Summary
In dit artikel bespreken we drie hersenen preparaten die worden gebruikt voor het opnemen van de klem van het flard van hele cel om te studeren het retinotectal circuit van Xenopus laevis kikkervisjes. Elk preparaat, met zijn eigen specifieke voordelen, draagt bij aan de experimentele werkwillig van de Xenopus tadpole als een model om te studeren van neurale functie.
Abstract
Het Xenopus tadpole retinotectal circuit, bestaat uit de retinale peesknoopcellen (RGCs) in het oog welk formulier synapses rechtstreeks op de neuronen in de optische tectum, is een populair model om te bestuderen hoe neurale circuits zelf monteren. De mogelijkheid voor het uitvoeren van de gehele cel patch klem opnames van tectal neuronen en naar record regering van Cambodja-opgeroepen antwoorden, beide in vivo of met behulp van een hele hersenen voorbereiding, heeft geleid tot een grote hoeveelheid hoge-resolutie data over de mechanismen die ten grondslag liggen aan een normale , abnormale, circuit vorming en functie. Hier beschrijven we het uitvoeren van de in vivo voorbereiding, de oorspronkelijke hele hersenen voorbereiding, en een meer recent ontwikkelde horizontale hersenen segment voorbereiding voor het verkrijgen van de hele cel patch klem opnames van tectal neuronen. Elk preparaat heeft unieke experimentele voordelen. De in vivo voorbereiding kan de opname van de directe reactie van de tectal neuronen op visuele stimuli geprojecteerd op het oog. De hele hersenen voorbereiding zorgt voor de axonen van de regering van Cambodja worden geactiveerd op een zeer gecontroleerde manier, en de horizontale hersenen segment voorbereiding staat opname uit over alle lagen van de tectum.
Introduction
Het retinotectal circuit is het belangrijke onderdeel van het visuele systeem van amfibieën. Het bestaat uit de RGCs in het oog, die hun axonen aan de optische tectum waar ze synaptic verbindingen met postsynaptisch tectal neuronen vormen uitsteken. Het Xenopus tadpole retinotectal circuit is een populaire developmental model neurale vorming en functie te gaan studeren. Er zijn vele kenmerken van de deze tadpole retinotectal circuit, waardoor zij een krachtige experimentele model1,2,3. Een belangrijke kenmerk, en de focus van dit artikel, is de mogelijkheid voor het uitvoeren van hele cel patch klem opnames vanaf tectal neuronen, in vivo of met behulp van de voorbereiding van een hele hersenen. Met een electrofysiologie tuig uitgerust met een versterker die ondersteuning biedt voor spanning - en stroom-clamp opnamefuncties, toestaan hele cel patch klem opnames van een neuron electrofysiologie te worden gekenmerkt op hoge resolutie. Dientengevolge, hebben hele cel patch klem opnames van tectal neuronen in de belangrijkste stadia van retinotectal circuit vorming verstrekt een gedetailleerde en uitgebreide kennis van de ontwikkeling en plasticiteit van intrinsieke4,5 , 6 , 7 en synaptische8,9,10,11 eigenschappen. Het combineren van hele cel patch klem tectal neuron opnamen, de mogelijkheid om uit te drukken van genen of morpholinos van belang in deze neuronen12, en een methode om te beoordelen van visuele rondleiding gedrag via een gevestigde visuele vermijden test13 bevordert de identificatie van de banden tussen moleculen, circuit functie, en gedrag.
Het is belangrijk op te merken dat het type van hoge resolutie, verkregen uit hele cel patch-clamp opnamen gegevens niet mogelijk met behulp van de nieuwere imaging benaderingen zoals de genetische calcium indicator GCaMP6, is omdat hoewel calcium indicatoren de beeldvorming toelaat van calcium dynamiek in grote populaties van neuronen tegelijkertijd, er is geen directe of voor de hand liggende manier waarop de specifieke elektrische parameters kunnen worden verkregen door het meten van delta fluorescentie in de waarin, en er geen manier om spanning is klem het neuron om te meten stroom-spanning-relaties. Duidelijk deze twee verschillende benaderingen, elektrofysiologische opnames en calcium imaging, niet-overlappende troeven bezitten en genereren van verschillende typen gegevens. De beste aanpak hangt dus af van de specifieke experimentele vraag aangepakt.
Hier beschrijven we onze werkwijze voor het verkrijgen van de hele cel patch klem opnames van neuronen van de tadpole optic tectum met behulp van een in vivo voorbereiding, hele hersenen voorbereiding, en een nieuwere bewerkt hele hersenen voorbereiding die is ontwikkeld in ons lab14 . In de sectie vertegenwoordiger resultaten tonen we de experimentele voordelen van elk preparaat en de verschillende soorten gegevens die kan worden verkregen. De grenzen en de sterke punten van de verschillende preparaten, alsmede tips voor het oplossen van problemen, zijn opgenomen in de sectie discussie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van de Universiteit van Wyoming. Alle procedures, met inbegrip van elektrofysiologische opnames, worden uitgevoerd bij kamertemperatuur, ongeveer 23 ° C. Alle methoden die hier worden beschreven zijn geoptimaliseerd voor het opnemen van de tectal neuronen van kikkervisjes tussen ontwikkelingsstadium 42 en 49 (geënsceneerd volgens Neiuwkoop en Faber15).
