Summary
इस पत्र में, हम तीन मस्तिष्क की तैयारी पूरे सेल पैच क्लैंप रिकॉर्डिंग के लिए इस्तेमाल के लिए Xenopus laevis tadpoles के retinotectal सर्किट का अध्ययन चर्चा । प्रत्येक तैयारी, अपने स्वयं के विशिष्ट फायदों के साथ, तंत्रिका सर्किट समारोह के अध्ययन के लिए एक मॉडल के रूप में Xenopus टैडपोल की प्रयोगात्मक पथ में योगदान देता है ।
Abstract
Xenopus टैडपोल retinotectal सर्किट, आंख में रेटिना नाड़ीग्रंथि कोशिकाओं (RGCs) शामिल है जो सीधे synapses ऑप्टिक tectum में न्यूरॉन्स पर फार्म, एक लोकप्रिय मॉडल के लिए अध्ययन कैसे तंत्रिका सर्किट स्वयं इकट्ठा । tectal न्यूरॉन्स से पूरे सेल पैच क्लैंप रिकॉर्डिंग को पूरा करने और RGC-पैदा प्रतिक्रियाओं को रिकॉर्ड करने की क्षमता, या तो vivo में या एक पूरे मस्तिष्क तैयारी का उपयोग कर, सामान्य अंतर्निहित तंत्र के बारे में उच्च संकल्प डेटा का एक बड़ा शरीर उत्पन्न , और असामान्य, सर्किट गठन और समारोह. यहाँ हम कैसे vivo तैयारी में प्रदर्शन करने के लिए का वर्णन, मूल पूरे मस्तिष्क तैयारी, और एक और अधिक हाल ही में विकसित क्षैतिज मस्तिष्क tectal न्यूरॉन्स से पूरी सेल पैच क्लैंप रिकॉर्डिंग प्राप्त करने के लिए टुकड़ा तैयारी. प्रत्येक तैयारी अद्वितीय प्रयोगात्मक लाभ है । vivo में तैयारी दृश्य उत्तेजनाओं को आंख पर पेश करने के लिए tectal ंयूरॉंस की प्रत्यक्ष प्रतिक्रिया की रिकॉर्डिंग सक्षम बनाता है । पूरे मस्तिष्क तैयारी RGC axons के लिए एक उच्च नियंत्रित तरीके से सक्रिय होने के लिए अनुमति देता है, और क्षैतिज मस्तिष्क टुकड़ा तैयारी tectum के सभी परतों के पार से रिकॉर्डिंग की अनुमति देता है ।
Introduction
retinotectal सर्किट amphibian दृश्य प्रणाली का प्रमुख घटक है । यह आंख में RGCs, जो ऑप्टिक tectum को अपने axons परियोजना जहां वे postsynaptic tectal ंयूरॉंस के साथ synaptic कनेक्शन फार्म का शामिल है । Xenopus टैडपोल retinotectal सर्किट तंत्रिका सर्किट गठन और समारोह का अध्ययन करने के लिए एक लोकप्रिय विकासात्मक मॉडल है । इस टैडपोल के retinotectal सर्किट के कई गुण है कि यह एक शक्तिशाली प्रयोगात्मक मॉडल1,2,3प्रदान कर रहे हैं । एक प्रमुख विशेषता है, और इस अनुच्छेद के ध्यान, tectal ंयूरॉंस से पूरे सेल पैच दबाना रिकॉर्डिंग, vivo में या एक पूरे दिमाग की तैयारी का उपयोग करने की क्षमता है । एक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी रिग वोल्टेज और वर्तमान दबाना रिकॉर्डिंग मोड का समर्थन करता है कि एक एम्पलीफायर के साथ लगे के साथ, पूरे सेल पैच दबाना रिकॉर्डिंग एक ंयूरॉन के इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी उच्च संकल्प पर विशेषता हो करने के लिए अनुमति देते हैं । नतीजतन, retinotectal सर्किट गठन के प्रमुख चरणों में tectal न्यूरॉन्स से पूरे सेल पैच दबाना रिकॉर्डिंग के विकास और आंतरिक4की प्लास्टिक की एक विस्तृत और व्यापक समझ प्रदान की है,5 , ६ , ७ आणि synaptic८,९,१०,११ गुण. पूरे सेल पैच दबाना tectal ंयूरॉन रिकॉर्डिंग, जीन को व्यक्त करने की क्षमता या इन ंयूरॉंस में ब्याज की morpholinos12, और एक विधि के माध्यम से दृश्य निर्देशित व्यवहार का आकलन करने के लिए एक स्थापित दृश्य परिहार परीक्षण13 को बढ़ावा देता है अणुओं के बीच लिंक की पहचान, सर्किट समारोह, और व्यवहार ।
यह नोट करने के लिए महत्वपूर्ण है कि उच्च संकल्प डेटा के प्रकार पूरे सेल पैच दबाना रिकॉर्डिंग से प्राप्त संभव आनुवंशिक कैल्शियम संकेतक GCaMP6 के रूप में नए इमेजिंग दृष्टिकोण का उपयोग नहीं है, क्योंकि हालांकि कैल्शियम संकेतक का उपयोग इमेजिंग परमिट एक साथ ंयूरॉंस की बड़ी आबादी में कैल्शियम गतिशीलता के, वहां कोई प्रत्यक्ष या स्पष्ट तरीका है कि विशिष्ट बिजली के मापदंडों सोमता में डेल्टा प्रतिदीप्ति मापने के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है, और वहां कोई रास्ता नहीं है वोल्टेज के लिए ंयूरॉन मापने के लिए वर्तमान-वोल्टेज रिश्ते । स्पष्ट रूप से इन दो अलग दृष्टिकोण, electrophysiological रिकॉर्डिंग और कैल्शियम इमेजिंग, गैर अतिव्यापी ताकत के अधिकारी और डेटा के विभिंन प्रकार उत्पंन करते हैं । इस प्रकार, सबसे अच्छा तरीका विशिष्ट प्रयोगात्मक सवाल पर निर्भर करता है संबोधित किया जा रहा है ।
