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Immunology and Infection

Deteção de ativação de Inflammasome e morte celular de Pyroptotic nos macrófagos da medula óssea-derivado murino

Published: May 21, 2018 doi: 10.3791/57463
Automatic Translation
1, 1
1Department of Laboratory Medicine, University of Washington

Summary

Descrevemos a detecção de ativação de inflammasome NLRP3 em bases celulares usando microscopia de fluorescência e mancha para ativa a caspase-1 e o adaptador, ASC. Um ensaio de liberação de lactato desidrogenase é apresentado para detectar pyroptotic lise em uma base de população. Estas técnicas podem ser adaptadas para estudar muitos aspectos da biologia de inflammasome.

Abstract

Inflammasomes são as plataformas sinalização imunes inatas que são necessários para o controle bem sucedido de muitos organismos patogénicos, mas também promovem inflamatória e doenças autoinflamatória. Inflammasomes são ativadas por receptores de reconhecimento padrão citosólica, incluindo membros da família do receptor (NLR) NOD-like. Estes receptores oligomerize na detecção de estímulos microbianas ou associada a danos. Recrutamento subsequente da proteína do adaptador ASC forma um complexo, de inflammasome microscopicamente visível que ativa a caspase-1 através da autoativação induzida por proximidade. Após a ativação, caspase-1 cliva pro-IL-1 β e pro-IL-18, levando à ativação e secreção dessas citocinas pró-inflamatórias. Caspase-1 também atua como mediador inflamatória forma de morte celular denominado pyroptosis, que apresenta a perda da lise de integridade e de célula de membrana. Caspase-1 fende gasdermin D, liberando o fragmento N-terminal que forma poros da membrana plasmática, levando a Lise osmótica.

In vitro, a ativação de caspase-1 pode ser determinado através da marcação de macrófagos derivados da medula óssea com a sonda de caspase-1 atividade FAM-YVAD-FMK e através da marcação das células com anticorpos contra a proteína do adaptador ASC. Esta técnica permite a identificação de inflammasome formação e ativação de caspase-1 em células individuais usando microscopia de fluorescência. Morte celular de Pyroptotic pode ser detectada medindo-se o lançamento do citosol lactato desidrogenase no meio de. Este procedimento é simples, custo-eficaz e realizado em um formato de placa de 96 poços, que permita a adaptação para a seleção. Neste manuscrito, mostramos que a ativação do inflammasome NLRP3 por nigericin leva à co localização da proteína do adaptador ASC e ativa a caspase-1, levando a pyroptosis.

Introduction

Inflamação mediada por Inflammasome é um componente crítico da defesa contra organismos patogénicos1, mas também está subjacente a etiologia de muitas doenças2. A resposta inflamatória a uma ampla gama de infecções é acionada através da detecção citosólica do patógeno associado padrões moleculares (PAMPs) ou danos associados a padrões moleculares (represas). Receptores de reconhecimento padrão (PRR), incluindo membros da família de NOD-like receptor (NLR), oligomerize na detecção destes PAMPs e represas. Isto provoca a formação de um complexo de proteína multi denominado o inflammasome, que contém o PRR, a adaptador da proteína associada a apoptose grão-como contendo um domínio C-terminal de caspase-recrutamento (cartão) (ASC) e a pro-forma de caspase-13,4. Este complexo permite induzida por proximidade autoativação de caspase-1. Ativa a caspase-1, em seguida, leva a um conjunto de eventos que são característicos da pyroptosis de caminho de morte celular inflamatória. Estes eventos incluem: a clivagem e liberação das citocinas IL-1 β e IL-18, exocitose lisossomo com lançamento de conteúdo lisossomal no espaço extracelular, condensação nuclear e gasdermin D clivagem. O domínio N-terminal lançado de gasdermin D insere-se na membrana plasmática, formando poros que causam a ruptura da membrana plasmática e liberação do conteúdo inflamatório, além de tirar um nicho protetor para patógeno replicação5, 6 , 7.

Aqui, focalizamos o inflammasome NLRP3 bem estudado. A ativação do inflammasome NLRP3 ocorre através de um processo de duas etapas8. O primeiro passo "escorva" ocorre através do reconhecimento por receptores do tipo Toll (TLR) de um produto microbiano. Isto é replicado no cenário de laboratório usando LPS para estimular TLR4. Esta estimulação upregulates NLRP3 e pro-IL-1 β através de sinalização do NF-kB. Escorva adicionalmente licenças NLRP3 através de mecanismos não-transcriptional induzindo sua deubiquitination9,10 e fosforilação ou desfosforilação de resíduos específicos de11,12.

