Summary
En este artículo discutimos tres preparaciones de cerebro utilizadas para la grabación de abrazadera de parche de células enteras a estudiar el circuito retinotectal de los renacuajos de Xenopus laevis . Cada preparación, con sus propias ventajas específicas, contribuye a la maleabilidad experimental de los renacuajos de Xenopus como modelo para el estudio de la función neuronal del circuito.
Abstract
El circuito de retinotectal renacuajo Xenopus , compuesto de las células ganglionares de la retina (RGCs) en el ojo que forman sinapsis directamente sobre las neuronas en El tectum óptico, es un modelo popular para estudiar circuitos neuronales cómo uno mismo-montar. La capacidad para llevar a cabo toda célula grabaciones de abrazadera de parche de neuronas tectal y al registro grave-evocado las respuestas, ya sea en vivo o mediante una preparación de todo el cerebro, ha generado un gran cuerpo de datos de alta resolución sobre los mecanismos subyacentes normales y anormal, circuito de formación y función. Aquí describimos cómo realizar la preparación en vivo , la preparación original de todo el cerebro, y más recientemente desarrollaron preparación de corte horizontal del cerebro para obtener grabaciones de abrazadera de parche de células enteras de neuronas tectal. Cada preparación tiene ventajas experimentales únicas. La preparación en vivo permite la grabación de la respuesta directa de neuronas tectal de aumento a los estímulos visuales que se proyectan en el ojo. La preparación de todo el cerebro permite que los axones RGC a activarse de forma muy controlada, y la preparación de corte horizontal del cerebro permite la grabación de a través de todas las capas del tectum.
Introduction
El circuito retinotectal es el componente principal del sistema visual de anfibios. Se compone de las RGCs en el ojo, que proyectan sus axones al tectum óptico donde forman conexiones sinápticas con las neuronas postsinápticas de tectal. El circuito de retinotectal renacuajo Xenopus es un popular modelo de desarrollo para el estudio de la función y formación de circuitos neuronales. Hay muchos atributos de circuito de retinotectal de este renacuajo que potente modelo experimental1,2,3. Un atributo importante y el foco de este artículo, es la capacidad para llevar a cabo grabaciones de abrazadera parche de células enteras de neuronas tectal, en vivo o utilizando una preparación de todo el cerebro. Con un aparejo de electrofisiología equipado con un amplificador que soporte el voltaje y corriente abrazadera modos de grabación, grabaciones de células enteras patch clamp permiten electrofisiología de la neurona que se caracterizará en alta resolución. Como resultado, toda célula parche abrazadera las grabaciones de las neuronas tectal en las distintas etapas claves de la formación de circuito retinotectal han proporcionado una comprensión detallada y completa del desarrollo y plasticidad intrínseca4,5 , 6 , 7 y sináptica8,9,10,11 propiedades. Combinación de grabaciones de celulares todo parche abrazadera neurona tectal, la habilidad de expresar genes o morfolinos de interés en estas neuronas12y un método para evaluar comportamiento guiado visual a través de un test de evitación visual establecido13 promueve el identificación de enlaces entre moléculas, la función del circuito y el comportamiento.
Es importante tener en cuenta que el tipo de alta resolución, datos obtenidos de las grabaciones de celular todo parche abrazadera no están posibles utilizar nuevos enfoques proyección de imagen tales como el indicador de calcio genética GCaMP6, porque aunque utilizando indicadores de calcio permite la proyección de imagen de calcio dinámica a través de grandes poblaciones de neuronas simultáneamente, no directa o de manera obvia de que los parámetros eléctricos específicos pueden obtenerse midiendo la fluorescencia del delta en la somata y no hay forma de tensión de la abrazadera la neurona para medir relaciones de corriente-tensión. Claramente estos dos enfoques distintos, las grabaciones electrofisiológicas y proyección de imagen del calcio, poseen fortalezas sin traslapo y generar diferentes tipos de datos. Así, el mejor método depende de la pregunta experimental concreta que se aborda.
Aquí, describimos nuestro método para adquirir células enteras patch clamp las grabaciones de las neuronas del tectum óptico renacuajo con una preparación en vivo , preparación de todo el cerebro, y un más nuevo modificado preparación de todo el cerebro que se desarrolló en nuestro laboratorio de14 . En la sección de resultados de representante, nos demuestran las ventajas experimentales de cada preparación y los diferentes tipos de datos que pueden obtenerse. Los límites y fortalezas de las diferentes preparaciones, así como consejos para la solución de problemas, se incluyen en la sección de discusión.