यहां, हम टैडपोल ऑप्टिक tectum के ंयूरॉंस से पूरे सेल पैच दबाना रिकॉर्डिंग प्राप्त करने के लिए हमारी विधि का वर्णन vivo तैयारी में एक का उपयोग कर, पूरे मस्तिष्क तैयारी, और एक नए संशोधित पूरे मस्तिष्क तैयारी है कि हमारे प्रयोगशाला में विकसित किया गया था14 . प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में, हम प्रत्येक तैयारी के प्रायोगिक लाभ और डेटा के विभिंन प्रकार है कि प्राप्त किया जा सकता है प्रदर्शित करता है । सीमा और विभिंन तैयारियों की ताकत, साथ ही समस्या निवारण के लिए सुझाव, चर्चा अनुभाग में शामिल हैं ।
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Protocol
यहां वर्णित सभी पद्धतियों को Wyoming विश्वविद्यालय के संस्थागत पशु देखभाल एवं उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया है । electrophysiological रिकॉर्डिंग सहित सभी प्रक्रियाओं, कमरे के तापमान पर किया जाता है, लगभग 23 डिग्री सेल्सियस. सभी तरीकों यहां वर्णित विकासात्मक चरण 42 और 49 के बीच tadpoles से tectal ंयूरॉंस रिकॉर्डिंग के लिए अनुकूलित कर रहे है (Neiuwkoop और फेबर15के अनुसार मंचन) ।
1. Vivo में तैयारी
- Anesthetize टैडपोल ।
- एक छोटी सी पेट्री 0.01% MS के साथ स्टाइनबर्ग समाधान युक्त पकवान में टैडपोल प्लेस-222 लगभग 5 मिनट के लिए ।
नोट: MS-222 उर्फ "Tricaine" एक आम मछली और amphibian संवेदनाहारी है । tadpoles में स्टाइनबर्ग के समाधान में उठाया जाता है mM: ०.०६७ KCl, ०.०३४ Ca (NO3)2• 4H2ओ, ०.०८३ MgSO4• 7H2ओ, 5.8 NaCl, 4.9 HEPES । - सुनिश्चित करें टैडपोल गहरी anaesthetized है (गैर उत्तरदायी और अब तैराकी) कदम 2 के लिए आगे बढ़ने से पहले.
- एक छोटी सी पेट्री 0.01% MS के साथ स्टाइनबर्ग समाधान युक्त पकवान में टैडपोल प्लेस-222 लगभग 5 मिनट के लिए ।
- anesthetized टैडपोल के फर्श पर एक जलमग्न सिलिकॉन ब्लॉक करने के लिए सुरक्षित/रिकॉर्डिंग डिश ।
- बाहरी रिकॉर्डिंग समाधान युक्त एक विच्छेदन/रिकॉर्डिंग डिश के लिए anaesthetized टैडपोल स्थानांतरित करने के लिए एक डिस्पोजेबल स्थानांतरण पिपेट का प्रयोग करें (115 मिमी के NaCl, KCl के 2 मिमी, CaCl के 3 मिमी2, MgCl के 3 मिमी2, HEPES के 5 मिमी, ग्लूकोज की 1 मिमी; 7.25 का उपयोग कर पीएच को समायोजित करें 10 N of NaOH, osmolarity 255 mOsm).
- सहज मांसपेशी चिकोटी कम करने के लिए, बाहरी समाधान करने के लिए acetylcholine रिसेप्टर अवरोधक, tubocurarine (100 µ मीटर) जोड़ें. (आमतौर पर, यह एक 200 µ एल पिपेट का उपयोग करके एक 10 मिमी tubocurarine स्टॉक के 100 µ एल जोड़ने के लिए बाहरी समाधान के 10 मिलीलीटर से किया जाता है) ।
- कीट पिन का प्रयोग, टैडपोल, पृष्ठीय पक्ष ऊपर, सिलिकॉन elastomer के एक जलमग्न ब्लॉक करने के लिए सुरक्षित (जैसे Sylgard 184, विवरण के लिए सामग्री तालिका देखें), जो विदारक डिश फर्श करने के लिए चिपक गया है.
नोट: पिन के स्थान महत्वपूर्ण है: उंहें मस्तिष्क के दोनों ओर जगह है, पर्याप्त रूप से impaling afferent RGC axons से बचने के लिए caudal है कि आंख से परियोजना और मस्तिष्क में प्रवेश बस ऑप्टिक tectum को पूर्वकाल (चित्रा 1) ।
- बाहरी रिकॉर्डिंग समाधान युक्त एक विच्छेदन/रिकॉर्डिंग डिश के लिए anaesthetized टैडपोल स्थानांतरित करने के लिए एक डिस्पोजेबल स्थानांतरण पिपेट का प्रयोग करें (115 मिमी के NaCl, KCl के 2 मिमी, CaCl के 3 मिमी2, MgCl के 3 मिमी2, HEPES के 5 मिमी, ग्लूकोज की 1 मिमी; 7.25 का उपयोग कर पीएच को समायोजित करें 10 N of NaOH, osmolarity 255 mOsm).