O segundo sinal para ativação NLRP3 é pensado para envolver fatores mitocondriais, espécies reativas de oxigênio, efluxo de potássio e cálcio, sinalização, apesar de um mecanismo unificador para ativação NLRP3 permanece elusiva8. NLRP3 ativado oligomerizes através de interações entre seus domínios NACHT e recrutas ASC através da ligação dos domínios pyrin (PYD)13. Em cada célula, estes complexos macromoleculares formam um único foco microscopicamente visível. ASC foi originalmente identificada como uma proteína KDa 22 que forma uma "mancha" durante a apoptose de células de leucemia humana e chamada apoptose-grão, como proteína associada contendo um cartão14. Mais tarde foi determinado que o ASC recrutas pro-caspase-1 através da interação do cartão da ASC com o cartão de pro-caspase-1, formando a inflammasome15.

Nem todos os NLRs exigem a presença de ASC para induzir a ativação de caspase-1. Ao contrário de NLRP3, NLRC4 e NLRP1b têm cartão domínios e diretamente podem recrutar pro-caspase-1 através de interações de cartão-cartão para induzir a ativação de caspase-1. Na ausência de ASC, ativa a caspase-1 permanece difusa por todo o citosol e não forma um único foco. Este ativo difusa caspase-1 é suficiente para induzir a morte celular de pyroptotic, mas é incapaz de processar a pro-IL-1 β13,16.

Neste manuscrito, discutiremos duas maneiras de avaliar a ativação de inflammasome. O primeiro usa a atividade fluorescente sonda, FAM-YVAD-FMK, que vincula a caspase-1 família de proteases. Esta família inclui caspase-1, mas também do mouse caspase-11 e caspase-4 humano e caspase-5. Usando os macrófagos de camundongos deficientes de caspase-1/11 em todos os experimentos, será abordada a especificidade da sonda. Esse método pode ser combinado com anticorpo rotulagem de inflammasome componentes, que também descreveremos. Visualização microscópica permite a identificação de células individuais contendo ativa a caspase-1 e oligomerized ASC. Usando esse método, os pesquisadores poderão determinar onde na cascata da formação inflammasome suas manipulações da célula hospedeira ou o organismo patogénico em estudo tem um efeito. Por exemplo, pode-se distinguir se uma determinada intervenção impede que o recrutamento de ASC para o NLRP3 complexo ou metas a subsequente recrutamento e ativação de caspase-117. Examinar os resultados da ativação de caspase-1 como a secreção de IL-1 β não seria capaz de distinguir entre estas duas possibilidades. Além disso, a secreção de IL-1 β poderia ser alterada sem alterar a capacidade de células para ativar caspase-1 e submeter-se pyroptotic célula morte16.

O segundo método mede a liberação de lactato desidrogenase (LDH) na célula de sobrenadante, que ocorre durante a lise de macrófagos pyroptotic seguindo a ativação de caspase-1, conforme descrito acima. Este segundo método é uma abordagem baseada na população, como a liberação de LDH em todo o bem é medida. Esta abordagem simples permite a análise rápida (30 minutos de tempo de incubação) das amostras para determinar se há morte celular mediada por caspase-1 e pode ser executada em um formato de placa de 96 poços.

Esses métodos são complementares, cada um com diferentes vantagens e ambos são facilmente passível de modificações. Por exemplo, tratamento de macrófagos com compostos alvo peso molecular pequeno antes da estimulação inflammasome pode ser usado para investigar o papel de certo proteínas podem ter sobre como controlar respostas inflamatórias.

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Protocol

Todos os procedimentos de animais foram aprovados e conduzidos em Universidade das orientações do Comité de uso e cuidado Animal institucional do Washington.

1. colheita de medula óssea

  1. Assepticamente, remover o fêmur e tíbia de um rato e limpar os ossos usando instrumentos esterilizados. Coloque os ossos limpos em meio de Eagle modificado Dulbecco (DMEM) 5 mM HEPES + 0,2 mg/mL de L-glutamina + 0,05 mM 2-Mercaptoetanol + sulfato de gentamicina 50 mg/mL + 10.000 U/mL penicilina/estreptomicina + 10% soro fetal bovino (FBS, DMEM-10 completa) e incubar a tubo no gelo por 15 min.
  2. Remova as articulações proximal e distal da bola com uma tesoura. Inserir uma agulha 25g ligada a uma seringa de 10ml cheia de médio a caverna dos ossos. Medula óssea usando DMEM-10 completa o jogo. Resuspenda qualquer touceiras pipetando meio de cima e para baixo suavemente.
  3. Centrifugar as células durante 10 minutos a 300 x g... e contar o número de células usando um hemocytometer. Neste ponto, ou congelar as células usando 90% FBS + 10% dimetilsulfóxido (DMSO) ou as células em uma placa de Petri para diferenciar os macrófagos usando meio de L929 condicionado (passo 2.1) de 15cm da placa.

