Summary
Die Versuchsdurchführung auf die Immunphänotypisierung der murinen orthotopen PDAC Homografts bezweckt die Profilierung der Tumor Immuno-Mikroumgebung. Tumoren sind Orthotopically über Operation implantiert. Tumoren von 200 – 600 mm3 in der Größe wurden geerntet und distanzierte um einzellige Suspensionen, gefolgt von Multi-immun FACS Markeranalyse mit verschiedenen fluoreszent-markierten Antikörpern vorzubereiten.
Abstract
Homograft (Phänomen) Tumoren sind das "Arbeitspferd" der heutigen Immuno-Onkologie (e/a) präklinischen Forschung. Der Tumor Mikroumgebung (TME), besonders seine immun-Komponenten ist entscheidend für die Prognose und Vorhersage der Behandlungsergebnisse, insbesondere der Immuntherapie. TME immun-Komponenten bestehen aus verschiedenen Untergruppen von Tumor infiltriert Immunzellen bewertbar durch mehrfarbige FACS. Duktales Pankreaskarzinom (PDAC) zählt zu den tödlichsten Malignances fehlen gute Behandlungsmöglichkeiten, so eine dringende und ungedeckten medizinischen Bedarf. Ein wichtiger Grund für seine nicht-Reaktion auf verschiedene Therapien (Chemo-, gezielte, I/O) wurde seine reichlich TME, bestehend aus Fibroblasten und Leukozyten, die Tumorzellen von den Therapien zu schützen. Orthotopically implantierten PDAC geglaubt wird, um mehr genau zurückzuerobern TME der menschlichen pankreaskarzinome als herkömmliche subkutaner (SC) Modelle.
Homograft Tumoren (KPC) sind Transplantationen von Maus spontane PDAC aus gentechnisch KPC-Mäuse (K-RasG12D / +/P53- / -/Pdx1-Cre) (KPC-GEMM). Der primäre Tumor-Gewebe ist schneiden Sie in kleine Fragmente (~ 2 mm3) und subkutan transplantiert (SC) an das Phänomen Empfänger (C57BL/6, 7 – 9 Wochen alt). Die Homografts wurden dann chirurgisch Orthotopically verpflanzt auf die Bauchspeicheldrüse von neuen C57BL/6 Mäusen zusammen mit SC-Implantation, die Tumor-Volumen von 300-1.000 mm3 von 17 Tagen erreicht. Nur Tumoren von 400 – 600 mm3 wurden gemäß dem genehmigten Autopsie Verfahren geerntet und gereinigt, um die angrenzenden keinen Tumor-Gewebe zu entfernen. Sie wurden getrennt pro Protokoll mit einem Gewebe Dissociator in einzellige Suspensionen, gefolgt von Färbungen mit dafür vorgesehenen Platten von eindringmittel-markierten Antikörpern für verschiedene Marker von verschiedenen Immunzellen (lymphoide, myeloischen und NK, DCs). Die gefärbten Proben wurden analysiert mit multi-Color FACS um Zahlen von Immunzellen der verschiedenen Linien, sowie ihr relativer Anteil innerhalb von Tumoren zu bestimmen. Die immun Profile der orthotopen Tumoren wurden dann mit den SC Tumoren verglichen. Die vorläufigen Daten bewiesen deutlich erhöhten eindringende TILs/TAMs in Tumoren in der Bauchspeicheldrüse und höhere B-Zell-Infiltration in Orthotopic anstatt SC Tumoren.
Introduction
Duktales Pankreaskarzinom (PDAC) bewirkt, dass fast eine halbe million Todesfälle weltweit jährlich eines der Top-5-Krebs-Killer. Es gibt einige wirksame Behandlungsmöglichkeiten und keine zugelassenen Immuntherapien; neue Behandlungen sind daher dringend erforderlich. Krebserkrankungen werden zunehmend als immunologische Erkrankungen, einschließlich PDAC, zusätzlich zu den Erbkrankheiten, wie heute bekannt anerkannt wird. Immunologische und genetische Faktoren würde wahrscheinlich feststellen, Prognose sowie Behandlung Ergebnisse. Tumoren Host immunüberwachung umgehen und schließlich vorrücken, um zum Tod führen. Viele dieser immun Prozesse treten innerhalb der Tumor Mikroumgebung (TME)1,2,3,4 wo verschiedene Arten von Immunzellen zu interagieren, mit Tumorzellen, miteinander und mit anderen tumor Stromazellen Komponenten direkt oder indirekt über Zytokine die Krankheit Ergebnis letztlich zu bestimmen. Charakterisierung der Tumor immun Komponenten des TME oder Tumor Immunphänotypisierung, einschließlich Subtypisierung, Nummerierung und Lokalisierung von verschiedenen Linien von Immunzellen, ist daher entscheidend für Anti-Tumor Immunität zu verstehen. Im Falle der PDAC, es wurde vorgeschlagen, die erhöhte Tumor infiltrieren suppressive Makrophagen (TAM) und B-Zellen zur Vermeidung von T-Zell-Infiltration und/oder Aktivierung und ein hohes Maß von Fibrose5,6geführt haben.
Das gemeinsame Konzept zu immun TMEs experimentell untersucht Surrogat Tumor präklinischen Tiermodellen verwenden würden, vor allem relevanten Maus Tumor Modelle7, besonders Maus Phänomen (Homograft) oder gentechnisch veränderte Mausmodelle (GEMM) Krebserkrankungen, auf die vermeintlichen Ähnlichkeit von Maus und Mensch für Tumoren und Immunität8,9. Es ist in Wirklichkeit verstanden, dass es angeborene Unterschiede zwischen den beiden Arten10,11.