- midline के साथ मस्तिष्क पट्टिका ।
- मस्तिष्क की एक स्पष्ट दृष्टिकोण के लिए, त्वचा को हटाने के एक बाँझ 25-जी सुई का उपयोग कर midline साथ एक सतही चीरा बनाने के द्वारा मस्तिष्क पर बल ।
- पट्टिका तंत्रिका ट्यूब में सुई डालने और धीरे ऊपर खींच (पृष्ठीय) ऐसी है कि ट्यूब के पृष्ठीय भाग साफ रूप से (गंभीर) कटौती जबकि फर्श प्लेट बरकरार छोड़ (चित्रा 1बी) के साथ एक ही midline धुरी के साथ मस्तिष्क ।
नोट: यह महत्वपूर्ण है कि तंत्रिका ट्यूब के फर्श की थाली बरकरार रह सकता है क्योंकि afferent संवेदी आदानों मंजिल की थाली के माध्यम tectum दर्ज करें ।
- tectal न्यूरॉन्स कवर पारदर्शी वेंट्रिकुलर झिल्ली निकालें ।
- इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी रिग के लिए रिकॉर्डिंग डिश हटो और एक टूटी हुई ग्लास पिपेट टिप का उपयोग करने के लिए वेंट्रिकुलर झिल्ली tectal ंयूरॉन कोशिका निकायों को दूर । हल्के से यह एक नाजुक टास्क वाइपर भर घसीट द्वारा टिप तोड़ो ।
- पेंच पिपेट धारक में पिपेट और नीचे micromanipulator के माध्यम से ऑप्टिक tectum को कम ।
- वेंट्रिकुलर झिल्ली को tectum से दूर छील करने के लिए टूटे हुए पिपेट का प्रयोग करें ।
नोट: यह आवश्यक नहीं है कि संपूर्ण tectum से झिल्ली को हटाया जाए; एक छोटी सी खिड़की पर्याप्त और ंयूरॉंस के बहुत सारे तक पहुंच प्रदान करेगा ।
- पूरे सेल पैच दबाना रिकॉर्डिंग प्राप्त करें ।
नोट: इस बिंदु आगे से दृष्टिकोण Segev, एट अल में वर्णित के रूप में माउस मस्तिष्क स्लाइस से पूरे सेल पैच दबाना रिकॉर्डिंग बाहर ले जाने के लिए समान है. 16 (चित्रा १सी). - रिकॉर्ड tectal ंयूरॉन प्रतिक्रिया प्रकाश की एक पूरी क्षेत्र फ्लैश करने के लिए रेटिना पर पेश ।
- रेटिना पर प्रकाश की एक पूरी क्षेत्र फ्लैश परियोजना के लिए, एक ऑप्टिक टैडपोल आंख के बगल में फाइबर जगह है । ऑप्टिक फाइबर के दूसरे छोर पर है कि प्रकाश चमकदार नियंत्रित करने के लिए अनुमति देता है एक चर रोकनेवाला के साथ लाइन में एक एलईडी है । एम्पलीफायर के डिजिटल उत्पादन के नेतृत्व ट्रिगर. इस तरह, प्रकाश की तीव्रता बदलती के पूरे क्षेत्र चमक (चित्रा 4ए) दर्ज किया जा सकता है ।
2. पूरे मस्तिष्क की तैयारी
- 1.1 करने के लिए 1.3 चरण निष्पादित करें ।
नोट: इस तैयारी के लिए बाहरी समाधान में tubocurarine की कोई जरूरत नहीं है । - मस्तिष्क को अलग करना ।
- hindbrain (चित्रा 2) विच्छेद करने के लिए एक 25-G सुई का प्रयोग करें ।
- टैडपोल से पूरे मस्तिष्क को अलग करने के लिए, धीरे मस्तिष्क के नीचे सुई चलाने के लिए, सभी पार्श्व और ventral संयोजी ऊतक और तंत्रिका तंतुओं विच्छेद करने के लिए एक caudal-टू-rostral दिशा में.
- सिलिकॉन elastomer के एक ब्लॉक करने के लिए मस्तिष्क को सुरक्षित ।
- एक बार पूरी तरह से मुक्त, घ्राण बल्ब और hindbrain के माध्यम से एक और पिन के माध्यम से एक पिन रखने के द्वारा सिलिकॉन elastomer के एक ब्लॉक करने के लिए मस्तिष्क सुरक्षित (चित्रा 2बी) । यह tectal ंयूरॉंस से रिकॉर्डिंग के लिए इष्टतम विंयास है ।
- इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी रिग के लिए विदारक गुंजाइश से टिकी पूरे मस्तिष्क तैयारी युक्त पकवान ले जाएँ. चरण 1.4 में वर्णित के रूप में एक टूटी हुई ग्लास पिपेट का उपयोग कर वेंट्रिकुलर झिल्ली निकालें ।
- प्लेस के ऑप्टिक chiasm पर एक द्विध्रुवी उत्तेजक इलेक्ट्रोड (जहां midbrain में प्रत्येक आंख पार से axon पथ) को सीधे RGC axons सक्रिय करें ।
- प्लेस द्विध्रुवी उत्तेजक इलेक्ट्रोड rostral, और लगभग बगल में, बड़े मध्य निलय । ऑप्टिक chiasm तुरंत बड़े मध्य निलय (चित्रा 2बी) के लिए rostral स्थित है ।
- धीरे उत्तेजक इलेक्ट्रोड नीचे ऑप्टिक chiasm पर ऐसी है कि एक छोटे से गड्ढा ऊतक में गठन किया है कम । द्विध्रुवी इलेक्ट्रोड एक पल्स उत्तेजित करता है जो उत्तेजना की ताकत ठीक नियंत्रित किया जा करने के लिए अनुमति देता है द्वारा संचालित है ।
- प्लेस द्विध्रुवी उत्तेजक इलेक्ट्रोड rostral, और लगभग बगल में, बड़े मध्य निलय । ऑप्टिक chiasm तुरंत बड़े मध्य निलय (चित्रा 2बी) के लिए rostral स्थित है ।
