- Opération chirurgicale pour une implantation orthotopique
- Anesthésier la souris par injection intramusculaire (IM) par étape 2.2.1.
- Après que les animaux sont complètement anesthésiés, fixer les souris sur une planche de l’expérience dans le poste de latéral droit.
- Maintenir les souris en position latérale droite. Désinfecter la peau autour de la rate avec iode puis de-ioder avec 75 % d’alcool éthylique.
- Trouver le point moyen de la rate et faire une incision verticale de 1 cm sur l’abdomen pour exposer la rate.
- Faire ressortir une partie du tissu du pancréas sous la rate doucement avec pince embout plat et un morceau de souris homogreffe tumeur de souris de graine sur le pancréas de souris bénéficiaire de suture par suture chirurgicale résorbable de 9-0.
- Fermez l’abdomen avec une suture de soie de 6-0 en double couture. Atteindre l’homéostasie par compression.
- Après l’implantation de tumeur finition, en cas de fuite de tissu ni saignement ni tumeur, garder les animaux en cage chaude.
- Surveiller l’animal jusqu'à ce qu’il regagne la conscience suffisante pour maintenir le décubitus sternal ; retourner l’animal à la salle des animale après la restauration complète de l’anesthésie. Surveiller la tumeur portant des souris en palpant l’abdomen près de la rate, puis sélectionnez aux souris porteuses de tumeurs orthotopique.
- Anesthésie et analgésie
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Avec tumeur souris Health surveillance
- Vérifier la consommation d’eau et de nourriture tous les jours.
- Observer l’aspect de la souris pour un pelage damés, grumeaux, Minceur, respiration anormale ou une ascite.
- Palper l’abdomen pour vérifier s’il y a des tumeurs spontanées sur le foie et la rate.
- Peser chaque semaine à l’aide d’une balance de souris.
- Si aucun des signes cliniques suivants sont observés, les souris sont sacrifiés pour le prélèvement d’échantillons et d’autopsie : perte de BW > 20 % ; avec facultés affaiblies de mobilité (pas capable de manger ou de boire) ; incapable de se déplacer normalement à cause d’ascite importante et distension abdominale ; effort dans la respiration.
3. autopsie et récolte de tumeur
- Inspecter visuellement et par palpation pour la présence de tumeurs palpables avant la résiliation.
- De résiliation, tout d’abord euthanasier souris conformément au protocole approuvé et ouvrir l’abdomen et examiner visuellement le pancréas pour les tumeurs.
- Couper la tumeur par post chirurgie mortelle et l’ajouter à froid PBS. Placer tous les animaux dans une chambre d’euthanasie propre, sans inculpation, translucide avec un couvercle spécial doté d’un port pour la livraison du dioxyde de carbone à utiliser.
- Décharge de gaz dans la chambre à un débit qui produit la perte de conscience rapide avec détresse minime à l’animal. La vitesse d’écoulement optimale pour le CO2 devrait être d’environ 2 à 2,5 L/min.
- Observer visuellement chaque animal au cours de la procédure d’euthanasie pour assurer tous les animaux reçoivent des concentrations de gaz adéquat et ne pas reprendre conscience au cours de la procédure de l’euthanasier.
- Maintenir le débit de gaz pour au moins 1 minute après la mort clinique apparente pour réduire au minimum la possibilité qu’un animal peut recouvrer (si apnéique mais pas mort).
- Enlever les tissus non-tumeur adjacents. Nettoyé de tumeur peut être photographié rapidement.
Placer les tissus tumoraux dans RPMI-1640 et tenir sur la glace avant de dissociation.
Remarque : Les carcasses d’animaux sont mis dans des sacs et stockés dans le congélateur approprié d’attendre le retrait.
4. tumeurs des tissus Dissociation et préparation de cellule unique
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Préparation du réactif
Remarque : Le Kit de Dissociation de tumeur contient 2 flacons de Enzyme D (poudre lyophilisée), 1 flacon de Enzyme R (poudre lyophilisée), 1 flacon d’Enzyme A (poudre lyophilisée) et 1 mL de tampon A.- Préparez Enzyme D en reconstituant la poudre lyophilisée dans chaque flacon de 3 mL de milieu RPMI-1640. Préparer des aliquotes d’un volume approprié afin d’éviter les cycles gel-dégel répétés.