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Protocol
Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el cuidado institucional del Animal y el Comité uso (IACUC) de la Universidad de Wyoming. Todos los procedimientos, incluyendo las grabaciones electrofisiológicas, se llevan a cabo a temperatura ambiente, aproximadamente de 23 ° C. Todos los métodos aquí descritos están optimizados para la grabación de neuronas tectal de renacuajos entre la etapa de desarrollo 42 y 49 (puesta en escena según Neiuwkoop y Faber15).
1. preparación en Vivo
- Anestesiar el renacuajo.
- Coloque los renacuajos en un pequeño plato de Petri que contenga solución de Steinberg con 0.01% MS-222 durante aproximadamente 5 minutos.
Nota: MS-222 aka "Tricaine" es un común pescados y anfibios anestésico. Los renacuajos son criados en la solución de Steinberg en mM: 0.067 KCl, 0.034 Ca (NO3)2•4H2O, 0.083 MgSO4•7H2O, NaCl 5.8, 4,9 HEPES. - Asegúrese de que el renacuajo es profundamente anestesiado (no responden y no natación) antes de proceder al paso 2.
- Coloque los renacuajos en un pequeño plato de Petri que contenga solución de Steinberg con 0.01% MS-222 durante aproximadamente 5 minutos.
- Asegure el renacuajo anestesiado a un bloque de silicona sumergida en el suelo del plato de grabación de disección.
- Utilice una pipeta de transferencia desechable para mover el renacuajo anestesiado a un plato de disección y grabación que contiene solución de grabación externo (115 mM de NaCl, KCl, 2 mM 3 mM de CaCl2, 3 mM de MgCl2, 5 mM de HEPES, 1 mM de glucosa; ajustar el pH 7.25 uso 10 N de NaOH, osmolaridad 255 mOsm).
- Para minimizar la espontánea del músculo espasmos, añadir el bloqueador de los receptores de la acetilcolina, tubocurarina (100 μm) a la solución externa. (Por lo general, esto se hace mediante el uso de pipeta 200 μL para añadir 100 μl de un caldo de tubocurarina 10 mM a 10 mL de la solución externa).
- Con pernos de insectos, fije el renacuajo, el lado dorsal, a un bloque sumergido de elastómero de silicona (como Sylgard 184, véase Tabla de materiales para más detalles), que ha sido pegado a la disección baja de plato.
Nota: La colocación de los pasadores es crítica: colocarlos a ambos lados del cerebro, suficiente caudal para evitar empalar a los axones aferentes de grave ese proyecto del ojo y entrar en el cerebro justo anterior al tectum óptico (figura 1A).
- Utilice una pipeta de transferencia desechable para mover el renacuajo anestesiado a un plato de disección y grabación que contiene solución de grabación externo (115 mM de NaCl, KCl, 2 mM 3 mM de CaCl2, 3 mM de MgCl2, 5 mM de HEPES, 1 mM de glucosa; ajustar el pH 7.25 uso 10 N de NaOH, osmolaridad 255 mOsm).
- Filete el cerebro a lo largo de la línea media.
- Para una visión clara del cerebro, retire la piel que cubre el cerebro haciendo una incisión superficial a lo largo de la línea media usando una aguja estéril de 25 G.
- Filete el cerebro a lo largo del mismo eje de la línea media por la inserción de la aguja en el tubo neural y tirando suavemente hacia arriba (dorsal) tal que la porción dorsal del tubo se corta limpiamente (cortada) dejando la placa intacta (figura 1B).
Nota: Es importante que la placa del piso del tubo neural se deje intacto porque las entradas sensoriales aferentes entran El tectum a través de la placa.
- Quitar la membrana ventricular transparente que cubre las neuronas tectal.
- Mover el plato de grabación para la plataforma de electrofisiología y use una pipeta de vidrio roto para quitar la membrana ventricular que cubrían los cuerpos celulares de neuronas tectal. Romper la punta arrastrando ligeramente a través de un limpiador de tarea delicada.
- Tornillo de la pipeta en el soporte de pipeta y baje hasta El tectum óptico a través de las amalgamas dentales.
- Utilizar la pipeta rota para pelar la membrana ventricular lejos El tectum.
Nota: No es necesario sacar la membrana entero tectum; una pequeña ventana será suficiente y proporcionar acceso a un montón de neuronas.
- Obtener la célula todo grabaciones de patch clamp.
Nota: El enfoque de este punto hacia adelante es similar a la realización de grabaciones de abrazadera de parche de células enteras de rodajas de cerebro de ratón como se describe en Segev, et al. 16 (Figura 1C). - Registro de las respuestas de la neurona tectal de aumento a un campo todo destello de luz se proyecta sobre la retina.
- Para proyectar un flash de todo campo de la luz sobre la retina, colocar una fibra óptica adyacentes al ojo de renacuajo. En el otro extremo de la fibra óptica es un LED con una resistencia variable que permite la luz luminancia a controlarse. Gatillo el LED por la salida digital del amplificador. De esta manera, todo campo destellos de diferentes intensidades de luz pueden ser registrado (figura 4A).
2. todo el cerebro preparación
- Realice los pasos 1.1 a 1.3.
Nota: No hay ninguna necesidad de tubocurarina en la solución externa para esta preparación. - Aislar el cerebro.
- Utilice una aguja de 25 G para separar el cerebelo (figura 2A).
- Para aislar todo el cerebro de los renacuajos, correr suavemente la aguja por debajo del cerebro, en una dirección caudal a rostral a cortar todos los lateral y ventral del tejido conectivo y fibras nerviosas.
- Asegure el cerebro a un bloque de elastómero de silicón.
- Una vez liberado totalmente, asegure el cerebro a un bloque de elastómero de silicona colocando un perno a través de uno de los bulbos olfativos y otro pasador por el cerebelo (figura 2B). Esta es la configuración óptima para la grabación de las neuronas tectal.
- Mover el plato que contiene la preparación anclados todo el cerebro de la disección alcance a la plataforma de electrofisiología. Quitar la membrana ventricular con una pipeta de vidrio roto como se describe en el paso 1.4.
- Coloque un electrodo de estimulación bipolar sobre el quiasma óptico (donde se cruzan los tractos axón de cada ojo en el cerebro medio) para activar directamente los axones RGC.
- Coloque el electrodo de estimulación bipolar rostral y casi junto al gran ventrículo medio. El quiasma óptico está situado inmediatamente rostral al ventrículo medio grande (figura 2B).
- Suavemente baje el electrodo estimulante en el quiasma óptico que está formado un pequeño hueco en el tejido. El electrodo bipolar es conducido por un estimulador de pulso que permite la fuerza del estímulo ser precisamente controlados.
- Coloque el electrodo de estimulación bipolar rostral y casi junto al gran ventrículo medio. El quiasma óptico está situado inmediatamente rostral al ventrículo medio grande (figura 2B).
- Realizar la grabación de abrazadera de parche de células enteras (figura 2C) según lo descrito por Segev, et al. 16
3. horizontal cerebro sector preparación
- Realice los pasos 2.1 a 2.3.
- Utilice una cuchilla para suprimir el cuarto más lateral (que en vivo corresponde a la cuarta más dorsal) de un lado de un tectum óptico. Este corte se hace paralelo al plano rostral caudal como se muestra en la figura 3A.
- Volver a prender el cerebro al lado del elastómero de silicona con las rebanadas del lado hacia arriba (para que la somata y neuropilo pueden accederse directamente para la grabación) y la superficie ventricular del cerebro hacia el bloque de elastómero de silicona (figura 3 B) (de modo que puede colocarse un electrodo bipolar en el quiasma óptico).
- Realizar la abrazadera del remiendo de células enteras o grabación potencial archivado local (figura 3C) según lo descrito por Segev, et al. 16
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Representative Results
Para registrar las respuestas evocadas de la luz un destello de todo campo de luz se proyecta sobre la retina mientras que la respuesta resultante se registra de neuronas individuales tectal (figura 4A). Este protocolo especial está diseñado para medir tanto la respuesta de la neurona a la luz de encendido ("On" respuesta) y luego apagar 15 s después para medir la "respuesta Off". Las neuronas tectal típicamente exhiben robusta y desactivar las respuestas (modalidad de pinza de voltaje registrados en aquí se muestra, con la neurona fijada a - 60mV para medir la corriente sináptica (figura 4B)). La cantidad de unidad sináptica recibida por cualquier una neurona puede cuantificarse mediante el registro de eventos sinápticas espontáneas (figura 4C). Relaciones voltaje corriente (curvas i-v) pueden ser generadas por la misma neurona por medio de las neuronas potenciales cada vez más despolarizado y grabación la resultante activa tensión Na+ y K+ corrientes, denominadas "mixto actual grabaciones"(figura 4D, E). Ha establecido que para estas neuronas anfibios, pico Na+ y K+ corrientes pueden cuantificarse mediante mezcladas grabaciones actuales porque los picos no temporal se solapen uno con el otro de4,7.
Directa activación de axones RGC en quiasma óptico puentea todos cómputo aguas arriba y el procesamiento de estímulos visuales que tienen lugar en el ojo y permite para el estudio de la transmisión sináptica entre axones RGC presinápticos y postsinápticas neuronas tectal de aumento en su forma más pura y reducido. Respuestas neurona tectal activación leve son generadas por RGCs estimulados por luz o directamente a través de un electrodo bipolar estimulante que consta de dos componentes: un componente monosynaptic (la entrada sináptica directa de RGCs activados) y un polysynaptic componente (la red local recurrente actividad alimentación nuevamente en la neurona que está grabando). En el caso de las respuestas evocadas luz, los componentes monosynaptic y polysynaptic superponen uno con el otro por cierta cantidad undeterminable. Esta superposición temporal límites qué puede concluirse acerca de la transmisión sináptica entre la retina y El tectum óptico. Utilizar una preparación de todo el cerebro y activar las vías de axones RGC directamente a través de un electrodo colocado en el quiasma óptico (figura 5A), sin embargo, producen un mono polysynaptic componente y que son esencialmente no solapados en el tiempo. Se puede ajustar la fuerza estimulante del electrodo bipolar. Medida que se aumenta la fuerza estimulante, existe un mayor número de axones RGC activados (figura 5B). Un protocolo de estimulación mínima determina la fuerza sináptica de un axón grave individual sobre una neurona tectal de aumento individual; un protocolo de estimulación máxima refleja el total o máxima entrada sináptica de todos el RGC axones combinado (figura 5C). La proporción adecuada de la entrada sináptica excitatoria a inhibitorio (E: I relación) recibida por un individuo neurona tectal es crítica para la función visual normal18. Figura 5 D muestra un ejemplo de los RGC-evocado inhibitorios y excitatorios actuales rastros registrados de una neurona individual tectal. La probabilidad de que la liberación del transmisor desde terminales del axón presináptico grave se mide por las grabaciones de pulso sincronizado. Para esto, la neurona postsináptica tectal de aumento se registra en el modo de pinza de voltaje para medir las corrientes sinápticas, mientras que los axones RGC se activan sucesivamente, separadas por un intervalo de tiempo de 50 ms (figura 5E).
Pueden realizarse grabaciones de abrazadera de parche de células enteras de neuronas tectal en cualquier capa somática. Similar a la preparación de todo el cerebro, axones RGC se pueden activar mediante la colocación de un electrodo bipolar de la grabación en el quiasma óptico (figura 6A). Todas las grabaciones realizadas en la preparación de todo el cerebro también se pueden realizar utilizando esta preparación de corte horizontal del cerebro. Figura 6 B muestra una traza de ejemplo de una respuesta evocada grave registrada de una neurona en la capa superficial. Esta preparación también permite el patrón espacial de entrada sináptica grave sobre las dendritas tectal para medirse. Para esto, se registran los potenciales evocados por el leve campo cada 10 μm a lo largo del eje medial-lateral (es decir, el eje distal proximal) del neuropilo (figura 6C). Esto genera un perfil de alta resolución del patrón de entrada grave funcional. Los potenciales de campo pueden transformarse luego en densidades de fuente actual calculando la segunda derivada espacial14 y las densidades actuales de la fuente a su vez pueden transformarse en una trama de la imagen. La trama de la imagen en la figura 6C muestra que la entrada más fuerte de Luis apunta a la zona más distal de la neuropilo.
Figura 1. En vivo procedimientos de preparación. (A) renacuajo inmovilizado en un pedazo de elastómero de silicón. Pernos están indicados por las flechas blancas. Tenga en cuenta la colocación de perno más caudal para evitar empalar a los tractos ópticos. La línea blanca discontinua indica la línea media. (B) Zoomed-en vista de todo el cerebro después de cortar a lo largo de la línea media dorsal y eliminar la piel de sobreposición. (C) grabación de patch-clamp de célula entera en vivo. (L: Lateral. M: medial. R: Rostral. C: Caudal. D: Dorsal. V: ventral. OB: bulbo olfatorio. OT: Tectum óptico. HB: Cerebelo). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 . Procedimientos de preparación del cerebro entero. (A) después de que el cerebro es fileteado a lo largo de la línea media, el cerebelo está roto. (B) todo el cerebro se diseca e inmovilizado para el elastómero de silicona. El asterisco blanco indica el pin en el bulbo olfatorio izquierdo. El cuadro rojo indica el tercio medio del tectum, es decir, el área de destino para la grabación. (C) células enteras patch clamp grabación con preparación de todo el cerebro. El asterisco negro indica la zona de membrana ventricular sin raspado donde las células no se puede acceder para la grabación. Cuando la membrana se ha eliminado con éxito, la somata aparece más diferenciados y definidos. La flecha indica una neurona insalubre. (PZ: zona proliferativa. LMV: Gran ventrículo Medial. OB: bulbo olfatorio. OT: Tectum óptico. HB: cerebelo. L: lateral. M: medial. R: Rostral. C: Caudal. D: Dorsal. V: Ventral). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 . Procedimientos de preparación de rebanada horizontal cerebro. (A) la porción más lateral de un lado del tectum óptico será cortado (indicado por la línea discontinua) después de la preparación de todo el cerebro. (B) preparación de corte Horizontal del cerebro después de ser inmovilizados al lado del elastómero de silicona. Líneas blancas dobles representan un estimulante electrodo colocado en el quiasma óptico. (C) vista de Zoomed de las capas de soma y el neuropil utilizando una preparación de corte horizontal del cerebro. La curva punteada indica el límite entre capas de soma y neuropilo. Esta figura ha sido modificada desde Hamodi, et al. 14 (L: Lateral. M: medial. R: Rostral. C: Caudal. D: Dorsal. V: ventral. OB: bulbo olfatorio. OC: quiasma óptico. OT: Tectum óptico. HB: Cerebelo). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 . Grabaciones de una preparación en vivo . (A) esquema que muestra la configuración típica de una grabación en vivo . (B) luz evoca respuestas incluyendo la luz y la luz de las respuestas. Rastros de inserción son zoom en vista de en - y respuesta, respectivamente. (C) espontánea excitatorios postsinápticas corrientes registradas. (D) Na+ y K+ corrientes en respuesta a la tensión de la abrazadera pasos de -60 mV a 30 mV de una sola neurona. (E) IV diagramas generados a partir de rastros en (D). Todas las grabaciones se realizaron con la neurona en -60 mV excepto en (D) generar IV-parcelas; las neuronas son pisadas cada vez más más despolarizado potenciales en incrementos de 10 mV, para activar las corrientes dependientes del voltaje. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 . Grabaciones de una preparación de todo el cerebro. (A) esquema que muestra la típica configuración de grabación de todo el cerebro, incluyendo un electrodo de estimulación se coloca en el quiasma óptico (líneas verdes y roja representan axones RGC). (B) superposición las huellas de las respuestas de Javier a los cambios de la fuerza de estimulación leve. (C) máximo estímulo respuesta (izquierda) y respuesta de estimulación mínima (derecha). (D) evocado por una leve respuesta inhibitoria y excitatoria en una sola neurona. Pareadas (E) pulso de facilitación de la respuesta evocada por el grave de una neurona individual. (OB: bulbo olfatorio. OC: quiasma óptico. OT: Tectum óptico). Todas las grabaciones se realizaron con la neurona en -60 mV excepto en (D) para medir las entradas excitatorias y el inhibitorias: se registra la entrada excitadora mediante la celebración de la neurona en el potencial de reversión de ácido γ-aminobutírico (GABA)-mediada por cloruro de corrientes (-45 mv); la entrada inhibidora mediante la celebración de la neurona en el potencial de reversión de ácido α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionico (AMPA)-mediada por corrientes (+ 5 mv). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6 . Grabaciones de un cerebro horizontal rebanada preparación. (A) esquema que muestra la configuración de una preparación de corte horizontal del cerebro. Tenga en cuenta que aunque el electrodo de estimulación se mantiene en el quiasma óptico, la pipeta de grabación es colocado ahora para acceso a las células a través de todas las capas tectal expuestas por la preparación de corte horizontal del cerebro. (B) una respuesta leve de una neurona en la capa superficial del tectum. (C) registran potenciales de campo en el neuropil y las densidades actuales convertidos de fuente (CSD) de mapas de calor de imagen parcela. (OC: quiasma óptico. OT: Tectum óptico. HB: Cerebelo). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Todos los métodos descritos en este trabajo están optimizados para la grabación de neuronas tectal de renacuajos entre la etapa de desarrollo 42 y 49 (puesta en escena según Neiuwkoop y Faber15). Por etapa 42, los renacuajos son suficientemente grande y suficientemente desarrollada para que los insectos pasadores pueden colocarse a ambos lados del cerebro para grabaciones en vivo y para llevar a cabo la disección de todo el cerebro. En etapas más tempranas, cuando los renacuajos son esencialmente de dos dimensiones (es decir, plano), los enfoques descritos aquí no son óptimos.
Debido a la facilidad en que neuronas tectal de aumento pueden ser accedidas y grabadas en configuración de célula entera, este circuito de modelo ha sido un semillero de descubrimientos fundamentales sobre la forma de circuitos como nervios y funcionamiento - función mientras se forma el19. Aquí hemos descrito cómo adquirir células enteras patch clamp las grabaciones de las neuronas tectal, incluyendo cómo hacer renacuajo en vivo y preparaciones de todo el cerebro, la grabación de diferentes configuraciones y ejemplos de los diferentes tipos de datos. La siguiente es una discusión de las fortalezas y limitaciones de cada preparación, seguido de consejos para lograr grabaciones de células completas de alta calidad.
Los renacuajos de Xenopus comienzan mostrando comportamientos de evitación visual por etapa 47/48, aproximadamente 7-8 días post fertilización3,13. Esto significa que incluso en estas etapas relativamente tempranas de desarrollo, el circuito retinotectal es funcional y capaz de procesar estímulos visuales. Preguntas fundamentales sobre el desarrollo y plasticidad del circuito retinotectal se han abordado directamente usando la preparación en vivo para registrar las respuestas de la neurona tectal de aumento a los estímulos visuales que se proyectan sobre la retina. Grabaciones en vivo en el renacuajo son relativamente simples en comparación con la configuración de grabación equivalente en los mamíferos debido a la simplicidad relativa del sistema nervioso y falta de un cráneo. Porque el soma de la neurona tectal individual puede ser visualizado en vivo, sellado en una neurona dada y alcanzar la configuración de grabación de celular todo parche abrazadera es esencialmente equivalente a la realización de la abrazadera del remiendo celular toda grabación en roedores de la rebanada preparativos. Los renacuajos suelen sobrevivieron durante varias horas en la plataforma (que puede evaluarse fácilmente mediante el control de los latidos del corazón). Una limitación inherente de la preparación del renacuajo en vivo es que sólo tectal las neuronas que residen en la capa profunda somática del tectum óptico, la capa que está inmediatamente adyacente al ventrículo medio grande, son accesible para la grabación (figura 1 ). Esto significa que tectal neuronas que residen en las capas externas de la somáticas de la tectum han sido en gran parte inexploradas en vivo.
La ventaja experimental de la preparación de todo el cerebro es que aísla el cerebro de los receptores periféricos sensoriales en los ojos y la piel, eliminando toda actividad sensorial conducida espuria. Aunque ya no es capaz de ser conducido por estímulos visuales, las entradas axonales RGC El tectum que todavía están presentes en la preparación de todo el cerebro y pueden ser activados directamente de forma muy controlada a través de un electrodo de estimulación bipolar (FHC) a quiasma óptico donde los dos grupos de tractos de axones RGC entran en el cerebro. El uso primero divulgado de la preparación de todo el cerebro fue en 1996, en un importante estudio realizado por Wu et al. 8, en que axones RGC fueron activados mediante un electrodo bipolar estimular que los autores podrían cuantificar la fuerza de cada axones RGC en postsynaptic neuronas tectal de aumento y, al hacerlo así hizo descubrimientos fundamentales sobre la progresión de la maduración de la sinapsis. Como con la preparación en vivo , la preparación de todo el cerebro permite el acceso a sólo las neuronas que residen en la capa profunda, adyacente a la membrana ventricular.
Aunque El tectum óptico está compuesto por aproximadamente nueve cuerpo celular capas17, todos los anteriores estudios de electrofisiología se han centrado en las neuronas de capa profunda tectal de aumento porque la tradicional todo el cerebro y en vivo (que se describen las preparaciones arriba) permitir el acceso sólo a las neuronas de la capa profunda. Para acceder a las neuronas tectal de aumento a través de todas las capas somáticas, de más profundo a más superficial así como todo el neuropil donde axones RGC forman conexiones sinápticas con las dendritas de la neurona tectal, hemos desarrollado una preparación modificado todo el cerebro, conocida como "el preparación de corte horizontal del cerebro"(3 de la figura14). Como con la preparación de todo el cerebro, la preparación de rebanada horizontal cerebro mantiene los axones RGC dentro del cerebro y puede controlarse mediante la colocación de un electrodo de estimulación bipolar en el quiasma óptico.
En general, las preparaciones están diseñadas para optimizar la visualización de y acceso a los Somas de neuronas tectal de aumento para llevar a cabo la grabación de abrazadera de parche de células enteras. Directo acceso a la soma es esencial para grabaciones de calidad células enteras patch clamp: acceso al interior de la neurona requiere la formación de una muy fuerte (> 1 × 109 Ω) entre la pipeta y la membrana plasmática de la neurona, que requiere direct contacto de la punta de la pipeta sobre esa membrana. Por lo tanto, suficiente remoción de la membrana ventricular es clave para la exitosa grabación. También, clave para éxito grabaciones RGC-evocado es la colocación correcta del electrodo estimulante bipolar sobre el quiasma óptico. Esencialmente todas las neuronas tectal reciban entrada sináptica directa de los axones RGC. Si no hay respuesta evocada por el grave se observa, entonces esto es probablemente debido a la colocación incorrecta del electrodo bipolar que no sea en el quiasma óptico y no en contacto con los nervios ópticos. Esto puede ser corregido colocando simplemente volver al electrodo estimulante. El incumplimiento grave-evocado las respuestas después de reposicionar el electrodo bipolar podría significar la proyección de RGC axón se cortó accidentalmente durante la disección. En este caso, es necesario empezar con una nueva preparación. Finalmente, una respuesta evocada grave el incumplimiento podría ser debido a la grabación de una célula que no es una neurona común tectal. Por ejemplo, glia normalmente no muestran la respuesta monosynaptic RGC-evocado normal de neuronas tectal y tampoco las neuronas mesencephalic grandes que se han encontrado, aunque en números muy bajos, que residen en El tectum óptico20. La posibilidad de grabación de una de estas células no-tectal de aumento es muy baja debido al número de neuronas tectal. Por supuesto, grabaciones de calidad también requieren el tectal neuronas saludables. Características de una neurona sana tectal de aumento son un compacto soma redondo u ovalados y de color claro y sin manchas. Una vez que se ha logrado la configuración de grabación de toda célula, la salud de la neurona puede evaluarse más a nivel de electrofisiológico mediante la medición de propiedades eléctricas fundamentales como reclinación potencial de la membrana, la resistencia de entrada y la capacitancia . El potencial de membrana en reposo de las neuronas tectal saludables entre etapas de desarrollo 42 y 49 es aproximadamente de -45 mV, con una resistencia de entrada promedio de aproximadamente 1 GΩ y una capacitancia de 10-12 pF3,4,5. Inevitablemente se dañará una pequeña fracción de las neuronas debido a la eliminación de la membrana ventricular. Los Somas de las neuronas dañadas o insalubres aparecen granuladas, hinchado, o arrugados. C figura 2se muestra un ejemplo de una neurona no saludable. Si la mayoría de las neuronas aparece malsana, esta podría ser una reflexión que hay algo mal con la solución de grabación externos, por lo que se recomienda hacer solución de grabación externo fresco. Además de aparecer sano, las neuronas mejor para grabar son típicamente asociadas con un número grande de otras neuronas, en lugar de ser aislado. También, elegir las células que son fácilmente accesibles. Por ejemplo, no empuje el tejido difícil de acceder a un celular porque esto podría dañar el tejido o mover el tejido y así desplazar el electrodo estimulante fuera de lugar. Finalmente, se debe restringidas en el tercio medio del tectum (figura 2B) para evitar diferencias de potencial debido al gradiente de desarrollo que existe en todo el rostro caudal eje4,8, grabaciones a menos que, por supuesto, el objetivo del experimento es el gradiente de desarrollo mencionado. El tectum adecuado es el área de la zona proliferativa rostral y caudal al borde caudal del ventrículo medio grande.
La abrazadera del remiendo toda célula técnica de la grabación no está sin sus limitaciones. En general, este estilo de grabación incluye grabación de una neurona a la vez. Esto está en contraste con las concepciones que la proyección de imagen de una nueva generación indicadores de calcio GCaMP6, que permiten la actividad de grandes poblaciones de neuronas para ser reflejada simultáneamente en una preparación de rebanada y en vivo.
Otro inconveniente inherente a grabaciones de pinza de voltaje de células enteras es el error de abrazadera de espacio (incapacidad para controlar el voltaje mucho más lejos más allá el soma), que limita el control temporal de la tensión4. En general, estas cuestiones de la abrazadera de tensión son mínimas cuando grabe de neuronas tectal de aumento sin embargo, debido a su tamaño relativamente pequeño, modestos arborizations dendríticos y corrientes relativamente pequeños y lento en comparación con las neuronas mamíferas. Estas características de neuronas tectal hacen especialmente favorable para abrazadera de tensión de grabación, medición de muchos parámetros y la construcción de perfiles de neuronas individuales5,6.
Direcciones futuras incluyen optimizar una en vivo cerebro horizontal rebanada preparación para caracterizar la función de las neuronas de la capa externa en el procesamiento de estímulos visuales.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
El apoyo de la beca del NIH SBC COBRE 1P20GM121310-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stemi Stereo 508 | Zeiss | 495009-0006-000 | Dissecting microscope |
| MS-222 "Tricane" | Finquel | ARF5G | Amphibian general anesthetic |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-3 | Used to prepare Stienberg's solution and external solution |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | P217-500 | Used to prepare Stienberg's solution and external solution |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-1KG | Used to prepare Stienberg's solution and external solution |
| Calcium nitrate tetrahyrate (Ca(NO3)•4H2O) | Sigma-Aldrich | 237124-500G | Used to prepare Stienberg's solution |
| Magnesium Sulfate (MgSO4) | Mallinckrodt Chemicals | 6066-04 | Used to prepare Steinberg's solution |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5080-500G | Used to prepare external recording solution |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | J.T. Baker | 2444-01 | Used to prepare external recording solution |
| D-glucose Anhydrous | Mallinckrodt Chemicals | 6066-04 | Used to prepare external recording solution |
| Tubocurarine hydrochloride pentahydrate | Sigma | T2379 | Nicotinic acetylcholine receptor antagonist |
| Insect Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | 0.1mm diameter stainless steel pins |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 761028 | Preweighed monomer and curing agent kit |
| Sterile Polystyrene Petri Dish - 60x15mm | Fisher Scientific | AS4052 | Small petri dishes |
| PrecisionGlide Needle 25Gx5/8 (.0.5mm X 16mm) | BD | 305122 | Syringe needles |
| 1mL Slip Tip Tuberculin Syringe | BD | 309659 | Disposable, sterile syringes |
| Borosilicate pipette glass | Sutter Instrument | BF150-86-10HP | Pulled to desired specifications using pipette pulling machine |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | Fabricates micropipettes for electrophysiology recording |
| Kimwipes Kimtech wipes | Kimberly-Clark | 34120 | Delicate task lint-free wipers |
| Axon Instruments MultiClamp 700B Headstage CV-7B | Molecular Devices | 1-CV-7B | Current clamp and voltage clamp headstage |
| MP-285 Motorized Manipulator with Tabletop Controller | Sutter Instrument | MP-285/T | Control for headstage on electrophysiology rig |
| Fiber-Coupled LED (Green) | Thorlabs | M530F2 | Fiber optic cable paired with green LED |
| Cluster Bipolar Electrode (25µm diameter) | FHC | 30207 | Bipolar stimulating electrode |
| ISO-Flex Stimulator | A.M.P.I. (Israel) | Contact manufacturer | Flexible stimulus isolator |
| Axon Instruments 700B Multipatch Amplifier | Molecular Devices | 2500-0157 | Amplifier for voltage- and current-clamp recording |
| Digidata 1322A digitizer | Molecular Devices | 2500-135 | Data acquisition system for electrophysiology recording |
| Axio Examiner.A1 | Zeiss | 491404-0001-000 | Microscope for electrophysiology |
| Micro-g Lab Table | TMC | 63-533 | Air table for electrophysiology microscope |
| Inspiron 620 Personal Desktop Computer with Windows 7 64-bit | Dell | D06D001 | Computer running electrophysiology software |
| c2400 CCD camera | Hamamatsu | 70826-5 | Charge-coupled device camera for electrophysiology imaging |
| 7 O'Clock Super Platinum Stainless Razorblades | Gillette | CMM01049 | Platinum-coated stainless razor blades |
| Transfer Pipets | Fisher Scientific | 13-711-7M | Disposable Polyethylene transfer pipets |
References
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