Transplantierten Maus Tumoren haben erhebliche betriebliche Vorteile gegenüber spontanen Tumoren7, nämlich synchronisierte Tumorentwicklung, im Gegensatz zu den elterlichen GEMM spontane Tumorentwicklung. Bestätigung der spontanen murinen Tumoren gelten Primärtumoren gewesen nie manipuliert, in Vitround Spiegelung original Maus Tumor Histo- / Molekulare Pathologie7sowie möglichen immun Profile. Diese murinen Homografts gelten oft als "eine Maus Version des Patienten abgeleitet Xenotransplantate (PDXs)". Sie haben daher wahrscheinlich eine bessere Übersetzbarkeit als konventionelle Phänomen Zelle Linie abgeleitet Maus Tumoren12. Vor allem sind viele Homografts abgeleitet spezifische GEMM bestimmte menschliche Krankheitsmechanismen, z. B. Onkogenen Fahrer Mutationen sind so konstruiert, wobei diese Bestätigung sollte daher Vorteile auf ihre klinische Relevanz haben. Insbesondere entwickeln die KPC GEMM Maus PDAC innerhalb von 15 – 20 Wochen alt, die morphologisch rekapituliert menschlichen Erkrankungen mit überwiegend gut bis mäßig-differenzierten glandulären Architektur und hochangereichertes Stroma. Dieses Modell rekapituliert auch die häufigsten genetischen Eigenschaften der menschlichen PDAC, nämlich Kras aktivierende Mutation und P53 Verlust der Funktion, die in 90 % und 75 % der menschlichen PDAC, jeweils5,6auftreten.
Standorte der Transplantation sind auch vorgeschlagen worden, eine Rolle im Modell Übersetzbarkeit. Die spezifische Gewebe Umgebung, wie z. B. eine entsprechende orthotopen Umgebung könnte eine Nische für bestimmte Tumoren, Fortschritt, im Gegensatz zu der einheitlichen subkutaner (SC) Umgebungen für die häufigsten transplantierten Tumoren. Es wäre von besonderem Interesse wird bzw. was für einen Unterschied zwischen den beiden Standorten der Transplantation, in Bezug auf die immun-Mikroumgebung und die Relevanz für Krebserkrankungen, z.B.existiert. im Falle der PDAC.
Einer der wichtigsten Aspekte der immun Profilierung oder Immunphänotypisierung, soll Tumor infiltrieren Immunzellen der verschiedenen Linien, Nummern, relative Anteil innerhalb von Tumoren, sowie ihren Aktivierungsstatus und Standorte bestimmen. Dazu gehören Tumor-Infiltratrating Lymphoctyes (TILs, T- und B-), Tumor infiltrieren Makrophagen (TAMs), Tumor infiltrieren natürlichen Killer-Zellen (NKs) und Tumor-Resident dendritischen Zellen3,13,14 , 15 , 16 , 17und die subzelluläre Lokalisation von bestimmten Zellen18,19,20, etc.. Fluoreszenz aktiviert Zelle Sortieren (FACS) oder Flow Cytometry ist eine einzellige Detection-Technologie, die häufig verwendet wird, um die spezifischen Parameter einer Zelle messen. Multi-Color flow Cytometry Maßnahmen mehrere Markierungen auf eine einzelne Zelle3,4,21 und ist die am häufigsten verwendete Methode zur Bestimmung der Zahlen und relativen Prozentsatz von verschiedenen Untergruppen von Immunzellen, auch innerhalb der Tumoren.
Dieser Bericht beschreibt die Verfahren für die Profilerstellung Tumor infiltrieren Immunzellen: 1) Implantation des orthotopen PDAC Maus Tumor Homografts, zusammen mit SC Implantation; (2) Tumor Gewebe Ernte und Vorbereitung der Einzelzelle über Tumor Dissoziation; (3) Flow Cytometry Analyse aller von den Zellen von Tumoren als Basislinie abgeleitet; (4) Vergleich der Baseline profile beider Transplantation Ansätze.
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Protocol
Alle Protokolle und Zusatzvereinbarungen oder Verfahren, die die Pflege und Verwendung von Tieren werden überprüft und genehmigt durch die Krone Bioscience Tier Heimen und verwenden Committee (IACUC) vor der Durchführung von Studien. Die Pflege und Verwendung von Tieren in der Regel nach internationalen Richtlinien AAALAC (Verein zur Prüfung und Akkreditierung of Laboratory Animal Care) erfolgt wie in der Anleitung für die Pflege und Verwendung von Labortieren, National Research berichtet Rat (2011). Alle tierische experimentelle Verfahren werden unter sterilen Bedingungen in SPF (spezifisch Pathogen-freies) Einrichtungen und unter strikter Einhaltung der Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren von unterschiedlichen staatlichen Institutionen (z.B. durchgeführt Die National Institutes of Health). Das Protokoll des Ausschusses für die Ethik von Tierversuchen an der Anlage Institution genehmigt werden müssen (z. B. institutionelle IACUC Ausschuß).
1. Vorbereitung für die Tumor-Transplantation
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Unterbringung von Tieren
- Erhalten Sie generische C57BL/6 Mäusen von einem kommerziellen Zucht-Anbieter.
- Hausmäuse (5) in einzelnen belüftete Käfige zu folgenden Bedingungen: Temperatur: 20 – 26 ° C; Luftfeuchtigkeit 30 – 70 %; Beleuchtung-Zyklus: 12 h hell und dunkel 12 h.
- Verwendung Corn Cob d. h. Bettwäsche wöchentlich gewechselt.
- Bieten Sie für Ernährung Bestrahlung sterilisiert trockenes Granulat Essen während des gesamten Studiums.
- Bieten Sie für Wasser Tiere freien Zugang zu sterilen Trinkwasser.
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Spender Tumor Fragment Vorbereitung
- Beginnen Sie durch die Überwachung des Körpergewichts (BW), über wiegen, mit einem Gleichgewicht und Tumorvolumen (TV), durch Messung der Bremssattel, der Spender Tumor-tragenden Mäusen.
- Wenn TV 500 – 1.200 mm3erreicht, einschläfern des Tieres in einem Biohazard Abzug gemäss Protokoll.
- Desinfizieren Sie die Haut um den Tumor mit jodophor Tupfer.
- Den Tumor chirurgisch zu entfernen (in Abschnitt 3 beschriebenen Details: Sektions- und Tumor Ernte) und den Tumor in einer Petrischale mit 20 mL PBS (Pre-chill die Medien oder Puffer auf 4 ° C vor euthanizing Tiere).
