Summary
يصف لنا الكشف عن التنشيط إينفلاماسومي NLRP3 على أساس الخلوية باستخدام مجهر الأسفار وتلطيخ النشطة caspase-1 وفي المحول، الرابطة. ويرد مقايسة الإفراج لاكتات نازعة للكشف عن تحلل بيروبتوتيك على أساس سكان. يمكن تكييفها مع هذه التقنيات لدراسة جوانب كثيرة من الأحياء إينفلاماسومي.
Abstract
إينفلاماسوميس هي الفطرية منصات الإشارات المناعية التي مطلوبة من أجل المكافحة الناجحة للعديد من الكائنات المسببة للأمراض، ولكن أيضا تعزيز التهابات وأمراض أوتوينفلاماتوري. يتم تنشيط إينفلاماسوميس من مستقبلات الاعتراف بنمط سيتوسوليك، بما في ذلك أفراد الأسرة مثل إيماءة مستقبلات (NLR). أوليجوميريزي هذه المستقبلات عند الكشف عن المنبهات الميكروبية أو المرتبطة بالضرر. أشكال التوظيف اللاحقة من البروتين محول ASC مجهريا مرئية إينفلاماسومي معقدة، مما ينشط caspase-1 عن طريق التنشيط التلقائي الناجم عن قرب. وبعد التنشيط، كليفس caspase-1 برو--إيل-1β والمحترفين-إيل-18، مما يؤدي إلى تنشيط وإفراز هذه السيتوكينات الموالية التحريضية. كما يتوسط Caspase-1 شكل موت الخلية يسمى بيروبتوسيس، الذي يتميز بفقدان غشاء النزاهة وخلية تفسخ التحريضية. كليفس Caspase-1 جاسديرمين د، الإفراج عن الجزء الطرفي ن الذي يشكل غشاء البلازما المسام، مما يؤدي إلى تحلل ناضح.
يمكن تحديد في المختبر، تفعيل caspase-1 وضع العلامات المشتقة من نخاع العظم الضامة مع المسبار caspase-1 نشاط الاتحاد الماليزي-يفاد-مارك فنلندي، وتسمية الخلايا مع الأجسام المضادة ضد بروتين محول ASC. هذا الأسلوب يسمح تحديد تشكيل إينفلاماسومي وتفعيل caspase-1 في الخلايا الفردية باستخدام مجهر الأسفار. ويمكن الكشف عن موت الخلية بيروبتوتيك بقياس إطلاق سراح سيتوسوليك اللاكتات نازعة في المتوسط. هذا الإجراء بسيطة وفعالة من حيث التكلفة وتنفيذه في شكل لوحة 96-جيدا، والسماح للتكيف للفحص. في هذه المخطوطة، نظهر أن تنشيط إينفلاماسومي NLRP3 من نيجيريسين يؤدي إلى توطين المشارك محول البروتين ASC ونشط caspase-1، مما يؤدي إلى بيروبتوسيس.
Introduction
التهاب إينفلاماسومي بوساطة هو عنصر حاسم للدفاع ضد1من الكائنات المسببة للأمراض، ولكن أيضا يكمن وراء مسببات العديد من الأمراض2. الاستجابة الالتهابية لمجموعة واسعة من الإصابات يتم تشغيلها بواسطة الكشف عن سيتوسوليك من مسببات الأمراض المرتبطة أنماط الجزيئية (بامبس) أو الأضرار المرتبطة أنماط الجزيئية (دامبس). نمط الاعتراف مستقبلات (بر)، بما في ذلك أفراد الأسرة مثل إيماءة مستقبلات (NLR)، أوليجوميريزي عند الكشف عن هذه بامبس ودامبس. هذا بتشغيل تشكيل مجمع متعدد البروتين يسمى إينفلاماسومي، الذي يحتوي على بر، البروتين محول المرتبطة استموات بقعة تشبه البروتين التي تحتوي على مجال caspase-توظيف ج-طرفية (بطاقة) (ASC) والمؤيدة شكل ،كاسباسي-134. ويسمح هذا المجمع التنشيط التلقائي المستحثة بالقرب من كاسباسي-1. ثم نشط caspase-1 يؤدي إلى مجموعة من الأحداث التي تتميز بها بيروبتوسيس مسار موت الخلية الملتهبة. وتشمل هذه الأحداث: الانقسام والإفراج عن السيتوكينات الالتهابية 1β إيل وايل-18، الرقابة يحلول مع الإفراج عن محتويات الليزوزومية في الفضاء خارج الخلية، والتكثيف النووية، والانقسام جاسديرمين د. إدراج المجال الطرفي ن المفرج عنهم من جاسديرمين د في غشاء البلازما، تشكيل المسام التي تسبب تمزق الأغشية البلازمية والإفراج عن محتويات التحريضية، بالإضافة إلى أخذ مكانة واقية الممرض النسخ المتماثل5، 6 , 7.
هنا، علينا أن نركز على إينفلاماسومي NLRP3 مدروسة. تفعيل إينفلاماسومي NLRP3 يحدث من خلال عملية ذات خطوتين8. يحدث "فتيلة" الخطوة الأولى من خلال الاعتراف المستقبلات الشبيهة بعدد القتلى (TLR) من منتج الميكروبية. ويتكرر هذا في إنشاء مختبر باستخدام لبس لتحفيز TLR4. هذا التحفيز أوبريجولاتيس NLRP3 والمحترفين-إيل-1β من خلال إشارات NF-كيلو بايت. تراخيص NLRP3 من خلال آليات غير النسخي بحمل ديوبيكويتينيشن9،10 والفسفره أو ديفوسفوريليشن من المخلفات المحددة11،12به فتيلة بالإضافة إلى ذلك.
