Summary
I dette papir diskuterer vi tre hjernen præparater bruges til optagelse af hele cellen patch klemme til at studere retinotectal kredsløb af Xenopus laevis haletudser. Hvert præparat, med sin egen specifikke fordele, bidrager til den eksperimentelle sporbarhed af Xenopus haletudse som en model til at studere neurale kredsløb funktion.
Abstract
Xenopus haletudse retinotectal banen, består af retinal ganglion celler (RGCs) i øjet som danner synapser direkte til neuroner i det optiske tectum, er en populær model til at studere hvordan neurale kredsløb selv samle. Evnen til at udføre hele celle patch klemme optagelser fra tectal neuroner og registrere RGC-fremkaldte svar, enten i vivo eller ved hjælp af en hele hjernen forberedelse, har genereret en stor krop af høj opløsning data om de underliggende normale mekanismer , og unormal, kredsløb dannelsen og funktionen. Vi beskrive her, hvordan man udfører i vivo forberedelse, den oprindelige hele hjernen forberedelse, og en mere nylig udviklet vandrette hjernen skive forberedelse for at opnå hele cellen patch klemme optagelser fra tectal neuroner. Hvert præparat har unikke eksperimentelle fordele. I vivo forberedelse giver mulighed for optagelse af tectal neuroner direkte reaktion på visuelle stimuli projiceret op på øjet. Hele hjernen forberedelse giver mulighed for RGC axoner skal aktiveres i et stærkt kontrolleret måde, og horisontale hjernen skive forberedelse giver mulighed for optagelse fra på tværs af alle lag af tectum.
Introduction
Retinotectal kredsløb er det vigtigste element i padde visuelle system. Det består af RGCs i øjet, som projektet deres axoner til det optiske tectum, hvor de danner synaptiske forbindelser med postsynaptiske tectal neuroner. Xenopus haletudse retinotectal kredsløb er en populær udviklingsmæssige model til at studere neurale kredsløb dannelsen og funktionen. Der er mange attributter af denne haletudse retinotectal kredsløb, der gør det en kraftfuld eksperimentel model1,2,3. Én stor attribut, og fokus i denne artikel, er evnen til at udføre hele cellen patch klemme optagelser fra tectal neuroner, in vivo eller ved hjælp af en hele hjernen forberedelse. Med et Elektrofysiologi rig outfitted med en forstærker, der understøtter spænding - og aktuelle-klemme optagelsestilstande, tillade hele cellen patch klemme optagelser en neuron Elektrofysiologi til karakteriseres i høj opløsning. Som følge heraf har hele cellen patch klemme optagelser fra tectal neuroner på tværs af de vigtigste faser af retinotectal kredsløb dannelse givet en detaljeret og omfattende forståelse af udviklingen og plasticitet af iboende4,5 , 6 , 7 og synaptic8,9,10,11 egenskaber. Ved at kombinere hele cellen patch klemme tectal neuron optagelser, evnen til at udtrykke gener eller morpholinos af interesse i disse neuroner12, og en metode til at vurdere visuel guidede adfærd via en etableret visuelle undgåelse test13 fremmer den identifikation af forbindelserne mellem molekyler, kredsløb funktion og adfærd.
Det er vigtigt at bemærke, at typen af høj opløsning data erhvervet fra hele cellen patch klemme optagelser ikke er muligt ved hjælp af nyere billeddiagnostiske tilgange såsom indikatoren genetiske calcium GCaMP6, fordi selv ved hjælp af calcium indikatorer tillader imaging af calcium dynamics på tværs af store populationer af neuroner samtidigt, der er ikke direkte eller indlysende måde at de specifikke elektriske parametre kan fås ved at måle delta fluorescens i somata, og der er ingen måde at spænding klemme neuron til at måle Aktuel spænding relationer. Klart disse to forskellige tilgange, elektrofysiologiske optagelser og calcium imaging, besidder ikke-overlappende styrker og generere forskellige typer af data. Den bedste fremgangsmåde afhænger således af det konkrete eksperimentelle spørgsmål bliver behandlet.
Her beskriver vi vores metode for at erhverve hele cellen patch klemme optagelser fra neuroner i haletudse optiske tectum ved hjælp af en i vivo forberedelse, hele hjernen forberedelse, og en nyere ændret hele hjernen forberedelse, der blev udviklet i vores lab14 . I afsnittet repræsentant resultater vise vi eksperimentelle fordelene ved hvert præparat og de forskellige typer af data, der kan opnås. Grænser og styrker af forskellige præparater, samt tips til fejlfinding, er inkluderet i afsnittet diskussion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder beskrevet her er blevet godkendt af institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) af Wyoming Universitet. Alle procedurer, herunder elektrofysiologiske optagelser, udføres ved stuetemperatur, ca 23 ° C. Alle metoder beskrevet her er optimeret til optagelse af tectal neuroner fra haletudser mellem udviklingsstadiet 42 og 49 (iscenesat ifølge Neiuwkoop og Faber15).