- Wenn es kontaminierenden Blut, den Tumor in einer anderen Petrischale zu übertragen und den Tumor mit PBS waschen.
- Halbierung des Tumors, überschüssige Haut, Gefäße, Verkalkung und/oder Nekrosen entfernen.
- Wählen Sie nur intakte Teile des Tumors und legen Sie sie in einen sterilen 50 mL Zentrifugenröhrchen und fügen Sie 20 mL PBS dann transportieren Sie den Schlauch auf ein Tier Extrazimmer für pharmakologischen Studien zu.
(2) Orthotopen und Engraftment subkutanen (SC)
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SC-Impfung
- Zuschnitte Tumoren in 2 mm Durchmesser mit einem Skalpell, 1 Stück in jeder Trokar für die SC-Implantation oder zur späteren orthotopen Implantation (siehe unten).
- Betäuben Sie die Empfänger Tier mit 5 % Isofluran, der von einer bugnase bei 1 % gepflegt wird. Das Tier wird beginnen zu entspannen, ihre aufrichtenden Reflex zu verlieren und schließlich unbeweglich geworden. In dieser Tiefe der Narkose können sie leicht durch schmerzhafte Reize geweckt werden; lassen Sie Anästhesie, zu vertiefen, bis solche Reaktionen auf Schmerz fehlen.
- Sobald betäubt, befestigen Sie die Mäuse auf einem Experiment Board in der rechten Seitenlage. Sterilisieren Sie die Maus über jodophor Tupfer, insbesondere der Umgebung der Tumoren.
- Machen Sie mit einem Skalpell einen Hautschnitt von 0,5 bis 1,0 cm auf der linken Flanke, nur cranial bis zur Hüfte.
- Tunnel unter der Haut in Richtung der vordergliedmaße, zwei bis drei Zentimeter, mit stumpfen Pinzette.
- Aseptisch einen Würfel des Tumors vom Medium und tief im Inneren des subkutanen Tunnels.
- Bestätigen Sie visuell, dass der Tumor tief im Tunnel (und nicht bei der hautinzision).
- Schließen Sie die Wunde mit Wunde Clips.
- Die Tiere Post Impfung zu überwachen, bis sie ausreichend Bewusstsein um sternale Recumbence beizubehalten wiederhergestellt. Tiere nur nach ihre vollständige Genesung aus der Narkose zurück in ihren Käfig zurück. Vervollständigen Sie das Anästhesie-Protokoll, und initiieren Sie das Tier-Gesundheit-Diagramm zu. Wiegen Sie Empfänger Tiere täglich für drei Tage
- Impfen Sie für ein Standardverfahren 5-10 Mäuse pro Gruppe für die Überwachung der Tumor Wachstum.
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Pankreas orthotopen implantation
- Anästhesie und Analgesie
- Verwenden Sie eine 2 mL Ketamin Injektion und 0,42 mL Xylazin Injektion (20 mg/mL) vermischt in 5,91 sterile Spritze Wasser oder Kochsalzlösung in ein Dosis-Volumen von 0,06-0,1 mL/20-25 g Körpergewicht.
Hinweis: Nach Tierschutz, Analgesie ist notwendig beide Pre und post-Vorgang. 0,05-0,1 mg Buprenorphin schnitzelfleisch, SC. Die erste Dosis ist Pre-Vorgang und dann dosiert 3 mal alle 4 Stunden Post-Vorgang immer wieder.
- Verwenden Sie eine 2 mL Ketamin Injektion und 0,42 mL Xylazin Injektion (20 mg/mL) vermischt in 5,91 sterile Spritze Wasser oder Kochsalzlösung in ein Dosis-Volumen von 0,06-0,1 mL/20-25 g Körpergewicht.
- Chirurgischer Eingriff zur orthotopen implantation
- Mäuse über intramuskuläre Injektion (IM) pro Schritt 2.2.1 zu betäuben.
- Nachdem die Tiere vollständig betäubt sind, befestigen Sie die Mäuse auf ein Experiment-Board in der rechten Seitenlage.
- Halten Sie die Mäuse in der rechten Seitenlage. Desinfizieren Sie die Haut um die Milz mit Jod dann de iodinate mit 75 % Äthylalkohol.
- Finden Sie den mittlere Punkt der Milz zu und machen Sie einen vertikalen Schnitt 1 cm am Bauch, Milz verfügbar zu machen.
- Ein Teil des Gewebes der Bauchspeicheldrüse unter der Milz sanft mit Flat-Tip Pinzette herausziehen, und Naht ein Maus Homograft Tumor Stück aus Samen Maus auf die Bauchspeicheldrüse des Empfängers Maus von 9-0 resorbierbaren chirurgischen Naht.
- Schließen Sie den Bauch mit einer 6-0 Seide Naht von doppelten Naht. Homöostase durch Kompression zu erreichen.
- Nach der Veredelung Tumor Implantation tritt weder Blutungen noch Tumor Gewebe austreten, halten Sie die Tiere in einem warmen Käfig.
- Überwachen Sie das Tier, bis es ausreichend Bewusstsein zur Aufrechterhaltung der sternalen liegen wiedererlangt; das Tier in den tierraum nach vollständiger Genesung aus der Narkose zurück. Überwachen des Tumors mit Mäusen durch Abtasten des Bauches in der Nähe der Milz und wählen Sie sich die Mäuse mit orthotopen Tumoren.
- Anästhesie und Analgesie
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Tumor-tragenden Mäusen Gesundheit Überwachung
- Überprüfen Sie den Verbrauch von Wasser und Nahrung täglich.
- Überprüfen der Maus Auftritt für ein ungepflegt Fell, Klumpen, Schlankheit, abnorme Atem oder Aszites.
- Ertasten Sie den Bauch zu überprüfen, ob es spontane Tumoren in der Leber oder Milz gibt.
- Wiegen Sie Mäuse, die wöchentlich mit einer Waage.
- Wenn eines der folgenden klinischen Anzeichen zu beobachten sind, werden die Mäuse für Probenentnahme und Autopsie geopfert: BW Verlust > 20 %; beeinträchtigte Mobilität (nicht in der Lage zu essen oder zu trinken); nicht normalerweise durch erhebliche Aszites und erweiterten Bauch bewegen; Aufwand in der Atmung.
(3) Autopsie und Tumor-Ernte
- Überprüfen Sie optisch und durch Abtasten auf das Vorhandensein von tastbaren Tumoren vor Kündigung.
- Für die Kündigung zuerst einschläfern Mäuse nach genehmigten Prüfplan und öffnen den Bauch und visuell prüfen für Tumoren die Bauchspeicheldrüse.
- Schneiden Sie den Tumor chirurgisch Post mortal und kaltem PBS hinzufügen. Legen Sie alle Tiere in eine saubere, ungeladenen, transluzente Euthanasie Kammer mit einem speziellen Deckel mit einem Anschluss für die Lieferung des Kohlendioxids verwendet werden.
- Entladen Sie Gas in die Kammer mit einer Durchflussrate, die schnelle Bewusstlosigkeit mit minimalen Stress für das Tier produziert. Die optimale Durchflussmenge für CO2 sollte ca. 2 – 2,5 L/min sein.
- Beobachten Sie visuell jedes Tier bei der Euthanasie zu versichern, dass alle Tiere erhalten angemessene Gaskonzentrationen und tanken Bewusstsein nicht während des Verfahrens einschläfern.
- Pflegen Gasstrom für mindestens 1 min nach offensichtlichen klinischen Tod die Möglichkeit zu minimieren, die ein Tier erholen kann (wenn Apnoe aber nicht tot).
- Neben nicht-Tumor-Gewebe zu entfernen. Gereinigte Tumor kann schnell fotografiert werden.
Setzen Sie die Tumorgewebe in RPMI-1640 und halten auf dem Eis vor Dissoziation.
Hinweis: Tierkörper sind eingesackt und gespeichert in den entsprechenden Gefrierschrank auf Entfernung zu warten.
(4) Tumor Gewebe Dissoziation und einzelne Zelle Vorbereitung
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Reagenz-Vorbereitung
Hinweis: Der Tumor Dissoziation Bausatz besteht aus 2 Fläschchen Enzym d (lyophilisierte Pulver), 1 Fläschchen Enzym R (lyophilisierte Pulver), 1 Fläschchen Enzym A (lyophilisierte Pulver) und 1 mL des Puffers A.- Bereiten Sie Enzym D durch Neuaufbau des lyophilisierten Pulvers in jedes Fläschchen mit 3 mL RPMI-1640. Bereiten Sie Aliquote von einem entsprechenden Volumen, wiederholte Frost-Tau-Zyklen zu vermeiden.
- Bereiten Sie Enzym-R durch Neuaufbau der gefriergetrockneten Pulvers im Fläschchen mit 2,7 mL RPMI 1640 vor. Bereiten Sie Aliquote von einem entsprechenden Volumen, wiederholte Frost-Tau-Zyklen zu vermeiden.
- Bereiten Sie Enzym A durch Neuaufbau des lyophilisierten Pulvers in der Ampulle mit 1 mL Puffer A mit dem Kit geliefert. Tun Sie nicht Wirbel. Bereiten Sie Aliquote von einem entsprechenden Volumen, wiederholte frei-tau-Zyklen zu vermeiden.
- Bereiten Sie die Enzym-Mix durch Zugabe von 2,35 mL RPMI-1640, 100 µL Enzym D, 50 µL Enzym R und 12,5 µL Enzym a in jeder GentleMACS C-Schlauch.
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Tumor-Dissoziation
- Für jeden Tumor bereiten Sie einem C-Rohr mit Tumor-Verdauung-Mix, finden Sie in Abschnitt 4.1 für Verdauung Puffer Verdünnung und Vorbereitung.
- Verwendung 3 mL Verdauung Puffer für Tumor Fragmente < 0,8 g, und stellen Sie sicher, der Tumor vollständig verdaut.
- Mit der Studie Code, Tumor, Maus-ID, Behandlungsgruppe und tumorgewicht kennzeichnen.
- Sammeln Sie den Tumor von der Maus zu, waschen Sie den Tumor in kaltem PBS und reinigen Sie das Gewebe auf den Tumor (z. B. Blutgefäße, Fett, Faszie, etc.) befestigt.
- Setzen Sie den Tumor in Verdauung Medien in einen Brunnen von einem sterilen 6-well-Platte.
- Halten Sie den Tumor mit der sterilen Pinzette/Pinzette und Scheibe mit einem Skalpell. Schneiden Sie den Tumor gut genug, um in kleinere Stücke (~ 1 mm3) zu brechen.
- Legen Sie die Tumor-Stücke wieder in den C-Schlauch und den restlichen Verdauung Puffer waschen der Plattenrandes und übertragen dann die Flüssigkeit in den C-Schlauch, der bis Verdauung auf Eis gelegt wird.
- Schalten Sie die Dissociator mit Heizungen.
- Platzieren Sie Tumor Dissoziation C-Rohre kopfüber in die Ärmel der vakanten Stellen zu, und passen Sie den Status der Röhre Positionen von kostenlos bis ausgewählt. Wählen Sie eine Dissoziation-Programm (37_c_m_TDK_1), gefolgt von der Auswahl des Ordners erforderlich, wo die Liste der Programme angezeigt wird.
- Ausziehen Sie C-Rohre nach Beendigung des Programms die Dissociator und Spin kurz (300 X g, 4 ° C), um die Probe pellet.
- Wieder auszusetzen Sie Proben und in eine Zelle Sieb über eine 50 mL-Tube. Waschen Sie die Zellen durch die Zelle Sieb mit 10 mL Waschpuffer, eine einzellige Suspension bereitzustellen.
- Die Rohre bei 300 X g für 5 min zentrifugieren, überstand verwerfen und erneut aussetzen der Zellen mit 5 mL Waschpuffer, Anzahl vitaler Zellen verwenden Trypan blau und/oder durch Zelle Zähler und passen Sie die Zelle Concentraton, 1 x 106 Zellen pro Röhre oder pro Probe. Gehören Sie die richtigen Isotype Kontrolle Antikörper um sicherzustellen, dass Beflecken spezifisch ist
(5) immun Panel-Design und Flow-Datenerfassung
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Panel-design
- Bitte siehe Tabelle 1.
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Immunostaining
- FC-Block-Sample-Zellen: Zellen in 200 µL Puffer mit 1 µg/mL Fc-Block, gefolgt von Inkubation auf Eis oder 4 ° C Kälte für 15 min im Dunkeln Färbung wieder auszusetzen.
- Fleck-Zellen mit den gewünschten Antikörper/Fluoreszenz-Paneele (zB. T-Cell Panel, Makrophagen-Panel, etc..): Fügen Sie die Antikörper-Mischung verdünnt in Fc blockierende Puffer zu jeder Probe, Fleck für mindestens 30 min auf Eis im Dunkeln.
- Jedes Rohr 1 mL kaltem PBS Eis hinzufügen und erneut aussetzen der Zellen sanft, gefolgt von Zentrifugation bei 300 X g für 5 min. verwerfen der resultierende überstand.
- Wiederholen Sie, um die Zellen zweimal waschen.
- Fleck für intrazelluläre Marker bei Bedarf, Springen folgende Schritte 6-10, ansonsten mit Schritt 10 fort.
- Wieder aussetzen der Zelle Pellet durch Puls-Wirbel und 200 µL bereit Fixierung/Permeabilisierung funktionierende Lösung für jede Probe hinzufügen. Wirbel wieder Puls und dann bei 4 ° C inkubieren Übernachtung (bevorzugt) oder 30 min bei Raumtemperatur im Dunkeln.
- Spin-down der Zellen und den überstand zu entfernen.
- Waschen Sie zweimal durch Hinzufügen von 1 mL 1 x Permeabilisierung Puffer (hergestellt aus 10 x Permeabilisierung Puffer, verdünnt mit destilliertem H2O) gefolgt von Zentrifugieren und Dekantieren des Überstandes.
- Intrazelluläre Marker-Antikörper in 1 x Permeabilisierung Puffer hinzufügen und bei Zimmertemperatur 30 Minuten im Dunkeln inkubieren.
- Waschen Sie Zellen zweimal mit 1 mL 1 x Permeabilisierung Puffer. Zentrifugieren Sie und Dekantieren Sie überstand.
- Zellen in 150 µL Puffer Färbung aufschwemmen und auf eine Cytometer analysieren. Aufgrund der Fixierung und Permeabilisierung Verfahren, FSC (vorwärts-Light Scatter) / SSC (Seitenlicht Streuung) Verteilung der Zellpopulation werden verschiedene Zellen zu leben. Das Tor und Spannungen müssen daher geändert werden.
-
FMO-Steuerelemente (Fluorescence abzüglich einer Kontrolle)
Hinweis: Multi-Color Flow-Analyse ist besonders wichtig für die Analyse von Tumor infiltriert Immunzellen. Daher gibt es eine Notwendigkeit, einen Weg finden, zu identifizieren und gate-Zellen im Zusammenhang mit Daten, die durch mehrere Fluorochromes in einem bestimmten Bereich zu verbreiten. FMO (Fluoreszenz Minus eins) Kontrolle ist ein wichtiger Ansatz für diesen Zweck.- Zu diesem Zweck sind zusätzliche Mäuse in jeder Gruppe für FMO Steuerelemente (mindestens 2 pro Rx) und Prozess individuell für jedes Gewebe. Nach Dissoziation, Pool-Gewebe. Zum Beispiel in einer Studie mit 4 Rx-Gruppen, sollten 8 weitere Tumoren einzeln verarbeitet und dann gebündelt in einer Probe für RGV.
-
Flow-Instrument-Setup
- Machen Sie Entschädigung Perlen, während die Maschine erwärmt wird (mindestens 20 min).
- Verwenden Sie CS & T Perlen, um Leistung zu überprüfen.
- Einstellungen für Spannung und Entschädigung: UltraComp Perlen, Wirbel der Comp gründlich vor der Anwendung Perlen zu verwenden.
- Beschriften Sie eine separate 12 x 75 mm2 Probenröhrchen für jeden Fluorochrom konjugierten Antikörper.
- Fügen Sie 100 µL Puffer, um jedes Rohr Färbung. Jedes Rohr 1 volle Tropfen (ca. 60 µL) der Perlen hinzufügen.
- Fügen Sie Antikörper und führen Sie die Färbung genau so, wie die in Ziffer 4 genannten Beispielprozess.
- Zugeben Sie 0,5 mL Puffer, um völlig Wulst Pellets über Wirbel wieder auszusetzen Färbung.
- Eingestellte Flow Cytometer PMT Spannung pro Zielgewebe für die gegebenen Experiment.
- Durchflusszytometer für die Datenerfassung durch Anspritzung auf der Singulett-perlenpopulation pro FSC und SSC Lesungen durchlaufen.
- Eingestellte Durchflussmenge um 200 – 300 Veranstaltungen/s.
- Legen Sie eine angemessene Entschädigung für einen gegebenen Fluorescein [FITC]-konjugierten Antikörpern, Verwendung eine FL1 vs. FL2 Dot-Plot.
- Legen ein Quadrant Tor direkt damit negative Perlen im unteren linken Quadranten sind und positive Perlen sind in der oberen oder unteren Quadranten. Passen Sie die kompensationswerte bis mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) jede Bevölkerung (siehe Quadrant Statistik Fenster) ungefähr gleich ist (d.h. für FL2-% FL1, FL2 MFI von beiden Perlen sollte ähnlich sein).
- Wiederholen Sie die Schritte 5.4.11. und 5.4.12 für alle Rohre.
- Fahren Sie mit dem tatsächlichen Erwerb gefärbten Proben. Führen Sie den Ausgleich-Assistenten aus und speichern Sie die Einstellungen mit dem Format "Datum experimentieren Ihre Initialen".
6. die Bewegungsdaten Analyse und Präsentation
- Analysieren Sie Daten per Flowjo und/oder Kaluza.
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Representative Results
Orthotopen Implantation der PDAC führte zu schnelle Tumorwachstum ähnlich gesehen für die SC-Implantation. Nachdem die Spender Tumor Fragmente in Empfänger Mäuse implantiert wurden sowohl subkutan und Orthotopically gemäß den Protokollen beschrieben Schritte 2.1 und 2.2, die implantierten KPC Homograft Tumoren gezeigt ähnlich rasant wie in Abbildung 1A . KPC Homograft Tumoren zu unterschiedlichen Zeitpunkten geerntet sind in Abbildung 1 b und Vertreter H & E Bilder sind Abbildung 1angezeigt. Unsere Daten zeigten ein ähnliches Wachstum des SC und orthotopen Implantate.
Lebensfähigen Tumorzellen und Zellen in der TME, einschließlich Tumor infiltrieren Immunzellen aus entweder Orthotopic oder SC-Implantation, können effizient wiederhergestellt werden. Tumoren wurden geerntet und zur anschließenden FACS-Analyse mit einem kommerziellen Dissociator (Abbildung 2A) nach dem in Schritt 4 beschriebenen Protokoll einzelne Zellsuspensionen Vorbereitung verdaut. Wir erhalten in der Regel recht hoch tragfähige Zelle Erträge von tumorproben beider Arten der Implantation (~ 80 % Lebensfähigkeit basierend auf Trypan blau); der repräsentative FACS-Plot zeigt lebensfähige Zellen vom Tumor, getrennt von der toten Zellen/zellenrückstand (Abb. 2 b).
Tumor infiltriert Immunzellen von verschiedenen Untergruppen wurden im orthotopen und SC implantierten Tumoren, während ihre Profile Unterschiede haben identifiziert. Die einzigen Zellsuspension vorbereitet von Tumorgewebe mithilfe der in Schritt 4.2 beschriebenen Methode FACS Analyse nach der Färbung mit 16 farbpanel von Markern dargestellt in Tabelle 1, die verschiedene Linien von wichtigen Immunzellen als deckt ausgesetzt waren sowie von Tumorzellen. Die gating-Strategie oder immun Abstammung Hierarchie zusammen mit repräsentativen Fluss Grundstücke sind in Abbildung 3Adargestellt. CD45, ein Marker für alle Reifen Immunzellen diente unterscheiden Tumorzellen und Tumor infiltrieren Immunzellen. Alle immun Linien wurden anschließend von CD45 analysiert+ Populationen, wie durch das Panel (Tabelle 1) angezeigt.
Neben Marker, Zellengröße dient auch zu differenzieren (Abb. 3 b Links) unterschiedliche Subpopulationen Quantifizierung Zelle Teilmengen, einschließlich T, B-Lymphozyten, Makrophagen und MDSCs, etc.. Tumor immun Profilabgleich des SC vs. orthotopen Homografts der pankreaskarzinome zu infiltrieren. Die großen aufgezählten Zell-Populationen von mehreren wichtigen Teilmengen der Tumor infiltrieren Immunzellen werden Abbildung 3dargestellt. Die Daten zeigt deutlich, dass der Tumor Immunzelle Infiltration im Vergleich mit der Bauchspeicheldrüse von gesunden Mäusen signifikant gestiegen ist. Darüber hinaus wurden unterschiedliche Prozentsätze der Teilmenge der Tumor infiltrieren Immunzellen im orthotopen Vsgefunden. SC Homografts, z.B. deutlich mehr B-Zellen im orthotopen als SC
| Marker | Immun-Zell-Population |
| CD45 | Insgesamt Leukozyten |
| CD3 | Gesamt-T-Zellen |
| CD4 | CD4 + T-Helfer-Zellen |
| CD8 | CD8 + zytotoxischen T-Zellen |
| CD44 / CD62L * | Naiv, Speicher und Effektor-T-Zellen |
| CD69/CD44/OX40/CD25 etc.* | Aktivierungsmarker |
| CD4 + CD25 + FoxP3 + | Regulatorische T-Zellen |
| CD11b + Ly6c/Ly6g | G-MDSC und M-MDSC |
| CD11b + F4/80 | Makrophagen |
| IA/IE/CD206 | M1 und M2-Makrophagen |
| CD3-CD335 + | NK-Zellen |
| CD3 + CD335 + | NKT-Zellen |
| CD19 | B-Zellen |
| TNF-a/IFN-f/IL-7/IL-3 etc.* | Zytokine |
| PD-1/PD-L1/CTLA-4/TIM-3 etc.* | Checkpoint-Inhibitoren |
| Granzym B etc.* | Häufig angeforderte Marker |
| KI67/Brd U/PNCA etc. | Verbreitung |
| Lebenden/Toten (feststellbar) | Lebenden/Toten |
| * Hinweis: Weitere Marker können hinzugefügt werden, je nach Bedarf | |
Tabelle 1: 16-Farben-Flow Panels entwickelt für die Analyse von Tumor infiltriert Maus Immunzellen.
Abbildung 1: sowohl orthotopen und SC (SubQ) implantiert PDAC Homograft Tumoren bei C57BL/6 Mäusen zeigten ein ähnliches Wachstum mit oder ohne Behandlung Gemcitabin. (A) die Wachstumskurve: SC-Links und orthotopen-rechts. Blau: Fahrzeug; Gold: Gemcitabin (initiiert am 10. Tag Post Impfung als durchschnittliche Tumorvolumen SC 200 mm-3erreichten). (B) Tumorgewebe zu unterschiedlichen Zeitpunkten. (C) Vertreter H & E Färbung beider Arten von Homografts (40 x 10). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Tumor Gewebe Dissoziation, tragfähige einheitliche Zellsuspension vorzubereiten. (A) die Nutzung der Disassociator; (B) der lebensfähigen Zellen getrennt von abgestorbenen Zellen, dargestellt durch Flow-Analyse. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: multi-Color Flow-Analyse von Tumor infiltriert Immunzellen des orthotopen und SC PDAC Homografts. Die Rohdaten aus jede tumorprobe wurden aus dem Flow Cytometry Instrument, gefolgt von Analyse mit Flowjo FACS-Analyse-Software erworben. (A) die standard-gating-Strategie für die Analyse wird als ein Beispiel; (B) repräsentative gating und Analyse Bewegungsdaten mit der Standard-gating Strategie; (C) repräsentative Tumor infiltrieren immun Cellsare angezeigt, um Treg, B-Zellen und Makrophagen enthalten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Obwohl Studien mit SC Tumore leichter durchgeführt werden, können Orthotopically implantierten Tumoren Modelle potenziell relevanter für präklinische pharmakologischen Studien (besonders I/O Untersuchungen) sein, verbesserte Übersetzbarkeit versorgen. Dieser Bericht soll helfen das interessierte Leser/Publikum, dass man direkt die technischen Verfahren zu visualisieren, die in ihrer jeweiligen Forschung verwendet werden können. Unsere Protokolle zeigen, dass orthotopen Implantation der PDAC kann dazu führen, dass effiziente Tumorwachstum, ähnlich wie SC Implantation. Unsere Beobachtungen scheinen auch die Anwesenheit von verschiedenen immun Profile von TMEs aus verschiedenen Implantationen empfehlen. Die großen Herausforderungen orthotopen, im Vergleich zu SC Implantationen anzupassen sind, dass komplexe Fähigkeiten erforderlich sind, der Prozess ist zeitaufwendig, die chirurgische Eingriffe für die Implantation sind arbeitsintensiv und auch die Schwierigkeit bei der Überwachung der orthotopen tumor Wachstum im Leben.
Es gibt vier wichtige Schritte, um sicherzustellen, dass orthotopen Pankreas-Tumor Experimente erfolgreich durchgeführt werden: 1) den chirurgischen Eingriff der Implantation; (2) die sorgfältige und zeitnahe Überwachung der Tumorentwicklung; (3) die Bedeutung der Durchführung von Pre-Experiment überprüft zuerst mit dem Verfahren vertraut zu machen und bewerten die nehmen Rate und Tumor-Wachstum; (4) mit einzelnen Zellsuspensionen von dissoziierten Tumoren als eine alternative Engraftment Methode. Dieser Bericht Verfahren ist hilfreich für die Leser für die Forschung mit Hilfe dieser speziellen Methode sowie andere Pankreas orthotopen Modelle, und auch andere orthotopen Modelle mit Bauch-Eröffnung Chirurgie.
Flow Cytometry oder FACS ist derzeit das wichtigste Werkzeug um Immunoprofiling durchzuführen. Die Immunphänotypisierung von Tumoren durch FACS unterscheidet sich deutlich von derjenigen Zellen aus verschiedenen Organen, wie peripheren Blut, Milz, Lymphknoten und Knochenmark auf folgende Weise. Im Allgemeinen ist ein sehr kleiner Prozentsatz von Immunzellen in Tumoren (kleine Stichprobengröße) vorhanden. Die extreme Heterogenität von Tumoren und die geringe Anzahl von Immunzellen vorhanden machen sich erholenden tragfähige seltenere Immunzellen technisch anspruchsvoll, erfordert maßgeschneiderte Tumor Gewebe Dissoziation mit Maschinen. Beide vorherigen Punkte machen gleichzeitige Multi-Parameter-Messung mit multi-Color Durchflusszytometrie erforderlich. Multi-Color Flow erfordert komplexe Marker-Panel-Design, Entschädigung und gating Strategien durch Fluoreszenz spektrale Überlappung. Dieser Bericht versuchte auch, den Prozess der Tumor immun Profilierung über definierte Tumor Gewebe Dissoziation und multi-Color Flow Cytometry Analyse dem interessierten Leser/Publikum zu demonstrieren.
Drei wichtige Schritte könnten besonders wichtig sein, produktive TIL Analyse ergeben: Erstens eine hohe Ausbeute der lebensfähigen Zellen erholt dissoziiert Tumoren mit individuellen Tumor Dissoziation Verfahren; Zweitens, die optimierte Konstruktion des großen Multi-Color verfügbar Reagenzien Färbung Platten auf; Drittens, eine optimierte gating Strategie in der Analyse. Die Autoren weisen darauf hin das Training und die Erfahrungen der Betreiber der Datenerfassung und Analyse sind unerlässlich für die erfolgreiche Flow Cytometry Analyse von TIL.
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Disclosures
Alle Autoren sind aktuelle Vollzeit-Mitarbeiter von Krone Bioscience, Inc.
Acknowledgments
Die Autoren würden Dr. Jody Barbeau - Danke für das kritische lesen und Bearbeitung des Manuskripts und danken Ralph Manuel für die Gestaltung von Kunstwerken. Die Autoren möchten auch die Krone Bioscience Onkologie Immuno-Onkologie Biomarker Team und Onkologie In Vivo -Team, für ihre großen technischen Bemühungen danken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia machine | \ | SAS3119 | \ |
| Trocar 20 | \ | \ | 2 mm |
| Petri dish | \ | \ | 20 mm |
| 100x antibiotic and antimycotic | \ | \ | \ |
| Iodophor swabs | \ | \ | Daily pharmacy purchase |
| Alcohol swabs | \ | \ | Daily pharmacy purchase |
| Liquid nitrogen | Air chemical | \ | \ |
| Biosafety hood | AIRTECH | BSC-1300IIA2 | \ |
| FACS machine LSRFortessa X-20 | BD | LSR Fortessa | \ |
| antibodies | BD | \ | \ |
| Trevigen MD or BD Matrigel Basement Membrane Matrix High concentration | BD | 354248 | \ |
| FACS buffers | BD | 554656 | Mincing buffer |
| Brilliant Staining Buffer | BD | 563794 | \ |
| Mouse BD Fc Block | BD | 553142 | \ |
| cell filters | BD-Falcon | 352350 | 70 µm |
| routine blood tube | BD-Vacutainer | 365974 | 2 mL |
| Kaluza | Beckman | vs 1.5 | |
| 6-well plates | Corning | 3516 | \ |
| Foxp3 Fix/Perm kit | ebioscience | 00-5523-00 | \ |
| UltraComp eBeads | ebioscience | 01-2222-42 | \ |
| Centrifuge | eppendorf | 5810R,5920R | \ |
| FlowJo software | FlowJo LLC | \ | vs 10.0 |
| PBS | Hyclone | SH30256.01 | 50 mL |
| RPMI 1640 | Hyclone | SH30809.01 | \ |
| Disposable, sterile scalpels | Jin zhong | J12100 | 11# |
| knife handle | Jin zhong | J11010 | \ |
| eye scissors and tweezers | Jin zhong | Y00030 | Eye scissors 10 cm |
| eye scissors and tweezers | Jin zhong | JD1060 | Eye tweezers 10 cm with teeth |
| Portable liquid nitrogen tank | Jinfeng | YDS-175-216 | \ |
| Electronic balance | Metter Toledo | AL204 | 0-100 g |
| Miltenyi C-tubes | Miltenyi | 130-096-334 | \ |
| Miltenyi Gentle MACS with heater blocks | Miltenyi | 120-018-306 | \ |
| Tumor Dissociation Kit | Miltenyi | 130-096-730 | \ |
| Cell counter | Nexcelom | Cellometer | Cellometer Auto T4 |
| cryopreservation tube | Nunc | 375418 | 1.8 mL |
| Cultrex High Protein Concentration (HC20+) BME | PathClear | 3442-005-01 | \ |
| syringes | Shanghai MIWA medical industry | \ | 1-5 mL |
| Studylog software | Studylog | \ | software |
| Studylog-Balance and supporting USB | OHAUS | SE601F | Balance and supporting USB |
| Studylog-Data line of vernier calipers | Sylvac | 926.6721 | Data line of vernier calipers |
| Caliper | Sylvac | 910.1502.10 | Sylvac S-Cal pro |
| Sterilized centrifuge tubes | Thermo | 339653 | 50 mL |
| Sterilized centrifuge tubes | Thermo | 339651 | 15 mL |
| Ice bucket | Thermo | KLCS-288 | 4 °C |
| Ice bucket | Thermo | PLF-276 | -20 °C |
| Ice bucket | Thermo | DW-862626 | -80 °C |
| RNAlater | Thermo | am7021 | \ |
References
- Chevrier, S., et al. An Immune Atlas of Clear Cell Renal Cell Carcinoma. Cell. 169 (4), 736-749 (2017).
- Wargo, J. A., Reddy, S. M., Reuben, A., Sharma, P. Monitoring immune responses in the tumor microenvironment. Curr. Opin. Immunol. 41, 23-31 (2016).
- Mosely, S. I., et al. Rational Selection of Syngeneic Preclinical Tumor Models for Immunotherapeutic Drug Discovery. Cancer Immunol. Res. 5 (1), 29-41 (2017).
- Rühle, P. F., Fietkau, R., Gaipl, U. S., Frey, B. Development of a Modular Assay for Detailed Immunophenotyping of Peripheral Human Whole Blood Samples by Multicolor Flow Cytometry. Int. J. Mol. Sci. 17 (8), e1316 (2016).
- Jiang, H., et al. Targeting focal adhesion kinase renders pancreatic cancers responsive to checkpoint immunotherapy. Nat. Med. 22 (8), 851-860 (2016).
- Gunderson, A. J., et al. Bruton Tyrosine Kinase-Dependent Immune Cell Cross-talk Drives Pancreas Cancer. Cancer Discov. 6 (3), 270-285 (2016).
- Li, Q. X., Feuer, G., Ouyang, X., An, X. Experimental animal modeling for immuno-oncology. Pharmacol. Ther. 17, 34-46 (2017).
- Takao, K., Miyakawa, T. Genomic responses in mouse models greatly mimic human inflammatory diseases. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 112 (4), 1167-1172 (2015).
- Payne, K. J., Crooks, G. M. Immune-cell lineage commitment: translation from mice to humans. Immunity. 26 (6), 674-677 (2007).
- Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. J. Immunol. 172 (5), 2731-2738 (2004).
- von Herrath, M. G., Nepom, G. T. Lost in translation: barriers to implementing clinical immunotherapeutics for autoimmunity. J. Exp. Med. 202 (9), 1159-1162 (2005).
- Talmadge, J. E., Singh, R. K., Fidler, I. J., Raz, A. Murine models to evaluate novel and conventional therapeutic strategies for cancer. Am. J. Pathol. 170 (3), 793-804 (2007).
- Erdag, G., et al. Immunotype and immunohistologic characteristics of tumor-infiltrating immune cells are associated with clinical outcome in metastatic melanoma. Cancer Res. 72 (5), 1070-1080 (2012).
- Gutiérrez-Garcia, G., et al. Gene-expression profiling and not immunophenotypic algorithms predicts prognosis in patients with diffuse large B-cell lymphoma treated with immunochemotherapy. Blood. 117 (18), 4836-4843 (2011).
- Paiva, B., et al. PD-L1/PD-1 presence in the tumor microenvironment and activity of PD-1 blockade in multiple myeloma. Leukemia. 29 (10), 2110-2113 (2015).
- Youn, J. I., Collazo, M., Shalova, I. N., Biswas, S. K., Gabrilovich, D. I. Characterization of the nature of granulocytic myeloid-derived suppressor cells in tumor-bearing mice. J. Leukoc. Biol. 91 (1), 167-181 (2012).
- Lavin, Y., et al. Innate Immune Landscape in Early Lung Adenocarcinoma by Paired Single-Cell Analyses. Cell. 169 (4), 750-765 (2017).
- Mahoney, K. M., et al. PD-L1 Antibodies to Its Cytoplasmic Domain Most Clearly Delineate Cell Membranes in Immunohistochemical Staining of Tumor Cells. Cancer Immunol. Res. 3 (12), 1308-1315 (2015).
- Yamaki, S., Yanagimoto, H., Tsuta, K., Ryota, H., Kon, M. PD-L1 expression in pancreatic ductal adenocarcinoma is a poor prognostic factor in patients with high CD8+ tumor-infiltrating lymphocytes: highly sensitive detection using phosphor-integrated dot staining. Int. J. Clin. Oncol. 22 (4), 726-733 (2017).
- Jiang, Y., et al. ImmunoScore Signature: A Prognostic and Predictive Tool in Gastric Cancer. Ann. Surg. , (2016).
- Ribas, A., et al. PD-1 Blockade Expands Intratumoral Memory T Cells. Cancer Immunol. Res. 4 (3), 194-203 (2016).