1. in Vivo voorbereiding
- Anesthetize de tadpole.
- Plaats de tadpole in een kleine petrischaal met Steinberg's oplossing met 0,01% MS-222 voor ongeveer 5 min.
Opmerking: MS-222 aka "tricaïne" is een gemeenschappelijk vissen en amfibieën verdoving. De kikkervisjes zijn opgegroeid in de Steinberg's oplossing in mM: 0.067 KCl, 0.034 Ca (3)2•4H2O, 0.083 MgSO4•7H2O, 5.8 NaCl, 4.9 HEPES. - Zorg ervoor de tadpole diep verdoofde (niet-reagerende en langer zwemmen) voordat u verdergaat met stap 2.
- Plaats de tadpole in een kleine petrischaal met Steinberg's oplossing met 0,01% MS-222 voor ongeveer 5 min.
- Beveilig de narcose tadpole naar een blok van de ondergedompelde silicone op de verdieping van de schotel ontleden/opname.
- Gebruik een pipet wegwerp overdracht om het verdoofde tadpole naar een dissectie/opname schotel met externe opnameoplossing (115 mM van NaCl, KCl, 2 mM 3 mM CaCl,2, 3 mM MgCl2, 5 mM HEPES, 1 mM van glucose; Breng pH op met behulp van de 7,25 10 N van NaOH, osmolariteit 255 mOsm).
- Om te minimaliseren van spontane spier twitches, voeg de acetylcholine receptor blocker, tubocurarine (100 µM) aan de externe-oplossing. (Meestal wordt dit gedaan met behulp van een 200 µL Pipetteer 100 µL van een 10 mM tubocurarine voorraad aan 10 mL externe oplossing toevoegen).
- Met behulp van insect pins, veilig de tadpole, dorsale zijde, naar een verzonken blok van silicone-elastomeer (Zie Materialen tabel voor details zoals 184 van Sylgard), die heeft zijn gelijmd aan de vloer schotel ontleden.
Opmerking: De plaatsing van de pennen is van cruciaal belang: plaats ze aan weerszijden van de hersenen, voldoende caudal om te voorkomen dat de afferent axonen van de regering van Cambodja spietsen dat project uit het oog en de hersenen net anterior to de optische tectum (Figuur 1A) invoeren.
- Gebruik een pipet wegwerp overdracht om het verdoofde tadpole naar een dissectie/opname schotel met externe opnameoplossing (115 mM van NaCl, KCl, 2 mM 3 mM CaCl,2, 3 mM MgCl2, 5 mM HEPES, 1 mM van glucose; Breng pH op met behulp van de 7,25 10 N van NaOH, osmolariteit 255 mOsm).
- Filet de hersenen langs de middellijn.
- Voor een duidelijke weergave van de hersenen, verwijder de huid over de hersenen door het maken van een oppervlakkige incisie langs de middellijn met behulp van een steriele naald 25-G.
- Filet pur de hersenen langs dezelfde middellijn as door het invoegen van de naald in de neurale buis en zachtjes naar boven trekken (dorsally) zodanig dat het dorsale gedeelte van de buis wordt netjes gesneden (afgehakte) terwijl het verlaten van de vloerplaat intact (Figuur 1B).
Opmerking: Het is belangrijk dat de vloerplaat van de neurale buis intact gelaten worden omdat de afferent sensorische input Voer de tectum via vloerplaat.
- Verwijder de doorzichtige ventriculaire membraan dat betrekking heeft op de tectal neuronen.
- De opname-schotel naar de elektrofysiologie rig en een gebroken glas Pipetteer tip gebruiken om het ventriculaire membraan overliggende het tectal neuron cel organen. Breken de tip door het licht over een delicate taak wisser te slepen.
- Schroef de pipet in de pipet houder en lager tot de optische tectum via de micromanipulator.
- Gebruik de gebroken pipet om schil de ventriculaire membraan uit de buurt van de tectum.
Opmerking: Het is niet nodig om het membraan van de gehele tectum; een klein venster zal volstaan en bieden toegang tot tal van neuronen.
- Het verkrijgen van de hele cel patch klem opnames.
Opmerking: De aanpak van dit punt naar voren is vergelijkbaar met het uitvoeren van hele cel patch klem opnames van muis hersenen segmenten, zoals beschreven in Segev, et al. 16 (Figuur 1C). - Het opnemen van het tectal neuron reacties op een heel veld lichtflits op het netvlies geprojecteerd.
- Om een heel veld lichtflits projecteren op het netvlies, plaatst u een optische vezel grenzend aan de de tadpole oog. Op het andere uiteinde van de optische vezel is een LED in overeenstemming met een variabele weerstand die het mogelijk maakt voor de lichte luminantie worden gecontroleerd. Trigger de LED door de digitale uitgang van de versterker. Op deze manier hele veld flitsen van verschillende intensiteiten van licht kunnen worden opgenomen (Figuur 4A)
2. de whole Brain voorbereiding
- Voer stap 1.1 tot en met 1.3.
Opmerking: Er is geen behoefte tubocurarine in de externe oplossing voor deze voorbereiding. - Isoleren van de hersenen.
- Gebruik een 25-G naald te verbreken van de hindbrain(Figuur 2).
- Om te isoleren van het hele brein van de tadpole, lopen voorzichtig de naald onder de hersenen, in een caudal-naar-rostraal richting te verbreken alle laterale en ventrale bindweefsel en zenuwvezels.
- Beveilig de hersenen naar een blok van silicone-elastomeer.
- Zodra volledig bevrijd, beveiligde de hersenen naar een blok van silicium elastomeer door het plaatsen van een pincode via een van de bulbus bollen en een andere pincode via het hindbrain (Figuur 2B). Dit is de optimale configuratie voor opnemen vanaf de tectal neuronen.
- Verplaats de schotel met de voorbereiding van de vastgezette hele hersenen buiten de ontleden om de elektrofysiologie tuig. Verwijder de ventriculaire membraan met behulp van een precisiepipet gebroken glas zoals beschreven in stap 1.4.
- Plaats een bipolaire stimulerende elektrode op de optic opticum (waar de axon traktaten uit elk van beide ogen kruisen op de veroorzaakt) als u wilt direct activeren de axonen van de regering van Cambodja.
- Plaats de bipolaire stimulerende elektrode rostraal en bijna grenzend aan, de grote middelste ventrikel. De optische opticum ligt onmiddellijk rostraal van de grote middelste ventrikel (Figuur 2B).
- Zachtjes lager het stimulerende elektrode naar beneden op de optic opticum zodanig dat een kleine deuk wordt gevormd in het weefsel. De bipolaire elektrode wordt gedreven door een pulse stimulator waarmee de kracht van de stimulatie juist worden gecontroleerd.
- Plaats de bipolaire stimulerende elektrode rostraal en bijna grenzend aan, de grote middelste ventrikel. De optische opticum ligt onmiddellijk rostraal van de grote middelste ventrikel (Figuur 2B).
- Voert u de hele cel patch klem opname (Figuur 2C) zoals beschreven door Segev, et al.. 16
3. horizontale Brain Slice voorbereiding
- Voer stap 2.1 tot 2.3.
- Gebruik een scheermesje de meest laterale vierde (welke in vivo correspondeert met de meest dorsale vierde) van de ene kant van een optische tectum accijnzen. Deze verlaging is evenwijdig aan de rostraal-caudal vlak zoals aangegeven in Figuur 3Agemaakt.
- Opnieuw vastzetten van de hersenen naar de kant van de silicone-elastomeer met de gesneden kant naar boven (zodat de waarin en de neuropil kunnen rechtstreeks worden benaderd voor opname) en de ventriculaire oppervlak van de hersenen geconfronteerd weg van de silicone-elastomeer blok (Figuur 3 B) (zodat een bipolaire elektrode kan worden geplaatst op de optic opticum).
- Voert u de hele cel patch klem of lokale gearchiveerde potentiële opname (Figuur 3C) zoals beschreven door Segev, et al.. 16
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Als u wilt opnemen van licht-opgeroepen reacties wordt een hele veld lichtflits geprojecteerd op het netvlies terwijl de resulterende reactie van individuele tectal neuronen (Figuur 4A) wordt geregistreerd. Dit bijzondere protocol is bedoeld voor het meten van zowel de reactie van het neuron aan het licht het op ("On" reactie) en vervolgens uitschakelen 15 s later voor het meten van de "Off reactie." Tectal neuronen vertonen meestal solide aan en uit de reacties (getoond hier opgenomen in spanning klem modus, met het neuron vastgeklemd zit op - 60mV voor het meten van synaptic huidige (Figuur 4B)). Het bedrag van synaptic station ontvangen door elke een neuron kan worden gekwantificeerd door de opname van de spontane synaptic gebeurtenissen (Figuur 4C). Stroom-spanning relaties (I-V curven) kunnen worden gegenereerd op basis van de dezelfde neuron door intensivering van het neuron om steeds meer depolarized potentieel en opname van de resulterende spanning-geactiveerde nb+ en K+ stromingen, hierna "gemengd huidige opnames' (Figuur 4D, E). Het is al goed ingeburgerd dat voor deze amfibieën neuronen, piek nb+ en K+ stromingen kunnen worden gekwantificeerd via gemengde huidige opnamen omdat de pieken niet stoffelijk met elkaar4,7 overlappen.
Directe activering van de regering van Cambodja axonen op de optic opticum mijdt alle upstream berekening en verwerking van visuele stimuli die in het oog plaatsvinden, en zorgt voor het bestuderen van de synaptische transmissie tussen presynaptische axonen van de regering van Cambodja en postsynaptisch tectal neuronen in haar meest zuivere en gereduceerde vorm. Tectal neuron reacties op activering van de regering van Cambodja zijn gegenereerd op basis van RGCs gestimuleerd door licht of direct met behulp van een bipolaire stimulerende elektrode, die bestaat uit twee componenten: een monosynaptic component (de directe synaptic inbreng van geactiveerde RGCs) en een polysynaptic component (het lokale netwerk van de terugkerende activiteit voederen terug op het neuron wordt opgenomen). In het geval van de lichte evoked respons overlappen de monosynaptic en polysynaptic componenten met elkaar door een onbepaald bedrag. Deze tijdelijke overlapping beperkt wat over synaptische transmissie tussen het netvlies en optische tectum kan worden geconcludeerd. Met behulp van een hele hersenen preparaat en het activeren van de regering van Cambodja axon darmkanaal rechtstreeks via een elektrode geplaatst op de optic opticum (Figuur 5A), echter, produceert een mono- en polysynaptic onderdeel dat zijn in wezen niet-overlappende tijdig. De stimulerende kracht van de bipolaire elektrode kan worden aangepast. Zoals de stimulerende kracht wordt verhoogd, is er een groter aantal regering van Cambodja axonen geactiveerd (Figuur 5B). Een minimale stimulatie-protocol bepaalt de synaptische sterkte van een individuele axon van de regering van Cambodja op een individuele tectal neuron; een maximale stimulatie protocol weerspiegelt de totale, of maximale, synaptic input van alle de regering van Cambodja axonen gecombineerd (Figuur 5C). De juiste verhouding van excitatory naar remmende synaptic input (E: ik verhouding) door een individu ontvangen tectal neuron is essentieel voor normale visuele functie18. Figuur 5 D ziet u een voorbeeld van de regering van Cambodja-opgeroepen excitatory en remmende huidige sporen opgenomen van een individuele tectal neuron. De kans op het vrijkomen van de zender uit de regering van Cambodja presynaptische axon terminals wordt gemeten door gepaarde pulse recordings. Hiervoor is het postsynaptisch tectal neuron opgenomen in de modus van de klem spanning voor het meten van synaptic stromingen, terwijl de regering van Cambodja axonen worden achtereenvolgens geactiveerd gescheiden door een tijdsinterval van 50 ms (Figuur 5E).
Hele cel patch klem opnames kunnen worden uitgevoerd vanuit de tectal neuronen die woonachtig zijn in een somatische laag. Gelijkaardig aan de voorbereiding van de hele hersenen, regering van Cambodja axonen kunnen worden geactiveerd door het plaatsen van een opname van de bipolaire elektrode op de optic opticum (Figuur 6A). Alle opnamen uitgevoerd in de hele hersenen voorbereiding kunnen ook worden uitgevoerd met behulp van deze horizontale hersenen segment voorbereiding. Figuur 6 B toont een voorbeeld spoor van een regering van Cambodja-opgeroepen reactie opgenomen van een neuron in de oppervlakkige laag. Deze voorbereiding voorziet ook in het ruimtelijk patroon van synaptic input van de regering van Cambodja op de tectal dendrites te meten. Voor dit veld van de regering van Cambodja-evoked potentials zijn opgenomen elke 10 µm langs de mediale-laterale as (dat wil zeggen, de distale-proximale as) van het neuropil (Figuur 6C). Dit genereert een high-resolution Profiel van het patroon van functionele input van de regering van Cambodja. Het veld potentieel kunnen vervolgens worden omgezet in de huidige bron dichtheden door het berekenen van de tweede ruimtelijke afgeleide14 en de huidige bron dichtheden op zijn beurt kunnen worden omgezet in een afbeelding plot. De plot van de afbeelding in Figuur 6C toont dat de sterkste inbreng van de regering van Cambodja richt zich op het meer distale gebied van de neuropil.
Figuur 1. In vivo voorbereiding procedures. (A) Tadpole gespeld neer op een stuk van silicone-elastomeer. Pinnen zijn aangegeven door de witte pijlen. Opmerking de meer caudal pin positionering om te voorkomen dat de optische traktaten spietsen. De witte onderbroken lijn geeft de middellijn. (B) Zoomed-in weergave van de gehele hersenen na snijden langs de dorsale middellijn en verwijderen van overlay huid. (C) geheel-cel patch-clamp opname in vivo. (L: laterale. M: mediale. A: rostraal. C: caudal. D: dorsale. V: de ventrale. OB: bulbus olfactorius. OT: Optische Tectum. HB: Hindbrain). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 . Hele brain voorbereiding procedures. (A) na de hersenen wordt gefileerd langs de middellijn, de hindbrain is verbroken. (B) de gehele hersenen is ontleed uit en gespeld neer aan de silicone-elastomeer. Het witte sterretje geeft aan dat de pin in de linker bulbus olfactorius. Het rode kader geeft aan het middelste derde van de tectum, dat wil zeggen, het doelgebied voor opname. (C) hele cel patch klem met opname van de hele hersenen voorbereiding. Het zwarte sterretje geeft het gebied van door de VN geschraapt ventriculaire membraan waar cellen niet toegankelijk voor opname. Wanneer het membraan met succes is verwijderd, verschijnen de waarin duidelijker worden en gedefinieerd. De pijl geeft een ongezonde neuron. (PZ: proliferatieve Zone. LMV: Grote mediale ventrikel. OB: bulbus olfactorius. OT: Optische Tectum. HB: Hindbrain. L: lateraal. M: mediale. A: rostraal. C: caudal. D: dorsale. V: ventrale). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 . Horizontale hersenen segment voorbereiding procedures. (A) het meest laterale gedeelte van één zijde van de optische tectum zal worden gesneden (aangegeven door de gestippelde lijn) na hele hersenen voorbereiding. (B) horizontale hersenen segment preparaat na wordt gespeld naar beneden naar de kant van de silicone-elastomeer. Dubbele witte lijnen geven een stimulerende elektrode geplaatst op de optic opticum. (C) Zoomed-in uitzicht op het soma lagen en neuropil met behulp van een horizontale hersenen segment voorbereiding. Onderbroken curve geeft aan de grens tussen soma lagen en neuropil. Dit cijfer is gewijzigd van Hamodi, et al.. 14 (L: laterale. M: mediale. A: rostraal. C: caudal. D: dorsale. V: de ventrale. OB: bulbus olfactorius. OC: Optic opticum. OT: Optische Tectum. HB: Hindbrain). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 . Opnames van de voorbereiding van een in vivo . (A) schema toont de typische configuratie van een in vivo -opname. (B) licht opgeroepen reacties, met inbegrip van licht op en licht uit reacties. Inzet sporen zijn in-of uitgezoomd-in weergave van op - en af-response, respectievelijk. (C) spontane excitatory postsynaptisch stromingen opgenomen. (D) nb+ en K+ stromingen in reactie op spanning klem stappen van -60 mV tot 30 mV van een enkel neuron. (E) IV Staanplaatsen gegenereerd op basis van sporen in (D). Alle opnamen werden gedaan met het neuron gehouden op -60 mV behalve in (D) voor het genereren van IV-percelen; neuronen zijn stapte om steeds meer depolarized mogelijkheden, in stappen van 10 mV, spanning-afhankelijke stromingen te activeren. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5 . Opnames van de voorbereiding van een hele hersenen. (A) schema toont de typische configuratie van hele hersenen opname met inbegrip van een stimulerende elektrode geplaatst op de optic opticum (groene en rode lijnen geven de regering van Cambodja axonen). (B) overlay sporen van de regering van Cambodja reacties op veranderingen in de regering van Cambodja stimulatie sterkte. (C) maximale stimulatie respons (links) en minimale stimulatie reactie (rechts). (D) een regering van Cambodja-opgeroepen excitatory en remmende reactie op een enkel neuron. (E) gepaarde pulse versoepeling van de regering van Cambodja-evoked respons van een individuele neuron. (OB: bulbus olfactorius. OC: Optic opticum. OT: Optische Tectum). Alle opnamen werden gedaan met het neuron gehouden op -60 mV behalve in (D) voor het meten van de excitatory en remmende ingangen: de excitatory input wordt opgenomen door het neuron op het potentieel van de omkering van Gamma-aminoboterzuur (GABA)-gemedieerde chloride stromingen (-45 mv); de remmende input door het neuron op het potentieel van de omkering van α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic zuur (AMPA)-gemedieerde stromingen (+ 5 mv). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6 . Opnames van een horizontale hersenen slice voorbereiding. (A) schema toont de configuratie van een horizontale hersenen segment preparaat. Merk op dat hoewel de stimulerende elektrode op de optic opticum blijft, de opname Pipet is nu gepositioneerd om toegang cellen over alle tectal lagen blootgesteld door de horizontale hersenen segment voorbereiding. (B) een reactie van de regering van Cambodja van een neuron die woonachtig zijn in de oppervlakkige laag van de tectum. (C) veld potentieel over de neuropil en de geconverteerde huidige bron dichtheden (centrale effectenbewaarinstellingen) blijkt uit beeldkaarten perceel warmte opgenomen. (OC: Optic opticum. OT: Optische Tectum. HB: Hindbrain). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Alle methoden die worden beschreven in dit werk zijn geoptimaliseerd voor het opnemen van de tectal neuronen van kikkervisjes tussen ontwikkelingsstadium 42 en 49 (geënsceneerd volgens Neiuwkoop en Faber15). Door stage 42, de kikkervisjes zijn groot genoeg en voldoende ontwikkeld, zodat de insecten pinnen aan weerszijden van de hersenen voor in vivo opnames en voor het uitvoeren van de gehele hersendissectie kunnen worden geplaatst. In eerdere stadia, wanneer de kikkervisjes in wezen twee-dimensionale zijn (d.w.z., plat), de benaderingen die hier worden beschreven zijn niet optimaal.
Als gevolg van het gemak waarop tectal neuronen kunnen worden benaderd en opgenomen in de configuratie van de hele cel, is dit model circuit een broeinest voor fundamentele ontdekkingen over hoe neurale circuits vorm terwijl werking- en functie terwijl de vorming van19. Hier hebben we beschreven hoe te verwerven van de hele cel patch klem opnames van tectal neuronen, met inbegrip van het uitvoeren van de tadpole in vivo en hele hersenen preparaten, de verschillende opname-configuraties en voorbeelden van de verschillende soorten gegevens. Het volgende is een bespreking van de sterke punten en beperkingen van elk preparaat, gevolgd door tips voor het bereiken van kwalitatief hoogwaardige hele cel opnames.
Xenopus kikkervisjes beginnen weer te geven van visuele vermijden gedrag door stage 47/48, ongeveer 7-8 dagen na bevruchting3,13. Dit betekent dat zelfs in deze relatief vroege stadia van ontwikkeling, het retinotectal circuit functionerende en geschikt voor verwerking van visuele stimuli. Fundamentele vraagstukken met betrekking tot de ontwikkeling en plasticiteit van het circuit van retinotectal werden direct aangepakt met behulp van de voorbereiding in vivo opnemen tectal neuron reacties op visuele stimuli op het netvlies geprojecteerd. In vivo opnamen in de tadpole zijn relatief eenvoudig vergeleken met de configuratie van de gelijkwaardige opname in zoogdieren als gevolg van de relatieve eenvoud van het zenuwstelsel en het ontbreken van een schedel. Omdat individuele tectal neuron Soma kan gevisualiseerde in vivo, is afdichten op een bepaalde neuron en het bereiken van de hele cel patch klem opname configuratie in wezen gelijkwaardig zijn aan de uitvoering van de gehele cel patch klem opnemen in knaagdier segment preparaten. Kikkervisjes overleven meestal gedurende enkele uren op het tuig (die kan worden gemakkelijk beoordeeld door monitoring van de hartslag). Een beperking die inherent zijn aan de tadpole in vivo voorbereiding is dat alleen tectal neuronen die woonachtig zijn in de diepe somatische laag van de optische tectum, de laag die direct grenst aan de grote middelste ventrikel, toegankelijk zijn voor het opnemen van de (Figuur 1 ). Dit betekent dat de tectal neuronen die woonachtig zijn in de somatische buitenlagen van de tectum grotendeels onontgonnen zijn geweest in vivo.
Het experimentele voordeel van de hele hersenen voorbereiding is dat het de hersenen van de perifere zintuigelijke receptoren in de ogen en de huid, het elimineren van alle onechte zintuiglijke gestuurde activiteiten isoleert. Terwijl niet langer geschikt voor verdreven door visuele stimuli, de regering van Cambodja axonale ingangen die gericht zijn op de tectum zijn nog steeds aanwezig in de hele hersenen voorbereiding en ze direct kunnen worden geactiveerd op een zeer gecontroleerde manier via een bipolaire stimulerende elektrode (FHC) geplaatst op de optische opticum waar de twee sets van de regering van Cambodja axon traktaten Voer voor de hersenen. De eerste gemelde gebruik van de hele hersenen voorbereiding was in 1996, in een belangrijke studie van Wu et al. 8, in de axonen van welke regering van Cambodja zijn geactiveerd met behulp van een bipolaire stimulerende elektrode zodat de auteurs de sterkte van individuele axonen van de regering van Cambodja op postsynaptisch tectal neuronen kunnen kwantificeren en daarbij dus fundamentele ontdekkingen gedaan over de voortgang van Synaps rijping. Net als bij de voorbereiding in vivo , biedt de hele hersenen voorbereiding toegang tot alleen die neuronen die woonachtig zijn in de diepe laag, grenzend aan de ventriculaire membraan.
Hoewel de optische tectum uit ongeveer negen cel lichaam lagen17 bestaat, alle eerdere electrofysiologie studies hebben gericht op de diepe laag tectal neuronen, omdat de traditionele hele hersenen en in vivo preparaten (beschreven Laat alleen toegang tot de neuronen van de diepe laag boven). Om de tectal neuronen dan benaderen via alle somatische lagen, van de diepste tot de meest oppervlakkige evenals de hele neuropil, waar de regering van Cambodja axonen synaptic verbindingen met tectal neuron dendrites vormen, ontwikkelden we een gemodificeerde hele hersenen voorbereiding, hierna aangeduid als "de horizontale hersenen segment voorbereiding"(Figuur 314). Net als bij de voorbereiding van de hele hersenen, de horizontale hersenen segment voorbereiding onderhoudt de axonen van de regering van Cambodja in de hersenen en ze kunnen worden gecontroleerd door het plaatsen van een bipolaire stimulerende elektrode op de optic opticum.
Globaal, de voorbereidingen zijn ontworpen om visualisatie van en toegang tot tectal neuron waarin voor het uitvoeren van de gehele cel patch klem opname te optimaliseren. Directe toegang tot het soma is essentieel voor de opnamen van de klem van de patch van kwaliteit hele cel: toegang tot de binnenkant van het neuron vereist de vorming van een zeer sterke (> 1 × 109 Ω) afdichting tussen de pipet en van het neuron plasmamembraan, waarvoor directe contact van het uiteinde van de pipet op die membraan. Vandaar, voldoende verwijdering van het ventriculaire membraan is sleutel tot succesvolle opname. Sleutel voor succesvolle regering van Cambodja-opgeroepen opnames is ook de juiste plaatsing van de elektrode bipolaire stimulerend op de optic opticum. In wezen alle tectal neuronen ontvangen directe synaptic input in de axonen van de regering van Cambodja. Indien geen reactie regering van Cambodja-opgeroepen wordt waargenomen, dan is dit waarschijnlijk te wijten aan onjuiste plaatsing van de bipolaire elektrode zodanig dat het niet op de optische opticum en geen contact met de optische zenuwen. Dit kan worden gecorrigeerd door simpelweg de stimulerende elektrode re-positionering. Niet-naleving van reacties van de regering van Cambodja-opgeroepen na de bipolaire elektrode re-positionering zou kunnen dat betekenen de regering van Cambodja axon projectie werd per ongeluk verbroken tijdens de dissectie. In dit geval is het nodig om opnieuw te beginnen met een nieuw preparaat. Ten slotte zou niet-naleving van een regering van Cambodja-evoked respons als gevolg van de opname van een cel die is niet een gemeenschappelijk tectal neuron. Bijvoorbeeld, glia meestal niet de normale regering van Cambodja-opgeroepen monosynaptic reactie weergegeven door de tectal neuronen weergegeven, en ook niet de grote mesencephalic neuronen die zijn gevonden, zij het op een zeer lage aantallen, die woonachtig zijn in de optische tectum20. De kans op opname van een van deze niet-tectal cellen is erg laag als gevolg van het grote aantal tectal neuronen. Kwaliteit opnames vereist natuurlijk, ook de tectal neuronen gezond. Kenmerken van een gezonde tectal neuron zijn een compacte ronde of ovale soma thats lichtgekleurde en zonder vlekken. Zodra de configuratie van de opname van de hele cel is bereikt, kan de gezondheid van het neuron verder worden geëvalueerd op het elektrofysiologische niveau door het meten van de fundamentele elektrische eigenschappen zoals rusten membraanpotentiaal, input weerstand en capaciteit . De rustpotentiaal membraan van gezonde tectal neuronen tussen ontwikkelingsstadia 42 en 49 is ongeveer-45 mV, met een gemiddelde input weerstand van ongeveer 1 GΩ, en een capaciteit van 10-12 pF3,4,5. Een klein deel van neuronen zal onvermijdelijk worden beschadigd als gevolg van de opheffing van de ventriculaire membraan. De waarin van beschadigde of ongezonde neuronen er korrelig uitzien, opgeblazen, of verschrompeld. Een voorbeeld van een ongezonde neuron wordt weergegeven Figuur 2C. Als de meerderheid van de neuronen ongezond weergegeven, zou dit een weerspiegeling die er iets mis met de opname van externe bron oplossing, is zodat het Word geadviseerd te halen van de verse externe opnameoplossing. Naast het verschijnen gezond, zijn de beste neuronen voor opname meestal geassocieerd met een groot aantal andere neuronen, in tegenstelling tot een afgezonderd. Ook kiest u cellen die gemakkelijk toegankelijk zijn. Bijvoorbeeld, niet duwen het weefsel te moeilijk toegang krijgen tot een cel omdat dit kan schade aan het weefsel of verplaatsen van het weefsel en dus de stimulerende elektrode misplaatst verschuiven. Ten slotte moeten opnamen worden beperkt tot het middelste derde van de tectum (Figuur 2B) om te voorkomen dat mogelijke verschillen als gevolg van de ontwikkelingstoxiciteit verloop dat in de rostro-caudal as4,8 bestaat, tenzij, natuurlijk, is de focus van het experiment de bovengenoemde developmental verloop. De juiste tectum is het gebied rostraal van de proliferatieve zone en caudal aan de zitbeenknobbel van grote middelste ventrikel.
De hele cel patch klem opname techniek is niet zonder haar beperkingen. In het algemeen, omvat deze stijl van opname een neuron op een moment opname. Dit is in tegenstelling tot methoden waarbij beeldvorming van een nieuwe generatie GCaMP6 calcium indicatoren, waarmee voor de activiteit van grote populaties van neuronen worden gelijktijdig beeld in een segment voorbereiding en in vivo.
Een ander nadeel die inherent zijn aan de hele cel spanning klem opnamen is de ruimte klem fout (de onmogelijkheid om te regelen van de spanning veel verder dan het soma), die temporele controle van spanning4 beperkt. Globaal, is deze spanning klem kwesties zijn minimaal bij het opnemen van tectal neuronen echter vanwege hun geringe oppervlakte, bescheiden dendritische arborizations en relatief klein en traag stromingen in vergelijking met zoogdieren neuronen. Deze kenmerken van tectal neuronen, waardoor ze bijzonder vatbaar voor spanning klem opname, meting van vele parameters, en de bouw van profielen voor individuele neuronen5,6.
Toekomstige richtingen omvatten het optimaliseren van een in vivo horizontale hersenen segment voorbereiding te karakteriseren van de functie van buitenlaag neuronen in het verwerken van visuele stimuli.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Ondersteund door de NIH-subsidie SBC COBRE 1P20GM121310-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stemi Stereo 508 | Zeiss | 495009-0006-000 | Dissecting microscope |
| MS-222 "Tricane" | Finquel | ARF5G | Amphibian general anesthetic |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-3 | Used to prepare Stienberg's solution and external solution |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | P217-500 | Used to prepare Stienberg's solution and external solution |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-1KG | Used to prepare Stienberg's solution and external solution |
| Calcium nitrate tetrahyrate (Ca(NO3)•4H2O) | Sigma-Aldrich | 237124-500G | Used to prepare Stienberg's solution |
| Magnesium Sulfate (MgSO4) | Mallinckrodt Chemicals | 6066-04 | Used to prepare Steinberg's solution |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5080-500G | Used to prepare external recording solution |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | J.T. Baker | 2444-01 | Used to prepare external recording solution |
| D-glucose Anhydrous | Mallinckrodt Chemicals | 6066-04 | Used to prepare external recording solution |
| Tubocurarine hydrochloride pentahydrate | Sigma | T2379 | Nicotinic acetylcholine receptor antagonist |
| Insect Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | 0.1mm diameter stainless steel pins |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 761028 | Preweighed monomer and curing agent kit |
| Sterile Polystyrene Petri Dish - 60x15mm | Fisher Scientific | AS4052 | Small petri dishes |
| PrecisionGlide Needle 25Gx5/8 (.0.5mm X 16mm) | BD | 305122 | Syringe needles |
| 1mL Slip Tip Tuberculin Syringe | BD | 309659 | Disposable, sterile syringes |
| Borosilicate pipette glass | Sutter Instrument | BF150-86-10HP | Pulled to desired specifications using pipette pulling machine |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | Fabricates micropipettes for electrophysiology recording |
| Kimwipes Kimtech wipes | Kimberly-Clark | 34120 | Delicate task lint-free wipers |
| Axon Instruments MultiClamp 700B Headstage CV-7B | Molecular Devices | 1-CV-7B | Current clamp and voltage clamp headstage |
| MP-285 Motorized Manipulator with Tabletop Controller | Sutter Instrument | MP-285/T | Control for headstage on electrophysiology rig |
| Fiber-Coupled LED (Green) | Thorlabs | M530F2 | Fiber optic cable paired with green LED |
| Cluster Bipolar Electrode (25µm diameter) | FHC | 30207 | Bipolar stimulating electrode |
| ISO-Flex Stimulator | A.M.P.I. (Israel) | Contact manufacturer | Flexible stimulus isolator |
| Axon Instruments 700B Multipatch Amplifier | Molecular Devices | 2500-0157 | Amplifier for voltage- and current-clamp recording |
| Digidata 1322A digitizer | Molecular Devices | 2500-135 | Data acquisition system for electrophysiology recording |
| Axio Examiner.A1 | Zeiss | 491404-0001-000 | Microscope for electrophysiology |
| Micro-g Lab Table | TMC | 63-533 | Air table for electrophysiology microscope |
| Inspiron 620 Personal Desktop Computer with Windows 7 64-bit | Dell | D06D001 | Computer running electrophysiology software |
| c2400 CCD camera | Hamamatsu | 70826-5 | Charge-coupled device camera for electrophysiology imaging |
| 7 O'Clock Super Platinum Stainless Razorblades | Gillette | CMM01049 | Platinum-coated stainless razor blades |
| Transfer Pipets | Fisher Scientific | 13-711-7M | Disposable Polyethylene transfer pipets |
References
- Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets. Dis. Model Mech. 6, 1057-1065 (2013).
- Pratt, K. G. Finding Order in Human Neurological Disorder Using a Tadpole. Curr. Pathobio. Rep. 3 (2), 129-136 (2015).
- Liu, Z., Hamodi, A. S., Pratt, K. G. Early development and function of the Xenopus tadpole retinotectal circuit. Curr. Opin. Neurobiol. 41, 17-23 (2016).
- Hamodi, A. S., Pratt, K. G. Region-specific regulation of voltage-gated intrinsic currents in the developing optic tectum of the Xenopus tadpole. J. Neurophysiol. 112 (7), 1644-1655 (2014).
- Pratt, K. G., Aizenman, C. D. Homeostatic regulation of intrinsic excitability and synaptic transmission in a developing visual circuit. J. Neurosci. 27 (31), 8268-8277 (2007).
- Cialeglio, C. M., Khakhalin, A. S., Wang, A. F., Constantino, A. C., Yip, S. P., Aizenman, C. D. Multivariate analysis of electrophysiological diversity of Xenopus visual neurons during development and plasticity. Elife. 4, 11351 (2015).
- Aizenman, C. D., Akerman, C. J., Jensen, K. R., Cline, H. T. Visually driven regulation of intrinsic neuronal excitability improves stimulus detection in vivo. Neuron. 39 (5), 831-842 (2003).
- Wu, G., Malinow, R. Cline H.T. of a central glutamatergic synapse. Science. , 972-976 (1996).
- Van Rheed, J. J., Richards, B. A., Akerman, C. J. Sensory-evoked spiking behavior emerges via an experience-dependent plasticity mechanism. Neuron. 87 (5), 1050-1060 (2015).
- Schwartz, N., Schohl, A., Ruthazer, E. S. Activity-dependent transcription of BDNF enhances visual acuity during development. Neuron. 70 (3), 455-467 (2011).
- Zhang, L. I., Tao, H. W., Holt, C. E., Harris, W. A., Poo, M. A critical window for cooperation and competition among developing retinotectal synapses. Nature. 395 (6697), 37-44 (1998).
- Hewapathirane, D. S., Haas, K. Single cell electroporation in vivo within the intact developing brain. J. Vis. Exp. (17), e705 (2008).
- Dong, W., et al. Visual avoidance in Xenopus tadpoles is correlated with the maturation of visual responses in the optic tectum. J. Neurophysiol. 101 (2), 803-815 (2009).
- Hamodi, A. S., Pratt, K. G. The horizontal brain slice preparation: a novel approach for visualizing and recording from all layers of the tadpole tectum. J. Neurophysiol. 113 (1), 400-407 (2015).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , Garland. New York. (1994).
- Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices. J. Vis. Exp. (112), e54024 (2016).
- Muldal, A. M., Lillicrap, T. P., Richards, B. A., Akerman, C. J. Clonal Relationships Impact Neuronal Tuning within a Phylogenetically Ancient Vertebrate Brain Structure. Curr. Biol. 24 (16), 1929-1933 (2014).
- Khakhalin, A. S., Koren, D., Gu, J., Xu, H., Aizenman, C. D. Excitation and inhibition in recurrent networks mediate collision avoidance in Xenopus tadpoles. Eur. J. Neurosci. 40 (6), 2948-2962 (2014).
- Ruthazer, E. S., Aizenmann, C. D. Learning to see: patterned visual activity and the development of visual function. Trends Neurosci. 44 (4), 183-192 (2010).
- Pratt, K. G., Aizenman, C. D. Multisensory integration in mesencephalic trigeminal neurons in Xenopus tadpoles. J. Neurophysiol. 102 (1), 399-412 (2009).
