Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Inflammasome harekete geçirmek ve Pyroptotic hücre ölümü fare kemik iliği türevi makrofajlar içinde tespiti

Published: May 21, 2018 doi: 10.3791/57463
Automatic Translation
1, 1
1Department of Laboratory Medicine, University of Washington

Summary

NLRP3 inflammasome harekete geçirmek algılama floresans mikroskobu kullanarak ve etkin caspase-1 ve adaptörü, ASC için boyama hücresel olarak açıklanmaktadır. Laktat dehidrogenaz yayın tahlil pyroptotic lizis nüfus olarak algılamak için sunulmuştur. Bu teknikler birçok açıdan inflammasome biyoloji çalışmaya adapte edilebilir.

Abstract

Inflammasomes birçok patojen organizmalar başarılı kontrolü için gerekli olan ama aynı zamanda inflamatuar teşvik doğuştan gelen bağışıklık sinyal gönderme platformları ve otoinflamatuvar hastalıklar vardır. Inflammasomes başını sallamak-benzeri reseptör (NLR) aile üyeleri de dahil olmak üzere sitozolik desen tanıma reseptörleri tarafından aktif hale gelir. Bu reseptörler mikrobiyal veya hasar ilişkili uyarinin algılama oligomerize. Sonraki artan adaptör protein alımı caspase-1 ile yakınlık kaynaklı auto-harekete geçirmek harekete geçirmek bir mikroskobik görünür inflammasome karmaşık, oluşturur. Harekete geçirmek, caspase-1 pro-IL-1β ve pro-IL-18, harekete geçirmek ve bu pro-inflamatuar sitokinlerin salgılanmasını lider cleaves. Caspase-1 Ayrıca inflamatuar formdaki membran bütünlüğü ve hücre lizis kaybı özellikleri pyroptosis olarak adlandırdığı hücre ölümü aracılık eder. Caspase-1 gasdermin için ozmotik lizis önde gelen D, plazma zarı gözenekleri, oluşturan N-terminal parça bırakmadan cleaves.

İçinde vitro, belgili tanımlık harekete geçirmek caspase-1 caspase-1 faaliyet sonda FAM-YVAD-FMK ile kemik iliği türevi makrofajlar etiketleme ve adaptör protein ASC karşı antikor hücrelerle etiketleme belirlenebilir. Bu teknik inflammasome oluşumu ve caspase-1 harekete geçirmek floresans mikroskobu kullanarak tek tek hücreleri içinde kimliği sağlar. Pyroptotic hücre ölümü Orta serbest bırakılması sitozolik laktat dehidrogenaz ölçüm tarafından tespit edilebilir. Bu basit, uygun maliyetli ve filtreleme için uyum sağlayan bir 96-şey plaka biçiminde gerçekleştirilen işlemdir. Bu makale, nigericin tarafından NLRP3 inflammasome aktivasyonu için adaptör protein ASC ve etkin caspase-1, yerelleştirme iş açar pyroptosis için önde gelen gösteriyoruz.

Introduction

Inflammasome-aracılı iltihap patojen organizmalar1karşı savunma bir kritik bileşenidir ama aynı zamanda pek çok hastalıkları2etyolojisinde altında yatan. Hasar moleküler modelleri (DAMPs) ilişkili veya çok çeşitli enfeksiyonların inflamatuar yanıt patojen ilişkili moleküler desenleri (PAMPs) sitozolik algılama tarafından tetiklenir. Desen tanıma reseptörleri (PRR), NOD benzeri reseptör (NLR) aile üyeleri de dahil olmak üzere bu algılama PAMPs ve DAMPs oligomerize. Bu PRR, apoptozis ile ilişkili leke gibi protein içeren bir C-terminal caspase-işe alım etki alanı (kart) (ASC) ve yanlısı şeklinde adaptör protein içeren inflammasome olarak adlandırdığı bir çok protein kompleksi oluşumunu tetikler caspase-13,4. Bu karmaşık yakınlık kaynaklı auto-harekete geçirmek-in caspase-1 sağlar. Active caspase-1 sonra özelliği inflamatuar hücre ölüm yolu pyroptosis olan olayları yol açar. Bu olaylar şunlardır: bölünme ve inflamatuar sitokinlerin IL-1β ve IL-18, lysosome ekzositozu ekstrasellüler boşluk, nükleer yoğunlaşma ve gasdermin D bölünme lizozomal İçindekiler sürümüyle serbest bırakılması. Plazma membran rüptürü ve yayın patojen çoğaltma5, için koruyucu bir niş zannetme yanı sıra inflamatuar İçindekiler neden gözenekleri oluşturan plazma zarı gasdermin D yayımlanan N-terminal alanı ekler 6 , 7.

