Summary
בנייר זה, נדון שלושה תכשירים המוח משמש עבור כל תיקון קלאמפ הקלטה ללמוד את המעגל retinotectal של ראשנים של צפרדע רפואית זריזה . כל הכנה, עם יתרונות ספציפיים משלה, תורמת ללקוחות שלנו ניסיוני של הראשן צפרדע רפואית כמודל ללמוד תפקוד מעגלים עצביים.
Abstract
המעגל retinotectal של ראשן צפרדע רפואית מורכבת של תאי גנגליון (RGCs) בעיניים איזו תבנית synapses ישירות על גבי נוירונים בריכוזים tectum סיב אופטי, הוא מודל פופולרי ללמוד את המעגלים העצביים איך להתחבר בעצמם. היכולת לבצע כל תא הקלטות מלחציים תיקון הנוירונים tectal ואליהן הרשומה מהרשות לשיקום האסיר-עורר תגובות, גם אין ויוו או באמצעות הכנה כל המוח, יצר גוף גדול של נתונים ברזולוציה גבוהה על המנגנונים שבבסיס נורמלי , חריג, מעגל היווצרות ואת הפונקציה. כאן נתאר כיצד לבצע ויוו ההכנה, הכנת כל המוח המקורי, ופיתח יותר לאחרונה המוח אופקי פרוסה לקראת קבלת התא כולו תיקון קלאמפ הקלטות של נוירונים tectal. בכל אופן ההכנה יתרונות ייחודיים ניסיוני. הכנת ויוו מאפשר ההקלטה של התגובה הישירה של הנוירונים tectal לגירויים חזותיים מוקרנת העין. הכנת כל המוח מאפשר האקסונים מהרשות לשיקום האסיר להיות מופעל בצורה מאוד מבוקרת, הכנת פרוסה אופקי המוח מאפשר הקלטה של-פני כל שכבות של tectum.
Introduction
המעגל retinotectal הוא המרכיב העיקרי של מערכת הראייה דו-חיים. הוא מורכב RGCs בעיניים, אשר פרויקט אקסונים שלהם כדי tectum אופטיים שם הם יוצרים קשרים סינפטיים עם נוירונים tectal postsynaptic. המעגל retinotectal ראשן צפרדע רפואית הוא מודל התפתחותי פופולרי ללמוד מעגלים עצביים היווצרות ותפקוד. ישנן תכונות רבות של מעגל retinotectal של ראשן הזה להפוך אותו דגם ניסיוני עוצמה1,2,3. תכונה אחת הגדולות, המוקד של מאמר זה, היא היכולת לבצע את כל התא תיקון קלאמפ הקלטות הנוירונים tectal, בתוך vivo או באמצעות הכנה כל המוח. עם מתקן קידוח אלקטרופיזיולוגיה לבוש עם מגבר התומך מתח, זרם-להדק מצבי הקלטה, הקלטות מלחציים תיקון כל התא לאפשר אלקטרופיזיולוגיה של נוירון להיות מאופיין ברזולוציה גבוהה. כתוצאה מכך, התא כולו תיקון קלאמפ הקלטות הנוירונים tectal ברחבי השלבים המפתח של היווצרות מעגל retinotectal סיפקו הבנה מפורט ומקיף של ההתפתחות ואת הפלסטיות של מהותי4,5 , 6 , 7 וסינפטית8,9,10,11 נכסים. שילוב כל התא תיקון קלאמפ נוירון tectal הקלטות, היכולת לבטא את הגנים או morpholinos עניין הנוירונים האלה12, שיטה להערכת התנהגות מודרכים חזותי באמצעות בדיקה הימנעות חזותי הוקמה13 מקדמת זיהוי של קישורים בין מולקולות, מעגל פונקציה התנהגות.
חשוב לציין כי הסוג ברזולוציה גבוהה נתונים שנרכשה מן התא כולו תיקון קלאמפ הקלטות אינה אפשרית באמצעות גישות הדמיה חדשות יותר כמו מחוון סידן גנטית GCaMP6, כי למרות באמצעות מחווני סידן מתירה ההדמיה של סידן dynamics על פני אוכלוסיות גדולות של נוירונים בו זמנית, לא ישיר או דרך ברור כי הפרמטרים חשמלי מסוים יכולה להיות מושגת על ידי מדידת קרינה פלואורסצנטית דלתא, somata, אין שום דרך מתח מלחציים נוירון כדי למדוד זרם-מתח מערכות יחסים. ברור אלה שתי גישות שונות, הקלטות אלקטרופיזיולוגיות, סידן הדמיה, בעלי עוצמות שאינם חופפים, ליצור סוגים שונים של נתונים. לפיכך, הגישה הטובה ביותר תלויה השאלה ניסיוני ספציפית נותרים ללא מענה.
כאן, אנו מתארים את השיטה שלנו לרכישת כל התא תיקון קלאמפ הקלטות הנוירונים tectum אופטיים ראשן, שימוש ויוו הכנה, הכנה כל המוח, ושינית וחדש יותר הכנה כל המוח שפותחה במעבדתנו14 . במקטע תוצאות נציג, נדגים את היתרונות ניסיוני של כל הכנה, סוגים שונים של נתונים שניתן להשיג. הגבולות ואת החוזק של תכשירים שונים, כמו גם עצות לפתרון בעיות, כלולים במקטע דיון.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של אוניברסיטת ויומינג. כל ההליכים, כולל הקלטות אלקטרופיזיולוגיות, מתבצעות בטמפרטורת החדר, כ 23 ° C. כל השיטות המתוארות כאן ממוטבים עבור הקלטה הנוירונים tectal של ראשנים בין שלב התפתחותי 42, 49 (מבוים על פי Neiuwkoop, פאבר15).