- Préparez Enzyme R en reconstituant la poudre lyophilisée dans la cuvette de 2,7 mL du milieu RPMI 1640. Préparer des aliquotes d’un volume approprié afin d’éviter les cycles gel-dégel répétés.
- Préparation enzymatique A par reconstitution de la poudre lyophilisée dans le flacon de 1 ml de tampons A fourni avec le kit. Ne pas vortexer. Préparer des aliquotes d’un volume approprié pour éviter gratuit-dégel-cycles répétés.
- Préparer le mélange enzymatique en ajoutant 2,35 mL du milieu RPMI-1640, 100 µL d’Enzyme D, 50 µL d’Enzyme R et 12,5 µL d’Enzyme A dans chaque gentleMACS C-tube.
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Dissociation de la tumeur
- Pour chaque tumeur préparer un C-tube avec mélange de digestion de tumeur, veuillez vous reporter à la section 4.1 pour dilution de tampon de digestion et de préparation.
- Utilisation 3 mL digestion tampon pour des fragments de tumeur < 0,8 g et s’assurer que la tumeur est complètement digérée.
- L’étiquette avec le code de l’étude, tumeur, souris ID, groupe de traitement et poids de tumeur.
- Recueillir la tumeur de la souris, laver la tumeur dans du PBS froid et nettoyer le tissu attaché sur la tumeur (par exemple les vaisseaux sanguins, graisse, carénage, etc.).
- Mettre la tumeur dans les médias de digestion dans un puits d’une plaque bien 6 stérile.
- Tenez la tumeur en place avec une pince à épiler/pince stérile et la tranche de pain avec un scalpel. Tranchez la tumeur assez bien de briser en petits morceaux (~ 1 mm3).
- Placer les morceaux de la tumeur dans le C-tube et utilisez le tampon de digestion restants pour laver la plaque et ensuite transférer le liquide dans le tube-C qui est placé sur la glace jusqu'à ce que la digestion.
- Allumez le dissociator avec radiateurs.
- Placez la dissociation de tumeur C-tubes à l’envers dans les manchons des postes vacants et régler le statut des postes de tube de Free à sélectionné. Choisir un programme de dissociation (37_c_m_TDK_1), suivi par la sélection du dossier requis, où apparaît la liste des programmes.
- Après la fin du programme, enlever C-tubes le dissociator et essorage brièvement (300 x g, 4 ° C) à l’échantillon de granule.
- Remettre en suspension les échantillons et mettez dans une passoire de cellules au-dessus d’un tube de 50 mL. Laver les cellules à travers le tamis de cellule avec 10 mL de tampon de lavage d’une suspension de cellules individuelles.
- Centrifuger les tubes à 300 x g pendant 5 min, jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules avec 5 mL de tampon de lavage, nombre de cellules viables utilisant trypan blue et/ou par compteur de cellules et ajuster le surpasse de cellule à 1 x 106 cellules par tube ou par échantillon. Inclure les anticorps de contrôle isotype correcte afin d’assurer une coloration spécifique
5. abri planche de bord et Acquisition de données de flux
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Planche de bord
- S’il vous plaît voir le tableau 1.
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Immunomarquage
- Des échantillons de cellules FC-bloc : remettre en suspension les cellules dans 200 µL de tampon avec 1 µg/mL Fc-bloc, suivi par incubation sur le froid glace ou à 4 ° C pendant 15 minutes dans l’obscurité de la coloration.
- Tache de cellules en utilisant les panneaux de l’anticorps désiré/fluorescence (par exemple. Panneau T-Cell, macrophage, etc..) : ajouter le mélange d’anticorps dilué dans un tampon bloquant Fc pour chaque échantillon, tache pendant au moins 30 minutes sur la glace dans l’obscurité.
- Ajouter 1 mL de PBS froid de glace dans chaque tube et remettre en suspension les cellules doucement, suivi par centrifugation à 300 x g pendant 5 min. jeter le surnageant qui en résulte.
- Répétez l’opération pour laver les cellules deux fois.
- Teinté de marqueurs intracellulaires si nécessaire, suivants étapes 6 à 10, sinon sautent à l’étape 10.
- Resuspendre le culot cellulaire par vortex impulsion et ajouter 200 µL de solution de travail de Fixation/perméabilisation préparée pour chaque échantillon. Vortex d’impulsion à nouveau et puis incuber à 4 ° C durant la nuit (préféré) ou 30 min à température ambiante dans l’obscurité.
