Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Detectie van Inflammasome-activering en Pyroptotic celdood in lymfkliertest beenmerg-afgeleide macrofagen

Published: May 21, 2018 doi: 10.3791/57463
Automatic Translation
1, 1
1Department of Laboratory Medicine, University of Washington

Summary

We beschrijven de detectie van NLRP3 inflammasome activering op cellulaire basis met behulp van fluorescentie microscopie en kleuring voor actieve caspase-1 en de adapter, ASC. Een lactaat dehydrogenase release assay wordt gepresenteerd voor het detecteren van lysis van de pyroptotic op basis van de bevolking. Deze technieken kunnen worden aangepast om te bestuderen van vele aspecten van inflammasome biologie.

Abstract

Inflammasomes zijn aangeboren immuun signalering platforms die vereist zijn voor de succesvolle bestrijding van vele pathogene organismen, maar ook bevordering van inflammatoire en autoinflammatory ziekten. Inflammasomes worden geactiveerd door cytosolische patroon erkenning receptoren, waaronder leden van de familie knik-achtige receptor (NLR). Deze receptoren oligomerize op het opsporen van microbiële of schade-geassocieerde stimuli. Latere indienstneming van de adapter proteïne ASC vormt een microscopisch zichtbaar inflammasome complex, die caspase-1 t/m nabijheid-geïnduceerde auto-activering activeert. Na het activeren cleaves caspase-1 pro-IL-1β en pro-IL-18, wat leidt tot de activering en de secretie van deze pro-inflammatoire cytokines. Caspase-1 bemiddelt ook de inflammatoire vorm van celdood genoemd pyroptosis, die beschikt over het verlies van lysis van de membraan integriteit en cel. Caspase-1 cleaves gasdermin D, het vrijgeven van het N-terminaal fragment dat vormt plasmamembraan poriën, wat leidt tot lysis van de osmotische.

In vitro, de activering van caspase-1 kan worden bepaald door het labelen van beenmerg-afgeleide macrofagen met de activiteit van de caspase-1 sonde FAM-YVAD-FMK en labelen van de cellen met antistoffen tegen het eiwit adapter ASC. Deze techniek maakt het mogelijk de identificatie van de inflammasome formatie en caspase-1 activering in afzonderlijke cellen met behulp van fluorescentie microscopie. De dood van de cel van de Pyroptotic kan worden gedetecteerd door het meten van de release van cytosolische lactaat dehydrogenase in het medium. Deze procedure is eenvoudig, kosteneffectief en uitgevoerd in een 96-wells-plaat-indeling, waardoor aanpassing voor screening. In dit manuscript, laten we zien dat de activering van de inflammasome van de NLRP3 door nigericin leidt tot de co lokalisatie van de adaptor eiwitten ASC en actieve caspase-1, wat leidt tot pyroptosis.

Introduction

Inflammasome-gemedieerde ontsteking is een essentieel onderdeel van de verdediging tegen pathogene organismen1, maar ook ten grondslag ligt aan de etiologie van vele ziekten2. De inflammatoire respons voor een groot aantal infecties wordt geactiveerd door cytosolische opsporing van pathogen verbonden moleculaire patronen (PAMPs) of schade geassocieerde moleculaire patronen (DAMPs). Patroon erkenning receptoren (PRR), met inbegrip van leden van de familie van de knik-achtige receptor (NLR), oligomerize na de detectie van deze PAMPs en DAMPs. Dit veroorzaakt de vorming van een multi eiwit complex genoemd de inflammasome, waarin de PRR, de adapter proteïne Apoptosis-geassocieerde speck-achtige eiwitten met een C-terminal caspase-recruitment domein (kaart) (ASC), en de Pro-vorm van caspase-13,4. Dit complex staat nabijheid-geïnduceerde auto-activering van caspase-1. Actieve caspase-1 leidt vervolgens tot een reeks van gebeurtenissen die karakteristiek voor de inflammatoire cel dood traject pyroptosis zijn. Deze gebeurtenissen omvatten: het splijten en de introductie van de inflammatoire cytokines IL-1β en de IL-18, lysosoom exocytose met introductie van lysosomale inhoud in de extracellulaire ruimte, nucleaire condensatie en gasdermin D decollete. De vrijgegeven N-terminale domein van gasdermin D wordt ingevoegd in het plasma-membraan, vorming van poriën waardoor plasmamembraan breuk en vrijlating van inflammatoire inhoud, naast een beschermende niche voor pathogen replicatie5, weg te nemen 6 , 7.

Hier focussen we op de goed bestudeerde NLRP3 inflammasome. De activering van de inflammasome van de NLRP3 vindt plaats via een proces in twee fasen8. De eerste stap van het "priming" vindt plaats via de erkenning door Toll-like receptors (TLR) van een microbiële product. Dit wordt gerepliceerd in het laboratorium-omgeving met behulp van LPS TLR4 stimuleren. Deze stimulatie upregulates NLRP3 en pro-IL-1β door signalering van NF-kB. Bovendien priming licenties NLRP3 via niet-transcriptionele mechanismen door inducerende haar deubiquitination9,10 en fosforylering of defosforylerings van bepaalde residuen11,12.