1. הכנה in Vivo
- עזים ומתנגד את הראשן.
- מקם את הראשן בצלוחית קטנה המכילה הפתרון של שטיינברג עם 0.01% MS-222 במשך כ 5 דקות.
הערה: MS-222 aka "Tricaine" הוא דגים, דו-חיים הרדמה נפוץ. הראשנים מגודלים בפתרון של שטיינברג במ מ: 0.067 אשלגן כלורי, 0.034 Ca (3)2•4H2O, 0.083 MgSO4•7H2O, 5.8 NaCl, 4.9 HEPES. - ודא הראשן עמוקות מרדימים (לא מגיב ולא שחייה) לפני שתמשיך לשלב 2.
- מקם את הראשן בצלוחית קטנה המכילה הפתרון של שטיינברג עם 0.01% MS-222 במשך כ 5 דקות.
- אבטח את ראשן anesthetized על בלוק המשוקע סיליקון על הרצפה של המנה לנתח/הקלטה.
- השתמש פיפטה של העברה חד פעמיות כדי לעבור הראשן anaesthetized תבשיל דיסקציה/הקלטה שיש פתרון הקלטה חיצוני (115 מ מ של NaCl, 2 מ מ של אשלגן כלורי, 3 מ מ של CaCl2, 3 מ מ של MgCl2, 5 מ"מ של HEPES, 1 מ מ גלוקוז; להתאים את ה-pH באמצעות 7.25 10 N של NaOH, mOsm osmolarity 255).
- כדי למזער את השריר ספונטנית מפרכס, להוסיף חוסם קולטן של אצטילכולין, tubocurarine (100 מיקרומטר) לפתרון חיצוני. (בדרך כלל, הדבר נעשה באמצעות פיפטה µL 200 להוסיף 100 µL מניה tubocurarine 10 מ מ 10 מ"ל של פתרון חיצוני).
- באמצעות סיכות חרקים, אבטח את ראשן, בצידו הגבי, לבלוק המשוקע סיליקון אלסטומר (כגון Sylgard 184, ראה טבלה חומרים לפרטים), אשר היה דבוק הרצפה מאכל ויבתר.
הערה: המיקום של הפינים הוא קריטי: למקם אותם משני צידי המוח, מספיק סימטרית כדי להימנע משפדים האקסונים מהרשות לשיקום האסיר מביא הפרויקט מהעין ו להזין את המוח רק והשתרשה עמוק בלבה tectum אופטיים (איור 1א').
- השתמש פיפטה של העברה חד פעמיות כדי לעבור הראשן anaesthetized תבשיל דיסקציה/הקלטה שיש פתרון הקלטה חיצוני (115 מ מ של NaCl, 2 מ מ של אשלגן כלורי, 3 מ מ של CaCl2, 3 מ מ של MgCl2, 5 מ"מ של HEPES, 1 מ מ גלוקוז; להתאים את ה-pH באמצעות 7.25 10 N של NaOH, mOsm osmolarity 255).
- פילה המוח לאורך הקו האמצעי.
- תצוגה ברורה של המוח, להסיר את העור המכסים את המוח על ידי ביצוע חתך שטחי לאורך הקו האמצעי באמצעות מחט סטרילית 25-G.
- פילה המוח לאורך קו האמצע באותו הציר על ידי החדרת המחט לתוך הצינור העצבי ומושך בעדינות כלפי מעלה (dorsally) כגון החלק הגבי של הצינור נקיה שנחתך (קטועה) תוך השארת הצלחת קומה שלמה (איור 1B).
הערה: חשוב במשטח הרצפה של הצינור העצבי להישאר שלם כי הקלט החושי מביא להזין את tectum באמצעות לוח קומה.
- הסר את הקרום חדרית שקוף שמכסה את הנוירונים tectal.
- להעביר את המנה הקלטת התכנית אלקטרופיזיולוגיה ולהשתמש טיפ פיפטה זכוכית שבורה להסרת קרום חדרית המכסים את הגופות התא של נוירון tectal. שבור את הקצה על-ידי גרירתו בקלילות על פני קידמית המשימה העדינה.
- להבריג את פיפטה המחזיק פיפטה, להוריד אותו למטה tectum סיב אופטי דרך micromanipulator.
- השתמש את פיפטה שבור לקלף קרום חדרית הרחק tectum.
הערה: אין צורך להסיר את הקרום tectum כולו; חלון קטן יספיק ומספקים גישה שפע של נוירונים.
- להשיג כל התא הקלטות מלחציים תיקון.
הערה: הגישה מרגע זה והלאה היא דומה בביצוע כל התא תיקון קלאמפ הקלטות מ פרוסות המוח העכבר כפי שמתואר שגב, et al. 16 (איור 1C). - שיא התגובות נוירון tectal כל השדה הבזק של אור מוקרנת הרשתית.
- להקרין כל השדה הבזק של אור על הרשתית, מקום של סיבים אופטיים סמוך לעין של הראשן. בקצה השני של סיבים אופטיים הוא LED בקנה אחד עם הנגד המשתנה המאפשר בוהק האור להיות נשלט. מפעילים את ה-LED, פלט דיגיטלי של המגבר. בדרך זו, כל השדה הבזקי משתנות בין עוצמות האור יכול להיות מוקלט (איור 4א).
2. כל המוח הכנה
- בצע שלבים 1.1-1.3.
הערה: יש צורך tubocurarine בפתרון חיצוני עבור הכנת. - לבודד את המוח.
- שימוש במחט 25-G לנתק את hindbrain (איור 2א).
- כדי לבודד את כל המוח של הראשן, בעדינות להפעיל את המחט מתחת המוח, כיוון סימטרית-על-rostral לנתק את כל רקמת חיבור לרוחב ו הגחון של סיבי עצב.
- לאבטח למוח בלוק של אלסטומר סיליקון.
- שוחרר לחלוטין, לאחר לאבטח למוח בלוק של אלסטומר סיליקון על-ידי הצבת סיכה אחת דרך אחת הנורות הריח וסיכה עוד דרך hindbrain (איור 2B). זוהי התצורה האופטימלית עבור הקלטה של נוירונים tectal.
- להעביר את המנה הכוללת הכנת מוצמדים כל המוח מהטווח ויבתר התכנית אלקטרופיזיולוגיה. הסר את הקרום חדרית באמצעות פיפטה זכוכית שבורה כפי שמתואר בשלב 1.4.
- במקום של הפרעה דו קוטבית אלקטרודה מגרה על הצנטר (איפה האקסון נרחבים מכל עין קרוס-המוח האמצעי) ישירות להפעיל את האקסונים מהרשות לשיקום האסיר.
- המקום האלקטרודה גירוי דו קוטבית rostral, ובצמוד כמעט, החדר האמצעי גדול. תצלובת ממוקם מיד rostral את החדר האמצעי גדול (איור 2B).
- בעדינות נמוך יותר האלקטרודה מגרה על גבי הצנטר כך שקע קטן נוצר בתוך הרקמה. האלקטרודה דו קוטבית מונעת על ידי ממריץ את הדופק אשר מאפשר את עוצמת גירוי בדיוק להיות תחת פיקוח.
- המקום האלקטרודה גירוי דו קוטבית rostral, ובצמוד כמעט, החדר האמצעי גדול. תצלובת ממוקם מיד rostral את החדר האמצעי גדול (איור 2B).
- ביצוע ההקלטה מלחציים תיקון התא כולו (איור 2C) כפי שתואר על ידי שגב, et al. 16
3. אופקי המוח פרוסה הכנה
- בצע שלבים 2.1 ל 2.3.
- השתמש סכין גילוח לסלק הרביעי הכי לרוחב (אילו ויוו המתאים ביותר הגבי הרביעי) של צד אחד של אחד tectum סיב אופטי. החתך הזה מתבצע במקביל למישור rostral-סימטרית כפי שמוצג באיור 3א.
- מחדש להצמיד את המוח לצד אלסטומר סיליקון עם פרוס צד פונה כלפי מעלה (כך somata ואת מורכב ניתן לגשת ישירות עבור הקלטה) והמשטח חדרית של המוח פונה לרחוב elastomer סיליקון (איור 3 B) (כך אלקטרודה דו-קוטבי יכול להיות ממוקם על הצנטר).
- לבצע את כל התא תיקון קלאמפ או המקומי הגישו הקלטה פוטנציאליים (איור 3C) כפי שתואר על ידי שגב, et al. 16
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדי להקליט אור-עורר תגובות כל השדה הבזק של אור מוקרן על הרשתית בזמן התגובה מתועד של נוירונים בודדים tectal (איור 4א). פרוטוקול מסוים זה תוכנן כדי למדוד את התגובה של הנוירון אל האור מגרה ("על" תגובה), ואז ביטול 15 s מאוחר יותר כדי למדוד את "את התגובה." הנוירונים tectal בדרך כלל מוצג חזקים תגובות לסירוגין (מצב קלאמפ שמוצג כאן מתח שהוקלט ב, עם הנוירון כשכרטיס ל- 60mV כדי למדוד זרם סינפטית (איור 4B)). ניתן לכמת את כמות נסיעה סינפטית שהתקבלו על-ידי כל נוירון אחד ע י הקלטת אירועים ספונטניים סינפטית (איור 4C). זרם-מתח מערכות יחסים (עקומות-V) ניתן שנוצר מן הנוירון אותו על ידי צעד הנוירון כדי פוטנציאל יותר ויותר depolarized, הקלטה וכתוצאה מכך מופעל מתח Na+ וזרמים K+ , המכונה "מעורב הנוכחי הקלטות"(איור 4D, E). זה כבר מבוססת היטב כי עבור נוירונים אלה דו-חיים, שיא Na+ ולא ניתן לכמת K+ זרמים דרך הקלטות הנוכחי מעורב כי הפסגות חנותם חופף אחד עם השני4,7.
ישיר הפעלה של אקסונים מהרשות לשיקום האסיר-הצנטר עוקף כל חישוב במעלה ועיבוד של גירויים חזותיים המתרחשים בעיניים, ומאפשר ללמוד את הסינאפסית בין presynaptic מהרשות לשיקום האסיר אקסונים postsynaptic tectal נוירונים ב שלה הטופס הכי טהור, מופחתת. נוירון tectal התגובות הפעלה מהרשות לשיקום האסיר מופקים מן RGCs מגורה על ידי האור או ישירות באמצעות אלקטרודה מגרה דו-קוטבי המורכב משני רכיבים: רכיב monosynaptic (ישיר סינפטית קלט מהמשתמש RGCs מופעל) ו- polysynaptic רכיב (רשת מקומית חוזרים ונשנים פעילות ההזנה חזרה אל מוקלטת הנוירון). במקרה של התגובות עורר אור, הרכיבים monosynaptic, polysynaptic חופפים אחד עם השני על ידי כמה כמות undeterminable. חפיפה טמפורלית הזה מגביל מה ניתן להסיק שמקדם על הסינאפסית בין הרשתית tectum סיב אופטי. באמצעות הכנה כל המוח והפעלת מערכת האקסון מהרשות לשיקום האסיר ישירות באמצעות אלקטרודה מונחת תצלובת (איור 5א), לעומת זאת, מייצרת מונו - רכיב polysynaptic כי הם בעיקרו של דבר שאינם חופפים בזמן. יכול להיות מותאם הכוח מגרה של האלקטרודה הפרעה דו קוטבית. כפי כוחו מגרה הוא גדל, יש מספר רב יותר של אקסונים מהרשות לשיקום האסיר מופעל (איור 5B). פרוטוקול גירוי מינימלי קובע את עוצמת סינפטית האקסון מהרשות לשיקום האסיר בודדים אל נוירון הפרט tectal; פרוטוקול גירוי מקסימאלית משקף את הסכום הכולל, או הקלט המרבית, סינפטית של כל מהרשות לשיקום האסיר האקסונים משולב (איור 5C). היחס הנכון של סינאפסות כדי מעכבות קלט סינפטית (E: אני יחס) שהתקבלו על-ידי הפרט נוירון tectal הוא קריטי עבור הפונקציה חזותי רגילה18. איור 5 D מראה דוגמה מהרשות לשיקום האסיר-עורר סינאפסות הנוכחי עקבות הקליט מ נוירון הפרט tectal. ההסתברות של שחרור המשדר מסופי האקסון presynaptic מהרשות לשיקום האסיר נמדד על ידי הקלטות לזווג את הדופק. בשביל זה, נוירון tectal postsynaptic נרשם במצב קלאמפ מתח כדי למדוד זרמים סינפטית, ואילו האקסונים מהרשות לשיקום האסיר מופעלים במרוכז, מופרדים על-ידי מרווח זמן 50 מילישניות (איור 5E).
התא כולו תיקון קלאמפ הקלטות יכול להתבצע בין הנוירונים tectal המתגוררים בכל שכבה סומאטית. בדומה ההכנה כל המוח, אקסונים מהרשות לשיקום האסיר ' יכול להיות מופעל על ידי הנחת אלקטרודה הקלטה דו קוטבי על תצלובת (איור 6א). כל ההקלטות ביצעו בהכנת כל המוח ניתן גם לבצע שימוש בתכשיר פרוסה המוח אופקי. איור 6 B מראה של בדוגמת מעקב מתגובה עורר מהרשות לשיקום האסיר הקליטה של נוירון בשכבה השטחית. ההכנה הזאת מאפשרת גם עבור התבנית המרחבי של קלט סינפטית מהרשות לשיקום האסיר על גבי דנדריטים tectal שברצונך למדוד. בשביל זה, עורר מהרשות לשיקום האסיר שדה פוטנציאל נרשמים כל 10 מיקרומטר לאורך הציר רוחבי המדיאלי (קרי, הציר דיסטלי-proximal) של מורכב (איור 6C). זה יוצר פרופיל ברזולוציה גבוהה של דפוס קלט מהרשות לשיקום האסיר פונקציונלי. הפוטנציאליות השדה ואז ניתן להפוך צפיפויות המקור הנוכחי על-ידי חישוב נגזרות המרחבי14 השני, הצפיפויות המקור הנוכחי בתורו יכול להיהפך מגרש התמונה. העלילה התמונה איור 6ג מציג הקלט מהרשות לשיקום האסיר החזק ביותר מטרות האזור דיסטלי יותר מורכב.
איור 1. אין ויוו הכנת נהלים. (א) ראשן ריתקה על פיסת סיליקון elastomer. סיכות מסומנים באמצעות החצים הלבנים. הערה מיקום הסיכה יותר סימטרית כדי להימנע משפדים את ספינלי אופטיים. הקו המקווקו לבן מציין את קו האמצע. (B) Zoomed בתצוגה של כל המוח לאחר חיתוך לאורך הקו האמצעי הגבי והסרה בשכבת-על העור. (ג) כל תא תיקון-קלאמפ הקלטה ויוו. (L: לרוחב. מ: רכיסה המדיאלי. R: rostral. C: סימטרית. D: הגבי. V: הגחוני /. אוב: הריח הנורה. OT: Tectum סיב אופטי. HB: Hindbrain). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 . כל המוח הכנת נהלים. (א) לאחר המוח הוא מטיגון לאורך הקו האמצעי, hindbrain לוקה בחסר. (B) כל המוח גזור החוצה, להצמיד את elastomer סיליקון. הכוכבית לבן מציין את ה-pin של הנורה הריח השמאלי. התיבה האדומה מציינת השלישי האמצעית של tectum, כלומר, אזור היעד עבור הקלטה. (ג) כל התא תיקון קלאמפ הקלטה באמצעות הכנה כל המוח. הכוכבית השחורה מציינת את האזור של האו ם שרוטים קרום חדרית שבו תאים לא ניתן לגשת להקלטה. שבו הקרום הוסרה בהצלחה, somata מופיעים יותר ברור ומוגדר. החץ מצביע של נוירון לא בריא. (PZ: אזור המקדימות. LMV: החדר האמצעי גדול. אוב: הריח הנורה. OT: Tectum סיב אופטי. HB: Hindbrain. L: לרוחב. מ: רכיסה המדיאלי. R: rostral. C: סימטרית. D: הגבי. V: הגחוני /). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 . המוח אופקי פרוסה הכנת נהלים. (א) בחלק הלטראלי ביותר של צד אחד של tectum סיב אופטי נפרס (שצוין על-ידי הקו המקווקו) לאחר הכנה כל המוח. (B) המוח אופקי פרוסה הכנה לאחר ריתקה לצד אלסטומר סיליקון. קווים לבנים זוגי מייצגים אלקטרודה מגרה מונחת הצנטר. (ג) Zoomed בנוף של סומא שכבות מורכב באמצעות הכנה פרוסה המוח אופקי. עקומת מקווקו מציינת את הגבול בין סומא שכבות מורכב. איור זה שונה מחן, et al. 14 (l: לרוחב. מ: רכיסה המדיאלי. R: rostral. C: סימטרית. D: הגבי. V: הגחוני /. אוב: הריח הנורה. OC: האופטי. OT: Tectum סיב אופטי. HB: Hindbrain). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 . הקלטות הכנה ויוו . (א) מפרטים טכניים מציג את התצורה טיפוסי של הקלטת ויוו . אור (B) עורר תגובות כולל אור על ואור את התגובות. שיבוץ עקבות הם שהתצוגה ב- view של - ואת חופש-תגובה, בהתאמה. זרמים postsynaptic סינאפסות ספונטנית (ג) נרשמה. (ד) Na+ וזרמים K+ בתגובה מתח תהדק את השלבים מ-60 mV 30 mV של נוירון בודד. (E) IV חלקות המופקים עקבות ב (ד). כל ההקלטות נעשו עם נוירון שנערך ב-60 mV חוץ ב (ד) כדי ליצור הרביעי-מגרשים; הנוירונים הם ניגש פוטנציאל יותר ויותר יותר depolarized, ב- 10 דרגות mV, להפעלת זרמים תלויי-מתח. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5 . הקלטות הכנה כל המוח. (א) מפרטים טכניים מציג תצורת טיפוסי של הקלטת כל המוח כולל של אלקטרודה מגרה מונחת הצנטר (ירוק ואדום קווים מייצגים מהרשות לשיקום האסיר אקסונים). Overlaying (B) עקבות של ההיענויות מהרשות לשיקום האסיר על שינויים של כוח גירוי מהרשות לשיקום האסיר. (ג) מקסימום גירוי תגובה (משמאל) והתגובה גירוי מינימלי (מימין). (ד) מהרשות לשיקום האסיר-עורר תגובה סינאפסות אל נוירון בודד. (E) מדגמים מזווגים דופק ההנחיה של תגובת עורר מהרשות לשיקום האסיר נוירון הפרט. (אבוב: הריח הנורה. OC: האופטי. OT: Tectum סיב אופטי). כל ההקלטות נעשו עם נוירון שנערך ב-60 mV חוץ (D) כדי למדוד את הקלט סינאפסות: הקלט סינאפסות נרשם על-ידי החזקת הנוירון כמה פוטנציאל ההיפוך של γ-אמינו בוטירית (GABA)-מתווכת כלוריד זרמים (-45 mv); הקלט המעכבת על-ידי החזקת הנוירון כמה פוטנציאל ההיפוך של חומצה α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic (אמפא)-מתווכת זרמים (+5 mv). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6 . הקלטות מוח אופקי לחתוך הכנה- (א) מפרטים טכניים מציג את התצורה של הכנה פרוסה המוח אופקי. שימו לב כי למרות האלקטרודה מגרה נשאר הצנטר, פיפטה הקלטת עכשיו ממוקם לתאים גישה לרוחב כל השכבות tectal נחשף על ידי הכנה פרוסה המוח אופקי. (B) מענה מהרשות לשיקום האסיר של נוירון המתגוררים השכבה השטחית של tectum. (ג) נרשם שדה פוטנציאל ברחבי מורכב את המומר הנוכחי מקור הצפיפויות (CSDs) המוצג על ידי מפות חום מגרש תמונה. (OC: האופטי. OT: Tectum סיב אופטי. HB: Hindbrain). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כל השיטות המתוארות בעבודה זו אופטימיזציה עבור הקלטה הנוירונים tectal של ראשנים בין שלב התפתחותי 42, 49 (מבוים על פי Neiuwkoop, פאבר15). ובבמה 42, הראשנים הם גדול מספיק ולא מספיק מפותח כך ניתן למקם את הסיכות חרקים משני צידי המוח להקלטות ויוו , שבצעתי את הקרע כל המוח. בשלבים מוקדמים יותר, כאשר הראשנים הם בעצם דו מימדי (קרי, שטוח), הגישות המתוארים כאן אינם מיטביים.
בשל הקלות שבה הנוירונים tectal ניתן לגשת להקליט ולצפות בתצורת התא כולו, היה מעגל זה מודל חממה על תגליות בסיסיות על טופס מעגלים עצביים איך תוך כדי תפקוד - ותפקוד תוך יצירת19. כאן תארנו כיצד לרכוש כל התא תיקון קלאמפ הקלטות הנוירונים tectal, כולל כיצד לבצע את ראשן ויוו כל המוח ההכנות, תצורות שונים הקלטה לבין דוגמאות של סוגים שונים של נתונים. הרשימה הבאה היא דיון היתרונות והמגבלות של כל הכנה, ואחריו טיפים להשגת הקלטות באיכות גבוהה כל התא.