ويعتقد أن تنطوي على عوامل mitochondrial والأنواع الأكسجين التفاعلية، افلوكس البوتاسيوم والكالسيوم الإشارات، على الرغم من أن إليه موحدة لتفعيل NLRP3 ما زال بعيد المنال8الإشارة الثانية لتنشيط NLRP3. NLRP3 تنشيط أوليجوميريزيس من خلال التفاعلات بين المجالات NACHT لها، والمجندين الرابطة عن طريق الربط بين المجالات بيرين (بيد)13. وتشكل هذه المجمعات الجزيئات في كل خلية، تركيز مجهريا مرئية واحدة. واعتبرت الرابطة أصلاً بروتين كاتشين 22 الذي يشكل "ذرة" أثناء [ابوبتوسس] خلايا سرطان الدم البشري، والمسماة المرتبطة استموات بقعة تشبه البروتين الذي يحتوي على بطاقة14. وتقرر في وقت لاحق أن المجندين ASC برو-كاسباسي-1 من خلال تفاعل بطاقة للرابطة مع بطاقة برو-كاسباسي-1 وتشكيل إينفلاماسومي15.
نلرس ليست كلها تتطلب وجود الرابطة للحث على تفعيل caspase-1. وخلافا NLRP3، NLRC4 و NLRP1b بطاقة المجالات ويمكن توظيف مباشر برو-كاسباسي-1 عن طريق التفاعلات بطاقة للحث على تفعيل caspase-1. نظراً لغياب الرابطة، ما زالت منتشرة في جميع أنحاء سيتوسول النشطة caspase-1 ولا تشكل بؤرة واحدة. هذا منتشرة نشطة caspase-1 يكفي للحث على موت الخلايا بيروبتوتيك، ولكن غير قادر على معالجة برو--إيل-1β13،16.
سوف نناقش في هذه المخطوطة، هناك طريقتان لتقييم تفعيل إينفلاماسومي. يستخدم الأول نشاط الفلورسنت التحقيق، الاتحاد الماليزي-إيفاد-مارك فنلندي، الذي يربط الأسرة caspase-1 من البروتياز. وتشمل هذه العائلة caspase-1، لكن أيضا الماوس caspase-11 والبشرية caspase-4 و caspase-5. وستعالج باستخدام الضامة من caspase-1/11 ناقص الفئران في جميع التجارب، خصوصية هذا التحقيق. هذا الأسلوب يمكن أن تكون جنبا إلى جنب مع جسم العلامات من مكونات إينفلاماسومي، الذي سوف يصف لنا أيضا. يسمح التصور المجهري لتحديد خلايا فردية تتضمن النشطة caspase-1، والرابطة أوليجوميريزيد. باستخدام هذا الأسلوب، سوف تكون قادرة على تحديد أين في تتالي تشكيل إينفلاماسومي التلاعب بهم من الخلية المضيفة أو الكائنات المسببة للأمراض قيد الدراسة لها أثر الباحثين. على سبيل المثال، يمكن للمرء أن يميز سواء بتدخل معين يحول دون توظيف ASC إلى NLRP3 معقدة أو يستهدف تجنيد اللاحقة وتفعيل caspase-117. دراسة نتائج تفعيل caspase-1 مثل إفراز 1β إيل لن قادراً على التمييز بين هذه الإمكانيات اثنين. أيضا، يمكن تغيير إفراز 1β إيل دون تغيير الخلايا القدرة على تفعيل caspase-1 والخضوع لموت الخلايا بيروبتوتيك16.
الأسلوب الثاني تدابير الإفراج نازعة لاكتات (رابطة حقوق الإنسان) في الخلية طافية، الذي يحدث أثناء بيروبتوتيك بلعم تحلل بعد تفعيل caspase-1 كما هو موضح أعلاه. هذا الأسلوب الثاني اتباع نهج قائم على السكان كما الإفراج عن رابطة حقوق الإنسان في جميع أنحاء جيدا يتم قياس. يسمح للتحليل السريع (30 دقيقة من وقت الحضانة) للعينات لتحديد ما إذا كان هناك موت الخلية caspase-1-بوساطة هذا النهج بسيطة ويمكن أن يتم في شكل لوحة 96-جيدا.
هذه الأساليب مكملة، وكل منهما مزايا مختلفة، وكلاهما قابلة بسهولة للتعديلات. على سبيل المثال، يمكن استخدام العلاج بلعم مع مركبات الوزن الجزيئي الصغيرة المستهدفة قبل التحفيز إينفلاماسومي للتحقيق في دور بعض البروتينات قد يكون على التحكم في ردود تحريضية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
كانت وافقت جميع الإجراءات الحيوانية والتي تجري تحت جامعة واشنطن رعاية الحيوان المؤسسية واللجنة استخدام المبادئ التوجيهية.
1-حصاد نخاع العظام
- أسيبتيكالي إزالة عظم الفخذ والساق من ماوس وتنظيف العظام باستخدام أدوات معقمة. ضع عظام تنظيفها في دولبيكو تعديل النسر المتوسطة (دميم) + 5 مم هيبيس + 0.2 مغ/مل لام الجلوتامين + 0.05 مم 2-mercaptoethanol + كبريتات الجنتاميسين 50 ملغم/مل + U/mL 10,000 البنسلين/ستربتوميسين + 10% مصل بقرى الجنين (FBS، دميم-10 كاملة) واحتضان أنبوب في الثلج لمدة 15 دقيقة.