Burada, iyi okudu NLRP3 inflammasome ele. NLRP3 inflammasome aktivasyonu ile iki adımlı işlem8oluşur. İlk "macun" adım tanıma programını Toll benzeri reseptörler bir mikrobiyal ürünün tarafından (TLR) oluşur. Bu TLR4 uyarmak için LPS kullanarak laboratuar ortamında çoğaltılır. Bu uyarımı upregulates NLRP3 ve NF-kB sinyal aracılığıyla pro-IL-1β. Ayrıca priming NLRP3 transkripsiyon mekanizmalar aracılığıyla onun deubiquitination9,10 ve fosforilasyon veya belirli artıkları11,12dephosphorylation inducing tarafından lisans verir.

İkinci sinyal NLRP3 harekete geçirmek için ne kadar zor8NLRP3 harekete geçirmek için birleştirici bir mekanizma kalır mitokondrial faktörler, reaktif oksijen türleri, potasyum sızma ve sinyal, kalsiyum içeren düşünülmektedir. Aktif NLRP3 onun NACHT etki alanları arasındaki etkileşimler yoluyla oligomerizes ve ASC pyrin (PYD) etki alanları13bağlama yolu ile acemi. Her hücre, tek bir mikroskobik görünür odak makromoleküllerin bu kompleksler oluşturur. ASC aslında insan lösemi hücreleri apoptosis sırasında bir "leke" oluşturan 22 KDa protein ve bir kart14içeren adlandırılmış apoptozis ile ilişkili leke gibi protein olarak tespit edilmiştir. Bu daha sonra ASC pro-caspase-1 inflammasome15şekillendirme kartı pro-caspase-1, ASC kartıyla etkileşimi aracılığıyla acemi belirlendi.

Tüm NLR'ler caspase-1 aktivasyon ikna etmek için ASC varlığını gerektirir. NLRP3, aksine NLRC4 ve NLRP1b kartı etki alanları var ve pro-caspase-1 caspase-1 aktivasyon ikna etmek için kart etkileşimleri aracılığıyla doğrudan işe. ASC yokluğunda active caspase-1 sitozol yaygın olarak kalır ve tek bir odak noktası formu değil. Bu yaygın active caspase-1 pyroptotic hücre ölümü ikna etmek yeterli ama pro-IL-1β13,16işleyemiyor.

Bu makale, inflammasome harekete geçirmek değerlendirmek için iki yol ele alınacak. İlk floresan faaliyet kullanan sonda, FAM-YVAD-caspase-1 proteaz ailesinin bağlayan FMK,. Bu aile caspase-1, ama aynı zamanda fare caspase-11 ve insan caspase-4 ve caspase-5 içerir. Caspase-1/11 eksik fare üzerinden makrofajlar tüm deneyler kullanarak, bu sonda özgüllük ele alınacaktır. Bu yöntem ayrıca anlatacağız inflammasome bileşenlerinin antikor etiketleme ile kombine edilebilir. Mikroskobik görselleştirme için tek tek hücreleri aktif caspase-1 ve oligomerized ASC içeren kimlik sağlar. Bu yöntemi kullanarak, araştırmacılar inflammasome oluşumu cascade bir etkisi konak hücre veya altında eğitim patojen organizma kendi işlemler olduğu belirlemek mümkün olacak. Örneğin, belirli bir müdahale ASC alımı karmaşık NLRP3 engeller ya da sonraki işe alım ve caspase-117aktivasyonu hedefleyen bir ayırt edebilirsiniz. Caspase-1 etkinleştirme IL-1β salgı gibi sonuçlarını inceleyerek bu iki olasılık arasında ayırt etmek mümkün olmaz. Ayrıca, IL-1β salgı hücreleri yetenek caspase-1 etkinleştirmek ve pyroptotic hücre ölüm16geçmesi değiştirmeden değişmiş.

İkinci yöntem yukarıda açıklanan caspase-1 harekete geçirmek izleyip pyroptotic makrofaj lizis sırasında oluşan serbest bırakılması laktat dehidrogenaz (karaciğer) süpernatant, hücre içine ölçer. Tüm karaciğer sürümünde de ölçülen bu ikinci yöntem nüfus temelli bir yaklaşım olur. Bu basit yaklaşım hızlı analiz örnekleri için (kuluçka süresi 30 dk) caspase-1-aracılı hücre ölümü olup olmadığını belirlemek için izin verir ve bir 96-şey plaka biçimde gerçekleştirilebilir.

Bu yöntemleri tamamlayıcı, her biri farklı avantajları ve her ikisi de kolayca değişiklikler mükellef bulunmaktadır. Örneğin, makrofaj tedavi ile hedeflenen küçük molekül ağırlıklı bileşikler inflammasome stimülasyon önce rol proteinler inflamatuar yanıt-e doğru kontrol üzerinde olabilir belirli araştırmak için kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm hayvan yordamlar onaylanmış ve University of Washington kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi kuralları altında yürütülen.