צפרדע רפואית ראשנים להתחיל הצגת התנהגויות הימנעות חזותי לפי שלב 47/48, כ 7-8 ימים לאחר ההפריה3,13. משמעות הדבר היא כי אפילו בשלבים אלה מוקדם יחסית של התפתחות, המעגל retinotectal היא מתפקדת ובעל יכולת של עיבוד גירויים חזותיים. שאלות בסיסיות לגבי פיתוח ו פלסטיות של מעגל retinotectal לבואינו ישירות באמצעות הכנת ויוו להקליט נוירון tectal תגובות לגירויים חזותיים מוקרנת הרשתית. In vivo הקלטות ב הראשן הם פשוטה יחסית לעומת תצורת הקלטה המקביל אצל יונקים בשל הפשטות היחסית במערכת העצבים, חוסר גולגולת. מכיוון נוירון הפרט tectal somas יכולים להיות מטמיעים ויוו, איטום על גבי נוירון מסוים ולהשיג כל התא תיקון קלאמפ הקלטה התצורה היא זהה ל ביצוע מלחציים תיקון התא כולו הקלטה בפרוסה מכרסמים ההכנות. ראשנים לשרוד בדרך כלל מספר שעות על האסדה (אשר יכול להיות מוערך בקלות על ידי ניטור את פעימות הלב). מגבלה אחת הטבועה של ראשן ויוו ההכנה היא כי רק נוירונים tectal המתגוררים השכבה סומאטית עמוק של tectum סיב אופטי, השכבה בה נמצא בסמוך לגן באמצע החדר גדול, נגישים עבור הקלטה (איור 1 ). משמעות הדבר היא כי נוירונים tectal המתגוררים סומאטית השכבות החיצוניות של tectum היה נחקרו במידה רבה ויוו.
היתרון ניסיוני של הכנת כל המוח הוא זה מבודד את המוח של קולטני חישה היקפיים עיניים, עור, ומבטל כל פעילות חושית מונחה כדין. אמנם כבר לא מסוגל להיות מונע על ידי גירויים חזותיים, תשומות עצב מהרשות לשיקום האסיר שמכוונות את tectum עדיין קיימות בהכנת כל המוח והוא הם יכול להיות מופעל ישירות בצורה מאוד מבוקרת באמצעות הפרעה דו קוטבית מגרה אלקטרודה (FHC) מונחת תצלובת שבו שתי קבוצות של מהרשות לשיקום האסיר האקסון ספינלי להזין את המוח. השימוש הראשון דווח על הכנת כל המוח היה בשנת 1996, במחקר חשוב על ידי וו. et al. 8, ב אקסונים מהרשות לשיקום האסיר אשר הופעלו באמצעות אלקטרודה גירוי דו קוטבי כך המחברים יכולים לכמת את כוחו של הפרט אקסונים מהרשות לשיקום האסיר על הנוירונים tectal postsynaptic ובאותו זמן אז גרם תגליות בסיסיות על ההתקדמות של סינפסה ההבשלה. כמו עם ההכנות ויוו , הכנת כל המוח מאפשר גישה רק האלה נוירונים המתגוררים ברובד עמוק, סמוך קרום חדרית.
אמנם tectum סיב אופטי מורכב של 9 תאי הגוף שכבות17, כל מחקרים אלקטרופיזיולוגיה קודמים התמקדו הנוירונים tectal שכבה עמוקה כי המוח כולו המסורתי ואת ויוו ההכנות (המתוארים מעל) לאפשר גישה רק הנוירונים של השכבה העמוקה. כדי לגשת הנוירונים tectal על פני כל השכבות הסומטית, מן העמוקות ביותר כדי השטחית ביותר כמו גם כל מורכב שבו מהרשות לשיקום האסיר אקסונים יוצרים קשרים סינפטיים עם נוירון tectal דנדריטים, פיתחנו הכנה ששונה כל המוח, המכונה "the המוח אופקי פרוסה הכנה"(איור 314). כמו עם הכנת כל המוח, המוח אופקי פרוסה ההכנה שומרת את האקסונים מהרשות לשיקום האסיר בתוך המוח ולאחר אפשר לשלוט על ידי הנחת של הפרעה דו קוטבית אלקטרודה מגרה על תצלובת.
בסך הכל, ההכנות נועדו כדי למטב את החזיית וגישה אל נוירון tectal somata כדי לבצע את כל התא תיקון קלאמפ הקלטה. ישיר גישה סומא הוא חיוני עבור איכות התא כולו תיקון קלאמפ הקלטות: גישה הפנימי של הנוירון מחייבת את היווצרות חזק מאוד (> 1 × 109 Ω) לאטום בין פיפטה של קרום פלזמה של הנוירון, המחייב ישירה איש הקשר של קצה פיפטה על גבי קרום זה. ומכאן, מספיקות להסרת קרום חדרית הוא המפתח עבור ההקלטה מוצלחת. גם, מפתח עבור הקלטות עורר מהרשות לשיקום האסיר מוצלח הוא המיקום הנכון של האלקטרודה גירוי דו קוטבית על גבי הצנטר. למעשה כל הנוירונים tectal לקבל קלט סינפטית ישיר האקסונים מהרשות לשיקום האסיר. אם אין תגובה עורר מהרשות לשיקום האסיר נצפית, ואז זה הוא ככל הנראה עקב מיקום שגוי של האלקטרודה דו-קוטבי כזה אינה תקפה הצנטר ואני לא פנייה אל העצבים האופטים. ניתן לתקן על ידי פשוט מיצוב מחדש האלקטרודה מגרה. כשל להתבונן מהרשות לשיקום האסיר-עורר תגובות לאחר מיצוב מחדש האלקטרודה דו-קוטבי, יכול להיות כי התחזית האקסון מהרשות לשיקום האסיר נותק בטעות בזמן. במקרה זה, יש צורך להתחיל מחדש עם תכשיר חדש. לבסוף, כשל להתבונן מענה עורר מהרשות לשיקום האסיר יכול להיות בגלל הקלטות מתא שאינו נוירון tectal נפוצים. למשל, עכשיו, דונלד בדרך כלל אינם מציגים את עורר מהרשות לשיקום האסיר monosynaptic תגובה נורמלית המוצג על-ידי נוירונים tectal, וגם לא הנוירונים mesencephalic גדולות שנמצאו, אם כי במספרים נמוך מאוד, המתגוררים tectum סיב אופטי20. הסבירות של הקלטה של אחד התאים האלה-tectal הוא נמוך מאוד בשל המספר העצום של נוירונים tectal. כמובן, הקלטות באיכות גם לדרוש את הנוירונים tectal כדי להיות בריאים. המאפיינים של נוירון tectal בריאים הם קומפקטי עגול או אובלי מפרחי סומא כי הוא בהיר וללא פגמים. ברגע השיגה תא כל הקלטה תצורה, הבריאות של הנוירון ניתן עוד יותר להעריך ברמת אלקטרופיזיולוגיות על ידי מדידת תכונות חשמליות יסוד כגון נח פוטנציאל ממברנה התנגדות קלט, קיבוליות . פוטנציאל ממברנה מנוחתו של נוירונים tectal בריא בין שלבים התפתחותיים 42 ו 49 הוא כ-45 mV, עם התנגדות קלט הממוצע של GΩ 1 כ ו קיבוליות של 10-12 pF3,4,5. חלק קטן של נוירונים באופן בלתי נמנע יתערער עקב הסרת קרום חדרית. Somata של נוירונים פגום או לא בריא מופיעים מגורענות, נפוח, או עם הזין המצומק. דוגמה נוירון לא בריאה מוצגת באיור 2C. אם הרוב המכריע של נוירונים מופיעים לא בריא, זה יכול להיות השתקפות זה יש משהו לא בסדר עם הפתרון הקלטה חיצוני, אז מומלץ להמציא פתרון הקלטה חיצוני טריים. מלבד מופיעים בריא, הנוירונים הטוב ביותר עבור הקלטת קשורים בדרך כלל עם מספר גדול של נוירונים אחרים, בניגוד להיות מבודדת. כמו כן, לבחור תאים שהם נגישים בקלות. לדוגמה, אל תדחוף את הרקמה קשה מדי לגשת תא כי זה עלול לגרום נזק לרקמת או להזיז את הרקמה ולא ובכך משמרת האלקטרודה מגרה מהמקום. לבסוף, הקלטות צריך להיות מוגבל האמצעי השלישי tectum (איור 2B) כדי להימנע ההבדלים הפוטנציאליים עקב מעבר הצבע התפתחותית שקיים על פני4,rostro-סימטרית ציר8, אלא אם, כמובן, המוקד של הניסוי הוא מעבר הצבע התפתחותית הנ. Tectum המתאים הוא האזור rostral של אזור המקדימות, סימטרית עד לקצה החדר האמצעי גדול סימטרית.
המלחציים תיקון התא כולו הקלטה טכניקה אינה ללא המגבלות. באופן כללי, זה הסגנון של הקלטה כוללת הקלטה נוירון אחד בכל פעם. זאת בניגוד גישות מעורבים הדמיה של דור חדש GCaMP6 סידן אינדיקטורים, המאפשרים הפעילות של אוכלוסיות גדולות של נוירונים לדימות בו-זמנית פרוסה הכנה ו vivo בתוך.
חיסרון נוסף הגלום להקלטות קלאמפ מתח התא כולו הוא השגיאה קלאמפ שטח (חוסר היכולת לשלוט המתח עוד הרבה מעבר סומא), אשר מגביל את השליטה הטמפורלי של מתח4. בסך הכל, נושאים אלה מלחציים מתח הן מינימליות בעת הקלטת של נוירונים tectal עם זאת, בשל גודלו הקטן יחסית שלהם, צנוע arborizations דנדריטים, זרמים קטן ואיטי יחסית בהשוואה בתרבית של נוירונים. מאפיינים אלו של נוירונים tectal לדקלם אותם במיוחד לשכנוע קלאמפ מתח הקלטה, מדידה של פרמטרים רבים ובניית פרופילים עבור נוירונים בודדים5,6.
כיוונים לעתיד כוללים אופטימיזציה של ויוו המוח אופקי פרוסה הכנה כדי לאפיין את הפונקציה של השכבה החיצונית נוירונים בעיבוד של גירויים חזותיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
נתמך על ידי המענק-NIH SBC COBRE 1P20GM121310-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stemi Stereo 508 | Zeiss | 495009-0006-000 | Dissecting microscope |
| MS-222 "Tricane" | Finquel | ARF5G | Amphibian general anesthetic |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-3 | Used to prepare Stienberg's solution and external solution |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | P217-500 | Used to prepare Stienberg's solution and external solution |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-1KG | Used to prepare Stienberg's solution and external solution |
| Calcium nitrate tetrahyrate (Ca(NO3)•4H2O) | Sigma-Aldrich | 237124-500G | Used to prepare Stienberg's solution |
| Magnesium Sulfate (MgSO4) | Mallinckrodt Chemicals | 6066-04 | Used to prepare Steinberg's solution |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5080-500G | Used to prepare external recording solution |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | J.T. Baker | 2444-01 | Used to prepare external recording solution |
| D-glucose Anhydrous | Mallinckrodt Chemicals | 6066-04 | Used to prepare external recording solution |
| Tubocurarine hydrochloride pentahydrate | Sigma | T2379 | Nicotinic acetylcholine receptor antagonist |
| Insect Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | 0.1mm diameter stainless steel pins |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 761028 | Preweighed monomer and curing agent kit |
| Sterile Polystyrene Petri Dish - 60x15mm | Fisher Scientific | AS4052 | Small petri dishes |
| PrecisionGlide Needle 25Gx5/8 (.0.5mm X 16mm) | BD | 305122 | Syringe needles |
| 1mL Slip Tip Tuberculin Syringe | BD | 309659 | Disposable, sterile syringes |
| Borosilicate pipette glass | Sutter Instrument | BF150-86-10HP | Pulled to desired specifications using pipette pulling machine |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | Fabricates micropipettes for electrophysiology recording |
| Kimwipes Kimtech wipes | Kimberly-Clark | 34120 | Delicate task lint-free wipers |
| Axon Instruments MultiClamp 700B Headstage CV-7B | Molecular Devices | 1-CV-7B | Current clamp and voltage clamp headstage |
| MP-285 Motorized Manipulator with Tabletop Controller | Sutter Instrument | MP-285/T | Control for headstage on electrophysiology rig |
| Fiber-Coupled LED (Green) | Thorlabs | M530F2 | Fiber optic cable paired with green LED |
| Cluster Bipolar Electrode (25µm diameter) | FHC | 30207 | Bipolar stimulating electrode |
| ISO-Flex Stimulator | A.M.P.I. (Israel) | Contact manufacturer | Flexible stimulus isolator |
| Axon Instruments 700B Multipatch Amplifier | Molecular Devices | 2500-0157 | Amplifier for voltage- and current-clamp recording |
| Digidata 1322A digitizer | Molecular Devices | 2500-135 | Data acquisition system for electrophysiology recording |
| Axio Examiner.A1 | Zeiss | 491404-0001-000 | Microscope for electrophysiology |
| Micro-g Lab Table | TMC | 63-533 | Air table for electrophysiology microscope |
| Inspiron 620 Personal Desktop Computer with Windows 7 64-bit | Dell | D06D001 | Computer running electrophysiology software |
| c2400 CCD camera | Hamamatsu | 70826-5 | Charge-coupled device camera for electrophysiology imaging |
| 7 O'Clock Super Platinum Stainless Razorblades | Gillette | CMM01049 | Platinum-coated stainless razor blades |
| Transfer Pipets | Fisher Scientific | 13-711-7M | Disposable Polyethylene transfer pipets |
References
- Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets. Dis. Model Mech. 6, 1057-1065 (2013).
- Pratt, K. G. Finding Order in Human Neurological Disorder Using a Tadpole. Curr. Pathobio. Rep. 3 (2), 129-136 (2015).
- Liu, Z., Hamodi, A. S., Pratt, K. G. Early development and function of the Xenopus tadpole retinotectal circuit. Curr. Opin. Neurobiol. 41, 17-23 (2016).
- Hamodi, A. S., Pratt, K. G. Region-specific regulation of voltage-gated intrinsic currents in the developing optic tectum of the Xenopus tadpole. J. Neurophysiol. 112 (7), 1644-1655 (2014).
- Pratt, K. G., Aizenman, C. D. Homeostatic regulation of intrinsic excitability and synaptic transmission in a developing visual circuit. J. Neurosci. 27 (31), 8268-8277 (2007).
- Cialeglio, C. M., Khakhalin, A. S., Wang, A. F., Constantino, A. C., Yip, S. P., Aizenman, C. D. Multivariate analysis of electrophysiological diversity of Xenopus visual neurons during development and plasticity. Elife. 4, 11351 (2015).
- Aizenman, C. D., Akerman, C. J., Jensen, K. R., Cline, H. T. Visually driven regulation of intrinsic neuronal excitability improves stimulus detection in vivo. Neuron. 39 (5), 831-842 (2003).
- Wu, G., Malinow, R. Cline H.T. of a central glutamatergic synapse. Science. , 972-976 (1996).
- Van Rheed, J. J., Richards, B. A., Akerman, C. J. Sensory-evoked spiking behavior emerges via an experience-dependent plasticity mechanism. Neuron. 87 (5), 1050-1060 (2015).
- Schwartz, N., Schohl, A., Ruthazer, E. S. Activity-dependent transcription of BDNF enhances visual acuity during development. Neuron. 70 (3), 455-467 (2011).
- Zhang, L. I., Tao, H. W., Holt, C. E., Harris, W. A., Poo, M. A critical window for cooperation and competition among developing retinotectal synapses. Nature. 395 (6697), 37-44 (1998).
- Hewapathirane, D. S., Haas, K. Single cell electroporation in vivo within the intact developing brain. J. Vis. Exp. (17), e705 (2008).
- Dong, W., et al. Visual avoidance in Xenopus tadpoles is correlated with the maturation of visual responses in the optic tectum. J. Neurophysiol. 101 (2), 803-815 (2009).
- Hamodi, A. S., Pratt, K. G. The horizontal brain slice preparation: a novel approach for visualizing and recording from all layers of the tadpole tectum. J. Neurophysiol. 113 (1), 400-407 (2015).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , Garland. New York. (1994).
- Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices. J. Vis. Exp. (112), e54024 (2016).
- Muldal, A. M., Lillicrap, T. P., Richards, B. A., Akerman, C. J. Clonal Relationships Impact Neuronal Tuning within a Phylogenetically Ancient Vertebrate Brain Structure. Curr. Biol. 24 (16), 1929-1933 (2014).
- Khakhalin, A. S., Koren, D., Gu, J., Xu, H., Aizenman, C. D. Excitation and inhibition in recurrent networks mediate collision avoidance in Xenopus tadpoles. Eur. J. Neurosci. 40 (6), 2948-2962 (2014).
- Ruthazer, E. S., Aizenmann, C. D. Learning to see: patterned visual activity and the development of visual function. Trends Neurosci. 44 (4), 183-192 (2010).
- Pratt, K. G., Aizenman, C. D. Multisensory integration in mesencephalic trigeminal neurons in Xenopus tadpoles. J. Neurophysiol. 102 (1), 399-412 (2009).