Het tweede signaal voor NLRP3 activering wordt gedacht aan het betrekken van mitochondriale factoren, reactieve zuurstof soorten, efflux van kalium en calcium signalering, hoewel een verenigende mechanisme voor NLRP3 activering ongrijpbaar8 blijft. Geactiveerde NLRP3 oligomerizes door middel van interacties tussen de domeinen van de NACHT, en ASC werft via de binding van de pyrin (PYD) domeinen13. In elke cel vormen deze macromoleculaire complexen een enkele microscopisch zichtbaar focus. ASC werd oorspronkelijk geïdentificeerd als een 22 KDa proteïne die vormt een "vlekje" tijdens de apoptosis van menselijke leukemie cellen en benoemde apoptosis-geassocieerde speck-achtige eiwitten met een kaart14. Later werd vastgesteld dat ASC pro-caspase-1 door de interactie van de kaart van ASC met de kaart van pro-caspase-1 werft, vormen de inflammasome15.

Niet alle NLRs vereisen de aanwezigheid van ASC ertoe caspase-1 activering. In tegenstelling tot NLRP3, NLRC4 en NLRP1b CARD domeinen hebt en pro-caspase-1 via CARD-CARD interacties voor het opwekken van caspase-1 activering rechtstreeks kunnen aanwerven. Bij gebrek aan ASC, actieve caspase-1 blijft diffuus in het cytosol en vormt niet een interne focus. Dit diffuse actieve caspase-1 is voldoende voor het opwekken van de dood van de cel van de pyroptotic, maar is niet pro-IL-1β13,16te verwerken.

In dit manuscript, zullen we beoordelen inflammasome activeren op twee manieren. De eerste maakt gebruik van de fluorescerende activiteit probe, FAM-YVAD-FMK, die bindt de caspase-1 familie van proteasen. Deze familie omvat caspase-1, maar ook de muis caspase-11 en menselijke caspase-4 en caspase-5. Met behulp van macrofagen van caspase-1/11 deficiënte muizen in alle experimenten, zal de specificiteit van deze sonde worden aangepakt. Deze methode kan worden gecombineerd met het antilichaam labeling van componenten van de inflammasome, die we ook zullen beschrijven. Microscopische visualisatie maakt de identificatie van de individuele cellen met actieve caspase-1 en oligomerized ASC. Met behulp van deze methode, zal onderzoekers kunnen bepalen waar in de inflammasome formatie cascade hun manipulaties van de gastheercel of het ziekteverwekkende organisme onder studie een effect hebben. Men kan bijvoorbeeld, of een bepaalde interventie voorkomt u dat de aanwerving van ASC tot de complexe NLRP3 richt zich op de latere werving en activering van caspase-117onderscheiden. Behandeling van de resultaten van caspase-1 activering zoals IL-1β afscheiding zou niet kunnen onderscheid maken tussen deze twee mogelijkheden. Ook kan de secretie van IL-1β worden gewijzigd zonder dat het vermogen van de cellen te activeren caspase-1 en pyroptotic cel dood16ondergaan.

De tweede methode meet de introductie van lactaat dehydrogenase (LDH) in de cel supernatant, die optreedt tijdens pyroptotic macrofaag lysis caspase-1 activering na zoals hierboven beschreven. Deze tweede methode is een populatie gebaseerde benadering het uitbrengen van LDH in het hele goed is gemeten. Deze eenvoudige aanpak zorgt voor de snelle analyse (30 min van incubatietijd) van monsters om te bepalen als er caspase-1-gemedieerde celdood en kan worden uitgevoerd in een 96-wells-plaat-indeling.

Deze methoden zijn complementair, elk met verschillende voordelen, en beide zijn gemakkelijk vatbaar voor wijzigingen. Macrophage behandeling met gerichte kleine molecuulgewicht verbindingen vóór inflammasome stimulatie kan bijvoorbeeld worden gebruikt te onderzoeken van de rol van bepaalde eiwitten kunnen hebben over de beheersing van de inflammatoire reacties.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dierlijke procedures werden goedgekeurd en uitgevoerd onder de Universiteit van Washington institutionele Animal Care en gebruik Comité richtsnoeren.