1. in Vivo forberedelse
- Bedøver haletudse.
- Placer haletudse i en lille petriskål indeholdende Steinbergs løsning med 0,01% MS-222 i ca 5 min.
Bemærk: MS-222 aka "Tricaine" er en fælles fisk og padder bedøvelsesmiddel. Haletudser er rejst i Steinbergs opløsning i mM: 0.067 KCl, 0.034 Ca (3)2•4H2O, 0.083 MgSO4•7H2O, 5,8 NaCl, 4.9 HEPES. - Sikre en haletudse er dybt bedøvet (ikke-responderende og ikke længere svømning), før du fortsætter til trin 2.
- Placer haletudse i en lille petriskål indeholdende Steinbergs løsning med 0,01% MS-222 i ca 5 min.
- Sikre den bedøvede haletudse til en neddykket silikone blok på gulvet af dissekere/optagelse parabol.
- Brug en engangs overførsel pipette til at flytte de bedøvet haletudse til en dissektion/optagelse parabol indeholdende ekstern optagelse løsning (115 mM af NaCl, 2 mM af KCl, 3 mM CaCl2, 3 mM i MgCl2, 5 mM af HEPES, 1 mM af glucose justere pH til 7.25 bruger 10 N NaOH, osmolaritet 255 mOsm).
- For at minimere spontan muskel sitren, tilføje acetylcholin receptor blokker, tubocurarin (100 µM) til den eksterne løsning. (Typisk, dette gøres ved hjælp af en 200 µL pipette til tilsættes 100 µL af en 10 mM tubocurarin bestand 10 mL af eksterne løsning).
- Brug insekt pins, sikre haletudse, dorsale side op, til en neddykket blok af silikoneelastomer (såsom Sylgard 184, se Materialer tabel for detaljer), som har været limet til dissekere parabol gulvet.
Bemærk: Placeringen af benene er kritisk: Placer dem på hver side af hjernen, tilstrækkeligt caudale at undgå spidde afferente RGC axoner projektet fra øjet og trænge ind i hjernen lige foran det optiske tectum (fig. 1A).
- Brug en engangs overførsel pipette til at flytte de bedøvet haletudse til en dissektion/optagelse parabol indeholdende ekstern optagelse løsning (115 mM af NaCl, 2 mM af KCl, 3 mM CaCl2, 3 mM i MgCl2, 5 mM af HEPES, 1 mM af glucose justere pH til 7.25 bruger 10 N NaOH, osmolaritet 255 mOsm).
- Fileten hjernen langs midterlinjen.
- Et klart overblik over hjernen, fjerne huden overliggende hjernen ved at gøre en overfladisk indsnit langs midterlinjen ved hjælp af en steril 25-G kanyle.
- Filet hjernen langs den samme midterlinje akse ved at indsætte nålen ind i den neurale rør og trækker forsigtigt opad (dorsalt) sådan, at den dorsale del af røret er rent skær (afhuggede) mens bundpladen intakt (figur 1B).
Bemærk: Det er vigtigt, at gulvet plade af neuralrøret være overladt intakt, fordi de afferente sensoriske input Indtast tectum via bundpladen.
- Fjerne den gennemsigtige ventrikulære membran, der dækker de tectal neuroner.
- Flytte optagelse parabol til Elektrofysiologi riggen og bruge et glasskår pipette tip til at fjerne den ventrikulære membran overliggende tectal neuron celle organer. Bryde spidsen af let at trække det over en delikat opgave vinduesvisker.
- Skru pipetten i pipette indehaveren, og sænk den ned til den optiske tectum via micromanipulator.
- Bruge den brudte pipette til at skrælle den ventrikulære membran fra tectum.
Bemærk: Det er ikke nødvendigt at fjerne membranen fra den hele tectum; et lille vindue vil være tilstrækkeligt og giver adgang til masser af neuroner.
- Få hele cellen patch klemme optagelser.
Bemærk: Tilgang fra dette punkt fremad er lig udfører hele cellen patch klemme optagelser fra mus hjernen skiver, som beskrevet i Segev, et al. 16 (Figur 1C). - Optage tectal neuron svar til et hele feltet lysglimt projiceret op på nethinden.
- For at projicere et hele feltet lysglimt på nethinden, Placer en optiske fiber støder op til den haletudse øje. I anden enden af den optiske fiber er et LED i overensstemmelse med en variabel modstand, der giver mulighed for lys luminans skal kontrolleres. Udløse LED af den digitale udgang på forstærkeren. På denne måde optaget hele området glimt af vekslende intensitet af lys kan være (figur 4A).
2. hele hjernen forberedelse
- Udfør trin 1.1-1.3.
Bemærk: Der er ingen grund for tubocurarin i den eksterne løsning til dette præparat. - Isolere hjernen.
- Bruge en 25-G nål til at afskære baghjernen (fig. 2A).
- For at isolere hele hjernen fra haletudse, køre forsigtigt nålen nedenunder i hjernen, i retningen caudale til rostralt at afskære alle laterale og ventrale bindevæv og nervefibre.
- Sikre hjernen til en blok af silikoneelastomer.
- Når helt befriet, sikre hjernen til en blok af silikoneelastomer ved at placere en pin gennem en af de olfaktoriske pærer og en anden pin gennem baghjernen (figur 2B). Dette er den optimale konfiguration til optagelse fra tectal neuroner.
- Flytte fadet indeholdende fastgjorte hele hjernen forberedelse fra dissekere anvendelsesområdet til Elektrofysiologi riggen. Fjerne den ventrikulære membran ved hjælp af et glasskår pipette som beskrevet i trin 1.4.
- Placer en bipolar stimulere elektroden på den optiske chiasm (hvor axon skrifter fra hvert øje krydser på midthjernen) for at aktivere direkte RGC axoner.
- Sted bipolar stimulere elektroden rostralt, og næsten støder op til den store midterste ventrikel. Den optiske chiasm ligger umiddelbart rostralt for den store midterste ventrikel (figur 2B).
- Sænk forsigtigt stimulere elektroden ned på den optiske chiasm sådan, at en lille bule dannes i væv. Den bipolære elektrode er drevet af en pulse stimulator, som giver mulighed for styrken af stimulation til styres præcist.
- Sted bipolar stimulere elektroden rostralt, og næsten støder op til den store midterste ventrikel. Den optiske chiasm ligger umiddelbart rostralt for den store midterste ventrikel (figur 2B).
- Udføre hele cellen patch klemme optagelse (figur 2C), som beskrevet af Segev, et al. 16
3. horisontale hjernen skive forberedelse
- Udfør trin 2.1 til 2.3.
- Bruge et barberblad til punktafgifter den mest laterale fjerde (som i vivo svarer til den mest dorsale fjerde) af den ene side af en optiske tectum. Denne nedskæring er foretaget parallelt med rostralt-caudale som vist i fig. 3A.
- Re-ben hjernen til siden af silikoneelastomer med den snittede side opad (så at somata og neuropil kan tilgås direkte til optagelse) og ventrikulær overfladen af hjernen vender væk fra silikoneelastomer blok (figur 3 B) (således at en bipolære elektrode kan anbringes på den optiske chiasm).
- Udføre hele cellen patch klemme eller lokale gemt potentielle optagelse (figur 3C), som beskrevet af Segev, et al. 16
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at registrere lys-fremkaldte svar er en hele feltet lysglimt projiceres nethinden mens de resulterende svar er optaget fra enkelte tectal neuroner (figur 4A). Denne særlige protokol er designet til at måle både svaret af neuron til lyset tænde ("om" reaktion) og derefter slukke 15 s senere til at måle den "Off svar." Tectal neuroner typisk udviser robust på og ned af svar (vist her optaget i spænding klemme tilstand, med neuron fastspændt til - 60mV til at måle synaptic nuværende (fig. 4B)). Mængden af synaptic drev modtaget af nogen en neuron kan kvantificeres ved at optage spontane synaptic begivenheder (fig. 4C). Aktuel spænding relationer (-V kurver) kan genereres ud fra de samme neuron ved at træde neuron til i stigende grad depolariseret potentialer og optager den resulterende spænding-aktiveret Na+ og K+ strømninger, omtales som "blandet nuværende optagelser"(figur 4D, E). Det har været veletableret, for disse padde neuroner, peak Na+ og K+ strømninger kan kvantificeres via blandet aktuelle optagelser, fordi toppene ikke tidsligt overlapper med hinanden4,7.
Direkte aktivering af RGC axoner på den optiske chiasm omfartsveje alle upstream beregning og behandling af visuelle stimuli, der finder sted i øjet, og giver mulighed for at studere den synaptiske transmission mellem præsynaptiske RGC axoner og postsynaptiske tectal neuroner i sin mest rene og reduceret form. Tectal neuron svar til RGC aktivering er genereret fra RGCs stimuleres af lys eller direkte ved hjælp af en bipolar stimulere elektroden består af to komponenter: en monosynaptic komponent (direkte synaptic input fra aktiveret RGCs) og en polysynaptic komponent (lokale tilbagevendende netværk aktivitet fodring tilbage på neuron registreres). For de lette evoked svar overlappe de monosynaptic og polysynaptic komponenter hinanden med nogle nogle beløb. Denne tidsmæssige overlapning begrænser hvad kan indgås om synaptisk transmission mellem nethinden og optiske tectum. Ved hjælp af en hele hjernen forberedelse og aktivere RGC axon tarmkanalen direkte via en elektrode placeret på den optiske chiasm (figur 5A), men producerer en mono- og polysynaptic komponent, der er det væsentlige ikke-overlappende i tid. Stimulerende styrken af det bipolære elektrode kan justeres. Som stimulerende styrken er øget, er der et større antal RGC axoner aktiveret (figur 5B). En minimal stimulation protokol bestemmer synaptic styrken af en individuel RGC axon på en individuel tectal neuron; en maksimal stimulering protokollen afspejler det samlede beløb eller maksimalt, synaptic input fra alle RGC axoner kombineret (figur 5C). De rette forhold af excitatoriske til hæmmende synaptic input (E: Jeg ratio) modtaget af en individuel tectal neuron er kritisk for normal visuelle funktion18. Figur 5 D viser et eksempel på de RGC-fremkaldte excitatoriske og hæmmende aktuelle spor optaget fra en individuel tectal neuron. Sandsynligheden for, at senderen frigivelse fra RGC præsynaptiske axon terminaler er målt af parret puls optagelser. For dette registreres det postsynaptiske tectal neuron i spænding klemme mode til at måle synaptic strømninger, mens RGC axoner aktiveres successivt, adskilt af en 50 ms tidsinterval (figur 5E).
Hele cellen patch klemme optagelser kan foretages fra tectal neuroner bosat i ethvert somatiske lag. Svarende til hele hjernen forberedelse, RGC axoner kan aktiveres ved at placere en bipolar optagelse elektrode på optiske chiasm (fig. 6A). Alle optagelser foretaget i hele hjernen forberedelse kan også udføres ved hjælp af dette horisontale hjernen skive forberedelse. Figur 6 B viser et eksempel spor af en RGC-evoked response optaget fra en neuron i de overfladiske lag. Denne forberedelse giver også mulighed for den rumlige mønster af RGC synaptic input på de tectal dendritter skal måles. Herfor, RGC-fremkaldte felt potentialer registreres hver 10 µm langs medial-lateral akse (dvs, den distale-proksimale akse) af neuropil (figur 6C). Dette skaber en høj opløsning profil af mønstret af funktionelle RGC input. Feltet potentialer kan derefter omdannes til aktuelle kilde tætheder ved at beregne det anden fysisk afledte14 og de aktuelle kilde tætheder kan igen blive omdannet til et billede plot. Billede plottet i figur 6C viser, at de stærkeste RGC input mål området mere distale i neuropil.
Figur 1. In vivo forberedelse procedurer. (A) haletudse hængte på et stykke af silikoneelastomer. Pins er angivet af de hvide pile. Bemærk den mere caudale pin placering for at undgå at spidde de fiberoptiske skrifter. Den hvide stiplede linje angiver midterlinjen. (B) zoome-på baggrund af hele hjernen efter skære langs svinekroppens midterlinje og fjernelse af overliggende hud. (C) hele-celle patch-clamp optagelse i vivo. (L: Lateral. M: mediale. R: rostralt. C: halefinne. D: dorsale. V: ventral. OB: olfaktoriske pære. OT: Optiske Tectum. HB: Baghjernen). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 . Hele hjernen forberedelse procedurer. (A) efter at hjernen er fileteret langs midterlinjen, baghjernen er afskåret. (B) hele hjernen er dissekeret ud og besejrede til silikoneelastomer. Den hvide stjerne angiver pin i venstre olfaktoriske pære. Det røde felt angiver den midterste tredjedel af tectum, dvs, målområdet for optagelse. (C) hele cellen patch klemme optagelse ved hjælp af hele hjernen forberedelse. Den sorte stjerne angiver området af un-skrabede ventrikulær membran hvor celler ikke kan tilgås til optagelse. Hvor membranen er blevet med held fjernet, vises somata mere distinkt og defineret. Pilen angiver en usund neuron. (PZ: proliferativ Zone. LMV: Store mediale ventrikel. OB: olfaktoriske pære. OT: Optiske Tectum. HB: baghjernen. L: lateral. M: mediale. R: rostralt. C: halefinne. D: dorsale. V: ventrale). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 . Vandrette hjernen skive forberedelse procedurer. (A) den mest laterale del af den ene side af det optiske tectum vil blive skåret (angivet ved den stiplede linje) efter hele hjernen forberedelse. (B) vandret hjernen skive forberedelse efter at være blevet holdt nede ved siden af silikoneelastomer. Dobbelt hvide linjer repræsenterer en stimulerende elektrode placeret på den optiske chiasm. (C) zoome-på baggrund af soma lag og neuropil ved hjælp af en vandret hjerne skive forberedelse. Stiplede kurve indikerer grænsen mellem soma lag og neuropil. Dette tal er blevet ændret fra Anette, et al. 14 (L: Lateral. M: mediale. R: rostralt. C: halefinne. D: dorsale. V: ventral. OB: olfaktoriske pære. OC: optiske Chiasm. OT: Optiske Tectum. HB: Baghjernen). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 . Optagelser fra en i vivo forberedelse. (A) diagram viser den typiske konfiguration af en in vivo -optagelse. (B) lys fremkaldte svar herunder lys på og lys ned af svar. Inset spor er zoomet på baggrund af på - og off-svar, henholdsvis. (C) spontan excitatoriske postsynaptiske strømninger registreres. (D) Na+ og K+ strømninger i svar til spænding klemme skridt fra -60 mV til 30 mV fra en enkelt neuron. (E) IV parceller genereret fra spor i (D). Alle optagelser blev gjort med neuron afholdt på -60 mV undtagen i (D) at generere IV-arealer; neuroner er trådte til i stigende grad mere depolariseret potentialer, i 10 mV intervaller, at aktivere spænding-afhængige strømninger. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 . Optagelser fra en hele hjernen forberedelse. (A) skematisk viser den typiske konfiguration af hele hjernen optagelse herunder en stimulere elektroden anbringes på den optiske chiasm (grønne og røde linjer repræsenterer RGC axoner). (B) overliggende spor af RGC svar til ændringer af RGC stimulation styrke. (C) maksimal stimulering response (venstre) og minimum stimulering response (til højre). (D) en RGC-fremkaldte excitatoriske og hæmmende svar på en enkelt neuron. (E) forbundne puls facilitering af en enkelt neuron RGC-fremkaldt reaktion. (OB: olfaktoriske pære. OC: optiske Chiasm. OT: Optiske Tectum). Alle optagelser blev gjort med neuron afholdt på -60 mV undtagen i (D) for at måle de excitatoriske og hæmmende input: excitatoriske input er registreret ved at holde neuron tilbageførsel potentialet af γ-aminosmørsyre (GABA)-medieret chlorid strømforhold (-45 mv); den hæmmende input ved at holde neuron tilbageførsel potentialet af α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic syre (AMPA)-medieret strømme (+ 5 mv). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6 . Optagelser fra en vandret hjerne skær forberedelse. (A) skematisk viser konfigurationen af en vandret hjernen skive forberedelse. Bemærk, at selvom stimulere elektroden forbliver på den optiske chiasm, optagelse pipette er nu positioneret til at adgang celler på tværs af alle de tectal lag udsat af horisontale hjernen skive forberedelse. (B) en RGC svar fra en neuron bosat i de overfladiske lag af tectum. (C) registreres felt potentialer på tværs af neuropil og de konverterede aktuelle kilde tætheder (værdipapircentraler) vist af plot varme grafikobjekter. (OC: optiske Chiasm. OT: Optiske Tectum. HB: Baghjernen). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Alle metoder, der beskrives i dette arbejde er optimeret til optagelse af tectal neuroner fra haletudser mellem udviklingsstadiet 42 og 49 (iscenesat ifølge Neiuwkoop og Faber15). Tidspunkt 42, haletudser er tilstrækkeligt stort og tilstrækkeligt udviklede så at insekt benene kan placeres på enten side af hjernen i vivo optagelser og udfører hele hjernen dissektion. På tidligere stadier, når haletudser er hovedsagelig todimensional (dvs.flade), metoderne beskrevet her er ikke optimale.
På grund af den lette tectal neuroner kan tilgås og optaget i hele cellen konfiguration, har denne model kredsløb været et arnested for grundlæggende opdagelser om hvordan neurale kredsløb form, mens funktion- og funktion samtidig danner19. Her har vi beskrevet hvordan man erhverve hele cellen patch klemme optagelser fra tectal neuroner, herunder hvordan man udfører haletudse i vivo og hele hjernen præparater, forskellige optagelse konfigurationer og eksempler på forskellige typer af data. Følgende er en diskussion af styrker og begrænsninger af hvert præparat, efterfulgt af tips til at opnå høj kvalitet hele cellen optagelser.
Xenopus haletudser begynde at vise visuelle undgåelse opførsel af stage 47/48, ca 7-8 dage efter befrugtningen3,13. Det betyder, at selv i disse relativt tidlige faser af udvikling, retinotectal kredsløbet er velfungerende og kan behandle visuelle stimuli. Grundlæggende spørgsmål vedrørende udvikling og plasticitet af retinotectal kredsløbet har behandlet direkte, bruger i vivo forberedelse til at registrere tectal neuron svar til visuelle stimuli projiceret op på nethinden. In vivo optagelser i en haletudse er relativt enkel sammenlignet med den tilsvarende optagelse konfiguration i pattedyr på grund af den relative enkelhed af nervesystemet og manglen på et kranium. Fordi enkelte tectal neuron svovldepositioner kan være visualiseret i vivo, er forsegling på en given neuron og opnå hele cellen patch klemme optagelse konfiguration væsentlige svarer til gennemføre hele cellen patch klemme optagelse i gnavere skive præparater. Haletudser typisk overleve i flere timer på riggen, (som kan vurderes let ved overvågning af hjerterytme). Én begrænsning iboende haletudse i vivo forberedelse er, at kun tectal neuroner bosat i det dybe somatiske lag af det optiske tectum, det lag, der umiddelbart støder op til den store midterste ventrikel, er tilgængeligt for optagelse (figur 1 ). Det betyder, at tectal neuroner bosat i de ydre somatiske lag af tectum har været stort set uudforskede in vivo.
Den eksperimentelle fordel af hele hjernen forberedelse er, at det isolerer hjernen fra de perifere sensoriske receptorer i øjnene og huden, fjerne alle falske sensorisk-drevet aktivitet. Mens ikke længere i stand til at blive drevet af visuelle stimuli, de RGC cytoskeletale indgange, der er målrettet tectum er stadig til stede i hele hjernen forberedelse og de kan aktiveres direkte i et stærkt kontrolleret måde via en bipolar stimulerende elektrode (FHC) placeret på den optiske chiasm hvor de to sæt af RGC axon skrifter trænge ind i hjernen. Den første rapporterede brugen af hele hjernen forberedelse var i 1996, i en vigtig undersøgelse af Wu et al. 8, i hvilke RGC axoner er blevet aktiveret ved hjælp af en bipolar stimulerende elektrode, således at ophavsmændene kunne kvantificere styrken af individuelle RGC axoner på postsynaptiske tectal neuroner, og derved så gjorde grundlæggende opdagelser om progression af synapse modning. Som med forberedelse i vivo giver hele hjernen forberedelse adgang til kun disse neuroner har bopæl i de dybe lag, støder op til den ventrikulære membran.
Selv om den optiske tectum er sammensat af cirka ni cellen kroppen lag17, alle tidligere Elektrofysiologi studier har fokuseret på de dybe lag tectal neuroner, fordi den traditionelle hele hjernen og i vivo præparater (beskrevet ovenfor) kun give adgang til den dybe lag neuroner. For at få adgang til tectal neuroner på tværs af alle somatiske lag, fra dybeste til mest overfladiske og hele neuropil hvor RGC axoner danner synaptiske forbindelser med tectal neuron dendritter, udviklede vi en modificeret hele hjernen forberedelse, omtales som "den vandrette hjernen skive forberedelse"(figur 314). Som med hele hjernen forberedelse, vandrette hjernen skive forberedelse fastholder RGC axoner i hjernen og de kan kontrolleres ved at placere en bipolar stimulere elektroden på den optiske chiasm.
Samlet set er forberedelserne designet til at optimere visualisering af og adgang til tectal neuron somata til at udføre hele cellen patch klemme optagelse. Direkte adgang til soma er afgørende for kvalitet hele cellen patch klemme optagelser: adgang til indersiden af neuron kræver dannelsen af et meget stort (> 1 × 109 Ω) tætning mellem pipetten og de neuron plasmamembran, som kræver direkte Kontakt pipette spids på denne membran. Derfor, tilstrækkelig fjernelse af den ventrikulære membran er nøglen til vellykket optagelse. Nøglen til vellykket RGC-fremkaldte optagelser er også den korrekte anbringelse af bipolar stimulere elektroden på den optiske chiasm. Stort set alle tectal neuroner modtage direkte synaptic input fra RGC axoner. Hvis ingen RGC-evoked response er observeret, er det mest sandsynligt på grund af forkert placering af det bipolære elektrode, så det ikke er på den optiske chiasm og ikke at kontakte synsnerverne. Dette kan afhjælpes ved blot igen placerer stimulere elektroden. Overskridelsen RGC-fremkaldte svar efter igen placerer den bipolære elektrode kan betyde at RGC axon projektion blev ved et uheld afskåret under dissektion. I dette tilfælde er det nødvendigt at starte forfra med et nyt præparat. Endelig, manglende overholdelse af en RGC-fremkaldt reaktion kunne være på grund af optagelse fra en celle, der ikke er en fælles tectal neuron. For eksempel, glia viser typisk ikke de normale RGC-fremkaldte monosynaptic svar vises af tectal neuroner, og heller ikke de store mesencephalic neuroner, der er blevet fundet, om end på et meget lavt antal, bosat i det optiske tectum20. Sandsynligheden for optagelse fra en af disse ikke-tectal celler er meget lav på grund af det store antal af tectal neuroner. Kvalitet optagelser kræver naturligvis, også de tectal neuroner at være sund. Karakteristik af en sund tectal neuron er en kompakt runde eller ovale soma, der er lys-farvet og uden pletter. Når hele cellen optagelse konfiguration er opnået, kan sundhed af neuron yderligere vurderes på elektrofysiologiske niveau ved at måle grundlæggende elektriske egenskaber såsom hvile membran potentiale, input modstand og kapacitans . Sund tectal neuroner mellem udviklingsstadier 42 og 49 hvilende membran potentiale er ca -45 mV, med en gennemsnitlig input modstand på ca. 1 GΩ, og en kapacitans af 10-12 pF3,4,5. En lille brøkdel af neuroner vil uundgåeligt blive beskadiget som følge af fjernelsen af den ventrikulære membran. Somata af beskadigede eller usundt neuroner virke grynet, oppustet, eller skrumpet. Figur 2Cer vist et eksempel på en usund neuron. Hvis flertallet af neuroner vises usunde, kunne dette være en overvejelse, at der er noget galt med ekstern optagelse opløsning, så det anbefales at gøre op frisk ekstern optagelse løsning. Udover optræder sund, er de bedste neuroner for optagelse typisk forbundet med en lang række andre neuroner, i stedet for at blive isoleret. Også vælge celler, der er let tilgængelige. For eksempel skal ikke skubbe vævet for svært at få adgang til en celle, da dette kan beskadige vævet eller flytte væv og dermed Skift stimulere elektroden malplaceret. Endelig skal optagelser begrænses til den midterste tredjedel af tectum (figur 2B) at undgå potentielle forskelle på grund af de udviklingsmæssige forløb, der eksisterer på tværs af rostro-caudale akse4,8, Medmindre selvfølgelig, fokus for eksperimentet er den førnævnte udviklingsmæssige forløb. Tectum ordentlig er området rostralt for den proliferative zone og caudale store midterste ventrikel caudale kant.
Den hele celle patch klemme optagelse teknik er ikke uden sine begrænsninger. Generelt indebærer denne stil af optagelse at optage en neuron ad gangen. Dette er i modsætning til tilgange, der inddrager imaging af en ny generation GCaMP6 calcium indikatorer, som giver mulighed for aktivitet af store populationer af neuroner at blive afbildet samtidigt i en skive forberedelse og in vivo.
En anden ulempe forbundet til hele celle spænding klemme optagelser er plads klemme fejl (den manglende evne til at styre spænding langt videre ud over soma), som begrænser tidsmæssige kontrol af spænding4. Samlet, disse spænding klemme spørgsmål er minimal når optagelse fra tectal neuroner imidlertid på grund af deres relativt lille størrelse, beskedne dendritiske arborizations og relativt lille og langsom strømninger i forhold til pattedyr neuroner. Disse karakteristika af tectal neuroner gør dem særlig modtagelig for spænding klemme optagelse, måling af mange parametre, og opførelsen af profiler for individuelle neuroner5,6.
Fremtidige retninger omfatter optimering af en i vivo vandrette hjernen skive forberedelse til at karakterisere funktionen af ydre lag neuroner i behandling af visuelle stimuli.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Støttet af NIH grant SBC COBRE 1P20GM121310-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stemi Stereo 508 | Zeiss | 495009-0006-000 | Dissecting microscope |
| MS-222 "Tricane" | Finquel | ARF5G | Amphibian general anesthetic |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-3 | Used to prepare Stienberg's solution and external solution |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | P217-500 | Used to prepare Stienberg's solution and external solution |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-1KG | Used to prepare Stienberg's solution and external solution |
| Calcium nitrate tetrahyrate (Ca(NO3)•4H2O) | Sigma-Aldrich | 237124-500G | Used to prepare Stienberg's solution |
| Magnesium Sulfate (MgSO4) | Mallinckrodt Chemicals | 6066-04 | Used to prepare Steinberg's solution |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5080-500G | Used to prepare external recording solution |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | J.T. Baker | 2444-01 | Used to prepare external recording solution |
| D-glucose Anhydrous | Mallinckrodt Chemicals | 6066-04 | Used to prepare external recording solution |
| Tubocurarine hydrochloride pentahydrate | Sigma | T2379 | Nicotinic acetylcholine receptor antagonist |
| Insect Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | 0.1mm diameter stainless steel pins |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 761028 | Preweighed monomer and curing agent kit |
| Sterile Polystyrene Petri Dish - 60x15mm | Fisher Scientific | AS4052 | Small petri dishes |
| PrecisionGlide Needle 25Gx5/8 (.0.5mm X 16mm) | BD | 305122 | Syringe needles |
| 1mL Slip Tip Tuberculin Syringe | BD | 309659 | Disposable, sterile syringes |
| Borosilicate pipette glass | Sutter Instrument | BF150-86-10HP | Pulled to desired specifications using pipette pulling machine |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | Fabricates micropipettes for electrophysiology recording |
| Kimwipes Kimtech wipes | Kimberly-Clark | 34120 | Delicate task lint-free wipers |
| Axon Instruments MultiClamp 700B Headstage CV-7B | Molecular Devices | 1-CV-7B | Current clamp and voltage clamp headstage |
| MP-285 Motorized Manipulator with Tabletop Controller | Sutter Instrument | MP-285/T | Control for headstage on electrophysiology rig |
| Fiber-Coupled LED (Green) | Thorlabs | M530F2 | Fiber optic cable paired with green LED |
| Cluster Bipolar Electrode (25µm diameter) | FHC | 30207 | Bipolar stimulating electrode |
| ISO-Flex Stimulator | A.M.P.I. (Israel) | Contact manufacturer | Flexible stimulus isolator |
| Axon Instruments 700B Multipatch Amplifier | Molecular Devices | 2500-0157 | Amplifier for voltage- and current-clamp recording |
| Digidata 1322A digitizer | Molecular Devices | 2500-135 | Data acquisition system for electrophysiology recording |
| Axio Examiner.A1 | Zeiss | 491404-0001-000 | Microscope for electrophysiology |
| Micro-g Lab Table | TMC | 63-533 | Air table for electrophysiology microscope |
| Inspiron 620 Personal Desktop Computer with Windows 7 64-bit | Dell | D06D001 | Computer running electrophysiology software |
| c2400 CCD camera | Hamamatsu | 70826-5 | Charge-coupled device camera for electrophysiology imaging |
| 7 O'Clock Super Platinum Stainless Razorblades | Gillette | CMM01049 | Platinum-coated stainless razor blades |
| Transfer Pipets | Fisher Scientific | 13-711-7M | Disposable Polyethylene transfer pipets |
References
- Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets. Dis. Model Mech. 6, 1057-1065 (2013).
- Pratt, K. G. Finding Order in Human Neurological Disorder Using a Tadpole. Curr. Pathobio. Rep. 3 (2), 129-136 (2015).
- Liu, Z., Hamodi, A. S., Pratt, K. G. Early development and function of the Xenopus tadpole retinotectal circuit. Curr. Opin. Neurobiol. 41, 17-23 (2016).
- Hamodi, A. S., Pratt, K. G. Region-specific regulation of voltage-gated intrinsic currents in the developing optic tectum of the Xenopus tadpole. J. Neurophysiol. 112 (7), 1644-1655 (2014).
- Pratt, K. G., Aizenman, C. D. Homeostatic regulation of intrinsic excitability and synaptic transmission in a developing visual circuit. J. Neurosci. 27 (31), 8268-8277 (2007).
- Cialeglio, C. M., Khakhalin, A. S., Wang, A. F., Constantino, A. C., Yip, S. P., Aizenman, C. D. Multivariate analysis of electrophysiological diversity of Xenopus visual neurons during development and plasticity. Elife. 4, 11351 (2015).
- Aizenman, C. D., Akerman, C. J., Jensen, K. R., Cline, H. T. Visually driven regulation of intrinsic neuronal excitability improves stimulus detection in vivo. Neuron. 39 (5), 831-842 (2003).
- Wu, G., Malinow, R. Cline H.T. of a central glutamatergic synapse. Science. , 972-976 (1996).
- Van Rheed, J. J., Richards, B. A., Akerman, C. J. Sensory-evoked spiking behavior emerges via an experience-dependent plasticity mechanism. Neuron. 87 (5), 1050-1060 (2015).
- Schwartz, N., Schohl, A., Ruthazer, E. S. Activity-dependent transcription of BDNF enhances visual acuity during development. Neuron. 70 (3), 455-467 (2011).
- Zhang, L. I., Tao, H. W., Holt, C. E., Harris, W. A., Poo, M. A critical window for cooperation and competition among developing retinotectal synapses. Nature. 395 (6697), 37-44 (1998).
- Hewapathirane, D. S., Haas, K. Single cell electroporation in vivo within the intact developing brain. J. Vis. Exp. (17), e705 (2008).
- Dong, W., et al. Visual avoidance in Xenopus tadpoles is correlated with the maturation of visual responses in the optic tectum. J. Neurophysiol. 101 (2), 803-815 (2009).
- Hamodi, A. S., Pratt, K. G. The horizontal brain slice preparation: a novel approach for visualizing and recording from all layers of the tadpole tectum. J. Neurophysiol. 113 (1), 400-407 (2015).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , Garland. New York. (1994).
- Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices. J. Vis. Exp. (112), e54024 (2016).
- Muldal, A. M., Lillicrap, T. P., Richards, B. A., Akerman, C. J. Clonal Relationships Impact Neuronal Tuning within a Phylogenetically Ancient Vertebrate Brain Structure. Curr. Biol. 24 (16), 1929-1933 (2014).
- Khakhalin, A. S., Koren, D., Gu, J., Xu, H., Aizenman, C. D. Excitation and inhibition in recurrent networks mediate collision avoidance in Xenopus tadpoles. Eur. J. Neurosci. 40 (6), 2948-2962 (2014).
- Ruthazer, E. S., Aizenmann, C. D. Learning to see: patterned visual activity and the development of visual function. Trends Neurosci. 44 (4), 183-192 (2010).
- Pratt, K. G., Aizenman, C. D. Multisensory integration in mesencephalic trigeminal neurons in Xenopus tadpoles. J. Neurophysiol. 102 (1), 399-412 (2009).