- Segev, एट अल द्वारा वर्णित के रूप में पूरे सेल पैच दबाना रिकॉर्डिंग (चित्रा 2सी) निष्पादित करें । 16
3. क्षैतिज मस्तिष्क टुकड़ा तैयारी
- चरणों 2.1 करने के लिए 2.3 प्रदर्शन ।
- एक उस्तरा ब्लेड का प्रयोग सबसे पार्श्व चौथे उत्पाद (जो vivo में सबसे पृष्ठीय चौथे से मेल खाती है) एक ऑप्टिक tectum के एक पक्ष के । इस कटौती को rostral-caudal विमान के समानांतर बनाया गया है जैसा कि चित्रा 3एमें दिखाया गया है ।
- फिर से सिलिकॉन elastomer के पक्ष को कटा हुआ पक्ष का सामना करना पड़ के साथ मस्तिष्क पिन (ताकि सोमता और neuropil सीधे रिकॉर्डिंग के लिए पहुंचा जा सकता है) और सिलिकॉन elastomer ब्लॉक से दूर का सामना करना पड़ मस्तिष्क की वेंट्रिकुलर सतह (चित्रा 3 ख) (इतना है कि एक द्विध्रुवी इलेक्ट्रोड ऑप्टिक chiasm पर रखा जा सकता है) ।
- पूरे सेल पैच दबाना या स्थानीय Segev, एट अल द्वारा वर्णित के रूप में संभावित रिकॉर्डिंग (चित्रा 3सी) दायर प्रदर्शन । 16
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Representative Results
प्रकाश की एक पूरी क्षेत्र फ्लैश रिकॉर्ड करने के लिए रोशनी का अनुमान रेटिना पर पेश किया है, जबकि परिणामी प्रतिक्रिया व्यक्तिगत tectal ंयूरॉंस (चित्रा 4ए) से दर्ज की गई है । इस विशेष प्रोटोकॉल के लिए दोनों की प्रतिक्रिया को मापने के लिए डिज़ाइन किया गया है प्रकाश ंयूरॉन पर मोड़ ("पर" प्रतिक्रिया) और फिर बंद 15 एस मोड़ बाद में उपाय करने के लिए "बंद प्रतिक्रिया." Tectal न्यूरॉन्स आम तौर पर मजबूत प्रदर्शन और प्रतिक्रियाओं को बंद (यहाँ दिखाया वोल्टेज क्लैंप मोड में दर्ज की गई, ंयूरॉन के साथ clamped-60mV synaptic वर्तमान (चित्रा 4बी)). synaptic ड्राइव की मात्रा किसी भी एक न्यूरॉन द्वारा प्राप्त सहज synaptic घटनाओं (चित्रा 4सी) रिकॉर्डिंग द्वारा quantified जा सकता है. वर्तमान वोल्टेज रिश्तों (I-V curves) एक ही ंयूरॉन से तेजी से एक प्रकार का ध्रुवीकरण क्षमता और जिसके परिणामस्वरूप वोल्टेज-सक्रिय न+ और कश्मीर+ धाराओं, के रूप में संदर्भित करने के लिए कहा "मिश्रित वर्तमान ंयूरॉन कदम से उत्पंन किया जा सकता रिकॉर्डिंग "(चित्रा 4डी, ई) । यह अच्छी तरह से स्थापित किया गया है कि इन amphibian ंयूरॉंस के लिए, पीक Na+ और K+ धाराओं मिश्रित वर्तमान रिकॉर्डिंग के माध्यम से quantified जा सकता है क्योंकि चोटियों अस्थाई एक दूसरे4,7के साथ ओवरलैप नहीं करते ।
RGC axons के ऑप्टिक chiasm में प्रत्यक्ष सक्रियकरण सभी नदी के ऊपर गणना और दृश्य उत्तेजनाओं के प्रसंस्करण कि आंखों में जगह ले बाईपास, और presynaptic RGC axons और postsynaptic tectal ंयूरॉंस के बीच synaptic संचरण के अध्ययन के लिए अनुमति देता है इसके सबसे शुद्ध और कम फार्म । Tectal ंयूरॉन प्रतिक्रियाओं को RGC सक्रियण RGCs से उत्पंन कर रहे है प्रकाश द्वारा उत्तेजित या सीधे एक द्विध्रुवी उत्तेजक दो घटकों से मिलकर इलेक्ट्रोड का उपयोग: एक monosynaptic घटक (सक्रिय synaptic से प्रत्यक्ष RGCs इनपुट) और एक polysynaptic घटक (स्थानीय आवर्तक नेटवर्क गतिविधि ंयूरॉन पर वापस खिला दर्ज की जा रही है) । प्रकाश पैदा प्रतिक्रियाओं के मामले में, monosynaptic और polysynaptic घटकों को कुछ unनिर्धारक राशि से एक दूसरे के साथ ओवरलैप । इस लौकिक ओवरलैप सीमा क्या रेटिना और ऑप्टिक tectum के बीच synaptic संचरण के बारे में निष्कर्ष निकाला जा सकता है । एक पूरे मस्तिष्क तैयारी का उपयोग करना और एक इलेक्ट्रोड ऑप्टिक chiasm पर रखा के माध्यम से सीधे RGC axon पथ को सक्रिय (चित्रा 5), तथापि, एक मोनो और polysynaptic घटक है कि अनिवार्य रूप से गैर समय में ओवरलैपिंग का उत्पादन कर रहे हैं. द्विध्रुवी इलेक्ट्रोड की उत्तेजक ताकत समायोजित किया जा सकता है. उत्तेजक शक्ति बढ़ जाती है के रूप में, वहाँ RGC axons सक्रिय की एक बड़ी संख्या है (चित्रा 5बी). एक न्यूनतम उत्तेजना प्रोटोकॉल एक व्यक्ति tectal ंयूरॉन पर एक व्यक्ति RGC axon की synaptic ताकत निर्धारित करता है; एक अधिक से अधिक उत्तेजना प्रोटोकॉल कुल, या अधिकतम, synaptic इनपुट सभी RGC axons संयुक्त (चित्रा 5सी) से दर्शाता है । उत्तेजक निरोधात्मक synaptic इनपुट (E:I अनुपात) एक व्यक्ति tectal ंयूरॉन द्वारा प्राप्त करने के लिए उचित अनुपात सामांय दृश्य समारोह18के लिए महत्वपूर्ण है । चित्र 5 D RGC-पैदा किए गए उत्तेजक और निरोधात्मक मौजूदा अंश का एक उदाहरण दिखाता है जो एक व्यक्ति tectal ंयूरॉन से रिकॉर्ड किया गया है । RGC presynaptic axon टर्मिनलों से ट्रांसमीटर रिहाई की संभावना युग्मित पल्स रिकॉर्डिंग से मापा जाता है. इस के लिए, postsynaptic tectal ंयूरॉन वोल्टेज दबाना मोड में दर्ज की है synaptic धाराओं को मापने के लिए, जबकि RGC axons क्रमिक सक्रिय कर रहे हैं, एक 50 ms समय अंतराल (चित्रा 5ई) से अलग है ।