1. de oogst van het beenmerg

  1. Aseptisch Verwijder van het bovenbeen en onderbeen van een muis en reinig de botten met behulp van steriele instrumenten. Plaats de schoongemaakte botten in Dulbecco bewerkt Eagle Medium (DMEM) + 5 mM HEPES 0,2 mg/mL L-glutamine + 0.05 mM 2-mercaptoethanol + gentamicine-sulfaat 50 mg/mL + 10.000 U/mL penicilline/streptomycine + 10% foetale runderserum (FBS, DMEM-10 compleet) en Incubeer de buis op ijs gedurende 15 minuten.
  2. Verwijder de gewrichten van de proximale en distale bal met behulp van schaar. Invoegen van een naald van de 25 G gekoppeld aan een 10 mL spuit gevuld met medium in de holte van de botten. Spoelen van het beenmerg met behulp van DMEM-10 compleet. Resuspendeer klontjes door pipetteren zachtjes op en neer het medium.
  3. De cellen gedurende 10 minuten bij 300 x g centrifugeren en tellen van het aantal cellen met behulp van een hemocytometer. Op dit moment bevriezen van de cellen met behulp van 90% FBS + 10% dimethylsulfoxide (DMSO) of plaat van de cellen in een 15 cm petrischaal te onderscheiden van macrofagen met behulp van L929 geconditioneerd medium (stap 2.1).

2. de differentiatie van het beenmerg-afgeleide macrofagen

  1. Met behulp van voorverwarmde differentiatie medium (21 mL van DMEM-10 compleet en 9 mL van L929 cel geconditioneerd medium zoals beschreven door Swanson et al. 18), zet het beenmergcellen in een 15 cm niet-Weefselkweek behandeld petrischaal (1.2-1.5 x 107 cellen). Incubeer de plaat bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 7 dagen. Voeg een extra 30 mL van differentiatie medium aan de plaat op dag 3 of 4.
    Opmerking: Het is belangrijk niet te gebruiken van weefselkweek behandeld platen, zoals macrofagen moeilijk zullen te ontkoppelen en te oogsten.
  2. Het verzamelen van macrofagen, wassen van de plaat met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en Voeg 20 mL koude PBS + 1 mM ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA). Incubeer de plaat bij 4 ° C voor 10 min. oogst de cellen door de PBS + EDTA pipetteren over de gewenste cellen en wassen van de plaat met 10 mL PBS. Combineer beide wast in twee 15 mL conische buizen.
  3. Centrifugeer de cellen bij 300 x g gedurende 10 minuten en resuspendeer de cellen in 10 mL gratis DMEM van fenol-rood + 5 mM HEPES + 0,2 mg/mL L-glutamine + 0.05 mM 2-mercaptoethanol + 5% FBS (DMEM-5) en de cellen met een hemocytometer of een teller Coulter tellen. Houd de cellen op het ijs tijdens het tellen.
  4. Beënt de macrofagen in weefselkweek gecoate platen bij 2 x 105 cellen/mL. Zaad voor microscopie experimenten, 1 mL van cellen op coverslips in 24 goed platen. Zaad voor LDH release assays, 100 µL van cellen in een 96 goed bord. Zaad voor de LDH-assay, 9 wells (3 wells onbehandeld, 3 putjes met 100% lysis besturingselementen en 3 wells voor de experimentele prikkel).
  5. Centrifugeer de 96 goed plaat voor 5 min op 300 x g om er zeker van te zijn dat de cellen worden gelijkelijk verdeeld over de put.
  6. Incubeer de plaat 's nachts bij 37 ° C + 5% CO2 voordat de priming-proces.

3. priming

  1. Vervang het medium met verse medium (DMEM-5) met 100 ng/mL LPS (μL van de 500 voor de 24 goed plaat of 50 μl voor de 96 goed plaat).
    Opmerking: Er zijn een aantal structurele verschillen in LPS, die invloed hebben op het vermogen te stimuleren TLR4-gemedieerde priming19. LPS van Salmonella minnesota R595 (Re) is verkrijgbaar bij meerdere leveranciers en wordt aanbevolen.
  2. Incubeer de plaat gedurende 3 uur bij 37 ° C en 5% CO2.

4. de activering van het NLRP3 Inflammasome met Nigericin en labelen met FAM-YVAD-FMK

  1. Verwijder het medium en 290 μL van DMEM-5 met 5 μM nigericin en 5 mM glycine te vervangen. Glycine is toegevoegd aan het verminderen van de hoeveelheid lysis van de cel dat zich tijdens caspase-1 activering5 voordoet. Incubeer gedurende 60 minuten bij 37 ° C en 5% CO2. Wild type zowel caspase-1 gebrekkig macrofagen gebruiken om ervoor te zorgen dat de waargenomen labelen specifiek voor caspase-1.
  2. Tijdens de laatste 45 min, toevoegen 10 μL van 30 x FAM-YVAD-FMK, bereid volgens de instructies van de fabrikant.
  3. Na 60 min, verwijder het medium en wassen van de cellen drie keer, gedurende 5 minuten elk met 1 mL koude PBS.
  4. 250 μL van 2% paraformaldehyde toevoegen aan elk putje en incubeer op ijs bedekt met aluminiumfolie voor 30 min.
  5. Tijdens de laatste 5 min, toevoegen 4 μL van 0,2 mM far-red fluorescerende nucleïnezuur vlek op het etiket van de kernen. Label DNA kunnen ook 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) of andere kleurstoffen worden gebruikt.
  6. Wassen van de cellen drie keer met 1 mL koude PBS en monteer de coverslips op Microscoop dia's met behulp van 7 μL anti-fade montage medium. Laat het medium van de montage harden afgelopen nacht voor het afdichten van het dekglaasje aan naar de Microscoop-dia met behulp van nagellak.
  7. Het imago van de macrofagen door confocale microscopie. Ex / Em voor FAM-YVAD-FMK is 492/520nm en 642/661 voor far-red fluorescerende nucleïnezuur vlek. Zorg ervoor dat de Microscoop instellen zodanig dat onbehandeld cellen vertonen geen vlekken in de 488 kanaal achtergrond. Anders zal achtergrondkleuring FAM-YVAD-FMK worden gevonden en niet de feitelijke actieve caspase-1.
    Opmerking: Microscoop set-up wordt beschreven in sectie 6.