2. diferenciação de macrófagos derivados de medula óssea

  1. Usando o meio de diferenciação pré-aquecido (21 mL de DMEM-10 completa e 9 mL do meio de celular condicionado de L929 como descrito por Swanson et al . 18), colocar células da medula óssea em 15 cm de uma cultura de não-tecidos tratados de Petri (1.2-1.5 x 107 células). Incube a placa a 37 ° C e 5% de CO2 por 7 dias. Adicione um adicional 30 mL de meio de diferenciação na placa no dia 3 ou 4.
    Nota: É importante não utilizar placas de cultura de tecidos tratada, como macrófagos será difícil separar e colheita.
  2. Para coletar os macrófagos, lavar a placa com tampão fosfato salino (PBS) e adicionar 20 mL de PBS frio + ácido de 1 mM ácido etilenodiaminotetracético (EDTA). Incubar a placa a 4 ° C por 10 min. colheita das células pipetando o PBS + EDTA sobre as células e lavar a placa com 10 mL de PBS. Combine as duas lavagens em dois tubos de 15ml cónico.
  3. Centrifugar as células em 300 x g durante 10 minutos e ressuspender as células em 10 mL de vermelho de fenol livre DMEM 5 mM HEPES + 0,2 mg/mL de L-glutamina + 0,05 mM 2-Mercaptoetanol + 5% FBS (DMEM-5) e contar as células usando um hemocytometer ou um contador de Coulter. Manter as células no gelo durante a contagem.
  4. Propagar os macrófagos em placas de cultura de tecidos revestida a 2 x 105 células/mL. Para experimentos de microscopia, 1 mL de células em lamelas em 24 placas bem as sementes. Para ensaios de liberação LDH, semente 100 µ l de células em um prato bem 96. Para o ensaio LDH, sementes 9 poços (3 poços não tratada, 3 poços com controles 100% Lise e 3 poços para o estímulo experimental).
  5. Centrifugue a placa bem 96 durante 5 min à 300 g x para se certificar de que as células são distribuídas igualmente entre o poço.
  6. Incube a placa durante a noite a 37 ° C + 5% CO2 antes de iniciar o processo de preparação.

3. escorva

  1. Substitua o medium com meio fresco (DMEM-5), contendo 100 ng/mL LPS (500 μL a 24 bem placa ou 50 μL para o 96 bem da placa).
    Nota: Há uma variedade de variações estruturais em LPS, que afetam a capacidade de estimular a escorva mediada por TLR419. LPS de minnesota de Salmonella R595 (Re) está disponível a partir de vários fornecedores e é recomendado.
  2. Incube a placa por 3 h a 37 ° C e 5% de CO2.

4. activação do Inflammasome NLRP3 com Nigericin e rótulos com FAM-YVAD-FMK

  1. Remover o meio e substituí-lo com 290 μL de DMEM-5 contendo 5 μM nigericin e glicina de 5 mM. A glicina é adicionada para reduzir a quantidade de lise celular que ocorre durante a ativação de caspase-15. Incube durante 60 minutos a 37 ° C e 5% de CO2. Use ambos o tipo selvagem e o caspase-1 macrófagos deficientes para assegurar que a rotulagem observada é específica para caspase-1.
  2. Durante o último 45 min, adicionar 10 μL de 30 x FAM-YVAD-FMK, preparado de acordo com as instruções do fabricante.
  3. Após 60 min, retire o meio e lave as células três vezes por 5 min cada com 1 mL de PBS frio.
  4. Adicionar 250 μL de paraformaldeído 2% a cada poço e incubar no gelo coberto com papel alumínio por 30 min.
  5. Durante o último 5 min, adicione 4 μL de mancha de far-red do ácido nucleico fluorescente de 0,2 mM para rotular os núcleos. 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ou outros corantes também podem ser usado para rótulo de DNA.
  6. Lavar as células três vezes com 1 mL de PBS frio e montar as lamelas em corrediças do microscópio usando 7 meio de montagem antidesbotamento μL. Deixe o meio de montagem endurecer durante a noite antes de selar a lamela para o slide de microscópio usando esmalte.
  7. Os macrófagos da imagem pela microscopia confocal. Ex / Em para FAM-YVAD-FMK é 492/520nm e 642/661 por corante fluorescente far-red do ácido nucleico. Certifique-se de configurar o microscópio, tal que as células não tratadas não mostram qualquer fundo de coloração no canal 488. Caso contrário, coloração de fundo FAM-YVAD-FMK será detectado e não real ativa a caspase-1.
    Nota: A configuração do microscópio é descrita na secção 6.