- إزالة مفاصل الكرة الدانية والبعيدة باستخدام مقص. إدراج 25 غ إبرة تعلق بحقنه 10 مل مليئة المتوسطة إلى جوفاء العظام. طرد نخاع العظام باستخدام دميم-10 كاملة. ريسوسبيند أي كتل من بيبيتينج المتوسطة في أعلى وأسفل برفق.
- الطرد المركزي الخلايا لمدة 10 دقائق في 300 x ز وحساب عدد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير. عند هذه النقطة، أما تجميد الخلايا باستخدام 90% FBS + 10% ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]) أو لوحة الخلايا في 15 سم طبق بيتري التفريق بين الضامة باستخدام L929 مكيفة المتوسطة (الخطوة 2، 1).
2-التفريق بين الضامة المشتقة من نخاع العظام
- استخدام التمييز المعالجون مسبقاً المتوسطة (21 مل دميم-10 كاملة ومل 9 من L929 خلية مكيفة المتوسطة كما وصفها سوانسون et al. 18)، وضع خلايا نخاع العظام في 15 سم تعامل غير زراعة الأنسجة طبق بتري (1.2-1.5 × 107 الخلايا). احتضان اللوحة في 37 درجة مئوية و 5% CO2 لمدة 7 أيام. إضافة 30 مل إضافية متوسطة التمايز إلى اللوحة في اليوم 3 أو 4.
ملاحظة: من المهم عدم استخدام لوحات تعامل زراعة الأنسجة، والضامة سيكون من الصعب فصل وموسم الحصاد. - جمع الضامة وتغسل اللوحة مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) وإضافة 20 مل من برنامج تلفزيوني الباردة + 1 ملم حمض الإيثيلين (يدتا). احتضان لوحة عند 4 درجة مئوية للحد الأدنى 10 حصاد الخلايا التي بيبيتينج في برنامج تلفزيوني + يدتا فوق الخلايا وتغسل اللوحة مع 10 مل من برنامج تلفزيوني. الجمع بين كلا يغسل إلى اثنين من أنابيب مخروطية الشكل 15 مل.
- الطرد المركزي الخلايا في 300 غرام x لمدة 10 دقائق وريسوسبيند الخلايا في 10 مل من دميم الحرة الفينول الحمراء + 0.2 مغ/مل لام الجلوتامين + 0.05 مم 2-mercaptoethanol + 5 مم حبيس 5% FBS (دميم-5) وعدد الخلايا باستخدام أما هيموسيتوميتير أو عداد كولتر. تبقى الخلايا على الجليد أثناء عملية عد الأصوات.
- البذور الضامة في لوحات زراعة الأنسجة المغلفة في 2 × 105 خلايا/مل. لإجراء التجارب على الفحص المجهري، البذور 1 مل خلايا على كوفيرسليبس في 24 لوحات جيدا. لرابطة حقوق الإنسان الإفراج عن فحوصات، البذور 100 ميليلتر من الخلايا في صفيحة جيدا 96. للمقايسة رابطة حقوق الإنسان، البذور 9 الآبار (آبار 3 دون علاج، آبار 3 مع ضوابط تحلل 100% وآبار 3 لحافز التجريبي).
- الطرد المركزي 96 لوحة جيدا لمدة 5 دقائق في 300 غرام x للتأكد من الخلايا هي موزعة بالتساوي عبر البئر.
- احتضان لوحة بين عشية وضحاها في 37 ° C + 5% CO2 قبل البدء في عملية التفجير.
3-فتيلة
- استبدال المتوسطة مع المتوسط الطازجة (دميم-5) تحتوي على 100 نانوغرام/مليلتر لبس (500 ميكروليتر 24 لوحة جيدا أو 50 ميكروليتر 96 لوحة جيدا).
ملاحظة: توجد مجموعة متنوعة من التغيرات الهيكلية في لبس، التي تؤثر على القدرة على تحفيز فتيلة بوساطة TLR419. لبس من مينيسوتا السالمونيلا R595 (Re) هو متاح من بائعين متعددين، وينصح. - احتضان لوحة ح 3 في 37 درجة مئوية و 5% CO2.
4-تفعيل إينفلاماسومي NLRP3 مع نيجيريسين ووضع العلامات مع الاتحاد الماليزي-إيفاد-مارك فنلندي
- إزالة المتوسطة واستبدله ميكروليتر 290 دميم-5 التي تحتوي على 5 ميكرومترات نيجيريسين و 5 مم جليكاين. جليكاين إضافة إلى الحد من كمية تحلل الخلية التي تحدث أثناء تفعيل caspase-15. احتضان لمدة 60 دقيقة في شركة 37 درجة مئوية و 5%2. استخدام الضامة قاصرة نوع البرية و caspase-1 لضمان أن التالي الملاحظة المحددة ل caspase-1.
- خلال 45 دقيقة الماضية، إضافة 10 ميكروليتر من 30 × الاتحاد الماليزي-إيفاد-مارك فنلندي، أعد وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
- بعد 60 دقيقة، إزالة المتوسطة وغسل الخلايا ثلاث مرات لمدة 5 دقائق كل مع 1 مل من برنامج تلفزيوني الباردة.
- إضافة 250 ميكروليتر من بارافورمالدهيد 2% لكل بئر واحتضان على الجليد مغطاة برقائق الألومنيوم لمدة 30 دقيقة.