5. antilichaam kleuring

Opmerking: Als u het label van de cellen met antilichamen tegen ASC detecteren, zaad, prime en bloot de cellen nigericin identiek aan de vorige sectie. De verwerking achteraf is als volgt:

  1. Wassen van de cellen drie keer, gedurende 5 minuten elk met 1 mL koude PBS. Voeg toe 250 μL van fixatie en permeabilization oplossing. Incubeer de cellen op ijs en voor 30 min gedekt.
  2. Wassen van de macrofagen drie keer, gedurende 5 minuten elk met 1 mL van was buffer.
  3. Voeg 250 μL van primair antilichaam tegen ASC verdund 1:500 in was buffer en incubeer gedurende 1 h op ijs. Omvatten een dekglaasje aan dat elke primair antilichaam niet ontvangt, maar ontvangt alleen de secundaire. Deze dekglaasje aan zal worden gebruikt tijdens de installatie van Microscoop de juiste verschuiving wilt instellen.
  4. Wassen van de cellen drie keer, gedurende 5 minuten, elk met 1 mL was buffer.
  5. Voeg toe 250 μL van secundair antilichaam (fluorescente kleurstof geconjugeerd geit-anti-muis) verdund 1:500 in was buffer en incubeer gedurende 1 h op ijs. 4 μL van 0,2 mM far-red fluorescerende nucleïnezuur vlek voor de laatste 5 min van deze incubatie aan label kernen toevoegen.
  6. Wassen van de cellen 3 x met 1 mL koud was buffer en monteer de coverslips op Microscoop dia's met behulp van 7 μL anti-fade montage medium. Laat het medium van de montage harden afgelopen nacht voor het afdichten van het dekglaasje aan naar de Microscoop-dia met behulp van duidelijke nagellak.
  7. Afbeelding macrofagen door confocale microscopie. Ex / Em voor het secundaire antilichaam is 555/580 nm en 642/661 voor far-red fluorescerende nucleïnezuur vlek (zoals hieronder beschreven).
    Opmerking: Labelen met FAM-YVAD-FMK en labelen van antilichaam kan worden gecombineerd zodat co lokalisatie van actieve caspase-1 en ASC. Hiervoor volg de voorwaarden voor het labelen van de FAM-YVAD-FMK en schakel over naar het antilichaam labeling protocol voor verdere verwerking.

6. beeldvorming van gelabelde macrofagen door confocale microscopie

Opmerking: De gekleurde cellen kunnen worden bekeken nadat de coverslips hebben toestemming gekregen om te genezen overnachten en naar de Microscoop dia met nagellak zijn verzegeld. Hier, wordt beeldvorming met behulp van een confocal microscoop beschreven. Cellen kunnen ook worden bekeken door standaard fluorescentie microscopie.

  1. Plaats van de dia met de onbehandelde cellen in het werkgebied van de Microscoop en het concentreren van de Microscoop op de cellen.
  2. Met behulp van de Microscoop Look Up Table (LUT) aanpassen instellingen, de verschuiving zodat er geen positieve FAM-YVAD-FMK vlekken in de onbehandelde cellen. Dit proces kan ook worden uitgevoerd met behulp van caspase-1 gebrekkig macrofagen.
    Opmerking: De offset moet worden aangepast voor elk kanaal dat wordt gebruikt in het experiment, maar het instellen van de juiste offset is meest kritisch voor de FAM-YVAD-FMK kanaal en fluorescerende antilichamen kanalen. De verschuiving voor de DNA-kanaal is minder kritisch. Zodra de offset is vastgesteld, deze instelling voor de rest van het experiment niet aanpassen.
  3. Zet de dia aan het monster nigericin behandeld. Het vinden van een veld dat beide cellen die positief en negatief bevat voor FAM-YVAD-FMK kleuring zijn. Pas het imaging vliegtuig van de FAM-YVAD-FMK kanaal naar het vliegtuig dat de hoogste intensiteit van positieve kleuring heeft. Dit zal normaal het vliegtuig waar het midden van de inflammasome-focus is beeld.
  4. Stel de winst zo in dat foci zijn zichtbaar in cellen die verkorte kernen zijn. Na het instellen van zowel winst en offset, laat u deze instellingen voor de rest van de imaging-sessie.
    Opmerking: Een gemakkelijke manier om te bepalen of een cel pyroptotic is door te kijken naar nucleaire morfologie. Cellen met actieve caspase-1 hebben afgerond en verkorte kernen, terwijl nucleoli zijn zichtbaar in cellen zonder caspase-1 activering en de nucleaire morfologie is vergelijkbaar met die van onbehandeld cellen.
  5. Het verzamelen van beelden van 5 willekeurig geselecteerde velden bij 100 X totale vergroting. Dit zal normaal gesproken resulteren in ongeveer 40 cellen per beeld. Herhaal dit proces voor elk monster.
  6. Het aantal cellen in elk beeld met behulp van de software van de analyse van de afbeelding. Dan tellen het aantal cellen met positieve FAM-YVAD-FMK kleuring. Vertegenwoordigen van het niveau van caspase-1 activering als het percentage van de FAM-YVAD-FMK positieve cellen.