5. anticorpos

Nota: Para rotular as células com anticorpos para detectar ASC, semente, prime e expor as células de nigericin idêntico da seção anterior. O processamento depois é como segue:

  1. Lave as células três vezes por 5 min cada com 1 mL de PBS frio. Adicione 250 μL de solução de fixação e permeabilização. Incubar as células no gelo e coberto por 30 min.
  2. Lave os macrófagos três vezes por 5 min cada com 1 mL de tampão de lavagem.
  3. Adicionar 250 μL do anticorpo primário contra ASC diluída a 1: 500 em tampão de lavagem e incubar durante 1 h no gelo. Incluem uma lamela que não recebe qualquer anticorpo primário, mas só vai receber o secundário. Esta lamela será usada para definir o deslocamento correto durante a instalação do microscópio.
  4. Lave as células três vezes por 5 min cada com 1 mL de tampão de lavagem.
  5. Adicione 250 μL do anticorpo secundário (tintura fluorescente conjugado cabra-anti-mouse) diluído a 1: 500 em tampão de lavagem e incubar durante 1 h no gelo. Adicione 4 μL de mancha de far-red fluorescente de ácidos nucleicos de 0,2 mM para o último 5 min desta incubação aos núcleos de rótulo.
  6. Lavar as células 3 x com 1 mL de tampão de lavagem fria e monte as lamínulas para microscópio slides usando 7 meio de montagem antidesbotamento μL. Deixe endurecer durante a noite antes de selar a lamela para o slide de microscópio usando esmaltes claros-o meio de montagem.
  7. Macrófagos de imagem por microscopia confocal. Ex / Em para o anticorpo secundário é 555/580 nm e 642/661 far-red fluorescente do ácido nucleico mancham (como descrito abaixo).
    Nota: Etiquetando com FAM-YVAD-FMK e rotulação de anticorpos pode ser combinado para mostrar a localização co de caspase-1 ativo e ASC. Para isso, siga as condições para a rotulagem de FAM-YVAD-FMK e alterne para o anticorpo protocolo para processamento adicional.

6. imagens de macrófagos rotuladas por microscopia Confocal

Nota: As células coradas podem ser exibidas após as lamínulas foram autorizadas a curar durante a noite e foram selados para a lâmina de microscópio com esmalte. Aqui, a imagem usar um microscópio confocal é descrito. As células também podem ser vistas por microscopia de fluorescência padrão.

  1. Coloque o slide com as células controle não tratados na fase de microscópio e concentrar o microscópio nas células.
  2. Usando o microscópio, olhe a tabela (LUT) configurações, ajuste o deslocamento tal que não há nenhuma mancha de FAM-YVAD-FMK positiva nas células não tratadas. Esse processo também pode ser realizado usando os macrófagos deficientes de caspase-1.
    Nota: O deslocamento deve ser ajustado para cada canal utilizado no experimento, mas definir o deslocamento correto é mais crítico para o canal de FAM-YVAD-FMK e canais de anticorpos fluorescentes. O deslocamento para o canal de DNA é menos crítico. Assim que tiver sido definido o deslocamento, não ajuste essa configuração para o resto do experimento.
  3. Mude o slide para a amostra de nigericin Tratado. Encontre um campo que contém ambas as células que são positivos e negativos para a FAM-YVAD-FMK coloração. Ajuste o plano da imagem latente do canal FAM-YVAD-FMK para o avião que tem a maior intensidade de coloração positiva. Normalmente, este será o avião onde o centro do foco inflammasome é fotografado.
  4. Ajuste o ganho tal que focos estão visíveis em células com núcleos condensados. Depois de definir o ganho e o deslocamento, embora essas configurações para o resto da sessão de imagens.
    Nota: Uma maneira fácil de determinar se uma célula é pyroptotic é olhando com morfologia nuclear. Células com ativa a caspase-1 tem arredondado e núcleos condensados, enquanto nucléolos são visíveis nas células sem ativação de caspase-1 e a morfologia nuclear é semelhante aos de células não tratadas.
  5. Recolha imagens dos 5 campos selecionados aleatoriamente em 100 X ampliação total. Normalmente, isso resultará em cerca de 40 células por imagem. Repita este processo para cada amostra.
  6. Conte o número de células em cada imagem usando software de análise de imagem. Em seguida, conte o número de células que possuem coloração positiva do FAM-YVAD-FMK. Representam o nível de ativação de caspase-1 como a porcentagem de células positivas FAM-YVAD-FMK.