1. kemik iliği hasat

  1. Aseptik femur ve tibia bir fareden çıkarın ve steril aletlerin kullanma kemikleri temizleyin. Temizlenmiş kemikleri Dulbecco modifiye kartal Orta (DMEM) + 5 mM HEPES + 0.2 mg/mL L-glutamin + 0,05 mM 2-mercaptoethanol + 50 mg/mL Gentamisin sülfat + 10.000 U/mL penisilin/streptomisin + % 10 fetal Sığır serum (FBS, DMEM-10 tam) yerleştirin ve kuluçkaya 15 dakika buzda tüp.
  2. Makas kullanarak proksimal ve distal topu eklemler kaldırın. Kemikleri hollow orta ile dolu bir 10 mL şırınga bağlı 25 G iğne yerleştirin. Kemik iliği DMEM-10 tam kullanarak floş. Herhangi bir kümeleri yukarı ve aşağı yavaşça orta pipetting tarafından resuspend.
  3. Hücreler için 300 x g, 10 dk santrifüj kapasitesi ve bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak. Bu noktada, %90 FBS + % 10 dimetil sülfoksit (DMSO) kullanarak hücreleri dondurmak veya 15 cm Petri kabına şartına L929 Orta (adım 2.1) kullanarak makrofajlar ayırt etmek için hücrelerde plaka.

2. kemik iliği türevi makrofajlar farklılaşma

  1. Önceden ısıtılmış farklılaşma Orta (DMEM-10 tam 21 mL ve Swanson vd tarafından açıklandığı gibi L929 koşullanmış hücrenin orta 9 mL kullanarak 18), kemik iliği hücreleri bir 15 cm koymak olmayan doku kültürü tedavi Petri kabına (1.2-1.5 x 107 hücreleri). 37 ° C ve % 5 CO2 plaka için 7 gün kuluçkaya. Ek bir 30 mL farklılaşma orta günde 3 ya da 4 plaka ekleyin.
    Not: makrofajlar ayırmak ve hasat zor olacak gibi bu doku kültürü tedavi kaplamalar, kullanmak önemlidir.
  2. Makrofajlar toplamak için fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) ile tabak yıkama ve 20 mL soğuk PBS + 1 mM ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) ekleyin. PBS + EDTA hücrenin üzerine pipetting hücreleri plaka 10 dk. hasat için 4 ° C'de kuluçkaya ve PBS 10 mL Tabağını yıka. Her iki birleştirme iki 15 mL konik tüpler içine yıkar.
  3. 300 x g 10 dk de hücreleri santrifüj kapasitesi ve fenol kırmızısı ücretsiz DMEM + 5 mM HEPES + 0.2 mg/mL L-glutamin + 0,05 mM 2-mercaptoethanol + %5 10 mL hücrelerde resuspend FBS (DMEM-5) ve bir hemasitometre ya da bir Coulter sayaç kullanarak hücreleri saymak. Sayım sırasında hücreler buz üzerinde tutun.
  4. Makrofajlar doku kültürü kaplı levha 2 x 105 hücre/mL, içinde tohum. Mikroskopi deneyler için 1 mL 24 iyi plakaları coverslips sayfasında bulunan bir hücreler tohum. Karaciğer yayın deneyleri için 96 iyi plaka hücrelerinin 100 µL tohum. Karaciğer tahlil için 9 wells (3 kuyu tedavi edilmezse, % 100 lizis kontrolleri ile 3 kuyu ve 3 kuyular için deneysel uyarıcı) tohum.
  5. Santrifüj 96 iyi plaka hücreleri belirli yapmak için 300 x g de 5 min için eşit derecede iyi arasında dağıtılmış.
  6. Gece saat 37 ° C + %5 CO2 plaka astar işlemine başlamadan önce kuluçkaya.

3. astar

  1. 100 ng/mL LPS (500 μL de plaka 24 veya 50 μL de plaka 96) içeren orta taze Orta (DMEM-5) ile değiştirin.
    Not: TLR4-aracılı astar19uyarmak için yeteneği etkileyen LPS yapısal değişimler çeşitli vardır. LPS Salmonella minnesota R595 üzerinden (Re) birden çok satıcı mevcuttur ve tavsiye edilir.
  2. 3 h 37 ° C ve % 5 CO2plaka kuluçkaya.

4. harekete geçirmek-in Nigericin ile NLRP3 Inflammasome ve FAM-YVAD-FMK ile etiketleme

  1. Orta kaldırın ve DMEM-5 5 mikron nigericin ve 5 mM glisin içeren 290 μL ile değiştirin. Glisin caspase-1 harekete geçirmek5sırasında oluşur hücre lizis azaltmak için eklenir. 60 dk 37 ° C ve % 5 CO2için kuluçkaya. Vahşi türü ve caspase-1 eksik makrofajlar gözlenen etiketleme caspase-1 için belirli olduğundan emin olmak için kullanın.
  2. Son 45 dakika 30 10 μL eklemek x FAM-YVAD-FMK, üreticinin yönergelerine göre hazırlanmış.
  3. 60 dk sonra orta kaldırmak ve hücreleri 5 dk her ile 1 mL soğuk PBS için üç kez yıkayın.
  4. Her şey için % 2 paraformaldehyde 250 μL ekleyin ve 30 dk için alüminyum folyo ile kaplı buz üzerinde kuluçkaya.
  5. Son 5 dk çekirdeklerin etiketlemek için 0.2 mM far-red floresan nükleik asit leke 4 μL ekleyin. 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) veya diğer boyalar da etiket DNA için kullanılabilir.
  6. Hücreleri üç kez 1 mL soğuk PBS ile yıkama ve coverslips 7 μL Anti-fade montaj orta kullanma mikroskop slaytlar üzerine monte. Montaj orta coverslip tırnak cilası kullanma mikroskop slayt için sızdırmazlık önce gece sertleşmesine izin.
  7. Makrofajlar tarafından confocal mikroskopi olabilir görüntü. EX / Em FAM-YVAD-FMK için 492/520nm ve 642/661 far-red floresan nükleik asit leke için. Mikroskobu tedavi edilmezse hücreleri herhangi bir arka plan 488 kanalda boyama gösterme gibi ayarlamak emin olun. Aksi durumda, arka plan FAM-YVAD-FMK boyama tespit ve gerçek değil active caspase-1 olur.
    Not: Mikroskop set-up 6 bölümünde anlatılan.