- خلال آخر 5 دقائق، إضافة 4 ميكروليتر من 0.2 مم استعملنا الحمض النووي الفلورسنت وصمة عار لتسمية الأنوية. يمكن أيضا استخدام 4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI) أو صبغات أخرى لتسمية الحمض النووي.
- تغسل الخلايا ثلاث مرات مع 1 مل من برنامج تلفزيوني الباردة وجبل كوفيرسليبس على شرائح المجهر استخدام 7 ميكروليتر تتلاشى لمكافحة تصاعد المتوسطة. واسمحوا المتوسط تصاعد تتصلب طوال الليل قبل ختم ساترة للشريحة المجهر استخدام طلاء الأظافر.
- صورة الضامة بالفحص المجهري [كنفوكل]. ت م للاتحاد الماليزي-إيفاد-مارك فنلندي هو 492/520nm و 642/661 للحمض النووي الفلورسنت استعملنا وصمة عار. تأكد من إعداد المجهر أن الخلايا غير المعالجة لا تظهر أي خلفية تلطيخ في قناة 488. خلاف ذلك، سوف يكون تلوين خلفية الاتحاد الماليزي-إيفاد-مارك فنلندي المكتشفة وغير الفعلية النشطة caspase-1.
ملاحظة: الإعداد مجهر يرد في القسم 6.
5-جسم تلطيخ
ملاحظة: لتسمية الخلايا مع الأجسام المضادة للكشف عن الرابطة، البذور، ورئيس الوزراء، وتعرض الخلايا إلى نيجيريسين مطابقة للمقطع السابق. التجهيز بعد ذلك على النحو التالي:
- تغسل الخلايا ثلاث مرات لمدة 5 دقائق كل مع 1 مل من برنامج تلفزيوني الباردة. إضافة 250 ميكروليتر حل التثبيت وبيرميبيليزيشن. احتضان الخلايا على الجليد، وتغطية لمدة 30 دقيقة.
- أغسل الضامة ثلاث مرات لمدة 5 دقائق كل مع 1 مل من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي.
- إضافة 250 ميكروليتر من جسم الأولية ضد الرابطة المخفف 1: 500 في المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي، واحتضان ح 1 على الجليد. وتشمل ساترة واحد التي لا تتلقى أي جسم الأولية، ولكن سوف تتلقى فقط الثانوية. سيتم استخدام هذا ساترة أثناء الإعداد المجهر لتعيين الإزاحة الصحيح.
- تغسل الخلايا ثلاث مرات لمدة كل 5 دقائق مع 1 مل أغسل المخزن المؤقت.
- إضافة 250 ميكروليتر من جسم الثانوي (صبغة الفلورسنت مترافق الماعز-مكافحة--الماوس) المخفف 1: 500 في المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي، واحتضان ح 1 على الجليد. إضافة 4 ميكروليتر من 0.2 مم استعملنا الحمض النووي الفلورسنت وصمة عار لآخر 5 دقائق من هذه الحضانة إلى نويات التسمية.
- تغسل الخلايا 3 x مع 1 مل من المخزن المؤقت للغسيل البارد وجبل كوفيرسليبس على مجهر الشرائح المتوسطة تتلاشى لمكافحة تصاعد ميكروليتر 7 باستخدام. واسمحوا المتوسط تصاعد تتصلب طوال الليل قبل ختم ساترة للشريحة المجهر استخدام طلاء الأظافر واضحة.
- صورة الضامة بالفحص المجهري [كنفوكل]. ت م للجسم المضاد الثانوي هو 555/580 نانومتر و 642/661 للحمض النووي الفلورسنت استعملنا وصمة عار (كما هو موضح أدناه).
ملاحظة: وضع العلامات مع الاتحاد الماليزي-إيفاد-مارك فنلندي ووسم جسم يمكن دمجها لإظهار الترجمة المشارك النشط caspase-1 والرابطة. لهذا، اتبع شروط تسمية الاتحاد الماليزي-إيفاد-مارك فنلندي، ثم التبديل إلى جسم وسم البروتوكول لمزيد من المعالجة.
6-تصوير الضامة المسمى بالفحص المجهري [كنفوكل]
ملاحظة: يمكن عرض الخلايا الملون بعد كوفيرسليبس قد سمح لعلاج بين عشية وضحاها، وتم إغلاق إلى الشريحة المجهر مع طلاء الأظافر. وهنا التصوير باستخدام مجهر [كنفوكل] هو وصف. يمكن أيضا أن ينظر إلى الخلايا بالميكروسكوب fluorescence القياسية.
- ضع الشريحة مع الخلايا التحكم غير المعالجة في مرحلة مجهر وتركيز المجهر على الخلايا.
- باستخدام إعدادات البحث أعلى الجدول (لوط) المجهر، ضبط الإزاحة مثل أن يكون هناك لا تلطيخ الاتحاد الماليزي-إيفاد-مارك فنلندي إيجابية في الخلايا غير المعالجة. يمكن أيضا إجراء هذه العملية استخدام الضامة ناقص caspase-1.
ملاحظة: الإزاحة قد يتعين تعديلها لكل قناة التي استخدمت في التجربة، ولكن تحديد الإزاحة الصحيح أهم قناة الاتحاد الماليزي-إيفاد-مارك فنلندي وقنوات جسم الفلورسنت. إزاحة للقناة الحمض النووي أقل أهمية. بمجرد تم تعيين الإزاحة، عدم ضبط هذا الإعداد لبقية التجربة. - التبديل الشريحة إلى العينة نيجيريسين معاملة. العثور على حقل يحتوي على كل الخلايا التي إيجابية وسلبية لتلطيخ الاتحاد الماليزي-إيفاد-مارك فنلندي. ضبط الطائرة التصوير من قناة الاتحاد الماليزي-يفاد-مارك فنلندي للطائرة التي لديها كثافة أعلى لتلطيخ إيجابية. سوف يكون هذا عادة الطائرة حيث يتم تصويرها وسط التركيز إينفلاماسومي.
- ضبط المكاسب مثل مرئية البؤر في الخلايا التي تحتوي على نويات مكثف. بعد تحديد الربح والإزاحة، ترك هذه الإعدادات لبقية الدورة التصوير.
ملاحظة: واحد طريقة سهلة لتحديد ما إذا كانت خلية بيروبتوتيك بالنظر إلى مورفولوجيا النووية. الخلايا النشطة caspase-1 قد اعتقلت ونوى مكثف، بينما مرئية نوكليولي في الخلايا دون تفعيل caspase-1 ومورفولوجيا النووية مماثلة لتلك الخلايا غير المعالجة. - جمع الصور من 5 حقول تم اختيارها عشوائياً في 100 × مجموع التكبير. وهذا سيؤدي إلى عادة حوالي 40 زنزانة كل صورة. كرر هذه العملية لكل عينة.
- حساب عدد الخلايا في كل صورة باستخدام برنامج تحليل الصور. ثم حساب عدد الخلايا التي تحتوي على تلطيخ الاتحاد الماليزي-إيفاد-مارك فنلندي إيجابية. ويمثل مستوى تفعيل caspase-1 بالنسبة المئوية للخلايا إيجابية الاتحاد الماليزي-يفاد-مارك فنلندي.
7-رابطة حقوق الإنسان الإفراج الإنزيم
ملاحظة: للمقايسة الإفراج عن رابطة حقوق الإنسان، البذور ورئيس الوزراء الخلايا كما هو موضح في المقطع السابق، باستثناء استخدام لوح جيدا 96. لا تقم بإزالة المتوسط بعد فتيلة.
- إضافة 50 ميكروليتر من دميم-5 التي تحتوي على 10 ميكرومترات نيجيريسين لآبار تجريبية و 50 ميكروليتر دميم-5 لآبار مراقبة تحلل عفوية و 100%. لا تقم بإضافة جليكاين في هذه التجربة نظراً للهدف قياس تحلل الخلية. احتضان لمدة 60 دقيقة في شركة 37 درجة مئوية و 5%2.
- بعد 30 دقيقة، إضافة 10 ميكروليتر من المخزن المؤقت لتحلل x 10 آبار مراقبة تحلل 100% وإضافة 10 ميكروليتر دميم-5 آبار أخرى. خلال هذه الحضانة، إزالة 1 قنينة من الركازة ميكس (1.5 مل الركازة المعصوفه) وقاسمه 1 المقايسة المخزن المؤقت (~ 12 مل) من الثلاجة والسماح لهم بذوبان الجليد محمية من الضوء إلى درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: يتضمن المزيج الركيزة tetrazolium ملح (فيوليت إيودونيترو-تيترازوليوم)، التي يتم تحويلها إلى منتج formazan أحمر. - وبعد تفريخ إجمالي 60 دقيقة، الطرد المركزي لوحة لمدة 5 دقائق في 500 غرام x على 10 درجات مئوية. نقل 50 ميكروليتر من المادة طافية على لوحة مسطحة القاع واضحة. وخلال هذا الوقت، إضافة 12 مل من المخزن المؤقت للمقايسة لقنينة مزيج الركيزة واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق قبل استخدام.
- إضافة 50 ميكروليتر من الركيزة لكل بئر واحتضان لمدة 30 دقيقة في الظلام. وتشمل الآبار فقط المتوسطة للقيم الفارغة. تحقق من اللوحة بعد 15 دقيقة للتأكد من أن الإشارة لا تتجاوز حد الكشف للقارئ لوحة.
- وبعد 30 دقيقة، إضافة 50 ميكروليتر من إيقاف الحل (حمض الخليك 1 م) وقياس OD490 استخدام قارئ لوحة.
- حساب النسبة المئوية لتحلل الخلية باستخدام الصيغة التالية:
سيتوكسيسيتي % = ((Experimental-Spontaneous)/(الحد الأقصى-عفوية)) × 100
التجريبية: نيجيريسين تعامل الخلايا؛ العفوية: دون علاج الخلايا؛ الحد الأقصى: الخلايا التي تتعرض لتحلل المخزن المؤقت
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
للكشف عن تفعيل caspase-1 عقب التعرض إلى نيجيريسين، تم تجهيز الخلايا كما هو موضح في قسم البروتوكول. نحن جنبا إلى جنب الاتحاد الماليزي-إيفاد-مارك فنلندي والرابطة جسم وسم بغية إظهار أن الرابطة ونشط caspase-1 تعريب المشترك بعد التنشيط بوساطة NLRP3 إينفلاماسومي. يبين الشكل 1A أن الضامة نوع البرية المعرضة إلى 5 ميكرومترات نيجيريسين تشكيل نقطة تركيز الرابطة في منطقة بيرينوكلير. هذه البؤر تحتوي أيضا على نشاط caspase-1 كما يراها التعريب المشارك للرابطة مع الاتحاد الماليزي-إيفاد-مارك فنلندي. الخلايا التي إيجابية بالنسبة لنشاط caspase-1 يكون التكثيف النووية تبين أن تمر هذه الخلايا بيروبتوسيس. ويبين الشكل 1B أنه بينما الضامة caspase-1/11 الفئران ناقصة تشكيل نقطة تركيز الرابطة، ليس لديهم أي caspase-1 النشطة المرتبطة بهذا التركيز كما هو مبين بسبب غياب الاتحاد الماليزي-إيفاد-مارك فنلندي تلطيخ. نواة هذه الخلايا غير مكثف، مشيراً إلى أنه لا يوجد أي بيروبتوتيك الخلية التي تحدث الوفاة. تم أخذ صور استخدام مجهر مسح [كنفوكل] مع 63 × النفط الغمر الهدف. تم حفظ الصور كملفات TIFF بدون أي مزيد من المعالجة.
من أجل تحديد مستوى موت الخلايا المرتبطة بالتعرض نيجيريسين، أجرينا مقايسة الإفراج عن رابطة حقوق الإنسان في ثقافة طافية. ويبين الشكل 2 أن نوع البرية الضامة الخضوع لموت الخلايا بعد التعرض إلى نيجيريسين. وفي المقابل، لا إطلاق سراح الضامة قاصرة في caspase-1 رابطة حقوق الإنسان في المادة طافية الخلية، مما يشير إلى أن الخلايا سليمة.
رقم 1: الاتحاد الماليزي-إيفاد-مارك فنلندي ووسم المضادة-ASC. (أ) البرية نوع (WT) والضامة ناقص caspase-1/11 (c1/11--/--) (ب) كانت تتعرض إلى 5 ميكرومترات نيجيريسين ح 1 وتحليلها لنشاط caspase-1 [كنفوكل] مجهرية باستخدام الاتحاد الماليزي-إيفاد-مارك فنلندي للكشف عن نشاط caspase-1، والرابطة المناهضة وتركز الأضداد الثانوي الابتدائي والماعز-مكافحة--الماوس للكشف عن الرابطة تشكيل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: رابطة حقوق الإنسان الإفراج عن نتائج المقايسة. نوع البرية والضامة ناقص caspase-1/11 قد تعرضت ل 5 ميكرومترات نيجيريسين ح 1 وقد تم تحليل الخلية طافية لوجود رابطة حقوق الإنسان. البيانات هي وسائل ± SD من replicates الثلاثة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد قدمنا في هذه المخطوطة، اثنين من التقنيات لبحث تفعيل إينفلاماسومي ونتيجة لتفعيل caspase-1 أثر التحفيز NLRP3 في مورين الضامة المشتقة من نخاع العظام. الأسلوب الأول يسمح للباحث تحديد مستوى تفعيل caspase-1 على أساس خلوي استخدام المراسل الفلورسنت الاتحاد الماليزي-إيفاد-مارك فنلندي. هذا المراسل محددة للغاية لربط الأسرة caspase-1 من الإنزيمات، كما يتبين من الغياب لتلطيخ في الضامة ناقص caspase-1/11. وأبدى أيضا خصوصية لاروك وآخرون. في هذه المخطوطة تصف دور البروتين واليرسينيا يوبم على تفعيل caspase-1. في هذه المخطوطة، تبين أن الاتحاد الماليزي-إيفاد-مارك فنلندي البؤر تتداخل مع البؤر التي تم تسميتها مع الأجسام المضادة الموجهة ضد caspase-117.
كما الحال مع أي تجربة، وهناك بعض الخطوات الهامة التي يتعين اتباعها من أجل القضاء على نتائج إيجابية خاطئة. أولاً وقبل كل شيء، من الضروري استخدام الضامة قاصرة نوع البرية و caspase-1/11. باستخدام هذه الأنواع اثنين من الخلية، يمكن استبعاد الشروط التي تؤدي إلى تلطيخ غير محددة من إجراء مزيد من التحليل. ثانيا، كما هو الحال مع أي جسم أو نشاط المسبار وسم المقايسة، من المهم أن دقة غسل الخلايا بعد تلطيخ مع الاتحاد الماليزي-إيفاد-مارك فنلندي. باستخدام ثلاثة 5 دقائق يغسل، هو تقلص إلى حد كبير مستوى الإشارات الخلفية. خطوة حاسمة ثالث يحدث أثناء الإعداد للمجهر [كنفوكل]. وهنا، من المهم أن الخلايا غير المعالجة المسمى مع الاتحاد الماليزي-إيفاد-مارك فنلندي يتم استخدامها لتعيين إزاحة المجهر [كنفوكل] بطريقة لا تلطيخ هيولى إيجابية من الملاحظ أن في الخلايا غير المعالجة. عند اتباع هذه الخطوات، هذا الأسلوب أداة مفيدة لتقييم تفعيل caspase-1 على أساس خلوية.
يمكن تعديل هذا البروتوكول بما يلائم احتياجات الباحثين. على سبيل المثال، يمكن أن تعامل الخلايا مع مركبات صغيرة الوزن الجزيئي في عدة خطوات خلال العملية بأكملها. ويسمح هذا بتحديد المسارات التي تعدل أوليجوميريزاتيون NLR، توظيف ASC أو برو-كاسباسي-1، أو تفعيل caspase-1 نفسها. التعديلات التي أدخلت على هذا البروتوكول يجب أن تكون بأنها لم تقم بتنشيط caspase-1 بحد ذاته. في حالة حدوث ذلك، مطلوب منحنى استجابة جرعة من المخدرات في السؤال. حتى ولو ركزنا على تفعيل إينفلاماسومي NLRP3، يمكن أيضا استخدام هذا البروتوكول لدراسة إينفلاماسوميس فجرها برس الأخرى. آخر تعديل أدرجنا في هذه المخطوطة هو المزيج من الاتحاد الماليزي-يفاد-مارك فنلندي تلطيخ مع جسم العلامات من مكونات إينفلاماسومي. ونحن تبين أن هناك تعريب المشارك من محول إينفلاماسومي الرابطة نشطة caspase-1. حد من هذا الأسلوب كما هو موضح، أنه يتطلب الوصول إلى مجهر [كنفوكل]. بيد أن استراتيجية ذات صلة للكشف عن تكوين التركيز ASC بالتدفق الخلوي كان الإبلاغ عن20،21.
يسمح الأسلوب الثاني ناقشنا للكشف السريع عن تحلل الخلية باستخدام مقايسة الإفراج عن رابطة حقوق الإنسان. من المهم ملاحظة أن الإفراج عن رابطة حقوق الإنسان تشير إلى فقدان لتحلل غشاء البلازما النزاهة والخلايا، كما يحدث خلال العديد من الأشكال الأخرى من موت الخلايا، وهو ليس تحديداً إلى بيروبتوسيس. ومع ذلك، يمكن تحديد استخدام الخلايا ناقصة caspase-1 خلية caspase-1-تعتمد على تحلل، سمة المميزة بيروبتوسيس.
خطوة حاسمة في هذا البروتوكول (خاصة عند استخدام عامل معدية) هو الطرد المركزي اللوحة بعد زرع الخلايا في صفيحة جيدا 96. الطرد المركزي اللوحة يسمح للمساواة في توزيع الضامة عبر كامل سطح البئر. مع التوزيع المتساوي، كل بلعم سوف تتعرض لنفس العدد من البكتيريا. دون استخدام الطرد المركزي، سوف يؤدي تأثير غضروف السائل في البئر إلى الضامة أكثر تتراكم على حافة البئر. سيؤدي هذا إلى أقل من تعدد المقصود من العدوى بوزارة الداخلية (وزارة الداخلية) القريبة من الجدار جيدا وأعلى مما هو مقصود في وسط البئر.
عيب محتمل للمقايسة الإفراج عن رابطة حقوق الإنسان أنه يقيس تفسخ على مستوى سكان وفي نقطة مرة واحدة كل المقايسة. نهج بديل هو قياس الإقبال على الأصباغ إيمبيرميانت خلية بالفحص المجهري، الذي يعرف بفقدان سلامة الغشاء على أساس خلية واحدة فقط. جنبا إلى جنب مع الخلايا الحية التصوير منصات، يمكن أن توفر هذا النهج أيضا إجراء تقييم الزمانية من بيروبتوسيس22. الصغيرة الحمض النووي ملزم الفلورية الأصباغ مثل يوديد propidium أو يمكن أن تمر عبر المسام جاسديرمين د اثيديوم بروميد وربط الأحماض النووية الخلوية وفلوريس5،،من2223. تشكيل المسام والإقبال على هذه الأصباغ الصغيرة وقتيا يسبق تحلل الخلية الطرفية. تحلل يسمح امتصاص الأصباغ أكبر والخسارة الكبيرة البروتينات الخلوية مثل رابطة حقوق الإنسان. استخدام جليكاين تجريبيا يمكن فصل تشكيل المسام من تفسخ، جليكاين لا يمنع تشكيل المسام توسط د جاسديرمين أو امتصاص الصبغة صغيرة أو إفراز إيل-1β، ولكن منع جليكاين تحلل السريع ورابطة حقوق الإنسان الإفراج عن5،22 , 23 , 24-نقترح بما في ذلك جليكاين في تجارب الاتحاد الماليزي-يافد-مارك فنلندي المصبوغة للحيلولة دون خسارة كاملة لسلامة الغشاء، ولكن يجب حذف جليكاين عند قياس بيروبتوتيك رابطة حقوق الإنسان الإفراج.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب قد لا يوجد تضارب في الكشف عن
Acknowledgments
تم الفحص المجهري كل كيك جورج م. مركز الفحص المجهري مع دعم من بيترز ناثانيال وبدعم من المعاهد الوطنية للصحة جائزة S10OD016240. S.L.F. معتمد من قبل المعهد الوطني للصحة K08AI119142 و R21AI130281. ونحن نشكر الدكتور ريتشارد Flavell والدكتور براد كوكسون للفئران ناقصة caspase-1/11، والدكتور براد كوكسون لتقاسم مرافق المختبرات والمعدات.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| E-MEM | ATCC | 30-2003 | For growing L929 cells |
| NCRC clone 929 (L929) | ATCC | CCL-1 | |
| Fixation/Permeabilization Kit | BD Biosciences | 554714 | Includes fixation and permeabilization solution, and wash buffer. Proprietary formulations. Contains 4.2% formaldehyde |
| Glycine | Biorad | 161-0718 | |
| Cytotox96 Nonradioactive cytotoxicity assay | Fisher Scientific | PR-G1780 | Includes Substrate Mix and Assay Buffer; Proprietary formulations. Stop solution is 1 M Acetic acid |
| FAM-YVAD-FMK | Immunocytochemistry Technologies | 98 | |
| DMEM, high glucose, no glutamine | Invitrogen | 11960044 | |
| DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red | Invitrogen | 31053028 | |
| Dulbecco's PBS, no calcium, no magnesium | Invitrogen | 14190144 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, US origin | Invitrogen | 26140079 | Heat inactivated at 55°C for 50 min |
| Gentamicin | Invitrogen | 15750060 | |
| ProLong Gold Mounting Medium | Invitrogen | p36934 | Proprietary formulation. Curing mounting medium. Hardens to refractory index of 1.46 |
| goat anti-mouse ALEXA555 | Invitrogen | A-21422 | |
| HEPES (Ultra Pure) | Invitrogen | 11344041 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 21051024 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| TO-PRO-3 Iodide | Invitrogen | T3605 | far-red fluorescent nucleic acid stain |
| C57BL/6J mouse | Jackson Laboratoy | 000664 | |
| caspase-1/11-/- mouse | Jackson Laboratory | 016621 | |
| Leica SP8X Confocal Microscope | Leica | ||
| Ultrapure LPS from Salmonella minnesota R595 (Re) | List Biologicals | 434 | |
| anti-ASC clone 2EI-7 | Millipore-Sigma | 04-417 | |
| beta-mercapto-ethanol | Millipore-Sigma | M6250-10ML | |
| DMSO | Millipore-Sigma | D2650-5X10ML | |
| EDTA | Millipore-Sigma | E5391 | |
| Spectramax M3 plate reader | Molecular Devices | 5000414 |
References
- Jorgensen, I., Miao, E. A. Pyroptotic cell death defends against intracellular pathogens. Immunol Rev. 265 (1), 130-142 (2015).
- Guo, H., Callaway, J. B., Ting, J. P. Inflammasomes: mechanism of action, role in disease, and therapeutics. Nat Med. 21 (7), 677-687 (2015).
- Bergsbaken, T., Fink, S. L., Cookson, B. T. Pyroptosis: host cell death and inflammation. Nat Rev Microbiol. 7 (2), 99-109 (2009).
- Martinon, F., Burns, K., Tschopp, J. The inflammasome: a molecular platform triggering activation of inflammatory caspases and processing of proIL-beta. Mol Cell. 10 (2), 417-426 (2002).
- Fink, S. L., Cookson, B. T. Caspase-1-dependent pore formation during pyroptosis leads to osmotic lysis of infected host macrophages. Cell Microbiol. 8 (11), 1812-1825 (2006).
- Bergsbaken, T., Fink, S. L., den Hartigh, A. B., Loomis, W. P., Cookson, B. T. Coordinated host responses during pyroptosis: caspase-1-dependent lysosome exocytosis and inflammatory cytokine maturation. J Immunol. 187 (5), 2748-2754 (2011).
- Shi, J., et al. Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death. Nature. 526 (7575), 660-665 (2015).
- Sutterwala, F. S., Haasken, S., Cassel, S. L. Mechanism of NLRP3 inflammasome activation. Ann N Y Acad Sci. 1319, 82-95 (2014).
- Juliana, C., et al. Non-transcriptional priming and deubiquitination regulate NLRP3 inflammasome activation. J Biol Chem. 287 (43), 36617-36622 (2012).
- Py, B. F., Kim, M. S., Vakifahmetoglu-Norberg, H., Yuan, J. Deubiquitination of NLRP3 by BRCC3 critically regulates inflammasome activity. Mol Cell. 49 (2), 331-338 (2013).
- Song, N., et al. NLRP3 Phosphorylation Is an Essential Priming Event for Inflammasome Activation. Mol Cell. 68 (1), 185-197 (2017).
- Stutz, A., et al. NLRP3 inflammasome assembly is regulated by phosphorylation of the pyrin domain. J Exp Med. 214 (6), 1725-1736 (2017).
- Broz, P., Dixit, V. M. Inflammasomes: mechanism of assembly, regulation and signalling. Nat Rev Immunol. 16 (7), 407-420 (2016).
- Masumoto, J., et al. ASC, a novel 22-kDa protein, aggregates during apoptosis of human promyelocytic leukemia HL-60 cells. J Biol Chem. 274 (48), 33835-33838 (1999).
- Yamamoto, M., et al. ASC is essential for LPS-induced activation of procaspase-1 independently of TLR-associated signal adaptor molecules. Genes Cells. 9 (11), 1055-1067 (2004).
- Miao, E. A., Rajan, J. V., Aderem, A. Caspase-1-induced pyroptotic cell death. Immunol Rev. 243 (1), 206-214 (2011).
- LaRock, C. N., Cookson, B. T. The Yersinia virulence effector YopM binds caspase-1 to arrest inflammasome assembly and processing. Cell Host Microbe. 12 (6), 799-805 (2012).
- Swanson, M. S., Isberg, R. R. Association of Legionella pneumophila with the macrophage endoplasmic reticulum. Infect Immun. 63 (9), 3609-3620 (1995).
- Miller, S. I., Ernst, R. K., Bader, M. W. LPS, TLR4 and infectious disease diversity. Nat Rev Microbiol. 3 (1), 36-46 (2005).
- Sester, D. P., et al. A novel flow cytometric method to assess inflammasome formation. J Immunol. 194 (1), 455-462 (2015).
- Sester, D. P., et al. Assessment of Inflammasome Formation by Flow Cytometry. Curr Protoc Immunol. , (2016).
- DiPeso, L., Ji, D. X., Vance, R. E., Price, J. V. Cell death and cell lysis are separable events during pyroptosis. Cell Death Discov. , (2017).
- Russo, H. M., et al. Active Caspase-1 Induces Plasma Membrane Pores That Precede Pyroptotic Lysis and Are Blocked by Lanthanides. J Immunol. 197 (4), 1353-1367 (2016).
- Evavold, C. L., et al. The Pore-Forming Protein Gasdermin D Regulates Interleukin-1 Secretion from Living Macrophages. Immunity. , (2017).