7. ensaio de liberação LDH

Nota: Para o ensaio de liberação LDH, semente e prime, que as células, exceto conforme descrito na seção anterior, usam um prato bem 96. Não remova o meio após a escorva.

  1. Adicionar 50 μL de DMEM-5 contendo 10 μM nigericin aos poços experimentais e 50 μL DMEM-5 para os poços de controle lise espontâneos e 100%. Não adicione glicina neste experimento, desde que o objetivo é medir a lise celular. Incube durante 60 minutos a 37 ° C e 5% de CO2.
  2. Depois de 30 min, adicionar 10 μL de tampão de Lise 10 x nos poços de controle de lise de 100% e adicionar 10 μL de DMEM-5 para os outros poços. Durante esta incubação, 1 frasco de mistura de substrato (1,5 mL de substrato liofilizado) e 1 alíquota de buffer de ensaio (~ 12 mL) Retire do congelador e deixá-los descongelar protegido da luz, à temperatura ambiente.
    Nota: A mistura de substrato contém um sal de tetrazólio (iodonitro-tetrazólio violeta), que é convertido em um produto formazan vermelho.
  3. Após a incubação total de 60 min, centrifugar a placa durante 5 min à 500 x g a 10 ° C. Transferi 50 μL do sobrenadante para um prato fundo plano claro. Durante este tempo, adicione 12 mL de tampão de ensaio para o frasco de mistura de substrato e incubar a temperatura ambiente por 5 min antes de usar.
  4. Adicionar 50 μL de substrato a cada poço e incube por 30 min no escuro. Incluem poços apenas médios, para valores em branco. Verifique a placa depois de 15 min para certificar-se de que o sinal não excederá o limite de detecção do leitor de placa.
  5. Depois de 30 min, adicione 50 μL de solução de paragem (1 M de ácido acético) e medir OD490 usando um leitor de placa.
  6. Calcule a porcentagem de lise celular usando a seguinte fórmula:
    Citotoxicidade % = ((Experimental-Spontaneous) / (máximo-espontânea)) × 100
    Experimental: células nigericin Tratado; espontânea: não tratada células; máxima: células expostas a Lise

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Representative Results

Para detectar a ativação de caspase-1 após a exposição de nigericin, as células foram processadas conforme descrito na seção de protocolo. Nós combinamos ambos FAM-YVAD-FMK e ASC anticorpo rotulando a fim de mostrar que ASC e ativa a caspase-1 co localizar após ativação mediada por NLRP3 inflammasome. Figura 1A mostra que o tipo selvagem macrófagos expostos a 5 μM nigericin têm formação de um foco ASC na região perinuclear. Estes focos contenham também ativa a caspase-1 visto pela localização co do ASC com FAM-YVAD-FMK. As células que são positivas para ativa a caspase-1 tem condensação nuclear, mostrando que essas células estão em fase de pyroptosis. A figura 1B mostra que enquanto os macrófagos de camundongos deficientes de caspase-1/11 tem a formação de um foco ASC, não têm qualquer ativo caspase-1 associado com este foco, como mostrado pela ausência de FAM-YVAD-FMK coloração. Os núcleos dessas células não são condensados, indicando que não há nenhum pyroptotic ocorrendo morte de células. Imagens foram tiradas usando um microscópio confocal de varredura com um 63 X objetivo de imersão de óleo. Imagens foram salvas como arquivos TIFF sem qualquer processamento adicional.

Para determinar o nível de morte celular que está associado com a exposição ao nigericin, realizamos um ensaio de liberação LDH no sobrenadante da cultura. A Figura 2 mostra que os macrófagos do tipo selvagem sofrem morte celular após a exposição a nigericin. Em contraste, macrófagos deficientes de caspase-1 não liberam LDH no líquido sobrenadante celular, indicando que as células estão intactas.

Figure 1
Figura 1: FAM-YVAD-FMK e anti-ASC rotulando. (A) Wild type (WT) e (B) deficiente de caspase-1/11 (c1/11- / -) macrófagos foram expostos a 5 μM nigericin por 1h e analisado para ativa a caspase-1 pela microscopia confocal usando FAM-YVAD-FMK para detectar ativa a caspase-1 e anti-ASC primários e cabra-anti-mouse anticorpos secundários para detectar ASC foco formação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: resultados de ensaio de liberação LDH. Tipo selvagem e macrófagos deficientes de caspase-1/11 foram expostos a 5 μM nigericin por 1h e célula sobrenadante foi analisada para a presença de LDH. Dados são meios ± DP de três repetições. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Neste manuscrito, apresentamos duas técnicas para examinar a ativação de inflammasome e a consequência da ativação de caspase-1 após estimulação NLRP3 em macrófagos murino derivadas da medula óssea. A primeira técnica permite que o pesquisador determinar o nível de ativação de caspase-1 em uma base celular usando o repórter fluorescente FAM-YVAD-FMK. Este repórter é altamente específico para a vinculação da caspase-1 família de enzimas, como visto pela ausência de coloração em macrófagos deficientes de caspase-1/11. Especificidade foi também demonstrada por LaRock et al. em seu manuscrito, descrevendo o papel da proteína Yersinia YopM na ativação de caspase-1. Em seu manuscrito, eles mostram que focos de FAM-YVAD-FMK sobrepõe-se com focos que foram rotulados com anticorpos dirigidos contra a caspase-117.

Como é o caso com alguma experiência, existem algumas etapas críticas que precisam ser seguidas a fim de eliminar os resultados falso-positivos. Em primeiro lugar, é imperativo usar macrófagos deficientes tanto tipo selvagem e caspase-1/11. Usando esses tipos de duas células, condições que levam a mancha não específica não podem ser excluídas de uma análise mais aprofundada. Em segundo lugar, tal como acontece com qualquer atividade ou anticorpo sonda ensaio de rotulagem, é importante lavar bem as células após coloração com FAM-YVAD-FMK. Usando três lavagens de 5 min, o nível de sinal de fundo é muito reduzido. Uma terceira etapa crítica ocorre durante a instalação do microscópio confocal. Aqui, é importante que as células não tratadas rotuladas com FAM-YVAD-FMK são usadas para definir o deslocamento do microscópio confocal de tal forma que nenhuma coloração citoplasmática positiva é observada nas células não tratadas. Quando estas etapas são seguidas, esta técnica é uma ferramenta útil para avaliar a ativação de caspase-1 em uma base celular.

Este protocolo pode ser modificado para atender às necessidades de pesquisadores. Por exemplo, as células podem ser tratadas com compostos de pequeno peso molecular em várias etapas durante todo o processo. Isto permitiria a identificação dos caminhos que modulam a oligomerização do NLR, o recrutamento de ASC ou pro-caspase-1, ou a ativação de caspase-1 em si. As modificações ao presente protocolo tem que ser tal que eles não ativar caspase-1 por si só. Se isso ocorrer, uma curva de resposta de dose da droga em questão é necessária. Mesmo que focamos na ativação de inflammasome o NLRP3, esse protocolo também pode ser usado para examinar inflammasomes desencadeada por outros PRRs. Outra modificação que incluímos neste manuscrito é a combinação de FAM-YVAD-FMK coloração com anticorpos rotulagem dos componentes inflammasome. Vamos mostrar que não há localização co do adaptador inflammasome ASC com ativa a caspase-1. Uma limitação deste método conforme descrito, é que ele requer acesso a um microscópio confocal. No entanto, uma estratégia relacionada para detectar a formação de foco ASC por citometria de fluxo tem sido relatado20,21.

A segunda técnica que discutimos permite a detecção rápida de lysis da pilha usando um ensaio de liberação LDH. É importante observar que a liberação LDH indica perda de Lise integridade e célula membrana plasmática, que também ocorre durante muitas outras formas de morte celular e não é específico para pyroptosis. No entanto, o uso de células de caspase-1 deficientes pode identificar lysis da pilha de caspase-1-dependente, uma característica definidora da pyroptosis.

Centrifugar a placa após a semeadura as células em um prato bem 96 é um passo crítico no presente protocolo (especialmente quando se utiliza um agente infeccioso). Centrifugação da placa permite a distribuição igualitária de macrófagos em toda a superfície do poço. Com distribuição igual, cada macrófago será exposto para o mesmo número de bactérias. Sem centrifugação, o efeito do menisco do fluido no poço implicará mais macrófagos acumular-se na borda do poço. Isso levaria a inferior pretendida multiplicidade de infecção (MOI) perto da parede bem e maior do que o pretendido MOI no centro do poço.

Uma desvantagem potencial de ensaio de liberação de LDH é que mede lise em um nível de população e em um ponto único tempo por ensaio. Uma abordagem alternativa é quantificar a absorção de corantes impermeant célula por microscopia, que identifica a perda da integridade da membrana em uma base única célula. Combinado com células vivas de imagem plataformas, esta abordagem também pode fornecer uma avaliação temporal de pyroptosis22. Fluorescentes de DNA-ligando pequenas corantes como iodeto de propidium ou brometo de etídio pode passar através do poro gasdermin D, ligar o celular de ácidos nucleicos e fluorescem5,22,23. Formação de poros e absorção de corantes estas pequenas precede temporalmente lysis da pilha terminal. Lise permite a absorção de corantes maiores e perda de proteínas celulares grandes tais como LDH. O uso de glicina experimentalmente pode desacoplar a formação de poros de Lise, como a glicina não bloqueia gasdermin formação de poros mediada por D, captação de tintura pequeno ou secreção de IL-1 β, mas glicina impede a rápida Lise e LDH lançamento5,22 , 23 , 24. sugerimos incluindo glicina em experimentos de coloração FAM-YAVD-FMK para impedir a perda completa da integridade da membrana, mas glicina deve ser omitida quando se mede o pyroptotic liberação LDH.

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Disclosures

Os autores têm sem conflitos de interesse a divulgar

Acknowledgments

Microscopia de todos foi feito no W. M. Keck microscopia Center com suporte de Nathaniel Peters e com apoio do prêmio NIH S10OD016240. S.L.F. é suportado pelo NIH K08AI119142 e R21AI130281. Agradecemos o Dr. Richard Flavell e o Dr. Brad Cookson para camundongos deficientes de caspase-1/11 e o Dr. Brad Cookson para a partilha de equipamentos e instalações laboratoriais.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
E-MEM ATCC 30-2003 For growing L929 cells
NCRC clone 929 (L929) ATCC CCL-1
Fixation/Permeabilization Kit BD Biosciences 554714 Includes fixation and permeabilization solution, and wash buffer. Proprietary formulations. Contains 4.2% formaldehyde
Glycine Biorad 161-0718
Cytotox96 Nonradioactive cytotoxicity assay Fisher Scientific PR-G1780 Includes Substrate Mix and Assay Buffer; Proprietary formulations. Stop solution is 1 M Acetic acid
FAM-YVAD-FMK Immunocytochemistry Technologies 98
DMEM, high glucose, no glutamine Invitrogen 11960044
DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red Invitrogen 31053028
Dulbecco's PBS, no calcium, no magnesium Invitrogen 14190144
Fetal Bovine Serum, qualified, US origin Invitrogen 26140079 Heat inactivated at 55°C for 50 min
Gentamicin Invitrogen 15750060
ProLong Gold Mounting Medium Invitrogen p36934 Proprietary formulation. Curing mounting medium. Hardens to refractory index of 1.46
goat anti-mouse ALEXA555 Invitrogen A-21422
HEPES (Ultra Pure) Invitrogen 11344041
L-Glutamine Invitrogen 21051024
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15140122
TO-PRO-3 Iodide Invitrogen T3605 far-red fluorescent nucleic acid stain
C57BL/6J mouse Jackson Laboratoy 000664
caspase-1/11-/- mouse Jackson Laboratory 016621
Leica SP8X Confocal Microscope Leica
Ultrapure LPS from Salmonella minnesota R595 (Re) List Biologicals 434
anti-ASC clone 2EI-7 Millipore-Sigma 04-417
beta-mercapto-ethanol Millipore-Sigma M6250-10ML
DMSO Millipore-Sigma D2650-5X10ML
EDTA Millipore-Sigma E5391
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References

  1. Jorgensen, I., Miao, E. A. Pyroptotic cell death defends against intracellular pathogens. Immunol Rev. 265 (1), 130-142 (2015).
  2. Guo, H., Callaway, J. B., Ting, J. P. Inflammasomes: mechanism of action, role in disease, and therapeutics. Nat Med. 21 (7), 677-687 (2015).
  3. Bergsbaken, T., Fink, S. L., Cookson, B. T. Pyroptosis: host cell death and inflammation. Nat Rev Microbiol. 7 (2), 99-109 (2009).
  4. Martinon, F., Burns, K., Tschopp, J. The inflammasome: a molecular platform triggering activation of inflammatory caspases and processing of proIL-beta. Mol Cell. 10 (2), 417-426 (2002).
  5. Fink, S. L., Cookson, B. T. Caspase-1-dependent pore formation during pyroptosis leads to osmotic lysis of infected host macrophages. Cell Microbiol. 8 (11), 1812-1825 (2006).
  6. Bergsbaken, T., Fink, S. L., den Hartigh, A. B., Loomis, W. P., Cookson, B. T. Coordinated host responses during pyroptosis: caspase-1-dependent lysosome exocytosis and inflammatory cytokine maturation. J Immunol. 187 (5), 2748-2754 (2011).
  7. Shi, J., et al. Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death. Nature. 526 (7575), 660-665 (2015).
  8. Sutterwala, F. S., Haasken, S., Cassel, S. L. Mechanism of NLRP3 inflammasome activation. Ann N Y Acad Sci. 1319, 82-95 (2014).
  9. Juliana, C., et al. Non-transcriptional priming and deubiquitination regulate NLRP3 inflammasome activation. J Biol Chem. 287 (43), 36617-36622 (2012).
  10. Py, B. F., Kim, M. S., Vakifahmetoglu-Norberg, H., Yuan, J. Deubiquitination of NLRP3 by BRCC3 critically regulates inflammasome activity. Mol Cell. 49 (2), 331-338 (2013).
  11. Song, N., et al. NLRP3 Phosphorylation Is an Essential Priming Event for Inflammasome Activation. Mol Cell. 68 (1), 185-197 (2017).
  12. Stutz, A., et al. NLRP3 inflammasome assembly is regulated by phosphorylation of the pyrin domain. J Exp Med. 214 (6), 1725-1736 (2017).
  13. Broz, P., Dixit, V. M. Inflammasomes: mechanism of assembly, regulation and signalling. Nat Rev Immunol. 16 (7), 407-420 (2016).
  14. Masumoto, J., et al. ASC, a novel 22-kDa protein, aggregates during apoptosis of human promyelocytic leukemia HL-60 cells. J Biol Chem. 274 (48), 33835-33838 (1999).
  15. Yamamoto, M., et al. ASC is essential for LPS-induced activation of procaspase-1 independently of TLR-associated signal adaptor molecules. Genes Cells. 9 (11), 1055-1067 (2004).
  16. Miao, E. A., Rajan, J. V., Aderem, A. Caspase-1-induced pyroptotic cell death. Immunol Rev. 243 (1), 206-214 (2011).
  17. LaRock, C. N., Cookson, B. T. The Yersinia virulence effector YopM binds caspase-1 to arrest inflammasome assembly and processing. Cell Host Microbe. 12 (6), 799-805 (2012).
  18. Swanson, M. S., Isberg, R. R. Association of Legionella pneumophila with the macrophage endoplasmic reticulum. Infect Immun. 63 (9), 3609-3620 (1995).
  19. Miller, S. I., Ernst, R. K., Bader, M. W. LPS, TLR4 and infectious disease diversity. Nat Rev Microbiol. 3 (1), 36-46 (2005).
  20. Sester, D. P., et al. A novel flow cytometric method to assess inflammasome formation. J Immunol. 194 (1), 455-462 (2015).
  21. Sester, D. P., et al. Assessment of Inflammasome Formation by Flow Cytometry. Curr Protoc Immunol. , (2016).
  22. DiPeso, L., Ji, D. X., Vance, R. E., Price, J. V. Cell death and cell lysis are separable events during pyroptosis. Cell Death Discov. , (2017).
  23. Russo, H. M., et al. Active Caspase-1 Induces Plasma Membrane Pores That Precede Pyroptotic Lysis and Are Blocked by Lanthanides. J Immunol. 197 (4), 1353-1367 (2016).
  24. Evavold, C. L., et al. The Pore-Forming Protein Gasdermin D Regulates Interleukin-1 Secretion from Living Macrophages. Immunity. , (2017).

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Imunologia e infecção edição 135 imunologia imunidade inata inflammasome caspase-1 ASC NLRP3 pyroptosis nigericin macrófagos da medula óssea-derivado murino
Deteção de ativação de Inflammasome e morte celular de Pyroptotic nos macrófagos da medula óssea-derivado murino
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den Hartigh, A. B., Fink, S. L. Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages. J. Vis. Exp. (135), e57463, doi:10.3791/57463 (2018).

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