5. antikor boyama

Not: ASC algılamak için antikorlar hücrelerle etiketlemek için tohum, Başbakan ve nigericin önceki bölüme aynı hücrelere ortaya çıkarmak. İşleme daha sonra aşağıdaki gibidir:

  1. Hücreleri 5 dk her ile 1 mL soğuk PBS için üç kez yıkayın. 250 μL fiksasyon ve permeabilization çözüm ekleyin. Hücreler buz üzerinde kuluçkaya ve 30 dk için kapalı.
  2. Üç kez 5 min için her 1 mL ile yıkama arabelleği makrofajlar yıkayın.
  3. ASC karşı birincil antikor 250 μL 1:500 yıkama arabelleği seyreltilmiş ekleyin ve buz üzerinde 1 h için kuluçkaya. Birincil herhangi bir antikor almaz, ancak yalnızca ikincil alacaksınız bir coverslip içerir. Bu coverslip mikroskop Kur sırasında doğru uzaklığı ayarlamak için kullanılır.
  4. Hücreleri ile 1 mL yıkama arabellek her 5 min için üç kez yıkayın.
  5. İkincil antikor (floresan boya konjuge keçi-anti-fare) 250 μL 1:500 yıkama arabelleği seyreltilmiş ve buz üzerinde 1 h için kuluçkaya ekleyin. Bu kuluçka son 5 min için 0.2 mM far-red floresan nükleik asit leke 4 μL etiket çekirdekler için ekleyin.
  6. 3 hücreleri yıkama x 1 mL soğuk yıkama arabellek ve coverslips mikroskop üzerine slaytlar 7 μL Anti-fade montaj orta kullanarak bağlama ile. Coverslip açık oje kullanma mikroskop slayt için sızdırmazlık önce gece sertleşmesine montaj orta izin.
  7. Görüntü makrofajlar tarafından confocal mikroskobu. EX / Em ikincil antikor için 555/580 nm ve 642/661 far-red floresan nükleik asit leke (aşağıda açıklandığı gibi).
    Not: FAM-YVAD-FMK ve antikor etiketleme ile etiketleme Co yerelleştirilmesini etkin caspase-1 ve ASC göstermek için birleştirilebilir. Bunun için FAM-YVAD-FMK etiketleme için koşulları izleyin ve sonra daha fazla işlem için protokol etiketleme antikor geçin.

6. Confocal mikroskobu tarafından etiketli makrofajlar görüntüleme

Not: coverslips gecede tedavi ve tırnak cilası ile mikroskop slayt mühürlü izin sonra lekeli hücreleri görülebilir. Burada, görüntüleme confocal mikroskop kullanılarak açıklanmıştır. Hücreleri de standart floresan mikroskopi tarafından görüntülenebilir.

  1. Tedavi edilmemiş kontrol hücreleri içeren slaydı mikroskop sahnesinde yerini ve hücreleri mikroskobunun odaklan.
  2. Orada öyle ki hiçbir olumlu FAM-YVAD-FMK tedavi edilmezse hücrelerde boyama mikroskop bakmak kadar tablo (LUT) ayarları kullanarak, uzaklık ayarlayın. Bu işlem caspase-1 eksik makrofajlar kullanılarak da gerçekleştirilebilir.
    Not: Uzaklık deneyde kullanılan her kanal için ayarlanması gerekir, ama doğru uzaklık ayarı FAM-YVAD-FMK kanal ve floresan antikor kanalları için en kritik. DNA kanal kenardan uzaklığı daha az önemlidir. Mahsup hesabı ayarladığınızda, bu ayarı deneme boyunca ayarlamak değil.
  3. Slayt geçiş yapmak için tedavi nigericin örnek. Pozitif ve negatif FAM-YVAD-FMK boyama için her iki hücre içeren bir alan bulun. Pozitif boyama en yüksek şiddeti vardır uçağa FAM-YVAD-FMK kanal görüntüleme uçak ayarlayın. Bu normalde inflammasome odak merkezi nerede görüntüsü uçak olacak.
  4. Öyle ki Foci yoğun çekirdeği olan hücrelerde görülebilir kazanç ayarlayın. Kazanç ve mahsup hesabı ayarladıktan sonra görüntüleme oturumun geri kalanı için bu ayarları bırakın.
    Not: bir hücre pyroptotic olup olmadığını belirlemek için bir kolay yolu nükleer morfoloji arıyor. Active caspase-1 içeren hücreleri yuvarlak ve yoğun çekirdeği nükleulus hücreleri caspase-1 harekete geçirmek ve nükleer morfoloji olmadan görünür iken, tedavi edilmemiş hücreleri benzer.
  5. Görüntü 100 X toplam büyütme 5 rasgele seçilen alan toplamak. Bu normalde görüntü başına yaklaşık 40 hücre sonuçlanır. Her örnek için bu işlemi yineleyin.
  6. Her görüntü görüntü analiz yazılımı kullanarak hücreleri saymak. Sonra olumlu FAM-YVAD-FMK boyama içeren hücreleri saymak. Caspase-1 etkinleştirme FAM-YVAD-FMK pozitif hücrelerinin yüzdesi olarak düzeyini temsil edecek.

7. karaciğer yayın tahlil

Not: karaciğer yayın tahlil için tohum ve önceki bölümde açıklandığı gibi hücreleri hariç Başbakan 96 iyi tabak kullanın. Orta priming sonra kaldırmaz.

  1. DMEM-5 10 mikron nigericin deneysel wells için ve 50 μL içeren 50 μL eklemek DMEM-5 spontan ve % 100 lizis denetim kuyuları için. Hedef hücre lizis ölçmek için olduğundan glisin bu deneyde eklemeyin. 60 dk 37 ° C ve % 5 CO2için kuluçkaya.
  2. 30 dk sonra % 100 lizis denetim wells için 10 x lizis arabelleği 10 μL ekleyin ve DMEM-5 10 μL diğer wells ekleyin. Bu kuluçka sırasında substrat Mix (kurutulmuş substrat 1,5 mL) 1 flakon ve tahlil arabelleği (~ 12 mL) 1 aliquot dondurucudan kaldırmak ve ışıktan oda sıcaklığında korunan çözülme bildirin.
    Not: Kırmızı formazan ürün için dönüştürülür tetrazolium tuz (iodonitro-tetrazolium menekşe), substrat içermektedir.
  3. 60 dk toplam kuluçka sonra plaka vasıl 500 x g 10 ° C'de 5 dakika santrifüj kapasitesi 50 μL süpernatant ile bir açık düz alt plaka aktarın. Bu süre içinde tahlil arabellek 12 mL substrat mix şişe ekleyin ve kullanmadan önce oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya.
  4. Her şey için 50 μL substrat ekleyin ve karanlıkta 30 dk için kuluçkaya. Orta tek kuyular için boş değerler içerir. Plaka 15 dakika sonra sinyal plaka okuyucu algılama sınırı aşan değil emin olmak için denetleyin.
  5. 30 dk sonra durmak eriyik (1 M asetik asit) 50 μL ekleyin ve bir plaka okuyucu kullanarak OD490 ölçmek.
  6. Aşağıdaki formülü kullanarak hücre lizis yüzdesini hesaplamak:
    % Cytoxicity = ((Experimental-Spontaneous) / (maksimum-spontan)) × 100
    Deneysel: tedavi nigericin hücreleri; spontan: tedavi edilmezse hücreleri; en fazla: hücre lizis arabelleğe maruz

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Caspase-1 harekete geçirmek nigericin maruz takip algılamak için hücreleri Protokolü bölümünde açıklandığı gibi işlendi. FAM-YVAD-FMK ve ASC ASC ve etkin caspase-1 NLRP3-aracılı inflammasome harekete geçirmek takip işbirliği yerelleştirmek olduğunu göstermek için antikor etiketleme kombine. Şekil 1A 5 mikron nigericin maruz vahşi türü makrofajlar Perinükleer bölgede bir ASC odak oluşumu olduğunu gösterir. Bu resimde de ASC FAM-YVAD-FMK ile ortak yerelleştirme tarafından görüldüğü gibi aktif caspase-1 içerir. Active caspase-1 için pozitif hücreler bu hücreler pyroptosis geçiren gösterilen nükleer yoğunlaşma var. Şekil 1B makrofajlar caspase-1/11 eksik farelerin bir ASC odak oluşumu var iken, onlar herhangi bir etkin caspase-1 FAM-YVAD-FMK boyama yokluğu tarafından gösterildiği gibi bu odak ile ilişkili yok gösterir. Bu hücrelerin çekirdekleri, hiçbir pyroptotic olduğunu gösteren Özet değil ölüm meydana gelen hücre. Görüntüleri bir 63 X yağı daldırma amacı ile tarama confocal mikroskop kullanarak alındı. Görüntüleri TIFF dosyaları olarak başka herhangi bir işleme olmadan kaydedildi.

Nigericin maruz kalma ile ilişkili hücre ölümü düzeyini belirlemek için biz bir karaciğer yayın tahlil süpernatant kültür gerçekleştirilen. Şekil 2 vahşi türü makrofaj hücre ölümü nigericin maruz kaldıktan sonra tabi gösterir. Buna ek olarak, makrofajlar caspase-1'eksik karaciğer hücreleri eksiksiz olduğunu gösteren hücre süpernatant, serbest değil.

Figure 1
Şekil 1: FAM-YVAD-FMK ve anti-ASC etiketleme. (A)vahşi türü (WT) ve (B) caspase-1/11 eksik (c1/11- / -) makrofajlar 1 h için 5 mikron nigericin maruz ve etkin caspase-1 için etkin caspase-1 ve anti-ASC algılamak için FAM-YVAD-FMK kullanarak confocal mikroskobu tarafından analiz ASC algılamak için birincil ve keçi-anti-fare ikincil antikor oluşumu odaklan. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: karaciğer yayın tahlil sonuçları. Vahşi türü ve caspase-1/11 eksik makrofajlar 1 h için 5 mikron nigericin sinin ve hücre süpernatant karaciğer varlığı için analiz edildi. Anlamına gelir ± SD üç çoğaltır verilerdir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu makale, biz inflammasome harekete geçirmek ve caspase-1 harekete geçirmek NLRP3 stimülasyon fare kemik iliği türevi makrofajlar içinde takip sonucu incelemek için iki teknik sundu. İlk teknik caspase-1 etkinleştirme floresan muhabir FAM-YVAD-FMK hücresel bağlamında düzeyini belirlemek araştırmacı sağlar. Bu muhabir caspase-1/11 eksik makrofajlar boyama yokluğu tarafından görüldüğü gibi enzimlerin caspase-1 Aile bağlama için çok özel. Özgüllük LaRock ve arktarafından da gösterildi. caspase-1 devre dışı Yersinia protein YopM rolünü açıklayan, gönderdikleri çalışmanın içinde. Gönderdikleri çalışmanın gösteriyorlar FAM-YVAD-FMK foci caspase-117karşı yönetmen antikorlar ile etiketli foci ile çakışıyor.

Her denemede olduğu gibi yanlış pozitif sonuçlar ortadan kaldırmak için izlenmesi gereken bazı önemli adımlar vardır. Her şeyden önce vahşi türü ve caspase-1/11 eksik makrofajlar kullanmak zorunludur. Bu iki hücre türleri kullanarak, non-spesifik boyama için yol koşulları daha fazla analiz dışlanabilir. İkinci olarak, tahlil etiketleme herhangi bir antikor veya etkinlik sondası gibi ile FAM-YVAD-FMK ile boyama sonra hücreler iyice yıkayın önemlidir. Üç 5 dk yıkar kullanarak, arka plan sinyal düzeyini önemli ölçüde azalır. Üçüncü önemli bir adım confocal mikroskop kurulumu sırasında oluşur. Burada, tedavi edilmemiş hücreler FAM-YVAD-FMK ile etiketli böyle bir şekilde hiçbir olumlu sitoplazmik boyama tedavi edilmezse hücrelerde görülmektedir confocal mikroskop uzaklığı ayarlamak için kullanılır önemlidir. Bu adımlar izlendiğinde, bu teknik harekete geçirmek-in caspase-1 hücresel olarak değerlendirmek için yararlı bir araçtır.

Bu iletişim kuralı araştırmacılar gereksinimlerinize uyacak şekilde değiştirilebilir. Örneğin, hücreleri ile küçük molekül ağırlıklı bileşikler birkaç adımlar tüm işlemi sırasında tedavi edilebilir. Bu NLR, ASC veya pro-caspase-1, alımı Oligomerizasyonda modüle yolları tanımlanması için sağlayacak ya da harekete geçirmek caspase-1 kendisi. Bu iletişim kuralı için yapılan değişiklikleri onlar caspase-1 tek başına yapmak değil harekete geçirmek böyle olmak zorunda. Bu durumda, söz konusu ilacın dozu yanıt eğrisi gereklidir. Biz NLRP3 inflammasome harekete geçirmek üstünde duruldu olsa bile, bu protokolü de diğer PRRs tarafından tetiklenen inflammasomes incelemek için kullanılabilir. Başka bir değişiklik bu el yazması dahil ettik FAM-YVAD-FMK antikor inflammasome bileşenleri etiketleme ile boyama ile birlikte olduğunu. Active caspase-1 inflammasome adaptör ASC Co yerelleştirme olduğunu göstereceğiz. Bir bu yöntemi açıklandığı gibi confocal mikroskop erişim gerektiren kısıtlamasıdır. Ancak, ASC odak oluşumu akış sitometresi tarafından tespit etmek için ilgili bir strateji bildirilen20,21olmuştur.

Konuştuğumuz ikinci teknik bir karaciğer yayın tahlil kullanarak hücre lizis hızlı tespiti için sağlar. Karaciğer yayın aynı zamanda birçok diğer formları hücre ölümü sırasında oluşur ve pyroptosis için spesifik değildir plazma membran bütünlüğü ve hücre lizis, kaybı gösterir unutmamak gerekir. Ancak, caspase-1 eksik hücrelerin kullanımı caspase 1 bağımlı hücre lizis, pyroptosis belirleyici bir özellik tanımlayabilirsiniz.

Bu iletişim kuralı (özellikle bulaşıcı bir ajan kullanırken) kritik bir adımda plaka 96 iyi plaka hücrelerde tohum sonra santrifüj kapasitesi var. Santrifüjü plaka makrofajlar eşit dağıtım için iyi bütün yüzeyi boyunca sağlar. Eşit dağıtım ile her makrofaj bakteriler aynı sayıda maruz kalacağı. Santrifüjü, daha fazla makrofajlar kuyunun kenarında biriken sıvı iyi menisküs etkisini sağlayacaktır. Bu enfeksiyon amaçlanan çokluğu iyi Center'da (MOI) iyi duvara yakın ve amaçlanan daha yüksek MOI düşürmek için yol açacak.

Karaciğer yayın tahlil bir potansiyel dezavantajı bu lizis nüfus düzeyinde ve tahlil için bir zaman noktasında ölçer olmasıdır. Alternatif bir yaklaşım tek hücre olarak membran bütünlüğü kaybı tanımlar mikroskobu tarafından hücre impermeant boyalar alımını ölçmek etmektir. Canlı hücre platformları Imaging ile birlikte, bu yaklaşım aynı zamanda pyroptosis22zamansal bir değerlendirme sağlar. Propidium iyodür gibi küçük DNA'ya bağlanıcı floresan boyalar veya etidyum bromür gasdermin D gözenek geçmek, hücresel nükleik asitleri bağlama ve5,22,23bulabilsem. Gözenek oluşumu ve bu küçük boya alımını geçici terminal hücre lizis önce. Lizis daha büyük boya alımını ve karaciğer gibi büyük hücresel protein kaybı sağlar. Glisin kullanımı deneysel olarak gözenek oluşumu lizis, üzerinden glisin gasdermin D-aracılı gözenek oluşumu, küçük boya alımı veya IL-1β salgı engellemez, ancak glisin hızlı lizis ve karaciğer sürüm5,22 engeller gibi çözmek , 23 , 24. membran bütünlüğü tamamen kaybı önlemek için FAM-YAVD-FMK boyama deneylerde glisin dahil öneririz ama glisin pyroptotic karaciğer yayın ölçerken ihmal gerekir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar hiçbir ifşa etmek çıkar çatışması var.

Acknowledgments

Tüm mikroskobu W. M. Keck mikroskobu merkezi Nathaniel Peters desteği ile ve NIH Ödülü S10OD016240 desteğiyle yapıldı. S.L.F. NIH K08AI119142 ve R21AI130281 tarafından desteklenir. Biz Dr Richard Flavell ve Dr. Brad Cookson caspase-1/11 eksik fareler için ve Dr. Brad Cookson laboratuvar tesisler ve ekipman paylaştığınız için teşekkür ederiz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
E-MEM ATCC 30-2003 For growing L929 cells
NCRC clone 929 (L929) ATCC CCL-1
Fixation/Permeabilization Kit BD Biosciences 554714 Includes fixation and permeabilization solution, and wash buffer. Proprietary formulations. Contains 4.2% formaldehyde
Glycine Biorad 161-0718
Cytotox96 Nonradioactive cytotoxicity assay Fisher Scientific PR-G1780 Includes Substrate Mix and Assay Buffer; Proprietary formulations. Stop solution is 1 M Acetic acid
FAM-YVAD-FMK Immunocytochemistry Technologies 98
DMEM, high glucose, no glutamine Invitrogen 11960044
DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red Invitrogen 31053028
Dulbecco's PBS, no calcium, no magnesium Invitrogen 14190144
Fetal Bovine Serum, qualified, US origin Invitrogen 26140079 Heat inactivated at 55°C for 50 min
Gentamicin Invitrogen 15750060
ProLong Gold Mounting Medium Invitrogen p36934 Proprietary formulation. Curing mounting medium. Hardens to refractory index of 1.46
goat anti-mouse ALEXA555 Invitrogen A-21422
HEPES (Ultra Pure) Invitrogen 11344041
L-Glutamine Invitrogen 21051024
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15140122
TO-PRO-3 Iodide Invitrogen T3605 far-red fluorescent nucleic acid stain
C57BL/6J mouse Jackson Laboratoy 000664
caspase-1/11-/- mouse Jackson Laboratory 016621
Leica SP8X Confocal Microscope Leica
Ultrapure LPS from Salmonella minnesota R595 (Re) List Biologicals 434
anti-ASC clone 2EI-7 Millipore-Sigma 04-417
beta-mercapto-ethanol Millipore-Sigma M6250-10ML
DMSO Millipore-Sigma D2650-5X10ML
EDTA Millipore-Sigma E5391
Spectramax M3 plate reader Molecular Devices 5000414