7. LDH Release Assay

Opmerking: Voor de LDH release assay, zaad en prime die de cellen zoals beschreven in de vorige sectie, behalve een 96 goed plaat gebruiken. Verwijder het medium niet na priming.

  1. Voeg 50 l DMEM-5 met 10 μM nigericin de experimentele putjes en 50 μl DMEM-5 tot en met de spontane en 100% lysis-controleputjes. Voeg geen glycine in dit experiment omdat het doel is om te meten van lysis van de cel. Incubeer gedurende 60 minuten bij 37 ° C en 5% CO2.
  2. Na 30 min, 10 μL van 10 x lysis buffer naar de 100% lysis-controleputjes en voeg toe 10 μL van DMEM-5 de andere putjes. Tijdens deze incubatie, 1 flacon van substraat mix (1,5 mL van gevriesdroogd substraat) en 1 hoeveelheid assay buffer (~ 12 mL) verwijderen uit de vriezer en laat ze ontdooien beschermd tegen licht tot kamertemperatuur.
    Opmerking: De substraat-mix bevat een tetrazolium zout (iodonitro-tetrazolium violet), die wordt geconverteerd naar een rode formazan-product.
  3. Na de totale broedtijd van 60 min, centrifugeer de plaat gedurende 5 minuten bij 500 x g bij 10 ° C. 50 μL van de bovendrijvende substantie overbrengen in een duidelijk flat-bodemplaat. Gedurende deze tijd, 12 mL buffer assay Voeg aan de flacon van substraat mix en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten voordat u gebruikt.
  4. Voeg 50 l substraat aan elk putje en incubeer gedurende 30 min. in het donker. Middellange enige putten voor lege waarden bevatten. Check de plaat na 15 min om ervoor te zorgen dat het signaal niet meer dan de detectiegrens van de afleesapparaat.
  5. Na 30 min, voeg 50 l eindeoplossing (1 M azijnzuur) en meet OD490 met behulp van een afleesapparaat.
  6. Bereken het percentage van lysis van de cel met de volgende formule:
    % Cytotoxiciteit = ((Experimental-Spontaneous) / (maximale-spontane)) × 100
    Experimental: nigericin behandeld cellen; spontane: onbehandeld cellen; maximale: cellen blootgesteld aan lysis-buffermengsel

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

U wilt opsporen caspase-1 activering na de blootstelling aan nigericin, werden de cellen verwerkt zoals beschreven in de sectie protocol. We combineren zowel FAM-YVAD-FMK en ASC antilichaam labelen om aan te tonen dat ASC en actieve caspase-1 mede lokaliseren na inflammasome NLRP3-gemedieerde activering. Figuur 1A blijkt dat wild type macrofagen blootgesteld aan 5 μM nigericin vorming van een focus van ASC in de perinuclear-regio. Deze foci bevatten ook actieve caspase-1 zoals gezien door de mede lokalisatie van ASC met FAM-YVAD-FMK. De cellen die positief voor actieve caspase-1 zijn hebben nucleaire condensatie waaruit blijkt dat deze cellen pyroptosis ondergaan. Figuur 1B laat zien dat terwijl macrofagen van caspase-1/11 deficiënte muizen de vorming van een focus van de ASC hebben, zij geen enkele actieve caspase-1 die samenhangen met deze focus hebben als aangetoond door de afwezigheid van FAM-YVAD-FMK kleuring. De kernen van deze cellen zijn niet verdicht, waarmee wordt aangegeven dat er geen pyroptotic cel dood voorkomen. Beelden werden genomen met behulp van een scanning confocal microscoop met een 63 X olie onderdompeling doelstelling. Afbeeldingen zijn opgeslagen als TIFF-bestanden zonder enige verdere verwerking.

Om te bepalen van het niveau van de dood van de cel die is gekoppeld aan de blootstelling aan nigericin, we een LDH release assay uitgevoerd op de cultuur bezinken. Figuur 2 toont dat wild type macrofagen ondergaan celdood na de blootstelling aan nigericin. In tegenstelling, vrijgeven macrofagen tekort aan caspase-1 niet LDH in het supernatant van de cel, die aangeeft dat de cellen intact zijn.

Figure 1
Figuur 1: FAM-YVAD-FMK en labelen van anti-ASC. (A) Wild type (WT) en (B) caspase-1/11 deficiente (c1/11- / -) macrofagen waren blootgesteld aan 5 μM nigericin voor 1 h en geanalyseerd voor actieve caspase-1 door confocale microscopie met behulp van FAM-YVAD-FMK actieve caspase-1 en anti-ASC primaire en geit-anti-muis secundaire antilichamen te detecteren ASC richten vorming. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: LDH release assay resultaten. Wild type en caspase-1/11 gebrekkig macrofagen werden blootgesteld aan 5 μM nigericin voor 1 h en cel supernatant werd geanalyseerd voor de aanwezigheid van LDH. Gegevens zijn middelen ± SD van drie wordt gerepliceerd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In dit manuscript, hebben we twee technieken te onderzoeken inflammasome activering en het gevolg van caspase-1 activering na stimulatie van de NLRP3 in lymfkliertest beenmerg-afgeleide macrofagen gepresenteerd. De eerste techniek laat toe de onderzoeker om te bepalen van het niveau van caspase-1 activering op basis van de fluorescerende verslaggever FAM-YVAD-FMK een cellulaire. Deze verslaggever is zeer specifiek voor het binden van de caspase-1 familie van enzymen, zoals gezien door het ontbreken van kleuring in caspase-1/11 gebrekkig macrofagen. Specificiteit was ook te zien door LaRock et al. in hun manuscript met een beschrijving van de rol van de Yersinia proteïne YopM op caspase-1 activering. In hun manuscript, ze laten zien dat er FAM-YVAD-FMK foci overlapt met foci die waren gelabeld met antilichamen gericht tegen caspase-117.

Zoals het geval is met een experiment, zijn er enkele kritische stappen die worden gevolgd moeten om het elimineren van vals-positieve resultaten. Allereerst is het noodzakelijk te gebruiken wild type zowel caspase-1/11 gebrekkig macrofagen. Met behulp van deze twee celtypes, kunnen de omstandigheden die tot het niet-specifieke kleuring leiden worden uitgesloten van verdere analyse. Tweede, zoals met een antilichaam of activiteit sonde labeling assay, is het belangrijk om de cellen na kleuring met FAM-YVAD-FMK grondig te wassen. Met behulp van drie 5 min wast, is het niveau van achtergrond signaal sterk verminderd. Een derde belangrijke stap treedt op tijdens de installatie van de confocal microscoop. Hier, is het belangrijk dat onbehandeld cellen voorzien van FAM-YVAD-FMK stelt u de verschuiving van de confocal microscoop op zodanige wijze dat geen positieve cytoplasmatische kleuring wordt waargenomen in de onbehandelde cellen worden gebruikt. Bij deze stappen worden gevolgd, is deze techniek een nuttig instrument om te beoordelen van de activering van caspase-1 op basis van cellulaire.

Dit protocol kan worden gewijzigd om in de behoeften van de onderzoekers. Bijvoorbeeld, kunnen de cellen worden behandeld met kleine molecuulgewicht verbindingen op verschillende stappen tijdens het hele proces. Hierdoor zouden voor de identificatie van de trajecten die de oligomerisatie van het NLR, de aanwerving van ASC of pro-caspase-1, moduleren of de activering van caspase-1 zelf. De voorgestelde wijzigingen van dit protocol moeten zodanig zijn dat zij niet activeert caspase-1 door zelf. Als dit gebeurt, wordt een dosis-responscurve van het geneesmiddel in kwestie nodig is. Hoewel we op de activering van de NLRP3 inflammasome gericht, kan dit protocol ook te onderzoeken van de inflammasomes veroorzaakt door andere PRRs worden gebruikt. Een andere wijziging die wij hebben opgenomen in dit manuscript is de combinatie van FAM-YVAD-FMK kleuring met antilichaam etikettering van inflammasome componenten. We laten zien dat er mede lokalisatie van de inflammasome adapter ASC met actieve caspase-1. Een beperking van deze methode is zoals beschreven, dat er toegang tot een confocal microscoop. Een verwante strategie ASC focus vorming worden opgespoord door stroom cytometry is echter gemeld20,21.

De tweede techniek die we besproken voorziet in de snelle detectie van lysis van de cel met behulp van een LDH release assay. Het is belangrijk op te merken dat LDH release verlies van plasmamembraan, integriteit en cel lysis, die ook optreedt tijdens de vele andere vormen van dood van de cel geeft, en is niet specifiek voor pyroptosis. Echter, het gebruik van caspase-1 gebrekkig cellen kunt identificeren lysis van de cel van de caspase-1-afhankelijk, een kenmerkend voor pyroptosis.

Een cruciale stap in dit protocol (vooral bij gebruik van een ziekteverwekker) is om de plaat na het zaaien van de cellen in een 96 goed plaat centrifugeren. Centrifugeren van de plaat zorgt voor gelijke verdeling van macrofagen over het gehele oppervlak van de put. Met gelijke verdeling, zal elke macrofaag worden blootgesteld aan hetzelfde aantal bacteriën. Zonder centrifugeren, zal de meniscus van de vloeistof in de put leiden tot meer macrofagen zich ophopen aan de rand van de put. Dit zou leiden tot lagere dan de beoogde multipliciteit van infectie (MOI) dicht tegen de muur goed en hoger dan bedoeld MOI in het midden van de put.

Een potentieel nadeel van het LDH release assay is dat het lysis op een bevolkingsniveau en op een enkel tijdstip per test meet. Een alternatieve benadering is te kwantificeren opname van cel impermeant kleurstoffen door microscopie, waarmee u verlies van de membraan integriteit op basis van één cel. In combinatie met levende cel imaging platformen, bieden deze aanpak ook een temporele beoordelingvan pyroptosis22. Kleine DNA-bindende fluorescerende kleurstoffen zoals propidium jodide of ethidiumbromide kan passeren de porie gasdermin D, cellulaire nucleic zuren te binden en lichten van5,22,23. Porie vorming en verbreiding van deze kleine kleurstoffen stoffelijk vóór terminal cellysis. Lysis kunt verbreiding van grotere kleurstoffen en verlies van grote cellulaire eiwitten zoals LDH. Het gebruik van glycine kan experimenteel afkoppelen porie vorming van lysis, glycine doet niet takel gasdermin D-gemedieerde porie vorming, kleine kleurstof opname of IL-1β-secretie, maar glycine belet de lysis van de snelle en LDH release5,22 , 23 , 24. Wij stellen voor met inbegrip van glycine in FAM-YAVD-FMK kleuring experimenten om compleet verlies van de membraan integriteit te voorkomen, maar glycine moet worden weggelaten bij het meten van pyroptotic LDH release.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen conflicten van belang om bekend te maken

Acknowledgments

Alle microscopie werd uitgevoerd bij het W. M. Keck microscopie centrum met steun van Nathaniel Peters en met ondersteuning van NIH award S10OD016240. S.L.F. wordt ondersteund door de NIH K08AI119142 en R21AI130281. Wij danken Dr. Richard Flavell en Dr. Brad Cookson voor caspase-1/11 deficiënte muizen, en Dr. Brad Cookson voor het delen van laboratoriumfaciliteiten en apparatuur.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
E-MEM ATCC 30-2003 For growing L929 cells
NCRC clone 929 (L929) ATCC CCL-1
Fixation/Permeabilization Kit BD Biosciences 554714 Includes fixation and permeabilization solution, and wash buffer. Proprietary formulations. Contains 4.2% formaldehyde
Glycine Biorad 161-0718
Cytotox96 Nonradioactive cytotoxicity assay Fisher Scientific PR-G1780 Includes Substrate Mix and Assay Buffer; Proprietary formulations. Stop solution is 1 M Acetic acid
FAM-YVAD-FMK Immunocytochemistry Technologies 98
DMEM, high glucose, no glutamine Invitrogen 11960044
DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red Invitrogen 31053028
Dulbecco's PBS, no calcium, no magnesium Invitrogen 14190144
Fetal Bovine Serum, qualified, US origin Invitrogen 26140079 Heat inactivated at 55°C for 50 min
Gentamicin Invitrogen 15750060
ProLong Gold Mounting Medium Invitrogen p36934 Proprietary formulation. Curing mounting medium. Hardens to refractory index of 1.46
goat anti-mouse ALEXA555 Invitrogen A-21422
HEPES (Ultra Pure) Invitrogen 11344041
L-Glutamine Invitrogen 21051024
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15140122
TO-PRO-3 Iodide Invitrogen T3605 far-red fluorescent nucleic acid stain
C57BL/6J mouse Jackson Laboratoy 000664
caspase-1/11-/- mouse Jackson Laboratory 016621
Leica SP8X Confocal Microscope Leica
Ultrapure LPS from Salmonella minnesota R595 (Re) List Biologicals 434
anti-ASC clone 2EI-7 Millipore-Sigma 04-417
beta-mercapto-ethanol Millipore-Sigma M6250-10ML
DMSO Millipore-Sigma D2650-5X10ML
EDTA Millipore-Sigma E5391
Spectramax M3 plate reader Molecular Devices 5000414

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jorgensen, I., Miao, E. A. Pyroptotic cell death defends against intracellular pathogens. Immunol Rev. 265 (1), 130-142 (2015).
  2. Guo, H., Callaway, J. B., Ting, J. P. Inflammasomes: mechanism of action, role in disease, and therapeutics. Nat Med. 21 (7), 677-687 (2015).
  3. Bergsbaken, T., Fink, S. L., Cookson, B. T. Pyroptosis: host cell death and inflammation. Nat Rev Microbiol. 7 (2), 99-109 (2009).
  4. Martinon, F., Burns, K., Tschopp, J. The inflammasome: a molecular platform triggering activation of inflammatory caspases and processing of proIL-beta. Mol Cell. 10 (2), 417-426 (2002).
  5. Fink, S. L., Cookson, B. T. Caspase-1-dependent pore formation during pyroptosis leads to osmotic lysis of infected host macrophages. Cell Microbiol. 8 (11), 1812-1825 (2006).
  6. Bergsbaken, T., Fink, S. L., den Hartigh, A. B., Loomis, W. P., Cookson, B. T. Coordinated host responses during pyroptosis: caspase-1-dependent lysosome exocytosis and inflammatory cytokine maturation. J Immunol. 187 (5), 2748-2754 (2011).
  7. Shi, J., et al. Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death. Nature. 526 (7575), 660-665 (2015).
  8. Sutterwala, F. S., Haasken, S., Cassel, S. L. Mechanism of NLRP3 inflammasome activation. Ann N Y Acad Sci. 1319, 82-95 (2014).
  9. Juliana, C., et al. Non-transcriptional priming and deubiquitination regulate NLRP3 inflammasome activation. J Biol Chem. 287 (43), 36617-36622 (2012).
  10. Py, B. F., Kim, M. S., Vakifahmetoglu-Norberg, H., Yuan, J. Deubiquitination of NLRP3 by BRCC3 critically regulates inflammasome activity. Mol Cell. 49 (2), 331-338 (2013).
  11. Song, N., et al. NLRP3 Phosphorylation Is an Essential Priming Event for Inflammasome Activation. Mol Cell. 68 (1), 185-197 (2017).
  12. Stutz, A., et al. NLRP3 inflammasome assembly is regulated by phosphorylation of the pyrin domain. J Exp Med. 214 (6), 1725-1736 (2017).
  13. Broz, P., Dixit, V. M. Inflammasomes: mechanism of assembly, regulation and signalling. Nat Rev Immunol. 16 (7), 407-420 (2016).
  14. Masumoto, J., et al. ASC, a novel 22-kDa protein, aggregates during apoptosis of human promyelocytic leukemia HL-60 cells. J Biol Chem. 274 (48), 33835-33838 (1999).
  15. Yamamoto, M., et al. ASC is essential for LPS-induced activation of procaspase-1 independently of TLR-associated signal adaptor molecules. Genes Cells. 9 (11), 1055-1067 (2004).
  16. Miao, E. A., Rajan, J. V., Aderem, A. Caspase-1-induced pyroptotic cell death. Immunol Rev. 243 (1), 206-214 (2011).
  17. LaRock, C. N., Cookson, B. T. The Yersinia virulence effector YopM binds caspase-1 to arrest inflammasome assembly and processing. Cell Host Microbe. 12 (6), 799-805 (2012).
  18. Swanson, M. S., Isberg, R. R. Association of Legionella pneumophila with the macrophage endoplasmic reticulum. Infect Immun. 63 (9), 3609-3620 (1995).
  19. Miller, S. I., Ernst, R. K., Bader, M. W. LPS, TLR4 and infectious disease diversity. Nat Rev Microbiol. 3 (1), 36-46 (2005).
  20. Sester, D. P., et al. A novel flow cytometric method to assess inflammasome formation. J Immunol. 194 (1), 455-462 (2015).
  21. Sester, D. P., et al. Assessment of Inflammasome Formation by Flow Cytometry. Curr Protoc Immunol. , (2016).
  22. DiPeso, L., Ji, D. X., Vance, R. E., Price, J. V. Cell death and cell lysis are separable events during pyroptosis. Cell Death Discov. , (2017).
  23. Russo, H. M., et al. Active Caspase-1 Induces Plasma Membrane Pores That Precede Pyroptotic Lysis and Are Blocked by Lanthanides. J Immunol. 197 (4), 1353-1367 (2016).
  24. Evavold, C. L., et al. The Pore-Forming Protein Gasdermin D Regulates Interleukin-1 Secretion from Living Macrophages. Immunity. , (2017).

Tags

Immunologie en infecties probleem 135 immunologie aangeboren immuniteit inflammasome caspase-1 ASC NLRP3 pyroptosis nigericin lymfkliertest beenmerg-afgeleide macrofagen
Detectie van Inflammasome-activering en Pyroptotic celdood in lymfkliertest beenmerg-afgeleide macrofagen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

den Hartigh, A. B., Fink, S. L.… More

den Hartigh, A. B., Fink, S. L. Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages. J. Vis. Exp. (135), e57463, doi:10.3791/57463 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter