Summary
Мы описываем обнаружения NLRP3 Инфламмасома активации на основе сотовой с помощью флуоресцентной микроскопии и пятнать для активно caspase-1 и адаптер, ASC. Лактатдегидрогеназа выпуска пробирного представлен для обнаружения pyroptotic лизиса на основе населения. Эти методы могут быть адаптированы для изучения многих аспектов биологии Инфламмасома.
Abstract
Inflammasomes являются врожденные иммунные сигнализации платформ, которые необходимы для успешного управления многих патогенных организмов, но и способствуют воспалительных и autoinflammatory заболеваний. Inflammasomes активируются цитозольной шаблон признание рецепторов, включая членов семьи NOD-подобные рецепторы (РНБ). Эти рецепторы oligomerize при обнаружении микробиологических или связанного с ней ущерба раздражителей. Последующего набора адаптер белка ASC образует микроскопически видимой Инфламмасома комплекс, который активирует caspase-1 через близость индуцированной auto активации. После активации caspase-1 расщепляет pro-IL-1β и про Ил-18, приводит к активации и секреции этих провоспалительных цитокинов. Caspase-1 также является посредником при воспалительных форма смерти клетки, называют pyroptosis, который включает потери целостности и клеток лизис мембраны. Caspase-1 расщепляет gasdermin D, выпустив N-концевого фрагмента, который формирует поры мембраны плазмы, ведущих к осмотической лизис.
В пробирке, активацию caspase-1 может определяться путем маркировки костного мозга, полученных макрофагов с активности каспазы-1 зонд FAM-YVAD-финских и маркировки клетки с антитела против белков адаптер ASC. Этот метод позволяет определить Инфламмасома формирования и активацию caspase-1 в отдельных клетках, с помощью микроскопии флуоресцирования. Смерть Pyroptotic клетки могут быть обнаружены путем измерения выпуска цитозольной лактатдегидрогеназа в среду. Эта процедура является простой, экономически эффективным и выполненных в формате 96-луночных пластины, позволяя адаптации для скрининга. В этой рукописи мы показываем, что активация NLRP3 Инфламмасома по nigericin приводит к совместно локализации адаптер белка ASC и активно caspase-1, приводит к pyroptosis.
Introduction
Инфламмасома опосредованной воспаление является важнейшим компонентом обороны против патогенных организмов1, но также лежит в основе этиологию многих заболеваний2. Воспалительной реакции на широкий спектр инфекций вызванных цитозольной обнаружение патоген-связанные молекулярные структуры (PAMPs) или повреждения связанные молекулярные структуры (DAMPs). Шаблон признание рецепторов (ПРР), включая членов семьи NOD-подобные рецепторы (РНБ), oligomerize при обнаружении Эти PAMPs и DAMPs. Это вызывает формирование комплекса различных белков называется Инфламмасома, который содержит ПРР, адаптер белка апоптоз связанные спек как белок, содержащий домен caspase набор C-терминала (карта) (ASC) и про форма ,caspase-134. Этот комплекс позволяет близость индуцированной auto активацию caspase-1. Активно caspase-1 затем приводит к набор событий, которые характерны pyroptosis путь смерти воспалительных клеток. Эти мероприятия включают: расщепление и релиз цитокинов ИЛ 1β и IL-18, лизосома экзоцитоз с высвобождение лизосомальных содержимого в внеклеточного пространства, ядерной конденсации и gasdermin D расщепления. Выпущенные N-концевой домен gasdermin D вставляет в плазматической мембране, образуя поры, которые вызывают разрыв мембраны плазмы и выпуску воспалительных содержимого, в дополнение к унося защитный нишу для патогена репликации5, 6 , 7.
Здесь мы сосредоточены на хорошо изученных Инфламмасома NLRP3. Активация NLRP3 Инфламмасома происходит через двухэтапный процесс8. Первый шаг «грунтовки» происходит через признание Толл подобные рецепторы (TLR) микробной продукта. Это реплицируется в лабораторных условиях с помощью ПЛАСТИНОК для стимулирования TLR4. Эта стимуляция upregulates NLRP3 и про IL-1β через NF-kB сигнализации. Грунтовка дополнительно лицензии NLRP3 через не-транскрипционный анализ механизмов, вызывая его deubiquitination9,10 и фосфорилирование или дефосфорилирование конкретные остатки11,12.
Второй сигнал для активации NLRP3 подумал привлечь митохондриальной факторов, реактивнооксигенных видов, измеряем калия и кальция сигнализации, хотя объединяющей механизм для активации NLRP3 остается недостижимой8. Активированные NLRP3 oligomerizes через взаимодействие между его NACHT доменов и новобранцев ASC через привязку доменов Пырин (PYD)13. В каждой ячейке эти макромолекулярных комплексов образуют единый микроскопически видимые фокус. ASC была первоначально определена как 22 кДа белков, который образуется «пятнышко» во время апоптоз клеток лейкемии человека, так и именованные апоптоз связанные спек как белок, содержащий карты14. Позже было установлено, что ASC новобранцев pro-caspase-1 через взаимодействие карты ASC с картой pro-caspase-1, образуя Инфламмасома15.
Не все NLRs требуют присутствия ASC побудить активацию caspase-1. В отличие от NLRP3 NLRC4 и NLRP1b имеют карты доменов и может непосредственно набирать pro-caspase-1 через карты-карты взаимодействия, чтобы побудить активацию caspase-1. В отсутствие ASC активно caspase-1 остается диффузных в цитозоле и не образуют единый фокус. Этот диффузных активно caspase-1 достаточно вызвать смерть клетки pyroptotic, но не может обработать pro ИЛ 1β13,16.
В этой рукописи мы будем обсуждать два способа оценить Инфламмасома активации. Первый использует действие флуоресцентный зонд, FAM-YVAD-финляндских марок, который связывает caspase-1 семьи протеаз. Это семейство включает caspase-1, но также мыши caspase-11 и человека caspase-4 и caspase-5. Используя все эксперименты макрофагов с несовершенным мыши caspase-1/11, будет рассматриваться специфика этот зонд. Этот метод может сочетаться с антителом маркировки Инфламмасома компонентов, которые мы также будем описывать. Микроскопические визуализации позволяет для идентификации отдельных ячеек, содержащих активные caspase-1 и oligomerized ASC. С помощью этого метода, исследователи смогут определить, где в каскад Инфламмасома формирования их манипуляций клетки-хозяина или патогенного организма изучается эффект. Например можно отличить ли данного вмешательства предотвращает вербовки ASC в сложных NLRP3 или последующего набора и активацию caspase-117. Изучение результатов активацию caspase-1 например, ИЛ 1β секрецию не сможет отличить эти две возможности. Кроме того секрецию ИЛ 1β могут быть изменены без изменения клеток способность активировать caspase-1 и пройти pyroptotic клеток смерть16.
Второй метод измеряет выпуск Лактатдегидрогеназа (LDH) в ячейку супернатанта, которая происходит во время pyroptotic макрофагов лизис после активацию caspase-1, как описано выше. Этот второй метод является подход, основанный на население, как хорошо измеряется выпуска ЛДГ в весь. Этот простой подход для быстрого анализа образцов (30 мин время инкубации) позволяет определить, является ли смерть caspase-1-опосредованной клетки и могут быть выполнены в формате 96-луночных пластины.
Эти методы являются взаимодополняющими, каждый с различными преимуществами и оба легко поддаются модификации. Например макрофагов обработка соединениями целевых небольшой молекулярной массой до стимуляции Инфламмасома может использоваться для расследования роли некоторые белки могут иметь на контроле воспалительных реакций.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Всех животных процедуры были одобрены и проводятся под университет Вашингтон институциональный уход животных и использования Комитетом руководящих принципов.
1. урожай костного мозга
- Асептически удаления бедренной и большеберцовой кости от мыши и очистить костей, с использованием стерильных инструментов. Уборка кости в Дульбекко изменения среднего орла (DMEM) + 5 мм HEPES + 0,2 мг/мл L-глютамина + 0,05 мм 2-меркаптоэтанол + гентамицина сульфат 50 мг/мл + 10 000 ед/мл пенициллина/стрептомицина + 10% плода бычьим сывороточным (ФБС, DMEM-10 полный) и инкубировать труба на льду за 15 мин.
- Удаление проксимальном и дистальном мяч суставов с помощью ножниц. Вставьте иглу 25 G, придает 10 мл шприц, наполненный среднего в дупле кости. Промойте костного мозга с помощью DMEM-10 полный. Ресуспензируйте любой сгустки, закупорить средних вверх и вниз осторожно.
- Центрифуга клетки для 10 мин на 300 x g и подсчитать количество ячеек с помощью Горяева. На данный момент либо заморозить клетки с помощью 90% FBS + 10% диметилсульфоксида (ДМСО) или плиты клетки в 15 см Петри дифференцировать макрофагов с помощью L929 кондиционером среднего (шаг 2.1).
2. дифференциация костного мозга-производные макрофаги
- С помощью подогретым дифференциации среднего (21 DMEM-10 полный до 9 мл L929 клеток кондиционером среды как описано Свонсон et al. 18), положить клетки костного мозга в 15 см не культуры ткани - лечение Петри (1,2-1,5 x 107 клеток). Инкубируйте пластины при 37 ° C и 5% CO2 в течение 7 дней. Добавьте дополнительные 30 мл дифференциации среднего к пластине в день 3 или 4.
Примечание: Важно не использовать тканевой культуры рассматриваются пластины, как макрофаги будет трудно отделить и урожай. - Для сбора макрофагов, мыть тарелку с фосфат амортизированное saline (PBS) и добавить 20 мл холодного PBS + 1 мм Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА). Инкубировать пластину на 4 ° C на 10 мин урожай клетки, закупорить PBS + ЭДТА над клетки и мыть тарелку с 10 мл ФСБ. Объединить оба моет в две пробирки конические 15 мл.
- Центрифуга клетки на 300 g x 10 мин и Ресуспензируйте клетки в 10 мл 5 мм HEPES, 5% + 0,2 мг/мл L-глютамина + 0,05 мм 2-меркаптоэтанол + бесплатно DMEM фенол красный FBS (DMEM-5) и подсчитать количество ячеек с помощью Горяева или Коултер счетчика. Держите клетки на льду во время подсчета голосов.
- Семя макрофаги в культуре ткани с покрытием пластин в 2 x 105 кл/мл. Для микроскопии экспериментов семян 1 мл клеток на coverslips в 24 хорошо пластин. Для выпуска анализов ЛДГ семян 100 мкл клеток в 96 пластины хорошо. Для assay ЛДГ семян 9 скважин (3 скважины не лечить, 3 скважины с 100% лизис управления и 3 скважины для экспериментальной стимул).
- Центрифуга 96 хорошо пластина для 5 мин на 300 x g сделать определенные клетки распределены одинаково хорошо.
- Инкубируйте пластину на ночь при 37 ° C + 5% CO2 перед запуском процесса грунтовки.
3. грунтование
- Замените носитель с свежими средний (DMEM-5), содержащий 100 нг/мл ПЛАСТИНОК (500 мкл для 24 хорошо пластины или 50 мкл для 96 хорошо пластины).
Примечание: Существует целый ряд структурных изменений в ПЛАСТИНОК, которые влияют на способность стимулировать TLR4-опосредованной грунтование19. LPS от сальмонеллы Миннесота R595 (Re) доступен от нескольких поставщиков и рекомендуется. - Инкубируйте пластину для 3 ч при 37 ° C и 5% CO2.
4. Активация NLRP3 Инфламмасома с Nigericin и маркировки с FAM-YVAD-FMK
- Удаление среды и заменить его с 290 мкл DMEM-5, содержащий 5 мкм nigericin и Глицин 5 мм. Глицин добавляется уменьшить количество лизис клеток, которое происходит во время активации caspase-15. Инкубируйте 60 мин при 37 ° C и 5% CO2. Используйте дикого типа и caspase-1 недостаточно макрофаги чтобы убедиться, что наблюдаемые маркировки для caspase-1.
- В течение последних 45 мин, добавить 10 мкл 30 x FAM-YVAD-FMK, подготовленный в соответствии с инструкциями производителя.
- После 60 мин удалите среды и вымыть клетки три раза за 5 мин каждый с 1 мл холодного PBS.
- Добавьте 250 мкл параформальдегида 2% для каждой скважины и инкубировать на льду, покрытые алюминиевой фольги для 30 мин.
- В течение последних 5 минут добавьте 4 мкл пятно far-red флуоресцентные нуклеиновой кислоты 0,2 мм на этикетке ядер. 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) или другие красители могут также использоваться для метки ДНК.
- Вымыть клетки три раза с 1 мл холодного PBS и смонтировать coverslips на скольжениях микроскопа с помощью 7 мкл анти затухания монтажа средних. Пусть монтажа средних ожесточу ночь до герметизации coverslip для микроскопа с помощью ногтей.
- Изображения макрофаги, confocal микроскопии. Ex / Em для FAM-YVAD-FMK-492/520nm и 642/661 для far-red флуоресцентные нуклеиновых кислот пятна. Убедитесь в том настроить Микроскоп, таким образом, что неочищенные клетки не показывать любой фон, пятнать в 488 канале. В противном случае окрашивания фона FAM-YVAD-FMK будет обнаружено и не фактический активных caspase-1.
Примечание: Микроскоп настройки описан в разделе 6.
5. антитело пятная
Примечание: Для пометки ячеек с антителами к обнаружить ASC, семян, премьер и разоблачить клетки nigericin идентичны к предыдущему разделу. Обработка после является следующим:
- Вымойте клетки три раза за 5 мин каждый с 1 мл холодного PBS. Добавьте 250 мкл раствора фиксации и permeabilization. Инкубировать клетки на льду и покрыты в течение 30 мин.
- Вымойте макрофаги три раза за 5 мин с 1 мл буфера мытья.
- Добавить 250 мкл первичного антитела против ASC разводят 1: 500 в буфере мыть и инкубировать 1 час на льду. Включать один coverslip, не получают каких-либо первичных антител, но будет получать только вторичный. Этот coverslip будет использоваться во время установки микроскоп для задания правильного смещения.
- Вымойте клетки три раза за 5 мин с 1 мл мыть буфера.
- Добавьте 250 мкл вторичные антитела (Люминесцентная краска конъюгированных коза анти мышь) разводят 1: 500 в буфере мыть и инкубировать 1 час на льду. Добавьте 4 мкл пятно far-red флуоресцентные нуклеиновой кислоты 0,2 мм за последние 5 минут это инкубации лейбл ядер.
- Вымыть клетки 3 x с 1 мл холодного мыть буфера и горе, coverslips на Микроскоп слайды с использованием 7 мкл анти затухания монтажа средних. Пусть монтажа средних ожесточу ночь до герметизации coverslip для микроскопа, используя четкие ногтей.
- Макрофаги изображения на confocal микроскопии. Ex / Em для вторичного антитела 555/580 Нм и 642/661 для far-red флуоресцентные нуклеиновой кислоты пятно (как описано ниже).
Примечание: Маркировки с FAM-YVAD-финских и маркировки антитела могут быть объединены чтобы показать Сопредседатель локализации активно caspase-1 и ASC. Для этого выполните условия для FAM-YVAD-FMK маркировки и затем переключиться на антитела обозначая протокол для дальнейшей обработки.
6. изображения помечены макрофагов, конфокальная микроскопия
Примечание: Окрашенных клеток можно просмотреть после coverslips было разрешено лечить всю ночь и были опечатаны для микроскопа с ногтей. Здесь описан изображений с помощью конфокального микроскопа. Клетки могут быть осмотрены стандартных флуоресцентной микроскопии.
- Поместите слайд с необработанной управления клеток на микроскопа и сосредоточиться на клетки микроскопа.
- С помощью параметров посмотрите вверх таблицы (LUT) микроскопа, настройте смещение, таким образом, что существует не положительный пятнать FAM-YVAD-FMK в необработанной клетках. Этот процесс может также выполняться с помощью caspase-1 недостаточно макрофагов.
Примечание: Смещение должно корректироваться для каждого канала, используемый в эксперименте, но установка правильного смещение является наиболее важным для FAM-YVAD-FMK канала и флуоресцентные антитела каналов. Смещение для канала ДНК менее важен. После задания смещение не настроить этот параметр для остальной части эксперимента. - Переключитесь слайд образца nigericin лечение. Найдите поле, которое содержит обе клетки, которые являются положительными и отрицательными для окрашивания FAM-YVAD-FMK. Настройка визуализации плоскости FAM-YVAD-FMK канала в плоскости, которая имеет высокие интенсивности положительный пятнать. Как правило, это будет самолет, где в центре внимания Инфламмасома образы.
- Отрегулируйте усиление, что очаги видны в клетках, которые имеют сокращенный ядер. После установки, усиление и смещение, оставьте эти параметры для остальной части изображений сессии.
Примечание: Один простой способ определить, является ли ячейка pyroptotic это, глядя на ядерное словотолкование. Клетки с активно caspase-1 имеют округлые и конденсированных ядра, в то время как ядрышек видны в камерах без активацию caspase-1 и ядерное словотолкование аналогичны необработанных клеток. - Собирайте изображения 5 случайно выбранных полей на 100 X общее увеличение. Как правило, это приведет к около 40 клеток на изображение. Повторите этот процесс для каждого образца.
- Подсчитать количество ячеек в каждом изображении с помощью программного обеспечения для анализа изображений. Затем подсчитать количество ячеек, которые имеют положительный пятнать FAM-YVAD-финских марок. Представляют собой уровень активацию caspase-1 как процент FAM-YVAD-FMK позитивных клеток.
7. ЛДГ релиз Assay
Примечание: Для assay релиз ЛДГ, семян и премьер, что клетки, как описано в предыдущем разделе, за исключением использования 96 хорошо пластины. Не удаляйте средство после грунтования.
- Добавьте 50 мкл DMEM-5, содержащий 10 мкм nigericin экспериментальной скважины и 50 мкл DMEM-5 скважин управления лизис спонтанное и 100%. Не добавляйте Глицин в этом эксперименте, поскольку цель состоит в том, чтобы измерить лизис клеток. Инкубируйте 60 мин при 37 ° C и 5% CO2.
- После 30 мин добавить 10 мкл 10 буфера lysis x 100% лизис контроля скважин и добавьте 10 мкл DMEM-5 других скважин. Во время этой инкубации удалить 1 флакон смеси субстрата (1,5 мл лиофилизированной субстрата) и 1 Алиготе аналитического буфера (~ 12 мл) из морозильника и пусть они оттепель защищенный от света до комнатной температуры.
Примечание: Смеси субстрата содержит tetrazolium соли (iodonitro-tetrazolium фиолетовый), который преобразуется в красной Формазаны продукта. - После инкубации всего 60 мин центрифуга пластину для 5 мин на 500 x g при 10 ° C. Передача 50 мкл супернатант пластины ясно с плоским дном. В это время добавить 12 мл аналитического буфера в флаконе смеси субстрата и инкубации при комнатной температуре в течение 5 минут перед использованием.
- Добавьте 50 мкл субстрата для каждой скважины и Инкубируйте 30 мин в темноте. Включать средний только скважин для пустых значений. Проверьте пластины после 15 минут, чтобы убедиться, что сигнал не будет превышать предел обнаружения пластины читателя.
- После 30 минут добавьте 50 мкл стоп раствора (1 M уксусной кислоты) и измерить ОД490 с помощью пластины читателя.
- Рассчитайте процент лизис клеток, с использованием следующей формулы:
% Cytoxicity = ((Experimental-Spontaneous) / (максимальная-спонтанное)) x 100
Экспериментальная: лечение nigericin клетки; Спонтанное: лечить клетки; максимум: подвергается буфера lysis клетки
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Чтобы обнаружить активацию caspase-1 после воздействия nigericin, клетки были обработаны как описано в разделе протокол. Мы объединили FAM-YVAD-финских и ASC антитела маркировки для того, чтобы показать, что ASC и активно caspase-1 совместно локализации, следуя Инфламмасома, NLRP3-опосредованной активации. Рисунок 1A показывает, что макрофаги дикого типа подвергается 5 мкм nigericin формирование фокус ASC в регионе perinuclear. Эти очаги также содержат активные caspase-1, как сопредседатель локализации ASC с FAM-YVAD-FMK. Клетки, которые являются позитивными для активного caspase-1 имеют ядерные конденсации, показаны, что эти клетки проходят pyroptosis. Рисунок 1B показывает, что хотя макрофаги caspase-1/11 несовершенным мышей имеют формирование фокус ASC, они не имеют каких-либо активных caspase-1, связанные с этой фокус как показано отсутствие FAM-YVAD-FMK пятнать. Ядер этих клеток не конденсируется, показывающее, что существует не pyroptotic клеток происходит смерть. Изображения были взяты с помощью Сканирующий конфокальный микроскоп с 63 X цель погружения нефти. Изображения были сохранены как TIFF-файлы без дальнейшей обработки.
С целью определения уровня гибели клеток, который связан с воздействием nigericin, мы провели assay релиз ЛДГ в культуре супернатант. Рисунок 2 показывает, что макрофаги дикого типа проходят смерти клетки после воздействия на nigericin. В отличие от этого макрофаги, дефицит caspase-1 не освобождают ЛДГ в надосадке клетки, указав, что клетки являются нетронутыми.
Рисунок 1: FAM-YVAD-финских и анти ASC маркировки. (A) дикого типа (WT) и (B) дефицит caspase-1/11 (c1/11- / -) макрофаги были подвержены 5 мкм nigericin за 1 ч и анализируются для активно caspase-1 confocal микроскопии, используя FAM-YVAD-FMK для обнаружения активно caspase-1 и анти ASC первичный и коза анти мышь вторичные антитела для обнаружения ASC фокус формирования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: результаты анализа выпуска ЛДГ. Дикого типа и несовершенным макрофаги caspase-1/11 были подвержены 5 мкм nigericin за 1 час и клеток супернатанта было проанализировано на наличие ЛДГ. Средства ± SD три реплицирует данные. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этой рукописи мы представили два методы для изучения Инфламмасома активации и следствием активацию caspase-1, после NLRP3 стимуляции в мышиных костного мозга-производные макрофагов. Первый метод позволяет исследователю для определения уровня активацию caspase-1 на основе сотовой, с использованием флуоресцентных репортер FAM-YVAD-FMK. Этот репортер весьма специфичен для привязки caspase-1 семейство ферментов, как отсутствие пятная недостатками макрофаги caspase-1/11. Специфика было также продемонстрировано Ларок и др. в своей рукописи, описывая роль белка Yersinia YopM на активацию caspase-1. В своей рукописи они показывают, что очаги FAM-YVAD-FMK перекрывается с медальоном, которые были помечены с антитела, направленные против caspase-117.
Как и в случае с любой эксперимент, есть некоторые важные шаги, которые должны быть выполнены для того, чтобы устранить ложные положительные результаты. Во-первых крайне важно использовать дикого типа и caspase-1/11 несовершенным макрофагов. С помощью этих типов двух ячеек, условия, которые приводят к неспецифичный пятнать могут быть исключены из дальнейшего анализа. Во-вторых как с любой антитела или деятельности зонд, маркировка пробы, важно тщательно вымыть клетки после окрашивания с FAM-YVAD-финских марок. С помощью трех моет 5 мин, значительно снижается уровень фонового сигнала. Третьим важнейшим шагом происходит во время установки конфокального микроскопа. Здесь важно, что неочищенные клетки, помечены FAM-YVAD-FMK используются для задания смещение конфокального микроскопа таким образом, что без положительных цитоплазматических пятнать наблюдается в необработанной клетках. Когда эти шаги будут, этот метод является полезным инструментом для оценки активацию caspase-1 на основе сотовой.
Этот протокол может быть изменен с учетом потребностей исследователей. Например клетки можно лечить с помощью небольших низкомолекулярных соединений на несколько шагов в ходе всего процесса. Это позволило бы для выявления путей, которые модулируют олигомеризации РНБ, найма ASC или про caspase-1, или активацию caspase-1 сам. Изменения к настоящему Протоколу должны быть такими, чтобы они не активировать caspase-1 сама по себе. Если это происходит, кривой отклика дозы препарата в вопросе не требуется. Даже несмотря на то, что мы сосредоточены на активации NLRP3 Инфламмасома, этот протокол может также использоваться для изучения inflammasomes, вызванных другими РРСС. Еще одно изменение, которое мы включили в этой рукописи является сочетание FAM-YVAD-FMK окрашивание с антителом маркировки компонентов Инфламмасома. Мы покажем, что есть совместно локализации Инфламмасома адаптер ASC с активно caspase-1. Ограничение этого метода как описано, является, что она требует доступа к конфокального микроскопа. Однако соответствующей стратегии для обнаружения ASC фокус формирования подачей cytometry был сообщил20,21.
Второй метод, который мы обсуждали позволяет для быстрого обнаружения лизис клеток, используя assay ЛДГ выпуска. Важно отметить, что релиз ЛДГ указывает на потерю целостности и клеток лизис плазматической мембраны, которая также происходит во многих других форм клеточной смерти и не является специфичным для pyroptosis. Однако использование caspase-1 недостаточно клеток можно определить caspase-1-зависимой ячейки лизиса, определяющей чертой pyroptosis.
Важным шагом в этом протоколе (особенно при использовании инфекционного агента) является центрифуга пластины после заполнения ячеек в 96 пластины хорошо. Центрифугирование плиты позволяет для равного распределения макрофагов по всей поверхности колодца. С равное распределение каждый Макрофаг будет подвергаться одинаковое количество бактерий. Без центрифугирования эффект мениска жидкости в скважине приведет к более макрофагов, накапливается на краю колодца. Это приведет к снижению чем предполагаемых многочисленных инфекции MOI (МВД) близко к стенке хорошо и выше, чем предполагалось в центре скважины.
Потенциальным недостатком пробирного релиз ЛДГ является, что он измеряет лизиса на уровне общей популяции и в один момент в assay. Альтернативный подход заключается в количественном определении поглощения клеток impermeant красителей, микроскопия, который идентифицирует потеря целостности мембраны на основе одной ячейки. В сочетании с живой клетки изображений платформы, этот подход может также обеспечить временной оценки pyroptosis22. Небольшие ДНК связывающих флуоресцентных красителей например пропидий йодидом или бромид ethidium может пройти через поры gasdermin D, привязать сотовой нуклеиновые кислоты и флуоресцировать5,,22-23. Поры формирования и усвоение этих небольших красители височно предшествует лизис терминала клеток. Лизис позволяет поглощения больших красителей и потеря большого клеточных белков, таких как ЛДГ. Использование глицин может экспериментально расцепить порообразования от lysis, как глицин не блокирует gasdermin D-опосредованной порообразования, поглощение малых красителя или секрецию ИЛ 1β, но глицин предотвратить быстрый лизис и ЛДГ выпуска5,22 , 23 , 24. Мы предлагаем, включая глицин FAM-YAVD-FMK окрашивание эксперименты для предотвращения полной потери целостности мембраны, но глицин должны быть опущены при измерении выпуска ЛДГ pyroptotic.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют никаких конфликтов интересов раскрывать
Acknowledgments
Все микроскопии было сделано на W. м. кека микроскопии центр при поддержке Натаниэль Питерс и при поддержке NIH премии S10OD016240. S.L.F. поддерживается низ K08AI119142 и R21AI130281. Мы благодарим д-р Ричард Флавелл и д-р Брэд Куксон для несовершенным мыши caspase-1/11 и д-р Брэд Куксон для совместного использования лабораторных помещений и оборудования.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| E-MEM | ATCC | 30-2003 | For growing L929 cells |
| NCRC clone 929 (L929) | ATCC | CCL-1 | |
| Fixation/Permeabilization Kit | BD Biosciences | 554714 | Includes fixation and permeabilization solution, and wash buffer. Proprietary formulations. Contains 4.2% formaldehyde |
| Glycine | Biorad | 161-0718 | |
| Cytotox96 Nonradioactive cytotoxicity assay | Fisher Scientific | PR-G1780 | Includes Substrate Mix and Assay Buffer; Proprietary formulations. Stop solution is 1 M Acetic acid |
| FAM-YVAD-FMK | Immunocytochemistry Technologies | 98 | |
| DMEM, high glucose, no glutamine | Invitrogen | 11960044 | |
| DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red | Invitrogen | 31053028 | |
| Dulbecco's PBS, no calcium, no magnesium | Invitrogen | 14190144 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, US origin | Invitrogen | 26140079 | Heat inactivated at 55°C for 50 min |
| Gentamicin | Invitrogen | 15750060 | |
| ProLong Gold Mounting Medium | Invitrogen | p36934 | Proprietary formulation. Curing mounting medium. Hardens to refractory index of 1.46 |
| goat anti-mouse ALEXA555 | Invitrogen | A-21422 | |
| HEPES (Ultra Pure) | Invitrogen | 11344041 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 21051024 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| TO-PRO-3 Iodide | Invitrogen | T3605 | far-red fluorescent nucleic acid stain |
| C57BL/6J mouse | Jackson Laboratoy | 000664 | |
| caspase-1/11-/- mouse | Jackson Laboratory | 016621 | |
| Leica SP8X Confocal Microscope | Leica | ||
| Ultrapure LPS from Salmonella minnesota R595 (Re) | List Biologicals | 434 | |
| anti-ASC clone 2EI-7 | Millipore-Sigma | 04-417 | |
| beta-mercapto-ethanol | Millipore-Sigma | M6250-10ML | |
| DMSO | Millipore-Sigma | D2650-5X10ML | |
| EDTA | Millipore-Sigma | E5391 | |
| Spectramax M3 plate reader | Molecular Devices | 5000414 |
References
- Jorgensen, I., Miao, E. A. Pyroptotic cell death defends against intracellular pathogens. Immunol Rev. 265 (1), 130-142 (2015).
- Guo, H., Callaway, J. B., Ting, J. P. Inflammasomes: mechanism of action, role in disease, and therapeutics. Nat Med. 21 (7), 677-687 (2015).
- Bergsbaken, T., Fink, S. L., Cookson, B. T. Pyroptosis: host cell death and inflammation. Nat Rev Microbiol. 7 (2), 99-109 (2009).
- Martinon, F., Burns, K., Tschopp, J. The inflammasome: a molecular platform triggering activation of inflammatory caspases and processing of proIL-beta. Mol Cell. 10 (2), 417-426 (2002).
- Fink, S. L., Cookson, B. T. Caspase-1-dependent pore formation during pyroptosis leads to osmotic lysis of infected host macrophages. Cell Microbiol. 8 (11), 1812-1825 (2006).
- Bergsbaken, T., Fink, S. L., den Hartigh, A. B., Loomis, W. P., Cookson, B. T. Coordinated host responses during pyroptosis: caspase-1-dependent lysosome exocytosis and inflammatory cytokine maturation. J Immunol. 187 (5), 2748-2754 (2011).
- Shi, J., et al. Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death. Nature. 526 (7575), 660-665 (2015).
- Sutterwala, F. S., Haasken, S., Cassel, S. L. Mechanism of NLRP3 inflammasome activation. Ann N Y Acad Sci. 1319, 82-95 (2014).
- Juliana, C., et al. Non-transcriptional priming and deubiquitination regulate NLRP3 inflammasome activation. J Biol Chem. 287 (43), 36617-36622 (2012).
- Py, B. F., Kim, M. S., Vakifahmetoglu-Norberg, H., Yuan, J. Deubiquitination of NLRP3 by BRCC3 critically regulates inflammasome activity. Mol Cell. 49 (2), 331-338 (2013).
- Song, N., et al. NLRP3 Phosphorylation Is an Essential Priming Event for Inflammasome Activation. Mol Cell. 68 (1), 185-197 (2017).
- Stutz, A., et al. NLRP3 inflammasome assembly is regulated by phosphorylation of the pyrin domain. J Exp Med. 214 (6), 1725-1736 (2017).
- Broz, P., Dixit, V. M. Inflammasomes: mechanism of assembly, regulation and signalling. Nat Rev Immunol. 16 (7), 407-420 (2016).
- Masumoto, J., et al. ASC, a novel 22-kDa protein, aggregates during apoptosis of human promyelocytic leukemia HL-60 cells. J Biol Chem. 274 (48), 33835-33838 (1999).
- Yamamoto, M., et al. ASC is essential for LPS-induced activation of procaspase-1 independently of TLR-associated signal adaptor molecules. Genes Cells. 9 (11), 1055-1067 (2004).
- Miao, E. A., Rajan, J. V., Aderem, A. Caspase-1-induced pyroptotic cell death. Immunol Rev. 243 (1), 206-214 (2011).
- LaRock, C. N., Cookson, B. T. The Yersinia virulence effector YopM binds caspase-1 to arrest inflammasome assembly and processing. Cell Host Microbe. 12 (6), 799-805 (2012).
- Swanson, M. S., Isberg, R. R. Association of Legionella pneumophila with the macrophage endoplasmic reticulum. Infect Immun. 63 (9), 3609-3620 (1995).
- Miller, S. I., Ernst, R. K., Bader, M. W. LPS, TLR4 and infectious disease diversity. Nat Rev Microbiol. 3 (1), 36-46 (2005).
- Sester, D. P., et al. A novel flow cytometric method to assess inflammasome formation. J Immunol. 194 (1), 455-462 (2015).
- Sester, D. P., et al. Assessment of Inflammasome Formation by Flow Cytometry. Curr Protoc Immunol. , (2016).
- DiPeso, L., Ji, D. X., Vance, R. E., Price, J. V. Cell death and cell lysis are separable events during pyroptosis. Cell Death Discov. , (2017).
- Russo, H. M., et al. Active Caspase-1 Induces Plasma Membrane Pores That Precede Pyroptotic Lysis and Are Blocked by Lanthanides. J Immunol. 197 (4), 1353-1367 (2016).
- Evavold, C. L., et al. The Pore-Forming Protein Gasdermin D Regulates Interleukin-1 Secretion from Living Macrophages. Immunity. , (2017).