- Tournez en bas les cellules et éliminer le surnageant.
- Lavez deux fois en ajoutant 1 mL de 1 x tampon de perméabilisation (fait partir de 10 x perméabilisation tampon, dilué avec distillée H2O) suivi par centrifugation et décantation du liquide surnageant.
- Ajoutez l’anticorps intracellulaire marqueur dans 1 x tampon perméabilisation et incuber à température ambiante pendant 30 min à l’obscurité.
- Laver deux fois avec 1 mL de 1 x tampon perméabilisation des cellules. Centrifuger et décanter le liquide surnageant.
- Remettre en suspension des cellules dans 150 µL de tampon de coloration et d’analyser sur un cytomètre. En raison de la procédure de fixation et perméabilisation, le FSC (nuage de points de lumière vers l’avant) / SSC (nuage de points du hublot) distribution de la population cellulaire sera différente de vivre les cellules. Par conséquent, la porte et les tensions devront être modifiées.
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Contrôles FMO (Fluorescence moins un contrôle)
Remarque : Analyse des flux multi-color est particulièrement important pour l’analyse des cellules immunitaires infiltrant de tumeur. Par conséquent, il faut trouver un moyen d’identifier et de cellules dans le contexte de données réparties en raison des plusieurs fluorochromes dans un groupe donné de la porte. Contrôle de la FMO (Fluorescence Minus One) est une approche importante à cet effet.- À cette fin, inclure souris supplémentaires au processus individuellement pour chaque tissu et chaque groupe de contrôles FMO (au moins 2 par Rx). Après dissociation, tissus de la piscine. Par exemple, dans une étude portant sur 4 groupes de Rx, 8 autres tumeurs devraient être traitées individuellement et ensuite regroupés dans un seul échantillon pour cadres d’obligations mutuelles.
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Réglage de l’Instrument courant
- Faire des perles de compensation alors que la machine se réchauffe (au moins 20 min).
- Perles de CS-T permet de vérifier les performances.
- Les paramètres de tension et d’indemnisation : utiliser UltraComp perles, vortex la maquette perles soigneusement avant de l’utiliser.
- Étiqueter un tube d’échantillon2 séparée 12 x 75 mm pour chaque anticorps conjugué fluorochrome.
- Ajouter 100 µL de tampon dans chaque tube de coloration. Ajouter 1 goutte complet (environ 60 µL) des perles à chaque tube.
- Ajouter des anticorps et effectuer la procédure de marquage exactement comme la procédure énoncée à l’article 4.
- Ajouter 0,5 mL de tampon de chacun, afin de complètement remettre en suspension pastilles perle via vortex de coloration.
- Régler la tension de PMT cytomètre en flux par le tissu cible pour l’expérience donnée.
- Executer le cytomètre en flux d’acquisition de données, par blocage sur la population de billes singulet par FSC et SSC lectures.
- Réglage débit autour de 200 à 300 événements/s.
- Définir une compensation appropriée pour une donnée fluorescéine [FITC]-anticorps conjugués, utiliser un FL1 vs FL2 dot plot.
- Placez une barrière de quadrant afin que les perles négatifs sont dans le quadrant inférieur gauche et les perles positifs sont dans le coin supérieur ou inférieur droit quadrant. Ajustez les valeurs de compensation jusqu'à ce que l’intensité de la fluorescence médian (IFM) de chaque population (comme indiqué dans la fenêtre de statistiques quadrant) est approximativement égale (c.-à-d. pour FL1 FL2-%, l’IFM FL2 de jante devrait être similaire).
- Répétez les étapes 5.4.11 et 5.4.12 pour tous les tubes.
- Procéder à l’acquisition du réel teinté d’échantillons. Exécutez l’Assistant de compensation et enregistrez les paramètres sous le format « date expérimenter vos initiales ».
6. flux de données analyse et présentation
- Analyser les données par Flowjo et/ou Kaluza.
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Representative Results
Implantation orthotopique du CCPP a abouti à la croissance tumorale rapide similaire à celle observée pour l’implantation de SC. Après que les fragments de tumeur de donateurs ont été implantés chez des souris bénéficiaires, tant par voie sous-cutanée et orthotopically selon les protocoles décrits aux étapes 2.1 et 2.2, les tumeurs de homogreffe KPC implantés a démontré une croissance rapide semblable comme sur la Figure 1 a . Les tumeurs de homogreffe KPC récoltées à différents moments sont indiquées dans la Figure 1 b et représentant H & images E sont montrés Figure 1. Nos données démontrent une croissance similaire de SC et orthotopique implants.
Cellules tumorales viables et des cellules dans la TME, y compris les cellules immunitaires infiltrant de tumeur, originaires d’orthotopique ou implantation SC, peuvent efficacement être récupérés. Les tumeurs ont été récoltées et digérés pour préparer des suspensions cellulaires unique pour analyse ultérieure de FACS en utilisant un commercial dissociator (Figure 2 a) selon le protocole décrit à l’étape 4. Nous avons obtenu habituellement rendements raisonnablement élevé de cellules viables de l’échantillons de tumeur des deux types d’implantation (~ 80 % viabilité basée sur le bleu Trypan) ; l’intrigue de FACS représentatif montre des cellules viables de tumeur, séparée les débris de cellules mortes/cellulaire (Figure 2 b).
Tumeur-infiltration de cellules immunitaires des différents sous-ensembles ont été identifiés en orthotopique et tumeurs SC implanté, tandis que leurs profils présentent des différences. La suspension monocellulaire, préparée à partir de tissus de la tumeur en utilisant la méthode décrite à l’étape 4.2 ont été soumis à l’analyse de FACS après coloration avec un panel de 16 couleurs de marqueurs indiqué dans le tableau 1, qui couvre les différentes lignées de cellules immunitaires importants comme Bien que les cellules tumorales. La hiérarchie de lignée stratégie ou immunitaire gating ainsi que des parcelles de flux représentatif est indiquée dans la Figure 3 a. CD45, un marqueur pour toutes les cellules immunitaires matures, a été utilisé pour distinctif des cellules tumorales et tumeur-infiltration de cellules immunitaires. Toutes les lignées immunitaires ont été analysées par la suite de CD45+ les populations tel qu’affiché par le panneau (tableau 1).
À côté des marqueurs, la taille des cellules est également utilisée pour différencier les différentes sous-populations (Figure 3 b gauche) afin de quantifier les sous-ensembles de cellules, y compris le T, les lymphocytes B, les macrophages et les MDSCs, etc.. Tumeur infiltrant la comparaison du profil immunitaire des homogreffes des cancers du pancréas SC vs l’orthotopique. Les populations de grandes cellules énuméré de plusieurs sous-ensembles principaux de tumeur infiltrant les cellules immunitaires sont indiquées Figure 3. Les données montrent clairement que la tumeur a considérablement augmenté l’infiltration des cellules immunitaires comparée avec le pancréas de souris saine. En outre, différents pourcentages de sous-ensemble de cellules immunitaires infiltrant de tumeur ont été trouvés dans l’orthotopic vs. Les homogreffes SC, par exemple beaucoup plus B-cellules dans orthotopique qu’en SC.
| Marqueur | Population de cellules immunitaires |
| CD45 | Leucocytes totales |
| CD3 | Lymphocytes T totales |
| CD4 | Cellules CD4 + T auxiliaires |
| CD8 | Cellules de T cytotoxiques CD8 + |
| CD44 / CD62L * | Lymphocytes T naïfs, mémoire et processeur d’effets |
| CD69/CD44/OX40/CD25 etc.* | Marqueurs d’activation |
| CD4 + CD25 + FoxP3 + | Lymphocytes T régulateurs |
| CD11b + Ly6c/Ly6g | G-MDSC et M-MDSC |
| CD11b + F4/80 | Macrophages |
| IA/IE/CD206 | Macrophages M1 et M2 |
| CD3-CD335 + | Cellules NK |
| CD3 + CD335 + | Cellules NKT |
| CD19 | Cellules B |
| TNF-a/IFN-r/IL-7/IL-3 etc.* | Cytokines |
| PD-1/PD-L1/CTLA-4/TIM-3 etc.* | Inhibiteurs de Checkpoint |
| B Granzym etc.* | Marqueurs fréquemment demandées |
| KI67/Brd U/PNCA etc. | Prolifération |
| Live/dead (réparable) | Live/dead |
| * Note : Les marqueurs supplémentaires peuvent être ajoutés selon les besoins | |
Tableau 1 : panneaux de circulation 16 couleurs destiné à l’analyse de la tumeur-infiltration de cellules immunitaires souris.
Figure 1 : les deux orthotopique et SC (subQ) implanté des tumeurs de homogreffe de CCPP dans C57BL/6 souris ont démontré une croissance similaire avec ou sans traitement de gemcitabine. Courbe de croissance (A) : SC-left et right-orthotopique. Bleu : Véhicule ; Or : Gemcitabine (initiée sur 10 jours après l’inoculation, lorsque le volume des tumeurs SC moyenne atteint 200 mm3). (B) les tissus de tumeurs à des moments différents. (C) représentant H & E coloration des deux types d’homogreffes (40 x 10). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : dissociation de tissu de tumeur pour préparer la suspension monocellulaire viable. (A) l’utilisation de la disassociator ; (B) le viable de cellules, séparée des cellules mortes, comme illustré par l’analyse des flux. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : analyse des flux multi-couleur des cellules immunitaires infiltrant de tumeur orthotopique et homogreffes ACPE SC. Les données brutes de chaque échantillon de la tumeur ont été acquises de l’instrument de cytométrie en flux, suivie d’analyse à l’aide de logiciels d’analyse Flowjo FACS. (A), la stratégie de blocage standard pour l’analyse, est affichée à titre d’exemple ; (B) représentatif de blocage et analyse données de flux en utilisant la norme gating stratégie ; (C) représentant-infiltration tumorale immunitaire cellsare affichée afin d’inclure les Treg, les lymphocytes B et les macrophages. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Bien que les études utilisant des tumeurs SC sont réalisées plus facilement, orthotopically implanté tumeurs modèles peuvent potentiellement être plus pertinentes pour les études de pharmacologie préclinique (en particulier les enquêtes I/O) pour fournir la traduisibilité améliorée. Ce rapport vise à aider le lecteurs/audience intéressée pour être en mesure de visualiser directement les procédures techniques qui peuvent être utilisés dans leurs recherches respectives. Nos protocoles de démontrent cette orthotopique implantation du CCPP peut entraîner la croissance de la tumeur efficace, semblable à l’implantation de SC. Nos observations semblent également suggérer la présence de différents profils immunitaires des eut depuis les implantations différentes. Les grands défis d’adaptation orthotopique, par rapport aux implantations de SC, sont que des compétences complexes sont nécessaires, le processus prend du temps, les interventions chirurgicales d’implantation sont de forte intensité de main de œuvre et aussi la difficulté de surveillance tumeur orthotopique croissance dans la vie.
Il y a quatre étapes essentielles pour s’assurer qu’orthotopique tumeur pancréatique expériences réalisées avec succès : 1) l’approche chirurgicale d’implantation ; 2) le suivi attentif et rapide du développement de la tumeur ; 3) l’importance de l’expérience préalable teste tout d’abord de se familiariser avec la procédure et d’évaluer le taux et le taux de croissance tumorale ; 4) en utilisant des suspensions cellulaires unique de tumeurs dissociés comme une méthode alternative de prise de greffe. Cette procédure de rapport est utile aux lecteurs pour effectuer des recherches à l’aide de cette homogreffe spécifique, mais aussi des autres modèles orthotopique du pancréas, et même d’autres orthotopique modèles impliquant la chirurgie abdomen-ouverture.
Cytométrie en flux ou FACS est actuellement l’outil le plus important d’exécuter immunoprofiling. Immunophénotypage des tumeurs par FACS diffère sensiblement de celle des cellules de différents organes, tels que le sang périphérique, rate, ganglions lymphatiques et la moelle osseuse de la manière suivante. Généralement, il y a un très faible pourcentage de cellules immunitaires présentes dans les tumeurs (petit échantillon). L’extrême hétérogénéité des tumeurs et le petit nombre de cellules immunitaires présentes font récupérer cellules immunitaires rares viables techniquement difficile, nécessitant des machines cybernétiques dissociation tissu de tumeur développée. Les deux points précédents rendent essentielle la mesure simultanée de plusieurs paramètre cytométrie multi-couleurs. Multi-couleur flux requiert conception panneau complexe marqueur, indemnisation et blocage des stratégies, en raison du chevauchement spectrale de fluorescence. Ce rapport a également tenté de démontrer aux lecteurs/spectateurs intéressés le processus de tumeur immunitaire profilage par dissociation de tissu de tumeur déterminées et analyse en cytométrie en flux de multicolore.
Trois étapes critiques pourraient être particulièrement importants pour le rendement productif TIL analyse : tout d’abord, un rendement élevé de cellules viables de dissocié des tumeurs à l’aide de procédures de tumeur personnalisés de dissociation ; Deuxièmement, la conception optimisée de grande multi-color coloration panneaux issu des réactifs disponibles ; Troisièmement, une stratégie de blocage optimisée dans l’analyse. Les auteurs désirent mettre l’accent sur la formation et l’expérience des opérateurs d’acquisition de données et d’analyse sont indispensables pour l’analyse de cytométrie de flux réussie de TIL.
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Disclosures
Tous les auteurs sont actuelles employés à plein temps de Crown Bioscience, Inc.
Acknowledgments
Les auteurs seraient remercie Dr Jody Barbeau - lecture critique et l’édition du manuscrit et remercier Ralph Manuel pour la conception des œuvres d’art. Les auteurs tiens également à remercier l’équipe de couronne Bioscience oncologie Immuno-oncologie biomarqueur et oncologie In Vivo , pour leurs grands efforts techniques.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia machine | \ | SAS3119 | \ |
| Trocar 20 | \ | \ | 2 mm |
| Petri dish | \ | \ | 20 mm |
| 100x antibiotic and antimycotic | \ | \ | \ |
| Iodophor swabs | \ | \ | Daily pharmacy purchase |
| Alcohol swabs | \ | \ | Daily pharmacy purchase |
| Liquid nitrogen | Air chemical | \ | \ |
| Biosafety hood | AIRTECH | BSC-1300IIA2 | \ |
| FACS machine LSRFortessa X-20 | BD | LSR Fortessa | \ |
| antibodies | BD | \ | \ |
| Trevigen MD or BD Matrigel Basement Membrane Matrix High concentration | BD | 354248 | \ |
| FACS buffers | BD | 554656 | Mincing buffer |
| Brilliant Staining Buffer | BD | 563794 | \ |
| Mouse BD Fc Block | BD | 553142 | \ |
| cell filters | BD-Falcon | 352350 | 70 µm |
| routine blood tube | BD-Vacutainer | 365974 | 2 mL |
| Kaluza | Beckman | vs 1.5 | |
| 6-well plates | Corning | 3516 | \ |
| Foxp3 Fix/Perm kit | ebioscience | 00-5523-00 | \ |
| UltraComp eBeads | ebioscience | 01-2222-42 | \ |
| Centrifuge | eppendorf | 5810R,5920R | \ |
| FlowJo software | FlowJo LLC | \ | vs 10.0 |
| PBS | Hyclone | SH30256.01 | 50 mL |
| RPMI 1640 | Hyclone | SH30809.01 | \ |
| Disposable, sterile scalpels | Jin zhong | J12100 | 11# |
| knife handle | Jin zhong | J11010 | \ |
| eye scissors and tweezers | Jin zhong | Y00030 | Eye scissors 10 cm |
| eye scissors and tweezers | Jin zhong | JD1060 | Eye tweezers 10 cm with teeth |
| Portable liquid nitrogen tank | Jinfeng | YDS-175-216 | \ |
| Electronic balance | Metter Toledo | AL204 | 0-100 g |
| Miltenyi C-tubes | Miltenyi | 130-096-334 | \ |
| Miltenyi Gentle MACS with heater blocks | Miltenyi | 120-018-306 | \ |
| Tumor Dissociation Kit | Miltenyi | 130-096-730 | \ |
| Cell counter | Nexcelom | Cellometer | Cellometer Auto T4 |
| cryopreservation tube | Nunc | 375418 | 1.8 mL |
| Cultrex High Protein Concentration (HC20+) BME | PathClear | 3442-005-01 | \ |
| syringes | Shanghai MIWA medical industry | \ | 1-5 mL |
| Studylog software | Studylog | \ | software |
| Studylog-Balance and supporting USB | OHAUS | SE601F | Balance and supporting USB |
| Studylog-Data line of vernier calipers | Sylvac | 926.6721 | Data line of vernier calipers |
| Caliper | Sylvac | 910.1502.10 | Sylvac S-Cal pro |
| Sterilized centrifuge tubes | Thermo | 339653 | 50 mL |
| Sterilized centrifuge tubes | Thermo | 339651 | 15 mL |
| Ice bucket | Thermo | KLCS-288 | 4 °C |
| Ice bucket | Thermo | PLF-276 | -20 °C |
| Ice bucket | Thermo | DW-862626 | -80 °C |
| RNAlater | Thermo | am7021 | \ |
References
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