पूरे सेल पैच दबाना रिकॉर्डिंग किसी भी दैहिक परत में रहने वाले tectal न्यूरॉन्स से बाहर किया जा सकता है । पूरे मस्तिष्क की तैयारी के लिए इसी तरह, RGC axons ऑप्टिक chiasm पर एक द्विध्रुवी रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड रखकर सक्रिय किया जा सकता है (चित्रा 6). पूरे मस्तिष्क की तैयारी में किए गए सभी रिकॉर्डिंग भी इस क्षैतिज मस्तिष्क टुकड़ा तैयारी का उपयोग कर प्रदर्शन किया जा सकता है । चित्र 6 बी एक RGC-पैदा की प्रतिक्रिया का एक उदाहरण के ट्रेस से पता चलता है सतही परत में एक ंयूरॉन से दर्ज की गई । यह तैयारी भी tectal dendrites पर RGC synaptic इनपुट के स्थानिक पैटर्न के लिए अनुमति देता है मापा जाएगा । इस के लिए, RGC क्षेत्र संभावित औसत दर्जे का-पार्श्व धुरी (यानी, बाहर के समीपस्थ धुरी) neuropil (चित्रा 6सी) के साथ हर 10 µm रिकॉर्ड कर रहे हैं । यह कार्यात्मक RGC इनपुट के पैटर्न के एक उच्च संकल्प प्रोफ़ाइल उत्पंन करता है । क्षेत्र की क्षमता तो दूसरा स्थानिक व्युत्पंन14 और वर्तमान स्रोत घनत्व बारी में एक छवि साजिश में तब्दील हो सकता है की गणना से वर्तमान स्रोत घनत्व में तब्दील किया जा सकता है । चित्रा 6सी में छवि साजिश से पता चलता है कि सबसे मजबूत RGC इनपुट neuropil के अधिक बाहर का क्षेत्र लक्ष्य ।
चित्र 1। vivo में तैयारी कार्यविधियां. (a) टैडपोल सिलिकॉन elastomer के एक टुकड़े पर टिकी हुई है । पिन सफेद तीर से संकेत मिलता है । अधिक caudal पिन स्थिति नोट करने के लिए impaling ऑप्टिक पथ से बचने के । सफेद डैश्ड रेखा midline को इंगित करती है । (ख) ज़ूम-पृष्ठीय midline के साथ काटने और ओवरले त्वचा को हटाने के बाद पूरे मस्तिष्क को देखने में । (ग) पूरे सेल पैच- vivo मेंरिकॉर्डिंग दबाना । (एल: पार्श्व । एम: औसत दर्जे का । आर: Rostral । ग: Caudal । डी: पृष्ठीय । वि: Ventral. ओबी: घ्राण बल्ब. OT: ऑप्टिक Tectum । HB: Hindbrain) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 2 . पूरे मस्तिष्क तैयारी प्रक्रियाओं । (क) मस्तिष्क midline के साथ पट्टिका के बाद, hindbrain के लिए गंभीर है । (ख) पूरे मस्तिष्क बाहर विच्छेदित है और सिलिकॉन elastomer के लिए नीचे टिकी है । सफेद तारे के बाएं घ्राण बल्ब में पिन इंगित करता है । लाल बॉक्स tectum के मध्य तीसरे को इंगित करता है, यानी, रिकॉर्डिंग के लिए लक्ष्य क्षेत्र । (ग) पूरे मस्तिष्क तैयारी का उपयोग कर पूरे सेल पैच दबाना रिकॉर्डिंग । काला तारांकन चिह्न अन-स्क्रैप किए गए वेंट्रिकुलर झिल्ली के उस क्षेत्र को इंगित करता है जहाँ रिकॉर्डिंग के लिए कक्षों तक पहुँचा नहीं जा सकता. जहां झिल्ली को सफलतापूर्वक हटा दिया गया है, सोमता अधिक विशिष्ट और परिभाषित दिखाई देता है । तीर एक अस्वस्थ ंयूरॉन इंगित करता है । (PZ: प्रफलन जोन । LMV: बड़े औसत दर्जे का निलय । ओबी: घ्राण बल्ब. OT: ऑप्टिक Tectum । HB: Hindbrain । एल: पार्श्व । एम: औसत दर्जे का । आर: Rostral । ग: Caudal । डी: पृष्ठीय । वि: Ventral) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 3 . क्षैतिज मस्तिष्क स्लाइस तैयारी प्रक्रियाओं । (क) ऑप्टिक tectum के एक पक्ष का सबसे पार्श्व भाग कटा हुआ होगा (डैश्ड रेखा द्वारा संकेत) पूरे मस्तिष्क की तैयारी के बाद । (ख) सिलिकॉन elastomer के पक्ष को नीचे पिन किया जा रहा है के बाद क्षैतिज मस्तिष्क टुकड़ा तैयारी । डबल व्हाइट लाइंस एक उत्तेजक इलेक्ट्रोड ऑप्टिक chiasm पर रखा प्रतिनिधित्व करते हैं । (ग) एक क्षैतिज मस्तिष्क टुकड़ा तैयारी का उपयोग कर सोमा परतों और neuropil के मद्देनजर जूम-इन । डैश्ड वक्र सोमा परतों और neuropil के बीच सीमा को इंगित करता है । यह आंकड़ा Hamodi, एट अल से संशोधित किया गया है । 