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jorgensen, I., Miao, E. A. Pyroptotic cell death defends against intracellular pathogens. Immunol Rev. 265 (1), 130-142 (2015).
  2. Guo, H., Callaway, J. B., Ting, J. P. Inflammasomes: mechanism of action, role in disease, and therapeutics. Nat Med. 21 (7), 677-687 (2015).
  3. Bergsbaken, T., Fink, S. L., Cookson, B. T. Pyroptosis: host cell death and inflammation. Nat Rev Microbiol. 7 (2), 99-109 (2009).
  4. Martinon, F., Burns, K., Tschopp, J. The inflammasome: a molecular platform triggering activation of inflammatory caspases and processing of proIL-beta. Mol Cell. 10 (2), 417-426 (2002).
  5. Fink, S. L., Cookson, B. T. Caspase-1-dependent pore formation during pyroptosis leads to osmotic lysis of infected host macrophages. Cell Microbiol. 8 (11), 1812-1825 (2006).
  6. Bergsbaken, T., Fink, S. L., den Hartigh, A. B., Loomis, W. P., Cookson, B. T. Coordinated host responses during pyroptosis: caspase-1-dependent lysosome exocytosis and inflammatory cytokine maturation. J Immunol. 187 (5), 2748-2754 (2011).
  7. Shi, J., et al. Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death. Nature. 526 (7575), 660-665 (2015).
  8. Sutterwala, F. S., Haasken, S., Cassel, S. L. Mechanism of NLRP3 inflammasome activation. Ann N Y Acad Sci. 1319, 82-95 (2014).
  9. Juliana, C., et al. Non-transcriptional priming and deubiquitination regulate NLRP3 inflammasome activation. J Biol Chem. 287 (43), 36617-36622 (2012).
  10. Py, B. F., Kim, M. S., Vakifahmetoglu-Norberg, H., Yuan, J. Deubiquitination of NLRP3 by BRCC3 critically regulates inflammasome activity. Mol Cell. 49 (2), 331-338 (2013).
  11. Song, N., et al. NLRP3 Phosphorylation Is an Essential Priming Event for Inflammasome Activation. Mol Cell. 68 (1), 185-197 (2017).
  12. Stutz, A., et al. NLRP3 inflammasome assembly is regulated by phosphorylation of the pyrin domain. J Exp Med. 214 (6), 1725-1736 (2017).
  13. Broz, P., Dixit, V. M. Inflammasomes: mechanism of assembly, regulation and signalling. Nat Rev Immunol. 16 (7), 407-420 (2016).
  14. Masumoto, J., et al. ASC, a novel 22-kDa protein, aggregates during apoptosis of human promyelocytic leukemia HL-60 cells. J Biol Chem. 274 (48), 33835-33838 (1999).
  15. Yamamoto, M., et al. ASC is essential for LPS-induced activation of procaspase-1 independently of TLR-associated signal adaptor molecules. Genes Cells. 9 (11), 1055-1067 (2004).
  16. Miao, E. A., Rajan, J. V., Aderem, A. Caspase-1-induced pyroptotic cell death. Immunol Rev. 243 (1), 206-214 (2011).
  17. LaRock, C. N., Cookson, B. T. The Yersinia virulence effector YopM binds caspase-1 to arrest inflammasome assembly and processing. Cell Host Microbe. 12 (6), 799-805 (2012).
  18. Swanson, M. S., Isberg, R. R. Association of Legionella pneumophila with the macrophage endoplasmic reticulum. Infect Immun. 63 (9), 3609-3620 (1995).
  19. Miller, S. I., Ernst, R. K., Bader, M. W. LPS, TLR4 and infectious disease diversity. Nat Rev Microbiol. 3 (1), 36-46 (2005).
  20. Sester, D. P., et al. A novel flow cytometric method to assess inflammasome formation. J Immunol. 194 (1), 455-462 (2015).
  21. Sester, D. P., et al. Assessment of Inflammasome Formation by Flow Cytometry. Curr Protoc Immunol. , (2016).
  22. DiPeso, L., Ji, D. X., Vance, R. E., Price, J. V. Cell death and cell lysis are separable events during pyroptosis. Cell Death Discov. , (2017).
  23. Russo, H. M., et al. Active Caspase-1 Induces Plasma Membrane Pores That Precede Pyroptotic Lysis and Are Blocked by Lanthanides. J Immunol. 197 (4), 1353-1367 (2016).
  24. Evavold, C. L., et al. The Pore-Forming Protein Gasdermin D Regulates Interleukin-1 Secretion from Living Macrophages. Immunity. , (2017).

Tags

İmmünoloji ve enfeksiyon sorunu 135 immünoloji doğuştan gelen bağışıklık inflammasome caspase-1 ASC NLRP3 pyroptosis nigericin fare kemik iliği türevi makrofajlar
Inflammasome harekete geçirmek ve Pyroptotic hücre ölümü fare kemik iliği türevi makrofajlar içinde tespiti
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

den Hartigh, A. B., Fink, S. L.… More

den Hartigh, A. B., Fink, S. L. Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages. J. Vis. Exp. (135), e57463, doi:10.3791/57463 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter