Summary
형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 및 활성 caspase-1와 어댑터, ASC에 대 한 얼룩 세포질 기준 NLRP3 inflammasome 활성화의 탐지를 설명 합니다. 젖 산 효소 자료 분석 결과 인구 기준 pyroptotic 세포를 감지 하 여. 이 기술은 inflammasome 생물학의 여러 측면을 연구 적응 될 수 있다.
Abstract
Inflammasomes는 많은 병원 성 생물의 성공적인 제어에 필요한 하지만 또한 염증 촉진 하는 타고 난 면역 신호 플랫폼 autoinflammatory 질병. Inflammasomes 끄 덕 같은 수용 체 (NLR) 가족의 일원을 포함 하 여 cytosolic 패턴 인식 수용 체에 의해 활성화 됩니다. 이 수용 체는 미생물 또는 손상 관련 된 자극의 감지 시 oligomerize. 접합 기 단백질 ASC의 후속 모집 caspase-1 근접 유도 자동 활성화를 통해 활성화 현미경으로 보이는 inflammasome 복잡 한, 형성 한다. 활성화, 따라 caspase-1 프로-일리노이-1β 및 프로-일-18, 활성화 및 이러한 프로 염증 성 cytokines의 분 비를 앞. Caspase-1는 또한 염증 성 형태의 세포 죽음 pyroptosis, 기능 막 무결성 및 셀 세포의 손실이 되 나 중재. Caspase-1 gasdermin D, 원형질 막 숨 구멍을 형성 하는 N 맨끝 파편 공개 삼투성 세포로 이어지는 앞.
골 수 유래 세포 caspase-1 활동 프로브 팸-YVAD-FMK의 라벨 및 어댑터 단백질 ASC에 대 한 항 체와 함께 셀 라벨 시험관, caspase-1의 활성화를 확인할 수 있습니다. 이 기술은 inflammasome 형성 및 caspase-1 활성화 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 개별 셀에 식별 수 있습니다. Pyroptotic 세포 죽음은 매체에 cytosolic 젖 산 효소의 릴리스를 측정 하 여 검색할 수 있습니다. 이 절차는 간단 하 고 비용 효과적인 심사에 대 한 적응을 허용 96 잘 접시 형태로 수행 합니다. 이 원고에서 우리 표시 nigericin, NLRP3 inflammasome의 활성화 어댑터 단백질 ASC 및 활성 caspase-1, 공동 현지화를 리드 pyroptosis로 이어지는.
Introduction
Inflammasome 중재 염증 병원 성 유기 체1에 대 한 방어의 중요 한 구성 요소 이지만, 또한 많은 질병2의 병 인 기초. 다양 한 감염에 염증 반응을 병원 체 관련 된 분자 패턴 (PAMPs)의 cytosolic 탐지에 의해 트리거되는 또는 손상 관련 된 분자 패턴 (DAMPs). 패턴 인식 수용 체 (PRR), 끄 덕 임 같이 수용 체 (NLR) 가족의 일원을 포함 하 여 이러한 감지 시 oligomerize PAMPs 및 DAMPs. 이 다중 단백질 복잡 한 inflammasome, PRR, Apoptosis 관련 스펙 같은 단백질 C 터미널 caspase 신규 모집 도메인 (카드) (ASC), 그리고 프로 형태의 포함 된 어댑터 단백질을 포함 하 되 나의 형성을 유발 caspase-13,4. 이 복잡 한 근접 유도 caspase-1의 자동 활성화 수 있습니다. 활성 caspase-1 다음 이벤트 염증 성 세포 죽음 통로 pyroptosis의 특성 집합을 리드. 이 이벤트에 포함 됩니다: 분열 그리고 염증 성 cytokines 일리노이-1β 및 세포 외 공간, 핵 응축 및 gasdermin D 분열에 lysosomal 내용의 출시와 함께 리소좀 exocytosis IL 18의 릴리스. Gasdermin D의 출시 된 N 맨끝 도메인 원형질 막 파열 및 병원 체 복제5, 에 대 한 보호 틈새를 데 려 하는 것 외에도 염증 성 내용의 자료를 일으키는 원인이 되는 숨 구멍을 형성 하는 원형질 막에 삽입 6 , 7.
여기, 우리는 잘 공부 NLRP3 inflammasome에 집중 한다. NLRP3 inflammasome의 활성화 2 단계 과정8통해 발생합니다. "프라이 밍"의 첫 번째 단계는 미생물 제품의 통행세 같이 수용 체 (TLR)에 의해 인식 통해 발생합니다. 이 LPS TLR4 자극을 사용 하 여 실험실에서 복제 됩니다. 이 자극 upregulates NLRP3 및 프로-일리노이-1β NF kB 신호를 통해 합니다. 또한 못쓰게 비 transcriptional 메커니즘을 통해 유도 deubiquitination9,10 및 인 산화 또는 특정 잔류물11,12dephosphorylation NLRP3 라이센스.
NLRP3 정품 인증에 대 한 두 번째 신호는 미토 콘 드 리아 요인, 반응성 산소 종, 칼륨 경과 및 신호, 칼슘을 포함 하는 NLRP3 활성화를 위한 통합 메커니즘 애매8남아 있지만 생각 된다. 활성화 된 NLRP3의 시 1 도메인 간의 상호 작용을 통해 oligomerizes 그리고 pyrin (PYD) 도메인13의 바인딩을 통해 ASC 신병. 각 셀에 이러한 고분자 단지 단일 현미경으로 보이는 초점을 형성 한다. ASC 22 KDa 단백질 인간의 백혈병 세포의 apoptosis 동안 "반점"를 형성 하 고 명명 된 apoptosis 관련 스펙 같은 단백질 포함 된 카드14원래 확인 되었다. 그것은 나중에 ASC 프로-caspase-1 inflammasome15형성 프로-caspase-1의 카드와 함께 ASC의 카드의 상호 작용을 통해 신병 결정 되었다.
모든 NLRs는 caspase-1 활성화를 유도 하는 ASC의 존재를 필요로. 달리 NLRP3, NLRC4 및 NLRP1b 카드 도메인 있고 프로-caspase-1 카드-카드 상호 작용 caspase-1 활성화 유도를 통해 모집 직접 수 있습니다. ASC의 부재, 활성 caspase-1는 cytosol에 걸쳐 확산 유적과 단일 초점을 형성 하지 않습니다. 확산이 활성 caspase-1 pyroptotic 세포 죽음을 유도 하기에 충분 하지만 프로 일 1β13,16처리할 수 있습니다.
이 원고에서 우리 inflammasome 활성화를 평가 하기 위해 두 가지 방법을 설명 합니다. 첫 번째 사용 하 여 형광 활동 프로브, FAM-YVAD-FMK, 프로 테아 제 caspase-1 제품군을 바인딩합니다. 이 가족 caspase-1, 또한 마우스 caspase-11와 인간의 caspase-4 caspase-5 포함 되어 있습니다. 모든 실험에 caspase-1/11 결핍 쥐에서 세포를 사용 하 여이 프로브의 특이성을 해결 것입니다. 이 방법은 항 체 또한 설명 합니다 inflammasome 부품의 라벨 결합 될 수 있다. 현미경 시각화는 개별 셀을 포함 하는 활성 caspase-1와 oligomerized ASC의 식별에 대 한 수 있습니다. 이 메서드를 사용 하 여, 연구원은 어디 inflammasome 형성 캐스케이드 호스트 셀 또는 연구에서 병원 성 유기 체 그들의 조작 효과가지고 결정할 수 됩니다. 예를 들어 하나의 주어진된 개입 복잡 한 NLRP3를 ASC의 채용을 방지 또는 후속 모집과 caspase-117의 활성화 여부를 구분할 수 있습니다. Caspase-1 활성화 IL 1β 분 비 등의 결과 검토 것 수 없습니다 이러한 두 가능성 사이 구별 하. 또한, IL 1β의 분 비는 caspase-1을 활성화 하 고 pyroptotic 세포 죽음16받을 수 셀을 변경 하지 않고 변경 될 수 있습니다.
두 번째 방법은 위에서 설명한 caspase-1 활성화 다음 pyroptotic 대 식 세포 세포의 용 해 도중 발생 하는 표면에 뜨는, 셀으로 젖 산 효소 (LDH)의 출시를 측정 합니다. 이 두 번째 방법은 전체에서 LDH의 릴리스 잘 측정은 인구에 기초를 둔 접근 이다.입니다. 이 간단한 접근 caspase 1 중재 하는 세포 죽음 인지 확인 하려면 샘플의 빠른 분석 (보육 시간 30 분)에 대 한 허용 하 고 96 잘 접시 형태로 수행할 수 있습니다.
이러한 메서드는 상호 보완적인, 각각 다른 장점, 그리고 둘 다 쉽게 수정 의무가 있습니다. 예를 들어 inflammasome 자극 이전 대상된 작은 분자량 화합물과 대 식 세포 치료 단백질에 선 동적인 응답을 제어 할 수 있습니다 특정 역할을 조사 하기 위해 사용할 수 있습니다.
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Protocol
모든 동물 절차 승인 되었고 워싱턴 기관 동물 관리 및 사용 위원회 지침의 대학에서 실시.
1입니다. 골의 수확
- Aseptically는 마우스에서 대 퇴 골과 경골을 제거 하 고 불 임 악기를 사용 하 여 뼈를 청소. Dulbecco 수정이 글 중간 (DMEM) + 5 mM HEPES + 0.2 mg/mL L-글루타민 + 0.05 m m 2-mercaptoethanol + 50 mg/mL gentamicin 황산 + 10000 U/mL 페니실린/스 + 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS, DMEM-10 완전 한) 청소 뼈를 놓고 알을 품는 15 분 동안 얼음에 튜브.
- 가 위를 사용 하 여 인접 및 원심 볼 관절을 제거 합니다. 중간 뼈의 구 렁에 가득 10 mL 주사기에 부착 된 25g 바늘을 삽입 합니다. DMEM-완전 한 10를 사용 하 여 골 수 밖으로 플러시. 어떤 덩어리를 pipetting 매체를 위아래로 부드럽게 하 여 resuspend.
- 셀 300 x g에서 10 분 원심 하 고는 hemocytometer를 사용 하 여 셀 수를 계산. 이 시점에서, 90 %FBS + 10% 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)를 사용 하 여 셀을 고정 하거나 접시 15cm L929 단련 중간 (단계 2.1)를 사용 하 여 세포 분화를 페 트리 접시에에서 셀.
2. 골 수 유래 세포의 분화
- 미리 데워 진된 차별화 매체 (DMEM-10 완전 한의 21 mL 및 L929 세포 조절 매체 스완 손 외 에 설명 된 대로의 9 mL를 사용 하 여 18) 15 cm에서 골 수 세포를 넣어 조직 문화 취급 페 트리 접시 (1.2-1.5 x 107 셀). 7 일 동안 37 ° C, 5% CO2 접시를 품 어. 하루 3 또는 4에 접시를 차별화 매체의 추가적인 30 mL를 추가 합니다.
참고: 그것은 중요 하다를 취급 하는 조직 문화 접시를 사용 하지 대 식 세포를 분리 하 고 수확 하기 어려울 것입니다. - 대 식 세포를 수집 하려면 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)와 접시를 세척 하 고 차가운 PBS + 1 mM ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 20 mL를 추가 합니다. 셀 위에 PBS + EDTA를 pipetting으로 셀 10 분 수확에 대 한 4 ° C에서 접시를 품 어 하 고 PBS의 10 mL와 함께 접시를 씻어. 두 개의 15 mL 원뿔 튜브에 두 세척을 결합 한다.
- 10 분에 대 한 300 x g에서 세포를 원심 및 페 놀 레드 무료 DMEM + 5 mM HEPES + 0.2 mg/mL L-글루타민 + 0.05 m m 2-mercaptoethanol, 5%의 10 mL에 셀 resuspend FBS (DMEM-5)는 hemocytometer 또는 Coulter 카운터 중 하나를 사용 하 여 셀을 카운트. 계산 하는 동안 얼음에 셀을 계속.
- 2 x 105 셀/mL에 코팅 하는 조직 문화 접시에 있는 대 식 세포 씨앗 현미경 실험, coverslips 24 잘 플레이트에 셀의 1 mL 씨. LDH 방출 분석 실험, 96 잘 접시에 셀의 100 µ L 씨. LDH 분석 결과 대 한 9 웰 스 (3 웰 스 치료, 100% 세포 제어 3 우물과 실험 자극에 대 한 3 웰 스) 씨.
- 특정 셀에 게 300 x g에 5 분 동안 원심 분리기는 96 잘 접시는 동등 하 게 잘 분산.
- 못쓰게 프로세스를 시작 하기 전에 하룻밤에서 37 ° C + 5% CO2 접시를 품 어.
3입니다. 애 벌 칠
- 100 ng/mL LPS 잘 접시 24에 대 한 500 μ (잘 접시는 96에 대 한 50 μ) 포함 된 신선한 매체 (DMEM-5)와 매체를 교체 합니다.
참고: 다양 한 LPS TLR4 중재 못쓰게19를 자극 하는 능력에 영향을 미치는 구조 변화 있다. 살 모 넬 라 미네소타 R595에서 LPS (Re) 여러 공급 업체에서 제공 하 고 것이 좋습니다. - 37 ° C, 5% CO23 h에 대 한 접시를 품 어.
4. Nigericin와 NLRP3 Inflammasome 및 팸-YVAD-FMK로의 활성화
- 매체를 제거 하 고 290 μ DMEM-5 5 μ M nigericin 및 5mm 글리신의 바꿉니다. 글리신은 caspase-1 활성화5하는 동안 발생 하는 세포 세포의 양을 줄이기 위해 추가 됩니다. 37 ° C, 5% CO260 분 동안 품 어. 야생 유형 및 caspase-1 부족 한 대 식 세포를 사용 하 여 관찰된 변하면 caspase-1에 대 한 특정 되도록.
- 마지막 45 분 동안 추가 30 10 μ x 팸-YVAD-FMK, 제조업체의 지침에 따라 준비.
- 60 분 후에 매체를 제거 하 고 씻어 3 시간 5 분 동안 각 1 mL와 함께 차가운 PBS의 셀.
- 각 음을 2 %paraformaldehyde 250 μ를 추가 하 고 30 분 동안 알루미늄 호 일로 덮여 얼음에 품 어.
- 마지막 5 분 동안 4 μ의 핵을 0.2 m m 빨강 형광 핵 산 얼룩을 추가 합니다. 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 또는 다른 염료 상표 DNA 사용할 수 있습니다.
- 세 번 차가운 PBS의 1 mL로 세포 세척 하 고 7 μ 방지 페이드 설치 매체를 사용 하 여 현미경 슬라이드에 coverslips를 탑재. 장착 매체 매니큐어를 사용 하 여 현미경 슬라이드에 coverslip 밀봉 하기 전에 밤에 강화 하자.
- Confocal 현미경 검사 법에 의해 대 식 세포를 이미지. 예 스 / 팸-YVAD-FMK에 대 한 Em 492/520nm 642/661 빨강 형광 핵 산 얼룩에 대 한. 현미경 치료 셀 488 채널에 얼룩 어떤 배경 표시 안 되도록 설정 되었는지 확인 합니다. 그렇지 않으면, 배경 식구 들-YVAD-FMK 얼룩 감지 하 고 실제 활성 caspase-1 될 것입니다.
참고: 현미경 설정 섹션 6에서에서 설명 되어 있습니다.
5. 항 체 얼룩이 지기
참고: ASC를 검출 하기 위하여 항 체와 함께 셀 라벨, 씨앗, 프라임 고 노출 셀 nigericin 이전 섹션에 동일 하. 처리 후는 다음과 같습니다:
- 3 시간 5 분 동안 각 1 mL와 함께 차가운 PBS의 세포를 씻어. 고정 및 permeabilization 솔루션의 250 μ를 추가 합니다. 얼음에 셀을 품 어 그리고 30 분 동안.
- 3 시간 5 분 동안 각 1 mL와 워시 버퍼의 대 식 세포를 씻어.
- ASC에 대 한 1 차적인 항 체의 250 μ 희석 1: 500 워시 버퍼에 추가 하 고 얼음에 1 시간에 품 어. 포함 한 coverslip 어떤 1 차 항 체에 영향을 받지 않는 하지만 보조를 받을 것 이다. 이 coverslip 올바른 오프셋을 설정 하는 현미경 설치 하는 동안 사용 됩니다.
- 셀 5 분 각 1 mL 워시 버퍼에 대 한 세 번 씻는 다.
- 이차 항 체 (형광 색소 활용 된 염소-안티-마우스)의 250 μ 워시 버퍼에서 1: 500을 희석 하 고 얼음에 1 시간에 대 한 품 어를 추가 합니다. 레이블 핵에 0.2 m m 빨강 형광 핵 산 얼룩이이 외피의 마지막 5 분의 4 μ를 추가 합니다.
- 3 세포를 씻어 감기 워시 버퍼 및 현미경에 coverslips 7 μ 방지 페이드 설치 매체를 사용 하 여 슬라이드 마운트의 1 mL x. 장착 매체 투명 매니큐어를 사용 하 여 현미경 슬라이드에 coverslip 밀봉 하기 전에 밤에 강화 하자.
- Confocal 현미경 검사 법에 의해 이미지 세포입니다. 전 이차 항 체에 대 한 Em은 555/580 / nm와 642/661 빨강 형광 핵 산에 대 한 얼룩 (아래와 같이).
참고: FAM-YVAD-FMK와 항 체 라벨로 표시 활성 caspase-1 및 ASC 공동 현지화를 결합 수 있습니다. 이 위해 식구 들-YVAD-FMK 라벨에 대 한 조건에 따라 하 고 추가 처리를 위해 프로토콜 라벨 항 체로 전환.
6. Confocal 현미경 검사 법에 의해 레이블이 세포 이미징
참고: 후에 coverslips 하룻밤 치료와 매니큐어와 현미경 슬라이드에 밀폐 되어 허용 된 스테인드 세포를 볼 수 있습니다. 여기, 이미징 confocal 현미경을 사용 하 여 설명 합니다. 세포는 또한 표준 형광 현미경으로 볼 수 있습니다.
- 현미경 단계에 치료 제어 셀과 슬라이드를 놓고 셀에 현미경을 집중 합니다.
- 치료 되지 않는 셀에 긍정적인 팸-YVAD-FMK 얼룩이 지는 그런 현미경 볼을 테이블 (LUT) 설정을 사용 하 여, 오프셋을 조정 합니다. 이 과정 또한 caspase-1 부족 한 세포를 사용 하 여 수행할 수 있습니다.
참고: 오프셋, 실험에 사용 되는 각 채널에 대 한 조정 해야 하지만 올바른 오프셋을 설정 하는 것이 식구 들-YVAD-FMK 채널 및 형광 항 체 채널에 대 한 가장 중요 한. DNA 채널에 대 한 오프셋은 덜 중요 합니다. 오프셋을 설정 실험의 나머지 부분에 대 한이 설정을 조정 하지 않습니다. - 취급 하는 nigericin 샘플 슬라이드를 전환 합니다. 긍정적이 고 식구 들-YVAD-FMK 얼룩에 대 한 부정적인 두 셀을 포함 하는 필드를 찾아. 긍정적인 얼룩이 지기의 가장 높은 강도 가진 비행기로 팸-YVAD-FMK 채널의 영상 평면을 조정 합니다. 이것은 일반적으로 비행기 inflammasome 초점의 센터 몇 군데 됩니다.
- 그런 foci 응축된 핵이 있는 셀에 표시 되는 이득을 조정 합니다. 이득 및 오프셋을 설정한 후 이미징 세션의 나머지 부분에 대 한 이러한 설정을 둡니다.
참고: 셀 pyroptotic 인지 확인 하는 쉬운 편도 핵 형태를 보고는. 활성 caspase-1 셀 둥근 이며 응축된 핵, nucleoli caspase-1 활성화 및 핵 형태학 없이 세포에서 볼 수 있습니다 하는 동안 치료 세포의 것과 유사 합니다. - 총 배율 X 100에 5 무작위로 선택 된 필드의 이미지를 수집 합니다. 이 이미지 당 약 40 셀 일반적으로 발생 합니다. 각 샘플에 대 한이 프로세스를 반복 합니다.
- 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 각 이미지에는 셀의 수를 계산 합니다. 다음 긍정적인 팸-YVAD-FMK 얼룩이 있는 셀의 개수를 계산 합니다. 팸-YVAD-FMK 긍정적인 세포의 백분율로 caspase-1 활성화의 수준을 나타냅니다.
7. LDH 자료 분석 결과
참고: LDH 자료 분석 결과 대 한 씨앗과 프라임 셀 이전 섹션에 설명 된 대로 제외 하 고 사용 하 여 96 잘 접시. 못쓰게 후 매체를 제거 하지 마십시오.
- DMEM-5 실험 웰 스에 10 μ M nigericin 및 50 μ의 50 μ 추가 자연과 100% 세포 제어 웰 스 DMEM-5. 때문에 목표 셀 세포를 측정 하는이 실험에서 글리신을 추가 하지 마십시오. 37 ° C, 5% CO260 분 동안 품 어.
- 30 분 후 100% 세포 제어 웰 스에 10 x 세포의 용 해 버퍼의 10 μ를 추가 하 고 다른 우물에 DMEM 5 10 μ를 추가 합니다. 이 부 화 하는 동안 냉장고에서 기판 믹스 (동결된 기판의 1.5 mL)의 1 유리병과 분석 결과 버퍼 (~ 12 mL) 1 약 수를 제거 하 고 실내 온도에 빛에서 보호 해 동 그들.
참고: 기판 믹스 빨간색 formazan 제품으로 변환 되는 tetrazolium 소금 (iodonitro tetrazolium 바이올렛), 포함 합니다. - 60 분 총 부 화 후 10 ° c.에 x 500g에 5 분 동안 접시를 원심 분명 평면 하단 플레이트에는 상쾌한의 50 μ를 전송 합니다. 이 시간 동안 기판 믹스의 유리병에 분석 결과 버퍼의 12 mL을 추가 하 고 사용 하기 전에 5 분 동안 실 온에서 품 어.
- 50 μ 기판의 각 음을 추가 하 고 어둠 속에서 30 분 동안 품 어. 중간만 웰 스 빈 값을 포함 합니다. 신호 플레이트 리더의 검출 한계를 초과 하지 것입니다 되도록 15 분 후 접시를 확인 합니다.
- 30 분 후 정지 솔루션 (1 M 초 산)의 50 μ를 추가 하 고 OD490 플레이트 리더를 사용 하 여 측정 합니다.
- 다음 수식을 사용 하 여 세포 세포의 용 해의 비율을 계산:
%Cytoxicity = ((Experimental-Spontaneous) / (최대-자발적인)) × 100
실험: 취급 하는 nigericin 세포; 자연: 치료 세포; 최대: 세포 세포의 용 해 버퍼에 노출
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Representative Results
검출 하기 caspase-1 활성화 nigericin에 노출 다음, 세포 프로토콜 섹션에 설명 된 대로 처리 했다. 우리 식구 들-YVAD-FMK와 ASC 항 체는 ASC 및 활성 caspase-1 공동 지역화 NLRP3이 중재 inflammasome 활성화 다음 보여 라벨 결합. 그림 1A 5 μ M nigericin에 노출 하는 야생 타입 세포 perinuclear 지역에서 ASC 초점의 형성을가지고 있음을 보여준다. 이 포커스 식구 들-YVAD-FMK와 ASC의 공동 지역화 보는 활성 caspase-1 포함. 활성 caspase-1 긍정적인 세포 핵 응축 보여주는 이러한 셀 pyroptosis 겪고 있다. 그림 1B 는 caspase-1/11 결핍 쥐의 세포는 ASC 초점의 형성을가, 그들은 필요가 없습니다 어떤 활성 caspase-연결 된 1이이 포커스 식구 들-YVAD-FMK 얼룩이 지기의 부재와 같이 보여 줍니다. 이 세포의 핵은 하지 집 광, 아무 pyroptotic 나타내는 세포 죽음 발생. 이미지는 기름 침수 목표 X 63와 검사 confocal 현미경을 사용 하 여 촬영 했다. 이미지는 어떤 추가 처리 없이 TIFF 파일으로 저장 되었다.
연결 nigericin에 노출 된 세포 죽음의 수준을 결정 하기 위하여 우리는 표면에 뜨는 문화에 LDH 자료 분석 결과 수행 합니다. 그림 2 는 야생 타입 세포 nigericin에 노출 된 후 세포 죽음을 받 다. 대조적으로, 세포 결핍 caspase-1 셀은 그대로 나타내는 셀 상쾌한에 LDH를 해제 하지 않습니다.
그림 1: FAM-YVAD-FMK와 안티 ASC 라벨. (A) 야생 타입 (WT)와 (B) (c 1/11-/-) caspase-1/11 불충분 한 세포 1 h 5 μ M nigericin에 노출 되었고 식구 들-YVAD-FMK를 사용 하 여 활성 caspase-1, 그리고 안티-ASC를 감지 하는 confocal 현미경 검사 법에 의해 활성 caspase-1에 대 한 분석 ASC를 감지 하는 기본 및 염소-안티-마우스 보조 항 체 형성 초점. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: LDH 자료 분석 결과 결과. 야생 유형 및 caspase-1/11 결핍 세포는 1 시간에 5 μ M nigericin에 노출 됐다 고 셀 표면에 뜨는 LDH의 존재에 대 한 분석 했다. 데이터는 3 개의 복제의 수단 ± SD. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
이 원고에서 우리 inflammasome 활성화 및 caspase-1 활성화 murine 골 수 유래 세포에서 NLRP3 자극을 다음의 결과 검사 하는 두 가지 방법을 제시 했습니다. 첫 번째 기술은 형광 기자 팸-YVAD-FMK를 사용 하 여 셀룰러 기준 caspase-1 활성화의 수준을 결정 하는 연구원을 수 있습니다. 이 기자는 caspase-1/11 결핍 세포에 얼룩의 부재에 의해 본 바인딩 효소, caspase-1 가족에 대 한 매우 구체적인. 특이성은 또한 LaRock 외에의해 표시 됩니다. 그들의 원고에서 caspase-1 활성화에 페스트 단백질 YopM의 역할을 설명 하. 그들의 원고에서 그들은 FAM-YVAD-FMK foci caspase-117에 대하여 지시 하는 항 체와 함께 표시 했다 foci와 겹치는 보여줍니다.
어떤 실험으로 거짓 긍정적인 결과 제거 하기 위해 따라야 하는 몇 가지 중요 한 단계가 있다. 우선, 야생 유형 및 caspase-1/11 결핍 세포를 사용 하는 것이 필수적입니다. 이러한 두 셀 형식 사용 하 여 일반적인 얼룩 이어질 조건 추가 분석에서 제외할 수 있습니다. 둘째, 어떤 항 체 또는 활동 조사 분석 결과 라벨와 마찬가지로 셀 식구 들-YVAD-FMK와 얼룩을 씻고 철저 하 게 중요 하다. 3 5 분 세척을 사용 하 여 배경 신호 수준의 크게 감소 된다. 세 번째 중요 한 단계는 confocal 현미경의 설치 하는 동안 발생합니다. 여기, 그것은 중요 한 치료 셀 식구 들-YVAD-FMK 표시 긍정적인 세포질 얼룩이 지는 치료 셀에서 관찰 하는 방식에 confocal 현미경의 오프셋을 설정 하는 데 사용 됩니다. 때 이러한 단계를 따라이 기술은 셀룰러 기준 caspase-1의 활성화를 평가 하는 유용한 도구 이다.
이 프로토콜 연구원 요구에 맞게 수정할 수 있습니다. 예를 들어 셀 전체 과정 중 여러 단계에서 작은 분자량 화합물으로 처리할 수 있습니다. 이것은 경로 NLR, ASC 또는 프로-caspase-1의 채용의 oligomerization 변조 식별에 대 한 허용 또는 caspase-1 자체의 활성화. 이 프로토콜에 대 한 수정 필요 그런 그들 자체로 caspase-1을 활성화 하지 않습니다. 이 경우에 약물의 복용량 응답 곡선이 필요 합니다. 비록 우리가 NLRP3 inflammasome의 활성화에 초점을 맞춘,이 프로토콜은 다른 호흡기에 의해 발생 하는 inflammasomes를 검사 하도 사용할 수 있습니다. 우리는이 원고에 포함 하는 다른 수정 식구 들-YVAD-FMK 항 체 라벨 inflammasome 구성 요소와 얼룩의 조합 이다. 우리는 활성 caspase-1 inflammasome 어댑터 ASC의 공동 지역화는 보여줍니다. 이 방법의 한계 설명, confocal 현미경에 접근을 요구 한다 이다. 그러나, cytometry에 의해 ASC 초점 형성을 검출 하는 관련된 전략 보고20,21되었습니다.
두 번째 기술은 우리가 논의 LDH 자료 분석 결과 사용 하 여 셀 세포의 급속 한 탐지 할 수 있습니다. LDH 릴리스는 또한 많은 다른 형태의 세포 죽음 동안 발생 하 고 pyroptosis에는 원형질 막 세포 무결성 및 셀의 손실을 나타냅니다 중요 하다. 그러나, caspase-1 부족 한 셀의 사용 caspase-1-종속 세포 세포의 용 해, pyroptosis의 정의 기능을 확인할 수 있습니다.
이 프로토콜 (특히 사용 하는 경우는 전염성이 에이전트)에서 중요 한 단계는 96 잘 접시에 셀 시드 후 접시를 원심. 원심 분리 격판덮개의 우물의 전체 표면에 걸쳐 세포의 동등한 배급에 대 한 수 있습니다. 동등 하 게 분배와 각 대 식 세포는 박테리아의 동일한 수에 노출 됩니다. 원심 분리, 없이 우물에 있는 액체의 초승달 모양 효과 우물의 가장자리에 축적 하는 더 많은 세포를 이어질 것입니다. 이 우물의 센터에서 (나) 잘 벽 가까이 하 고 의도 한 것 보다 더 높은 나 감염의 의도 다양성 보다 낮은 이어질 것 이다.
LDH 자료 분석 결과의 잠재적인 단점은 세포 인구 수준에 및 분석 결과 당 한 시간 점에서 측정입니다. 대체 방법은 현미경 검사 법, 식별 하는 단일 셀 기준 막 무결성의 손실에 의해 셀 impermeant 염료의 통풍 관을 정할 것입니다. 라이브 셀 이미징 플랫폼을 결합해,이 방법은 pyroptosis22의 일시적인 평가 제공할 수도 있습니다. Propidium 요오드 화물과 같은 작은 DNA 바인딩 형광 염료 또는 ethidium 평범한 사람 수 통과 gasdermin D 기 공, 세포 핵 산, 바인딩할5,,2223형광. 기 공 형성 하 고 이러한 작은 염료의 일시적으로 앞 터미널 세포 세포의 용 해. 세포는 더 큰 염료의 통풍 관 및 LDH 등 큰 세포질 단백질의 손실 수 있습니다. 글리신의 사용 수 있다 실험적으로 연결을 푸십시오 기 공 형성을에서 세포, 글리신 gasdermin D 중재 기 공 형성, 작은 염료의 통풍 관 또는, IL 1β의 분 비를 차단 하지 않습니다 하지만 급속 한 세포 및 LDH 릴리스5,22 글리신 방지는 , 23 , 24. 막 무결성의 완전 한 손실을 방지 하기 위해 팸-YAVD-FMK 착 실험에 글리신을 포함 하는 것이 좋습니다 하지만 글리신 pyroptotic LDH 릴리스를 측정할 때 생략 해야 합니다.
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Disclosures
저자는 공개 충돌의 관심을가지고
Acknowledgments
모든 현미경 W. M. 켁 현미경 센터 다니엘 피터 스의 지원 및 NIH 포상 S10OD016240의 지원으로 이루어졌다. S.L.F.는 NIH K08AI119142와 R21AI130281에 의해 지원 됩니다. 우리는 박사 리처드 Flavell 및 caspase-1/11 결핍 마우스, 박사 브래드 쿡 박사 브래드 쿡 실험실 시설 및 장비를 공유 하기 위한 감사 합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| E-MEM | ATCC | 30-2003 | For growing L929 cells |
| NCRC clone 929 (L929) | ATCC | CCL-1 | |
| Fixation/Permeabilization Kit | BD Biosciences | 554714 | Includes fixation and permeabilization solution, and wash buffer. Proprietary formulations. Contains 4.2% formaldehyde |
| Glycine | Biorad | 161-0718 | |
| Cytotox96 Nonradioactive cytotoxicity assay | Fisher Scientific | PR-G1780 | Includes Substrate Mix and Assay Buffer; Proprietary formulations. Stop solution is 1 M Acetic acid |
| FAM-YVAD-FMK | Immunocytochemistry Technologies | 98 | |
| DMEM, high glucose, no glutamine | Invitrogen | 11960044 | |
| DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red | Invitrogen | 31053028 | |
| Dulbecco's PBS, no calcium, no magnesium | Invitrogen | 14190144 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, US origin | Invitrogen | 26140079 | Heat inactivated at 55°C for 50 min |
| Gentamicin | Invitrogen | 15750060 | |
| ProLong Gold Mounting Medium | Invitrogen | p36934 | Proprietary formulation. Curing mounting medium. Hardens to refractory index of 1.46 |
| goat anti-mouse ALEXA555 | Invitrogen | A-21422 | |
| HEPES (Ultra Pure) | Invitrogen | 11344041 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 21051024 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| TO-PRO-3 Iodide | Invitrogen | T3605 | far-red fluorescent nucleic acid stain |
| C57BL/6J mouse | Jackson Laboratoy | 000664 | |
| caspase-1/11-/- mouse | Jackson Laboratory | 016621 | |
| Leica SP8X Confocal Microscope | Leica | ||
| Ultrapure LPS from Salmonella minnesota R595 (Re) | List Biologicals | 434 | |
| anti-ASC clone 2EI-7 | Millipore-Sigma | 04-417 | |
| beta-mercapto-ethanol | Millipore-Sigma | M6250-10ML | |
| DMSO | Millipore-Sigma | D2650-5X10ML | |
| EDTA | Millipore-Sigma | E5391 | |
| Spectramax M3 plate reader | Molecular Devices | 5000414 |
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