Summary
Disponibilità di SCs somatiche è fondamentale per la medicina rigenerativa, modellazione di malattia e per ottenere informazioni sulle proprietà di SC. Qui presentiamo strategie sperimentali per riprogrammare, in vitro, differenziato cellule adulte nelle loro cellule tessuto-specifici espandibile staminali/progenitrici corrispondente dall'espressione transitoria co-dell'attivatore trascrizionale unico YAP.
Abstract
Qui presentiamo protocolli per isolare cellule differenziate primarie e girare che li in cellule staminali/progenitrici (SCs) della stessa stirpe di espressione transitoria del fattore di trascrizione YAP. Con questo metodo, Luminale cellule differenziate di (LD) della ghiandola mammaria del mouse vengono convertite in cellule che esibiscono proprietà molecolari e funzionali di mammaria SCs. YAP inoltre si trasforma completamente differenziato pancreatica esocrina cellule nel pancreas condotto-come progenitori. Allo stesso modo, al SCs endogeno, naturale, YAP-indotta di cellule staminali-simili ("ySCs") possono essere alla fine ampliate come organoid colture a lungo termine in vitro, senza ulteriore bisogno di ectopico YAP/TAZ, come ySCs sono dotati di uno stato ereditabile autorinnovabile SC.
La procedura di riprogrammazione qui presentata offre la possibilità di generare ed espandere in vitro cellule progenitrici delle varie fonti di tessuto a partire da cellule differenziate. La semplice espansione di cellule somatiche ex vivo ha implicazioni per la medicina rigenerativa, per comprendere i meccanismi dell'inizio del tumore e, più in generale, per cellulare e gli studi di biologia dello sviluppo.
Introduction
Le cellule staminali somatiche tessuto-specifici (SCs) sono critiche per la riparazione e rinnovamento tissutale dopo la ferita. La possibilità di isolare facilmente e illimitatamente espandere ex vivo somatico SCs rappresenta un problema critico per potenziali terapie rigenerative, nonché per applicazioni di SC in ricerca di base e modellazione di malattia. Progressi in questa direzione, tuttavia, sono stato limitato dalla difficoltà di acquisire lo stato di SC di vari organi epiteliali in vitro. Infatti, nei diversi tessuti adulti residenti SCs può non esiste, o non essere prontamente disponibili, o loro numero e del potenziale rigenerativo può essere eroso dalle condizioni di invecchiamento o di malattia. Nel 2016, abbiamo iniziato a colmare questa lacuna segnalando che l'espressione di un singolo coactivator transcriptional, YAP (YES-associated protein) o sue proteine strettamente correlate TAZ (attivatore trascrizionale con un motivo PDZ), nelle cellule terminalmente differenziate in modo efficiente crea popolazioni di cellule funzionali, espandibile, non tumorigeniche, autologo che sono funzionalmente e molecolarmente indistinguibili da loro corrispondente tessuto-specifici SCs1. Un impulso di sostenuta YAP o attività TAZ per pochi giorni è sufficiente per indurre la comparsa di autorinnovanti SCs somatiche. Si tratta di una condizione stabile che non è più dipendente da espressione del transgene continuo, come esso può essere trasmesso attraverso generazioni di cellulari senza ulteriore espressione ectopica YAP/TAZ1. Il protocollo presentato qui dettagli la procedura utilizzata per generare cellule staminali/progenitrici epiteliali de novo del ghiandola mammaria e del pancreas, a partire da cellule differenziate di questi tessuti. Questa procedura si riempie una scatola nera nell'arena riprogrammazione/transdifferenziazione corrente. Gli sforzi principali in queste direzioni hanno infatti finora centrato sulla transizione di cella a uno stato di (iPSC) sulle cellule staminali pluripotenti indotte, seguito dalla conversione di questi embrionali e pluripotenti SCs in cellule più differenziate. Tuttavia, iPSCs sono tumorigeniche una volta introdotto nei tessuti adulti, alzando la necessità di sviluppare protocolli per la loro differenziazione completa ed efficiente2. Tuttavia, questo passaggio di differenziazione, anche quando possibile, è disponibile al prezzo di potenziali ripopolamento a lungo termine dell'organo, auto-organizzazione ed espandibilità. Questi sono gli attributi essenziali per la rigenerazione dell'organo che in realtà sono tipici solo di SCs endogena di tessuto-specifica e di SCs indotta da YAP attualmente descritto (ySCs). Allo stesso modo, transdifferenziazione diretta di tipo di una cella in un altro utilizzando cocktail di trascrizione vari fattori anche generano differenziato cellule che mancano essenziale potenziale proliferativo e staminalità3.
La procedura qui descritta sfrutta anche la tecnologia di recente introduzione organoid, da cui SCs endogena può essere ampliato e differenziato ex vivo4. SCs YAP-indotta può generare SCs organoid-formando anche in condizioni sperimentali, biologico o malattia in cui SCs endogeno non sono presenti. Vorremmo sottolineare che, a differenza con altre procedure di riprogrammazione, il tipo della plasticità delle cellule impartita da YAP può corrispondere all'unica forma di reversione ad uno stato di SC-like che si verifica nei tessuti viventi. Riacquisizione dei tratti di SC-come è stato associato con la riparazione dei tessuti o l'attivazione oncogenica5. Anche se superfluo per l'omeostasi dei tessuti adulti diversi, YAP e/o TAZ sono assolutamente essenziali per la rigenerazione, la crescita del tumore e l'espansione di SCs somatiche in vitro1,6,7,8 ,9,10,11,12
Protocol
Tutte le procedure degli animali sono state effettuate aderendo alle nostre linee guida istituzionali e approvato da OPBA e il Ministero della salute
1. generazione di mammaria indotta da YAP cellule staminali-simili (yMaSCs)
Nota: Tutte le composizioni di media e soluzione per la sezione 1 sono specificate nella tabella 1.
- Isolamento di popolazioni di cellule mammario primario
- Preparare sotto una cappa di coltura delle cellule: bisturi monouso, soluzione di ialuronidasi, dissociazione medium, emolitica soluzione, soluzione di ordinamento, collagene rivestimento soluzione, soluzione Ca2 + chelante, lavaggio medio #1, lavare medium #2, soluzione dispase, mammario coltura 2D, ghiaccio freddo HBSS/PS.
- Per un tipico esperimento, sacrificare 10 topi femminili (sia CD-1 del ceppo C57BL/6), 8-12 settimane vecchie di dislocazione cervicale. Sterilizzare l'addome con abbondanti soluzione di etanolo 70% prima della dissezione.
- Sezionare le ghiandole mammarie un'incisione a forma di Y lungo la pelle dell'addome e separando accuratamente le ghiandole dal peritoneum tirando delicatamente con una pinza Dumont. Mettere le ghiandole dissecate in un non-cellula adesivo con 10 mL di ghiaccio freddo HBSS/PS (20 ghiandole per ogni piatto), assicurandosi di non riporto alcun frammento di pelle.
- Sotto una cappa di coltura del tessuto, lavare una volta ogni ghiandola in 10 mL di fresco HBSS/PS e metterli in un piatto adesivo per vuoto non-cellula (20 ghiandole per ogni piatto). Non utilizzare le piastre di coltura del tessuto, come le cellule tendono a bastone a loro, provocando una perdita ingente di materiale.
- Tritare finemente le ghiandole mammarie con bisturi fino ad ottenuta una miscela omogenea di frammenti di 1 mm3 . Recuperare il tessuto macinato da ogni piatto in 10 mL di medium di dissociazione con una pipetta sierologica di 25 mL per evitare intasamenti e trasferire la sospensione in una provetta conica 50 mL x almeno 5 per disaggregare tessuto ciuffi di pipettaggio.
Nota: Per una digestione efficiente, corretta macinazione del tessuto nel passaggio 1.1.5 è cruciale. - Incubare per 1h a 37 ° C con agitazione vigorosa continuo. Dopo 1 h, controllare l'omogeneizzato e prolungare l'incubazione di 10 min se ciuffi sono ancora presenti. Rotazione verso il basso il tessuto digerito a 400 x g per 5 min a temperatura ambiente e scartare il surnatante. Risospendere il pellet di tessuto in 3 mL di soluzione emolitica e incubare per 3 minuti sul ghiaccio.
Nota: Hemolysis è un trattamento piuttosto duro, in modo rigoroso tempismo è cruciale in questa fase. - Lavare le cellule con 10 mL di mezzo di lavaggio #1, gira giù il tessuto digerito a 400 x g per 5 min e scartare il surnatante. Risospendere il pellet di tessuto in 10 mL di lavaggio medio # 2 e piastra in piastre di coltura di tessuto di 10 cm. Incubare i piatti per 1 h a 37 ° C in un'incubatrice di cultura cellulare.
Nota: Questo passaggio permetterà la rimozione della maggior parte dei fibroblasti, che aderisca alla piastra di coltura. - Recuperare la sospensione cellulare dai piatti e versare in una provetta conica da 50 mL. Spin a 400 x g per 5 min ed eliminare il supernatante. Lavare la pallina due volte in 10 mL di Ca2 + soluzione di chelatazione di rotazione verso il basso a 400 x g per 5 minuti ogni volta. Risospendere il pellet in 5 mL di 0,25% tripsina/EDTA e incubare per 5 min a 37 ° C.
- Aggiungere 5 mL di soluzione di dispase sulla cima la soluzione di tripsina e supplemento con dnasi I 1μg/mL. Pipettare su e giù per almeno 5 x attraverso una 1 mL-punta a disaggregare DNA ciuffi e incubare per 10 min a 37 ° C, agitando ogni 3 min.
- Aggiungere 10 mL di lavaggio medio #2 e filtro in una nuova provetta conica 50 mL attraverso un colino di cella 40 μm. Rotazione verso il basso la sospensione cellulare a 400 x g per 5 min e scartare il surnatante, assicurandosi di eliminare tutto il liquido.
- Purificazione delle cellule epiteliali mammarie di FACS
- Preparare la miscela di anticorpo aggiungendo 10 μL Lin (anticorpo di topo lignaggio cocktail), 12 μL anti-CD326 (Ep-CAM), ad una concentrazione finale di 30 ng/mL, 10 μL anti-CD49f, ad una concentrazione finale di 25 ng/mL, 10 μL anti-CD61, ad una concentrazione finale di 10 ng/mL , 2,5 µ l anti-CD29, ad una concentrazione finale di 2,5 ng/mL.
Nota: da 1,3 questo passo per passo, operare sempre al buio, per evitare lo sbiancamento degli anticorpi fluorescente contrassegnati. Per ogni pallina: - Tenere un piccolo numero di cellule (immergendo una mancia di 100 μL nel pellet) in un tubo separato. Risospendere le cellule in 500 μL di soluzione in un tubo di FACS di ordinamento e mantenere il ghiaccio come il campione senza etichetta per la procedura di FACS.
- Ogni risospendere in 200 μL di lavaggio medio #1, aggiungere 44,5 μL di miscela di anticorpo, pipettare accuratamente e incubare per 30 min in ghiaccio al buio. Diluire la sospensione cellulare in 10 mL di mezzo di lavaggio #1, gira giù a 400 x g per 5 min e scartare il surnatante.
- Risospendere il pellet cellulare in 2 mL di soluzione di ordinamento e filtro attraverso un tappo-colino FACS materiali procedere al FACS-separazione delle popolazioni di cellule (come in Figura 1B). Prima di eseguire il protocollo di FACS multicolor, assicurarsi di correggere per le possibili ripercussioni di ogni fluorocromo in ciascuno degli altri. Per effettuare questa operazione, Incubare ogni anticorpo coniugato fluoroforo separatamente con una sospensione cellulare e misurare valori di sovrapposizione spettrale per tutti i fluorofori e in tutti i rivelatori, tramite controlli di colore unico, al fine di creare una matrice di incremento retributivo.
Nota: In questo esperimento, sorter dotata di 85 μm ugello è stato impiegato. Una preparazione tipica da 10 topi femminili produrrà circa 800.000 cellule LD. Procedere alla filtrazione secondaria se grumi si formano durante la procedura di FACS.
- Preparare la miscela di anticorpo aggiungendo 10 μL Lin (anticorpo di topo lignaggio cocktail), 12 μL anti-CD326 (Ep-CAM), ad una concentrazione finale di 30 ng/mL, 10 μL anti-CD49f, ad una concentrazione finale di 25 ng/mL, 10 μL anti-CD61, ad una concentrazione finale di 10 ng/mL , 2,5 µ l anti-CD29, ad una concentrazione finale di 2,5 ng/mL.
- Semina delle cellule mammarie primarie di LD
- Durante la procedura di FACS ricoprire una piastra di coltura del tessuto ben multi con collagene ho rivestimento soluzione. Incubare per 1h a 37 ° C, 5% CO2 in un'incubatrice di coltura cellulare. Rimuovere la soluzione di rivestimento e lavare con lavaggio medio #1 poco prima di placcatura.
- Lavare le cellule recuperate dalla procedura di FACS con 10 mL di soluzione di lavaggio #1, gira giù 400 x g per 5 min ed eliminare il surnatante. Risospendere il pellet cellulare in terreno di coltura 2D mammaria (500 µ l/pozzetto) e piastra di collagene trattato. Lasciare che le celle di sedersi in un'incubatrice di coltura cellulare per 48 h consentire collegamento corretto delle cellule e la diffusione.
Nota: Per un tipico ordinamento da 10 topi femminili, 6-8 pozzetti di una piastra ben 24 pozzetti multi produrrà una densità cellulare ottimale (100 000 cellule/pozzetto).
- Induzione di yMaSCs (indotta da YAP mammaria cellule staminali)
Nota: Da questo punto in poi, tutte le procedure devono essere eseguite in condizioni di BSL-2.- Preparare il supporto di Colonia mammaria. Appena aggiungere la matrice della membrana basale al mezzo appena prima della semina delle cellule.
- Per l'induzione di YAP-indotta di cellule staminali mammarie (yMaSCs), trasduce le cellule primarie di LD da infezione lentivirale miscelando un volume del surnatante virale FUdeltaGW-rtTA, un volume del surnatante FUW-tetO-YAP (o TAZ), con due volumi di privo di siero mammaria Terreno di coltura 2D concentrazioni 2x di integratori, in un volume totale di 500 mL. Incubare le cellule con i surnatanti lentivirali per 48 h. Per una tipica preparazione lentivirale, fare riferimento al protocollo di linea22.
- Dopo l'infezione, lavare le cellule aderenti e trattare con terreno di coltura 2D mammaria completato con la doxiciclina 2 µ g/mL di indurre l'espressione genica esogeno YAP (o TAZ). Utilizzare le cellule infettate con empty, vettori che esprimono EGFP o YAPS94A o cellule infettate con viscoelastico YAP (o TAZ) vettori, ma lasciato senza doxiciclina come controlli negativi.
Nota: Successo infezione può essere convalidato mediante qRT-PCR con primer specifici per umani YAP transgene, come descritto in precedenza1. - Dopo 7 giorni di induzione con doxiciclina, staccare le cellule aderenti tramite incubazione con 0,05% tripsina/EDTA (150 μL/pozzetto) per 10 min a 37 ° C; smettere di trypsinization diluendo 1:5 a lavaggio medio #2 (600 μL/pozzetto) e contare le celle. Risospendere le cellule in mezzo Colonia mammaria (1 mL per ciascun pozzetto), completate con 2 μg/mL doxiciclina e seme ad una densità di clonogenic di 1.000 cellule per pozzetto in piastre di ancoraggio 24 pozzetti ultrabasso.
Nota: Assicurarsi che il supporto di Colonia mammaria è ghiacciata al momento dell'aggiunta di matrice della membrana dello scantinato. La matrice della membrana basale dovrà sempre essere conservata a-20 ° C all'arrivo e scongelata lentamente a 4 ° C durante la notte; una volta scongelato, deve sempre essere gestita sul ghiaccio, secondo le linee guida del produttore. - Una volta YAP-LD cellule esprimenti iniziare a proliferare e crescere come MaSC-come colonie in sospensione (yMaSC colonie) (14 giorni dopo la semina), contare ed elaborare per ulteriori analisi (Figura 1).
Nota: Le cellule di controllo negativo (come al punto 1.4.3) rimarrà come singole cellule. - Ricostituire la cultura con mezzo fresco di Colonia mammaria ogni 72 ore durante i 14 giorni di sviluppo della colonia di yMaSC; per fare questo preparare un'aliquota del mezzo di Colonia mammario senza matrice della membrana dello scantinato di 5%, completati con concentrazione 10x di integratori e aggiungere 01:10 del volume totale in ciascun pozzetto (ad es. 100 μL in 1 mL di terreno totale), per evitare eccessiva diluizione di la sospensione di matrice.
- Sub-coltura di yMaSCs
- Recuperare le colonie primarie dal mezzo di Colonia mammaria, quindi dissociare e reinizializzare.
Nota: colonie di yMaSC derivati da cellule riprogrammate YAP LD acquisiscono capacità di auto-rinnovamento e possono essere con successo Sub-coltivate senza ulteriore somministrazione di doxiciclina (cioè, indipendentemente dall'espressione di YAP/TAZ transgenici). - Preparare, sotto una cappa di cultura cellulare, Colonia mammario medio come descritto al punto 1.4.1 e mammario organoid medio.
- Raccogliere ogni campione ed incubare il volume in eccesso (10:1) di ghiaccio freddo HBSS per 1h sul ghiaccio, al fine di solubilizzare la matrice della membrana basale. Lavare colonie 3 x mediante centrifugazione a 180 x g per 5 min e risospendere in ghiaccio freddo HBSS. Incubare le colonie in tripsina/EDTA 0,05% per 10 min a 37 ° C per ottenere una sospensione di singola cellula. Pipetta colonie su e giù per 10 volte con una punta di p1000 per garantire dissociazione completa a livello di singola cellula.
- Conteggio e reseeding cellule nel mezzo di Colonia mammaria (1 mL per ciascun pozzetto) senza doxiciclina a una densità di clonogenic di 1.000 cellule per pozzetto in piastre di ancoraggio 24 pozzetti ultrabasso. Ripetere questo passaggio procedura ogni 10-14 giorni per valutare il auto-rinnovamento.
- Prima il terzo passaggio, passaggio yMaSC colonie in condizioni di coltura organoid, per migliorare yMaSC espansione e per consentire la formazione di mini-ghiandole, che si auto-organizzano in un epitelio bilayered strettamente rievocativo della ghiandola mammaria in vivo organizzazione istologica.
- Recuperare colonie dal mezzo Colonia mammaria come descritto al punto 1.5.3 a 1.5.4. Risospendere le colonie nel fattore di crescita di 100% ha ridotto la matrice della membrana basale, valutando la possibilità di replate un massimo di 20-25 colonie per ciascun pozzetto di una piastra di attacco 24 pozzetti ultrabasso in 150 µ l della matrice.
- Incubare le piastre in un'incubatrice di coltura cellulare per 40 min a 37 ° C e lasciare che la matrice della membrana basale solidificare e poi sovrapporre i gel con 500 μL del mezzo mammaria organoid.
- Dopo pochi giorni si verifica per la formazione di colonie di forma in erba organoids (Figura 1E).
- Dopo 10-14 giorni, passaggio o processo organoids per ulteriori analisi.
- A passage organoids culture, recuperare organoids raccolta ogni campione e incubando in volume in eccesso (10:1) di ghiaccio freddo HBSS per 1h sul ghiaccio, al fine di solubilizzare la matrice della membrana basale. Lavare organoids 3 x di spin giù a 180 x g per 5 min e risospendere in ghiaccio freddo HBSS.
- Incubare organoids in tripsina/EDTA 0,05% per 10 min a 37 ° C per ottenere una sospensione di singola cellula. Pipetta organoids su e giù per 10 volte con una punta di p1000 per garantire dissociazione completa a livello di singola cellula.
- Reinizializzare una sospensione singola cella in una goccia di matrice di fattore di crescita del 100% ridotta della membrana basale (150 μL per ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti ultrabasso allegato). Lasciate che la matrice della membrana basale formano un gel incubando 40 min a 37 ° C in un'incubatrice di coltura delle cellule e sovrapporre i gel con 500 μL del mezzo mammaria organoid.
Nota: yMaSC organoids possono essere crioconservati recuperando dalla cultura di matrice della membrana dello scantinato 100% come al punto 1.5.13, evitando trypsinization. Conservare nel mammario organoid supplementato con 10% DMSO. - Congelare rapidamente il organoids yMaSC a-80 ° C e quindi conservati in azoto liquido.
- Recuperare le colonie primarie dal mezzo di Colonia mammaria, quindi dissociare e reinizializzare.
2. generazione di yDucts
Nota: Tutte le composizioni di media e soluzione per la sezione 2 sono specificate nella tabella 2.
- Isolamento dei acini pancreatici primari
- Posizionare le forbici e pinze per dissezione nel 70% EtOH e preparare sotto un cappuccio acinose cultura medium della coltura cellulare, 15 mL per ogni mouse; mezzo di recupero acinose, 60 mL per ogni mouse; PBS/PS; collagenasi di soluzione di riserva; collagenasi ho soluzione A, 15 mL per ogni mouse; neutralizzata la coda di topo collagene ho soluzione. Neutralizzare il collagene della coda di ratto che a pH = 7, regolando prima con 0,1 N NaOH per tamponare l'acido acetico in cui il collagene è dissolto e poi con 10N HCl. Diluire a 2,5 mg/mL in PBS/PS tenere il collagene di coda di ratto, io e tutti i reagenti sul ghiaccio per neutralizzarlo. 6 a 9 settimane topi del genotipo corretto il sacrificio.
- Posizionare ogni mouse sul dorso e lavare l'addome con una soluzione di etanolo 70%. Fare un'incisione longitudinale lungo la parete addominale. Individuare e sezionare il pancreas (utilizzando la milza come guida) e metterlo in un piatto di adesivo non cellula 10cm in 10 mL di ghiaccio freddo PBS/PS trasferire i piatti immediatamente sotto un cofano di cultura cellulare. Da questo punto in poi, lavorare sempre sotto una cappa di cultura cellulare.
- Ogni pancreas in una nuova non-cellula di trasferimento adesivo piatto precedentemente riempito con 7 mL di collagenasi ho soluzione A.
- Tritare rapidamente ogni pancreas con una coppia di bisturi monouso, per ottenere una sospensione omogenea del tessuto di frammenti di3 circa 1 mm.
Nota: È importante notare che questa procedura dovrebbe richiedere non più di 2 min per la vitalità cellulare ottimale. - Incubare il piatto per digestione della collagenosi a 37 ° C, 5% CO2 in un'incubatrice di coltura cellulare per 10 minuti, scuotendo ogni 3 min per assicurare la digestione di tessuto omogeneo.
- Recuperare il tessuto digerito in una provetta conica da 50 mL (uno per ogni pancreas), lavare il piatto con 10 mL di terreno di lavaggio acinose e posizionarlo nello stesso tubo 50 mL conica, pipettaggio digerito tessuto su e giù per non più di 3 volte.
- Rotazione verso il basso il tessuto digerito per 5 min a 100 x g a 18 ° C ed eliminare il surnatante.
Nota: Rotazione verso il basso le cellule a 18 ° C per ridurre l'attività della collagenosi durante questo passaggio. - Risospendere il tessuto della pallina in 7 mL di collagenasi soluzione A e versare questa soluzione in un nuovo piatto di adesivo non cellula 10 cm.
- Incubare il piatto per un secondo ciclo di digestione della collagenosi a 37 ° C per 10 min come descritto al punto 2.1.5, scuotendo ogni 3 min per assicurare la digestione di tessuto omogeneo. Nel frattempo, preparare una provetta conica pulito 50 mL per ogni pancreas condita con un colino di cella 100 μm.
- Recuperare il tessuto digerito e passare attraverso il filtro di cella di 100 μm dalla macerazione del tessuto con un pistone della siringa sterile da 10 mL (assicurarsi di premere delicatamente verso il basso il tessuto, evitando le forze di taglio tangenziale alla superficie del filtro). Lavare il piatto con 10 mL di terreno di lavaggio acinose e passare questo 10ml con la stessa colino di cella 100 μm.
- Rotazione verso il basso il tessuto digerito per 5 min a 100 x g a 18 ° C ed eliminare il surnatante.
- Recuperare la pallina di tessuto con 10 mL di terreno di lavaggio acinose. Trasferire la soluzione di cella in una provetta conica da 50 mL già contenente ulteriori 10 mL di medium fresco lavare acinose, evitando eccessivi di pipettaggio per risospensione del pellet.
- Rotazione verso il basso il tessuto digerito per 5 min a 100 x g a 18 ° C ed eliminare il surnatante.
- Attentamente risospendere il tessuto digerito in 6 mL di terreno di recupero acinose e distribuirlo in 2 pozzetti della piastra ben coltura tissutale di multi 6-pozzetti, 3 mL ciascuno. Sotto un microscopio stereoscopico attentamente valutare la qualità dell'isolamento acinosa, che appaiono come una sospensione omogenea di acinose cluster, con una percentuale minore di singole cellule (Vedi fig. 2B); rimuovere qualsiasi tessuto grande ciuffi eventualmente presentano (in genere visibile anche ad occhio nudo), pipettando li fuori della soluzione.
- Semina dei acini pancreatici primari
- Incubare i cluster acinosi digeriti a 37 ° C in un'incubatrice di coltura cellulare per 2 h, per consentire il recupero delle cellule.
- Durante il cappotto di recupero cellulare 48 pozzetti multi pozzi con 100 μL di collagene neutralizzati ratto coda ho e incubare per 1h a 37 ° C in un'incubatrice di coltura cellulare per consentire un cuscino di idrogel per modulo.
- Dopo 2 h di recupero delle cellule, raccogliere sospensione di cellule acinose in un tubo conico, rotazione verso il basso per 5 min a 100 x g a 18 ° C ed eliminare il surnatante.
- Risospendere i acini nel volume appropriato di coltura acinosa (150 μL per pozzetto di una piastra di coltura del tessuto ben 48). Ogni seme dissociato pancreas in 16 pozzetti per ottenere una densità ottima (100-120 acinose cluster/pozzetto).
- Diluire questa sospensione acinosa con un volume uguale di collagene della coda di ratto neutralizzati ho soluzione, mantenendo i tubi sul ghiaccio. Mescolare accuratamente e rapidamente seme la sospensione cellulare in cima all'ammortizzatore di collagene descritto in 2.2.2 (300 μL per pozzetto di una piastra di coltura del tessuto ben 48 multi ben).
- Incubare 1h a 37 ° C in un'incubatrice di coltura cellulare per consentire un idrogel al form.
- Induzione dei organoids del pancreas
- Sovrapposizione di idrogeli di collagene con 500 μL di coltura acinose completati con la doxiciclina 2 μg/ml per induzione YAP-dipendente di pancreas organoids da R26-rtTAM2; TetO-YAPS127A topi; controlli negativi sono forniti da wt cellule coltivate nelle stesse condizioni o R26-rtTAM2; TetO-YAPS127A cellule coltivate in assenza di doxiciclina.
- Le cellule acinose coltura in terreno di coltura acinose completati con doxiciclina di 2 μg/mL per 5-7 giorni rinfrescante terreno di coltura (300 μL/pozzetto) ogni 48 h e in seguito organoid formazione da cambiamenti morfologici verso cisti formando strutture ductal-like ( Figura 2). Una volta organoids sono formate, le cellule possono essere attraversate in condizioni di coltura organoid pancreatico o raccolte per ulteriori analisi (ad es.: estrazione del RNA, immunofluorescenza).
- Sub-coltura dei organoids del pancreas
- Per valutare la loro capacità di auto-rinnovamento, clonally passage organoids pancreatica indotta da YAP (yDucts) in idrogeli di matrice tridimensionale della membrana dello scantinato (condizioni di coltura organoid pancreatico) indipendentemente dal rifornimento di YAP/TAZ esogeno (cioè. indipendentemente dalla somministrazione di doxiciclina).
- Preparare la tripsina 0,05%/EDTA; matrice di ridotta della membrana basale del fattore di crescita del 100%; Pancreatico Organoid Medium e la collagenosi ho soluzione B.
- Preparare un 15 mL conica tubo con 4 mL di collagenasi I soluzione B per ciascun pozzetto per essere attraversate.
- Scartare il terreno di coltura, attentamente estrarre idrogeli dai pozzi di aspirazione delicata e trasferirli a tubi conici.
- Incubare le provette a 37 ° C per 30 min, con continua agitazione vigorosa per consentire la completa digestione della matrice del collagene (controllare ogni 10 min fino a quando l'idrogel è completamente solubilizzata). Rotazione verso il basso cellule recuperate a 750 x g per 2 minuti e rimuovere il surnatante.
- Incubare le cellule recuperate in 1 mL di tripsina 0,05%/EDTA per 10 min a 37 ° C per ottenere una sospensione di singola cellula. Diluire la tripsina con 9 mL di PBS 1 x, rotazione verso il basso a 750 x g per 2 minuti e rimuovere il surnatante.
- Risospendere il pellet cellulare in matrice di ridotta della membrana basale di ghiaccio freddo fattore di crescita e seme in piastre di fissaggio ultra-basso (in genere una goccia di 150 µ l in un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti).
- Lasciate che l'idrogel di matrice della membrana dello scantinato solidificare incubando le piastre in un'incubatrice di coltura cellulare 40 min a 37 ° C e poi sovrapporre con pancreatico Organoid medio (500 μL per pozzetto). yDucts crescerà come ciste-come organoids in 7-10 giorni (Figura 2D).
- Per ulteriore passaggio organoids può essere rimosso dalla matrice della membrana basale tramite incubazione in ghiaccio freddo PBS 1 x per 30 minuti, seguita da lavaggio 3 volte da spin giù a 180 x g per 5 min e risospensione in PBS freddo ghiaccio 1 x per evitare il riporto di matrice. Organoids sono poi dissociato con tripsina 0,05% per 10 minuti ottenere una sospensione di cellule singole e reseeding nella matrice della membrana basale fresco e quindi sovrapposti con pancreatico Organoid Medium (come 2.4.7-2.4.8).
- yDuct organoids possono essere crioconservati in azoto liquido recuperando dalla cultura di matrice della membrana dello scantinato di 100% come in passo 2.4.9, evitando trypsinization, e la memorizzazione in pancreas Organoid Medium completato con 10% DMSO.
- yDuct organoids sono rapidamente congelato a-80 ° c e quindi conservati in azoto liquido.
Representative Results
Generazione di yMaSCs
Una panoramica della strategia sperimentale per riprogrammare cellule mammarie a LD primarie di espressione transiente di YAP è presentata in Figura 1A. Cellule epiteliali mammarie primarie di LD sono purificate da fluorescente-attivata cella ordinamento13. Figura 1B rappresenta una tipica procedura di ordinamento per ottenere tre distinte sottopopolazioni: cellule basali (EpCAMbassoCD49faltaCD61–), le cellule progenitrici Luminal (LP) (EpCAMaltaCD49fbassoCD61+ ) e le cellule LD (EpCAMaltaCD49fbassoCD61–). Attenzione gating di tre sottopopolazioni è indispensabile per isolare una preparazione pura di cellule di LD, che sono completamente differenziate e completamente crescita arrestato quando seminati in condizioni (Vedi Figura 1, pannello sinistro) di formazione di colonie di ghiandola mammaria. Al contrario, quando indotte per esprimere esogeno YAP, LD cellule iniziano a proliferare per formare colonie epiteliali densi facilmente riconoscibile in colture in sospensione matrice della membrana dello scantinato di 5% (Figura 1). L'efficienza della riprogrammazione, attestata intorno al 3% per un tipico esperimento, possono essere segnati contando il numero di colonie sopra il numero di singole cellule originariamente seminati in colture in sospensione matrice della membrana dello scantinato (Figura 1). Cellule riprogrammate luminale (yMaSCs) possono essere quindi il passaggio in 100% della membrana dello scantinato matrice organoid condizioni di coltura (Vedi schema in Figura 1A), auto-organizzazione in complesse organoid-come le strutture che si sviluppano attorno più lumen e visualizzare la capacità di auto-rinnovamento notevole anche in assenza di doxiciclina (cioè in assenza di espressione di YAP transgenici) (Figura 1E). Istologicamente, yMaSC-derivati organoids visualizzare uno strato basale (K14 positivo), affrontando la matrice della membrana basale ricostituita ECM e uno strato di luminal (K8 positivo), affrontando le cavità lumen-come all'interno di organoid (Figura 1F). Questa architettura è indistinguibile da quella dei organoids formata da popolazione nativa (Figura 1F).
Generazione di yDucts
Una panoramica della strategia sperimentale per riprogrammare i acini pancreatici primari di espressione transiente di YAP è presentata nella Figura 2A. Interi gruppi acinose sono isolati dalla massa del tessuto pancreatico tramite una combinazione di lieve dissociazione e l'esclusione di dimensione attraverso la filtrazione. Una preparazione tipica è presentata nella Figura 2B. Dopo l'isolamento, i cluster di cellule acinose dovrebbero apparire come una sospensione di esocrino acinose unità di dimensioni omogenee, senza contaminazione di endocrino isolotti di Langerhans o frammenti del albero duttale pancreatico e minima dissociazione di singole cellule. Contaminazione da isolotti endocrini o frammenti ductal è un'indicazione di filtrazione selettiva carenti (passo 2.1.10), probabilmente a causa di manipolazione duro; dissociazione indesiderati di acinose cluster da singole cellule potrebbe essere dovuto trattamento eccessivo collagenasi o unbuffered attività degli enzimi proteolitici rilasciato dal tessuto, che può essere frenato dal trattamento SBTI supplementare.
Un tipico esperimento di riprogrammazione acinoso è presentato in Figura 2; entro 5-7 giorni di cultura in collagene 3D-ho basato idrogel in presenza di doxiciclina, acini pancreatici derivati da topi R26-rtTAM2/tetO-YAPS127A facilmente trasformano in condotto-come cluster (che abbiamo chiamato yDucts), composto da un sottile monostrato di cellule epiteliali che proliferano intorno a una cavità centrale in espansione. L'efficienza di riprogrammazione, che è circa il 70% per un tipico esperimento, può essere facilmente misurato segnando il numero di cluster condotto-come oltre il numero totale di teste di serie dei acini (Figura 2D). Il controllo negativo cellule, cioè R26-rtTAM2 / + cellule o R26-rtTAM2/tetO-YAPS127A celle a sinistra senza doxiciclina, invariabilmente rimangono come post-mitotici acinose cluster in queste condizioni di coltura, come precedentemente segnalate1 ,14,15. Riprogrammate yDucts può quindi essere attraversate a livello di singola cellula in basati su Matrigel organoid cultura condizioni16 (Vedi schema in Figura 2A), visualizzazione di capacità di auto-rinnovamento notevole anche in assenza di doxiciclina (vale a dire in assenza di espressione di YAP transgenici) (Figura 2E).
Figura 1: Cellule staminali: cellule isolamento di LD mammario primario e l'induzione di mammaria. (A) rappresentazione schematica delle procedure sperimentali adottate per riprogrammare le cellule mammarie primarie di LD. (B) rappresentante FACS-piazzole che illustra una tipica procedura di ordinamento per purificare le cellule LD. i) dissociate cellule sono gated secondo scatter avanti e laterali per cellule vive (P1; blu); II) popolazione P1 è poi ulteriormente recintata in base al relativo profilo di Lin: la sottopopolazione delle cellule Lineage-negative (P2; grigio) è selezionata, escluse le cellule ematopoietiche Lineage-positive; III) popolazione P2 viene poi separata in un EpCAMalta (P3; giallo + verde) e unbasso (P6; rosso) sottopopolazioni di EpCAM; IV) P3 e P6 sono quindi ulteriormente gated secondo il loro profilo di CD61/CD49f in tre sottopopolazioni: EpCAMbassoCD49faltaCD61 cellule basali– (P7; rosso), EpCAMaltaCD49fbassoCD61+ LP cellule (P8; giallo) ed EpCAMaltaCD49fbassoCD61 cellule di LD– (P9; verde). (C) immagini sono illustrative della capacità delle cellule di LD, infettati con i costrutti indicati, di formare colonie mammarie 15 giorni dopo la semina in mezzo Colonia mammaria. Solo YAP-esprimendo le cellule diventano formanti colonie cellule, considerando che cellule di controllo negativo (EGFP-infettati) rimangono come celluli crescita-arrestato. Barra della scala = 50 μm. (D) quantificazione della Colonia formando la capacità delle cellule indicate, come in (C). I dati sono presentati come media + s.d. e sono rappresentativi di cinque esperimenti indipendenti, ciascuno con sei repliche tecniche. (E) immagine rappresentativa di YAP-riprogrammato cellule staminali-come delle cellule mammarie (yMaSCs) dopo 12 giorni in condizioni di coltura organoid in fresco idrogel dei matrice tridimensionale 100% della membrana dello scantinato in assenza di doxiciclina. Scala bar = 100 μm. (F) immagini di immunofluorescenza rappresentativo per il marcatore basale K14 (verde) e l'indicatore di luminal K8 (rosso) dei organoids derivano dalle cellule indicate, dopo 12 giorni in condizioni di coltura organoid. Barra della scala = 10 μm. Questa figura è riprodotto da Panciera et al., 20161. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Isolamento delle cellule acinose pancreatiche primarie e l'induzione dei progenitori del pancreas. (A) rappresentazione schematica delle procedure sperimentali adottate per riprogrammare le cellule acinose esocrine pancreatiche primarie. (B) immagine rappresentativa dei acini pancreatici primari subito dopo la procedura di isolamento (passo 2.1.14). La preparazione acinosa dovrebbe apparire come una sospensione omogenea di cluster acinose, con minima presenza di singole cellule. Barra della scala = 400 μm. (C) immagini rappresentative dei acini pancreatici primari derivata da R26-rtTAM2 (pannelli superiori)o R26-rtTAM2; tetO-YAPS127A (inferiore pannelli) topi e coltivate in 3-d collagene I-base di idrogel per 5 giorni con o senza Doxiciclina (doxy), come indicato. YAP-esprimendo i acini primari convertire solo in cellule che crescono come ciste-come organoid dopo aggiunta di doxiciclina. Scala bar = 70 μm. (D) quantificazione della capacità dei acini pancreatici per formare ductal organoids su transgenici YAP sovraespressione come in (C). I dati sono presentati come media + s.d. e sono rappresentativi di cinque esperimenti indipendenti, eseguita con quattro ripetizioni di tecniche. (E) immagine rappresentativa YAP-riprogrammata ductal-come delle cellule (yDucts) dopo tre passaggi in fresco idrogel dei matrice tridimensionale 100% della membrana dello scantinato in assenza di doxiciclina. Barra della scala = 130 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Isolamento delle cellule mammarie primarie | |
| CA2 + soluzione di chelatazione | Conservare a 4 ° C |
| EDTA | 0,02% w/V |
| PBS | |
| Collagene sono soluzione di rivestimento | |
| Acido acetico 0.02N, pH 3,23 | |
| Collagene di coda di ratto (rivestimento) | 01:50 |
| Soluzione di dispase | Conservare a 4 ° C |
| Dispase | 5 mg/ml |
| PBS | |
| Medio di dissociazione | |
| DMEM:F12 | |
| Soluzione di riserva di ialuronidasi | 400 U/mL |
| Pen/Strep | 1 x |
| Collagenasi di soluzione madre ho | 600 U/mL |
| Emolitica soluzione | Conservare a 4 ° C |
| Soluzione di NH4Cl | 1 parti |
| TrisBase 20,6 g/L | 9 parti |
| aggiustare il pH a 7,2 | |
| HBSS/PS | Conservare a 4 ° C |
| HBSS | |
| Pen/Strep | 2 x |
| Soluzione di riserva di ialuronidasi | Filtro 0,2 µm, conservare a 4 ° C |
| Ialuronidasi dai testicoli bovini (polvere) | 2.000 U/mL |
| Tampone fosfato di sodio 1 M pH7.3 | |
| Soluzione di NH4Cl | Conservare a T. amb. |
| H2O | |
| NH4Cl | 7,1 g/L |
| regolare il pH a 7.65 | |
| L'ordinamento di soluzione | Filtro 0,2 µm, conservare a 4 ° C |
| BSA | 0,1% |
| EDTA | 1 mM |
| PH HEPES 7 | 25 mM |
| PBS | |
| Lavare mezzo #1 | |
| DMEM/F12 | |
| Pen/Strep | 1 x |
| Lavare medio #2 | |
| DMEM/F12 | |
| FBS | 5% |
| Pen/Strep | 1 x |
| Terreno di coltura 2D mammaria | |
| DMEM/F12 | |
| FBS | 2% |
| eparina | 4 mg/mL |
| L-Glutammina | 1 x |
| bFGF murino | 10 ng/mL |
| murino EGF | 10 ng/mL |
| Pen/Strep | 1 x |
| Induzione e Passaging di yMaSCs | |
| Mammari Colonia Medium | |
| DMEM:F12 | |
| FBS | 5% |
| eparina | 4 µ g/mL |
| L-Glutammina | 1 x |
| Matrigel (aggiungere immediatamente prima della semina) | 5% |
| bFGF murino | 20 ng/mL |
| murino EGF | 10 ng/mL |
| Pen/Strep | 1 x |
| Mammari Organoid Medium | |
| DMEM:F12 avanzata | |
| B27 | 1 x |
| GlutaMax | 1 x |
| eparina | 4 µ g/mL |
| HEPES | 1 x |
| Noggin umano | 100 ng/mL |
| murina bEGF | 20 ng/mL |
| murino EGF | 50 ng/mL |
| R-Spondin 1 | 1 µ g/mL |
Tabella 1: generazione di yMaSCs. Composizione di tutti i diversi terreni di coltura e soluzioni necessarie per l'isolamento delle cellule mammarie primarie di LD e induzione di yMaSCs (sezione 1).
| Isolamento dei acini pancreatici primari | |
| Terreno di coltura acinose | |
| BPE | 50 µ g/mL |
| BSA | 0,1% |
| Desametasone | 1 µ g/mL |
| FBS | 0,1% |
| ITS-X | 1 x |
| Pen/Strep | 1 x |
| SBTI | 0,2 mg/mL |
| Medium di Waymouth | |
| Acinose lavaggio medio | |
| BSA | 0,1% |
| Pen/Strep | 1 x |
| Medium RPMI | |
| SBTI | 0,2 mg/mL |
| Acinose recupero medio | |
| Terreno di coltura acinose | |
| FBS | 30% |
| Collagenasi ho soluzione A | |
| Acinose lavaggio medio | |
| Collagenasi di soluzione madre ho | 360 U/mL |
| PBS/PS | Conservare a 4 ° C |
| PBS (Phosphate-buffered saline) | |
| Pen/Strep | 1 x |
| Collagenasi di soluzione madre ho | Conservare a-20 ° C |
| Collagenasi, tipo io (polvere) | 6.000 U/mL |
| PBS | |
| Passaggio dei organoids del pancreas | |
| Collagenasi ho soluzione B | |
| PBS 1 x | |
| Collagenasi di soluzione madre ho | 240 U/mL |
| Pancreatico Organoid Medium | |
| Avanzata DMEM/F12 | |
| B27 | 1 x |
| gastrina | 10 nM |
| FGF10 umano | 100 ng/mL |
| Noggin umano | 100 ng/mL |
| murino EGF | 50 ng/ml |
| N-acetilcisteina | 1,25 mM |
| Nicotinammide | 10 mM |
| Pen/Strep | 1 x |
| R-Spondin 1 | 1 mg/mL |
| SBTI | 0,2 mg/mL |
Tabella 2: generazione di yDucts. Composizione di tutti i diversi terreni di coltura e soluzioni necessarie per l'isolamento di cellule acinose primarie e induzione e passaggio di yDucts (sezione 2).
Discussion
Qui presentiamo i protocolli per riprogrammare le cellule epiteliali ex vivo terminalmente differenziate dei tessuti differenti in loro corrispondente tessuto-specifica del progenitor (o ySCs) di espressione transiente di YAP, come riferito precedentemente1. Noi abbiamo dettagliato due procedure: uno che consente la riprogrammazione delle cellule di FACS-purificato con vettori lentivirali e una seconda che evita l'infezione virale e si avvale di transgenici YAP espressione. Ogni protocollo presenta una strategia efficace per isolare e cellule differenziate primario di cultura e una strategia per forzare esogeno YAP espressione genica in cellule differenziate, generando de novo tessuto-specifici espandibile cellule staminali somatiche (Vedi schemi in figure 1A e 2A).
Abbiamo dimostrato che le strategie di isolamento qui presentate efficacemente isolare una popolazione pura di cellule differenziate, come dimostrato dal fatto che non abbiamo mai rilevato qualsiasi escrescenza da campioni di controllo negativo (figure 1 e 2 C).
I vettori lentivirali utilizzati in questo studio per la riprogrammazione delle cellule mammarie primarie di LD sono doxiciclina inducibile, offrendo la possibilità di uno stretto controllo dell'espressione del transgene; Questo permette di accendere e fuori esogeno YAP espressione a volontà. Particolare attenzione deve essere posto in evitando l'uso di un titolo virale eccessivo, come questo può essere dannoso in termini di efficienza di riprogrammazione. Nel caso di cellule acinose primarie, siamo passati ad un approccio completamente transgenico per ottenere una riprogrammazione di YAP-dipendente con manipolazioni minime. Questa strategia di quest'ultima inoltre è particolarmente adatta a primario dei acini pancreatici, come cluster acinose isolato sono molto fragili e scarsamente suscettibili di infezione lentivirale. La strategia transgenica impiegata offre lo stesso vantaggio di doxiciclina-dipendente vettori lentivirali per il controllo stretto dell'espressione genica. Inoltre, la strategia transgenica sfruttata con acini pancreatici primari porta il vantaggio aggiuntivo di un efficienza riprogramma molto più alta per la riprogrammazione indotta da virale delle cellule mammarie di LD. Oltre la plasticità intrinseca diversa associata a cellule derivate dai tessuti differenti, il più alto tasso di riprogrammazione del pancreas potrebbe essere derivato dalla maggiore efficienza di espressione associata all'espressione di YAP uniforme e autonoma in tutte le cellule espiantate. In particolare, abbiamo dimostrato che YAP esogeno non è più necessaria dopo la generazione del ySCs (colonie di yMaSC e yDucts), senza compromettere la loro capacità di auto-rinnovamento. Questo è perché ySCs riattivazione endogena YAP/TAZ e utilizzarli per il auto-rinnovamento quando esogeno YAP è spento1.
Abbiamo validato la nozione che ySCs emergono infatti da cellule differenziate controllando la cellula dell'origine dei nostri esperimenti riprogrammazione tramite genetica lignaggio traccia convalide1.
Ampia caratterizzazionedi ySCs Mostra che indotta da YAP riprogrammazione genera SCs somatiche normale1 come mi) a livello di trascrittomica, ySCs visualizzare massicce sovrapposizioni con SCs nativo; II) ySCs visualizzare potenziale differenziativo e può generare una progenie multilineare sempre limitata all'identità del loro tessuto di origine; III) ySCs sono non trasformate e non tumorigeniche quando trapiantate in vivo.
Qui descriviamo anche procedure per mantenere ed espandere la cultura sia yMaSCs e yDucts come organoids incorporato in idrogel di matrice della membrana dello scantinato di 100%. Queste condizioni consentono l'auto-organizzazione dei ySCs in organoids tridimensionali che assicurano il mantenimento delle proprietà di staminalità a lungo termine nella cultura, consentendo di espandere queste derivano popolazioni a volontà per analisi successive e applicazioni. Per ragioni sconosciute, non siamo riusciti a ottenere yMaSC organoids inserendo LD cellule direttamente in condizioni di coltura organoid infette 7 giorni dopo il trattamento doxiciclina nella piastra di coltura del tessuto plastica; in altre parole, il passaggio intermedio di crescita in condizioni di Colonia mammaria è essenziale. Nelle nostre mani, anche nativi popolazione richiedono condizioni di Colonia mammaria prima di passaggio nella cultura organoid. Inoltre, la conseguenza più efficiente di organoid è ottenuta quando noi evitare dissociare le colonie primarie in singole celle, ma piuttosto trasferire le colonie intatte in condizioni di coltura organoid.
Condizioni di coltura organoid sopportare anche il vantaggio di dare la possibilità di crioconservare ySCs, purché l'organoids sono recuperati da loro matrici, evitando la dissociazione di cella prima della crioconservazione in bagno di azoto.
Il YAP riprogrammazione procedura presentata in grado di convertire tipi distinti delle cellule differenziate derivati da diversi tessuti adulti loro corrispondente tessuto-specifici sulle cellule staminali (abbiamo testato utilizzando cellule mammarie, pancreatiche e neuronale)1. A differenza da iPSCs o altri sforzi di riprogrammazione, YAP/indotto SCs può mantenere i ricordi del loro tessuto di origine. Della nota, de-differenziazione delle cellule somatiche in cellule con proprietà simil-staminali è l'unica forma di plasticità di destino delle cellule e riprogrammazione osservati in vivo, per esempio dopo danno di tessuto e di sostenere la cicatrizzazione5,17 , 18 , 19 , 20. è degno di nota che YAP e TAZ sono in gran parte superflui per l'omeostasi normale ma cruciale per riparazione tissutale in molteplici tessuti11,21. Costantemente con una funzione fisiologica della riprogrammazione procedura qui descritta, YAP/TAZ sono stati recentemente indicati per essere richiesto nella rigenerazione intestinale in modelli murini di pazienti di colite ulcerosa causando una conversione delle cellule intestinali adulte in un epitelio di riparazione che visualizza le caratteristiche del budello fetale19. YAP riprogrammazione amplia così le attuali strategie di plasticità indotta delle cellule fornendo un mezzo per generare cellule staminali somatiche, uno stato che è stato finora impegnativo per catturare in vitro. Questo approccio, se esteso anche alle cellule di derivazione umana, potrebbe avere ampia rilevanza da applicazioni di medicina rigenerativa allo studio dello stato somatico staminalità e per l'espansione di somatico stelo cellule in vitro.
Disclosures
Gli autori non dichiarano concorrenti interessi finanziari.
Acknowledgments
Si ringrazia F. Camargo per il dono di tetO-YAPS127A topi; R26-rtTAM2 topi (stock #006965) sono stati acquistati presso il laboratorio di Jackson. Ringraziamo Chiara Frasson e Giuseppe Basso per aiuto con le procedure di FACS. Questo lavoro è supportato da AIRC speciale programma oncologia molecolare clinica ' 5 per mille ' e un PI-Grant AIRC per s. p ed Epigenetics Flagship progetto CNR-Miur concede a S.P. Questo progetto ha ricevuto finanziamenti dal Consiglio europeo della ricerca (CER) sotto ricerca Orizzonte 2020 dell'Unione europea e il programma per l'innovazione (di sovvenzione DENOVOSTEM n. 670126).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL sterile syringes | Rays | 10LC | |
| 100 mm cell strainer | Corning | 352360 | |
| 15 mL sterile conical tubes | Corning | 430052 | |
| 24-well ultra low attachment plates | Costar | 3473 | |
| 40 mm cell strainers | Corning | 352340 | |
| 48-well multiwell plates | Corning | 353078 | |
| 50 mL sterile conical tubes | Corning | 430290 | |
| 6-well multiwell plates | Corning | 353046 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634028 | |
| B27 supplement (50x) | Gibco | 17504001 | |
| BPE | Gibco | 13028014 | |
| BSA | Sigma | A9418 | |
| Collagenase, type I | Sigma | 17018029 | |
| dexamethasone | Sigma | D4902 | |
| Dispase | Gibco | 1705-041 | |
| Disposable scalpels | Swann-Morton | 0503 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| DnaseI | Roche | 11284932001 | |
| doxycycline hyclate | Sigma | D9891 | |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| Ethanol 100% | Sigma | 51976 | |
| FACS tubes (with strainer caps) | Falcon | 352235 | |
| FBS | Gibco | 10270106 | |
| FITC anti-mouse CD326 (Ep-CAM) | BioLegend | 118208 | |
| FUdeltaGW-rtTA | Addgene | #19780 | |
| FUW-tetO-EGFP | Addgene | #84041 | used as negative control |
| FUW-tetO-MCS | Addgene | #84008 | used as negative control |
| FUW-tetO-wtYAP | Addgene | #84009 | |
| FUW-tetO-YAPS94A | Addgene | #84010 | used as negative control (transcriptionally dead YAP mutant) |
| GlutaMax | Gibco | 35050061 | |
| HBSS | Gibco | 24020117 | |
| HCl | Sigma | 30721 | |
| heparin sodium salt | Sigma | H3149 | |
| HEPES buffer solution (1M) | Gibco | 15630-056 | |
| human R-Spondin1 (His Tag) | Sino Biological | 11083-H08H-5 | |
| Hyaluronidase from bovine testes | Sigma | H3506 | |
| ITS-X | Gibco | 51500056 | |
| K-14 antibody | Life Technologies | Ab7800 | |
| K-8 antibody | Life Technologies | Ab14053 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Lin (allophycocyanin [APC] mouse lineage antibody cocktail) | BD Biosciences | 51-9003632 | |
| Matrigel® Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free | Corning | 356231 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9165 | |
| NaOH | J.T.Baker | 0402 | |
| NH4Cl | Sigma | A9434 | |
| Nicotinamide | Sigma | 72340 | |
| non-cell adhesive 10 cm dishes (sterile polystirol petri dish ø 94) | ROLL | 18248 | |
| PBS 10x | Euroclone | ECM4004XL | |
| PE Hamster Anti-Mouse CD61 | BD Biosciences | 553347 | |
| PE-Cy5 Rat Anti-Human CD49f | BD Biosciences | 551129 | |
| PE/Cy7 anti-mouse/rat CD29 Antibody | BioLegend | 102222 | |
| Pen/Strep (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Rat Tail Collagen I (coating) | Sigma | 122-20 | |
| Rat Tail Collagen I for 3D culture | Cultrex | 3447-020-01 | |
| recombinant human FGF10 | Peprotech | 100-26 | |
| recombinant human Noggin | Peprotech | 120-10C | |
| recombinant murine EGF | Peprotech | 315-09 | |
| recombinant murine FGF basic (bFGF) | Peprotech | 450-33 | |
| RPMI 1640 medium | Gibco | 31870025 | |
| SBTI (Trypsin inhibitor from Glycine max) | Sigma | T6522 | |
| Tris BASE | Roche | 11814273001 | |
| Trypsin-EDTA 0,05% | Gibco | 25300054 | |
| Waymouth medium | Gibco | 31220023 |
References
- Panciera, T. Induction of Expandable Tissue-Specific Stem/Progenitor Cells through Transient Expression of YAP/TAZ. Cell Stem Cell. 19 (6), 725-737 (2016).
- Bar-Nur, O. Lineage conversion induced by pluripotency factors involves transient passage through an iPSC stage. Nat Biotechnol. 33 (7), 761-768 (2015).
- Xu, J., Du, Y., Deng, H. Direct lineage reprogramming: strategies, mechanisms, and applications. Cell Stem Cell. 16 (2), 119-134 (2015).
- Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Blanpain, C., Fuchs, E. Stem cell plasticity. Plasticity of epithelial stem cells in tissue regeneration. Science. 344 (6189), 1242281 (2014).
- Bai, H. Yes-associated protein regulates the hepatic response after bile duct ligation. Hepatology. 56 (3), 1097-1107 (2012).
- Cai, J. The Hippo signaling pathway restricts the oncogenic potential of an intestinal regeneration program. Genes Dev. 24 (21), 2383-2388 (2010).
- Elbediwy, A. Integrin signalling regulates YAP and TAZ to control skin homeostasis. Development. 143 (10), 1674-1687 (2016).
- Taniguchi, K. A gp130-Src-YAP module links inflammation to epithelial regeneration. Nature. 519 (7541), 57-62 (2015).
- Zhang, W. Downstream of mutant KRAS, the transcription regulator YAP is essential for neoplastic progression to pancreatic ductal adenocarcinoma. Sci Signal. 7 (324), ra42 (2014).
- Zanconato, F., Cordenonsi, M., Piccolo, S. YAP/TAZ at the Roots of Cancer. Cancer Cell. 29 (6), 783-803 (2016).
- Azzolin, L. YAP/TAZ incorporation in the beta-catenin destruction complex orchestrates the Wnt response. Cell. 158 (1), 157-170 (2014).
- Stingl, J. Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells. Nature. 439 (7079), 993-997 (2006).
- Means, A. L. Pancreatic epithelial plasticity mediated by acinar cell transdifferentiation and generation of nestin-positive intermediates. Development. 132 (16), 3767-3776 (2005).
- Shi, G. Maintenance of acinar cell organization is critical to preventing Kras-induced acinar-ductal metaplasia. Oncogene. 32 (15), 1950-1958 (2013).
- Huch, M. Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis. EMBO J. 32, 2708-2721 (2013).
- Fernandez Vallone, V. Trop2 marks transient gastric fetal epithelium and adult regenerating cells after epithelial damage. Development. 143 (9), 1452-1463 (2016).
- Yanger, K. Robust cellular reprogramming occurs spontaneously during liver regeneration. Genes Dev. 27 (7), 719-724 (2013).
- Yui, S. YAP/TAZ-Dependent Reprogramming of Colonic Epithelium Links ECM Remodeling to Tissue Regeneration. Cell Stem Cell. , (2017).
- Pan, F. C. Spatiotemporal patterns of multipotentiality in Ptf1a-expressing cells during pancreas organogenesis and injury-induced facultative restoration. Development. 140 (4), 751-764 (2013).
- Panciera, T., Azzolin, L., Cordenonsi, M., Piccolo, S. Mechanobiology of YAP and TAZ in physiology and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (12), 758-770 (2017).
- Lentiviral production and infection. , http://www.bio.unipd.it/piccolo/protocols/YAP_reprogramming_protocols.pdf (2016).