14 (एल: पार्श्व । एम: औसत दर्जे का । आर: Rostral । ग: Caudal । डी: पृष्ठीय । वि: Ventral. ओबी: घ्राण बल्ब. ओसी: ऑप्टिक Chiasm. OT: ऑप्टिक Tectum । HB: Hindbrain) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 4 . एक vivo में तैयारी से रिकॉर्डिंग । (क) योजनाबद्ध vivo रिकॉर्डिंग में एक के ठेठ विंयास दिखा । (ख) प्रकाश पर प्रकाश और प्रतिक्रियाओं के बंद प्रकाश सहित प्रतिक्रिया पैदा की । इनसेट अंश-पर-और ऑफ-रिस्पांस, क्रमशः के दृश्य में ज़ूम कर रहे हैं । (ग) सहज उत्तेजक postsynaptic स्वरुपात रिकॉर्डेड. (घ) Na+ और K+ वोल्टेज के जवाब में धाराओं से दबाना-60 एमवी से 30 एमवी के लिए एक भी ंयूरॉन । (ङ) चतुर्थ भूखंडों में अंश से उत्पन्न (घ). सभी रिकॉर्डिंग में आयोजित ंयूरॉन के साथ किया गया था-60 एमवी को छोड़कर (D) चतुर्थ भूखंड उत्पंन करने के लिए; न्यूरॉन्स तेजी से अधिक ध्रुवीकरण क्षमता के लिए कदम रखा है, 10 एमवी वेतन वृद्धि में, वोल्टेज पर निर्भर धाराओं को सक्रिय करने के लिए. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 5 . एक पूरे दिमाग की तैयारी से रिकॉर्डिंग । (क) योजनाबद्ध एक उत्तेजक इलेक्ट्रोड ऑप्टिक chiasm पर रखा सहित पूरे मस्तिष्क रिकॉर्डिंग के ठेठ विन्यास दिखा (हरे और लाल लाइनों RGC axons का प्रतिनिधित्व करते हैं). (ख) RGC उत्तेजना शक्ति के परिवर्तन करने के लिए RGC प्रतिक्रियाओं के निशान ओवरले । (ग) अधिकतम उत्तेजना प्रतिक्रिया (बाएं) और ंयूनतम उत्तेजना प्रतिक्रिया (दाएं) । (घ) एक RGC-पैदा उत्तेजक और एक एकल ंयूरॉन पर निरोधात्मक प्रतिक्रिया । (E) युग्मित पल्स RGC-एक व्यक्ति के ंयूरॉन प्रतिक्रिया पैदा की । (ओबी: घ्राण बल्ब. ओसी: ऑप्टिक Chiasm. OT: ऑप्टिक Tectum) । सभी रिकॉर्डिंग में आयोजित ंयूरॉन के साथ किया गया था-60 एमवी (घ) को छोड़कर उत्तेजक और निरोधात्मक आदानों को मापने के लिए: उत्तेजक इनपुट γ-Aminobutyric एसिड (गाबा) की उत्क्रमणीय क्षमता पर ंयूरॉन पकड़ द्वारा दर्ज की गई है-मध्यस्थता क्लोराइड धाराओं (-45 एमवी); α-एमिनो-3-hydroxy-5-मिथाइल-4-isoxazolepropionic एसिड (AMPA) की उत्क्रमणीय क्षमता पर न्यूरॉन को पकड़कर निरोधात्मक इनपुट-मध्यस्थता धाराओं (+ 5 एमवी). कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 6 . एक क्षैतिज मस्तिष्क टुकड़ा तैयारी से रिकॉर्डिंग । (a) एक क्षैतिज मस्तिष्क टुकड़ा तैयारी के विंयास दिखा योजनाबद्ध । ध्यान दें कि हालांकि उत्तेजक इलेक्ट्रोड ऑप्टिक chiasm में रहता है, रिकॉर्डिंग पिपेट अब क्षैतिज मस्तिष्क टुकड़ा तैयारी द्वारा उजागर सभी tectal परतों भर में कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए तैनात है । (B) tectum की सतही परत में रहने वाले न्यूरॉन से एक RGC प्रतिक्रिया । (C) neuropil में रिकॉर्ड किए गए फ़ील्ड संभावितों और छवि प्लॉट हीट मैप्स द्वारा दिखाए गए कनवर्टेड वर्तमान स्रोत घनत्व (सीएसडीएस) को दर्ज किया गया है । (OC: ऑप्टिक Chiasm । OT: ऑप्टिक Tectum । HB: Hindbrain) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
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Discussion
इस काम में वर्णित सभी तरीकों विकासात्मक चरण 42 और 49 के बीच tadpoles से tectal न्यूरॉन्स रिकॉर्डिंग के लिए अनुकूलित कर रहे हैं (Neiuwkoop और फेबर15के अनुसार मंचन किया). 42 चरण तक, tadpoles पर्याप्त रूप से बड़े और पर्याप्त रूप से विकसित कर रहे हैं ताकि कीट पिन vivo रिकॉर्डिंग में और पूरे मस्तिष्क विच्छेदन के लिए बाहर ले जाने के लिए मस्तिष्क के दोनों ओर पर रखा जा सकता है. पहले के चरणों में, जब tadpoles मूलतः दो आयामी है (यानी, फ्लैट), यहां वर्णित दृष्टिकोण इष्टतम नहीं हैं ।
कारण में आसानी जो tectal ंयूरॉंस तक पहुंचा और पूरे सेल विंयास में दर्ज किया जा सकता है, इस मॉडल सर्किट के बारे में मौलिक खोजों के लिए एक बड़ा केंद्र किया गया है कैसे तंत्रिका सर्किट के रूप में कार्य करते समय और कार्य करते हुए 19 गठन । यहाँ हम कैसे vivo और पूरे मस्तिष्क की तैयारी, विभिन्न रिकॉर्डिंग विन्यास, और डेटा के विभिन्न प्रकार के उदाहरण के में टैडपोल प्रदर्शन करने के लिए सहित tectal न्यूरॉन्स से पूरे सेल पैच क्लैंप रिकॉर्डिंग प्राप्त करने के लिए वर्णन किया है. निंनलिखित शक्तियों और प्रत्येक तैयारी की सीमाओं, उच्च गुणवत्ता पूरे सेल रिकॉर्डिंग को प्राप्त करने के लिए सुझावों के बाद की एक चर्चा है ।
Xenopus tadpoles चरण 47/48, लगभग 7-8 दिनों के बादनिषेचन3, 13 द्वारा दृश्य परिहार व्यवहार प्रदर्शित शुरू । इसका मतलब यह है कि विकास के इन अपेक्षाकृत प्रारंभिक चरणों में भी, retinotectal सर्किट कार्य कर रहा है और दृश्य उत्तेजनाओं प्रसंस्करण में सक्षम है । बुनियादी विकास और retinotectal सर्किट के प्लास्टिक के बारे में सवाल सीधे vivo में तैयारी का उपयोग करने के लिए दृश्य उत्तेजना रेटिना पर पेश करने के लिए tectal ंयूरॉन प्रतिक्रियाओं रिकॉर्ड संबोधित किया गया है । टैडपोल में vivo रिकॉर्डिंग में अपेक्षाकृत सरल तंत्रिका तंत्र और एक खोपड़ी की कमी के सापेक्ष सादगी के कारण स्तनधारी में समकक्ष रिकॉर्डिंग विन्यास की तुलना में कर रहे हैं. क्योंकि व्यक्तिगत tectal ंयूरॉन सोमाs vivo मेंvisualized किया जा सकता है, एक दिया ंयूरॉन पर सील और पूरे सेल पैच दबाना रिकॉर्डिंग विंयास अनिवार्य रूप से बाहर ले जाने के लिए बराबर है पूरी सेल पैच दबाना में कुतर स्लाइस तैयारियों. Tadpoles आम तौर पर रिग पर कई घंटे के लिए जीवित (जो आसानी से दिल की निगरानी द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है हरा) । एक vivo तैयारी में टैडपोल की अंतर्निहित सीमा है कि केवल tectal न्यूरॉन्स ऑप्टिक tectum की गहरी दैहिक परत में रहने, परत है कि तुरंत बड़े मध्य निलय के निकट है, रिकॉर्डिंग के लिए सुलभ हैं (चित्रा 1 ). इसका मतलब यह है कि tectum की बाहरी दैहिक परतों में रहने वाले tectal न्यूरॉन्स को vivo में काफी हद तक बेरोज़गारी मिली है.
पूरे मस्तिष्क की तैयारी का प्रयोगात्मक लाभ यह है कि यह आंखों और त्वचा में परिधीय संवेदी रिसेप्टर्स से मस्तिष्क को अलग, सभी नकली संवेदी संचालित गतिविधि को नष्ट करने. हालांकि अब सक्षम दृश्य उत्तेजनाओं द्वारा संचालित किया जा रहा है, RGC axonal आदानों कि लक्ष्य tectum अभी भी पूरे मस्तिष्क तैयारी में मौजूद हैं और वे सीधे एक उच्च नियंत्रित तरीके से एक द्विध्रुवी उत्तेजक इलेक्ट्रोड के माध्यम से सक्रिय किया जा सकता (FHC) पर रखा ऑप्टिक chiasm जहां RGC axon पथ के दो सेट मस्तिष्क में प्रवेश करते हैं । पूरे मस्तिष्क की तैयारी के पहले की सूचना का उपयोग 1996 में किया गया था, वू एट अल द्वारा एक महत्वपूर्ण अध्ययन में । 8, जिसमें RGC axons एक द्विध्रुवी उत्तेजक का उपयोग कर सक्रिय किया गया इलेक्ट्रोड ऐसी है कि लेखकों postsynaptic tectal ंयूरॉंस पर व्यक्तिगत RGC axons की ताकत यों तो सकता है, और ऐसा करने में की प्रगति के बारे में मौलिक खोजों बनाया synapse परिपक्वता । vivo में तैयारी के साथ के रूप में, पूरे मस्तिष्क तैयारी केवल उन न्यूरॉन्स गहरी परत में रहने के लिए उपयोग की अनुमति देता है, वेंट्रिकुलर झिल्ली के निकट.
हालांकि ऑप्टिक tectum लगभग नौ कोशिका शरीर परतों से बना है17, सभी पिछले इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी अध्ययन गहरी परत tectal ंयूरॉंस पर ध्यान केंद्रित किया है क्योंकि पारंपरिक पूरे मस्तिष्क और vivo में तैयारी (वर्णित ऊपर) केवल गहरी परत के ंयूरॉंस के लिए उपयोग की अनुमति । आदेश में सभी दैहिक परतों में tectal ंयूरॉंस का उपयोग करने के लिए, गहरे से सबसे सतही के रूप में के रूप में अच्छी तरह से पूरे neuropil जहां RGC axons synaptic ंयूरॉन tectal के साथ dendrites कनेक्शन फार्म, हम एक संशोधित पूरे मस्तिष्क तैयारी विकसित, के रूप में संदर्भित " क्षैतिज मस्तिष्क टुकड़ा तैयारी "(चित्रा 314) । पूरे मस्तिष्क की तैयारी के साथ के रूप में, क्षैतिज मस्तिष्क टुकड़ा तैयारी मस्तिष्क के भीतर RGC axons रखता है और वे ऑप्टिक chiasm पर एक द्विध्रुवी उत्तेजक इलेक्ट्रोड रखकर नियंत्रित किया जा सकता है.
कुल मिलाकर, तैयारी के दृश्य का अनुकूलन और tectal ंयूरॉन सोमता के लिए उपयोग के लिए पूरी सेल पैच दबाना रिकॉर्डिंग बाहर ले डिजाइन किए हैं । सोमा के लिए सीधी पहुँच गुणवत्ता पूरे सेल पैच दबाना रिकॉर्डिंग के लिए आवश्यक है: ंयूरॉन के अंदर तक पहुंच एक बहुत मजबूत के गठन की आवश्यकता है (> 1 × 109 Ω) पिपेट और ंयूरॉन है प्लाज्मा झिल्ली, जो प्रत्यक्ष की आवश्यकता के बीच सील उस झिल्ली पर पिपेट टिप के संपर्क । इसलिए, वेंट्रिकुलर झिल्ली की पर्याप्त हटाने सफल रिकॉर्डिंग के लिए महत्वपूर्ण है । इसके अलावा, सफल RGC के लिए कुंजी पैदा की रिकॉर्डिंग का सही स्थान है द्विध्रुवी उत्तेजक ऑप्टिक chiasm पर इलेक्ट्रोड । मूलतः सभी tectal न्यूरॉन्स RGC axons से सीधे synaptic इनपुट प्राप्त करते हैं. यदि कोई RGC-पैदा की प्रतिक्रिया मनाया जाता है, तो यह सबसे द्विध्रुवी इलेक्ट्रोड की गलत नियुक्ति के कारण इस तरह की संभावना है कि यह ऑप्टिक chiasm पर नहीं है और ऑप्टिक नसों से संपर्क नहीं है । यह बस फिर से स्थिति उत्तेजक इलेक्ट्रोड द्वारा सही किया जा सकता है. पुन: स्थिति के बाद RGC-पैदा प्रतिक्रियाओं का निरीक्षण करने में विफलता द्विध्रुवी इलेक्ट्रोड का मतलब हो सकता है कि RGC axon प्रक्षेपण गलती से विच्छेदन के दौरान गंभीर हो गया था । इस मामले में, यह एक नई तैयारी के साथ शुरू करने के लिए आवश्यक है । अंत में, एक RGC प्रतिक्रिया का पालन विफलता एक सेल है कि एक आम tectal ंयूरॉन नहीं है से रिकॉर्डिंग के कारण हो सकता है । उदाहरण के लिए, glia आम तौर पर प्रदर्शित नहीं सामांय RGC-पैदा monosynaptic tectal ंयूरॉंस द्वारा प्रदर्शित प्रतिक्रिया, और न तो बड़े mesencephalic ंयूरॉंस कि पाया गया है, हालांकि बहुत कम संख्या में, ऑप्टिक tectum में रहने वाले20। tectal न्यूरॉन्स की सरासर संख्या के कारण इन गैर-tectal कोशिकाओं में से एक से रिकॉर्डिंग की संभावना बहुत कम है. बेशक, गुणवत्ता रिकॉर्डिंग भी tectal ंयूरॉंस की आवश्यकता के लिए स्वस्थ हो । एक स्वस्थ tectal ंयूरॉन के लक्षण एक कॉंपैक्ट दौर या अंडाकार के आकार का सोमा कि हल्के रंग का है और धब्बों के बिना कर रहे हैं । एक बार पूरे सेल रिकॉर्डिंग विंयास हासिल किया गया है, ंयूरॉन के स्वास्थ्य और इस तरह की झिल्ली क्षमता, इनपुट प्रतिरोध, और समाई आराम के रूप में मौलिक बिजली के गुणों को मापने के द्वारा electrophysiological स्तर पर मूल्यांकन किया जा सकता है . विकास के चरणों के बीच स्वस्थ tectal ंयूरॉंस की आराम झिल्ली क्षमता 42 और 49 लगभग है-45 एमवी, लगभग 1 GΩ की एक औसत इनपुट प्रतिरोध के साथ, और 10-12 पीएफ की एकसमाई3, 4, 5. न्यूरॉन्स का एक छोटा सा अंश अनिवार्य रूप से वेंट्रिकुलर झिल्ली को हटाने के कारण क्षतिग्रस्त हो जाएगा. क्षतिग्रस्त या अस्वस्थ न्यूरॉन्स के सोमता दानेदार, फूला हुआ, या shriveled दिखाई देते हैं. एक अस्वस्थ ंयूरॉन का एक उदाहरण दिखाया गया है चित्रा 2सी। न्यूरॉन्स के बहुमत अस्वस्थ दिखाई देते हैं, तो यह बाहरी रिकॉर्डिंग समाधान के साथ कुछ गड़बड़ है कि एक प्रतिबिंब हो सकता है, तो यह ताजा बाहरी रिकॉर्डिंग समाधान बनाने के लिए सिफारिश की है. स्वस्थ दिखने के अलावा, रिकॉर्डिंग के लिए सबसे अच्छा ंयूरॉंस आम तौर पर अंय ंयूरॉंस की एक बड़ी संख्या के साथ जुड़े रहे हैं, के रूप में अलग होने का विरोध किया । साथ ही, उन कक्षों का चयन करें जो आसानी से पहुंच योग्य हों । उदाहरण के लिए, ऊतक पुश करने के लिए एक सेल का उपयोग भी मुश्किल नहीं है क्योंकि यह ऊतक को नुकसान या ऊतक चाल और इस तरह जगह से बाहर उत्तेजक इलेक्ट्रोड बदलाव हो सकता है । अंत में, रिकॉर्डिंग tectum (चित्रा 2बी) के मध्य तीसरे करने के लिए rostro-caudal अक्ष4,8भर में मौजूद है कि विकासात्मक ढाल के कारण संभावित मतभेदों से बचने के लिए प्रतिबंधित किया जाना चाहिए, जब तक, ज़ाहिर है, प्रयोग का ध्यान aforementioned विकासात्मक ढाल है । tectum उचित प्रफलन अंचल का क्षेत्र rostral है और बड़े मध्य निलय के caudal धार को caudal है.
पूरे सेल पैच दबाना रिकॉर्डिंग तकनीक अपनी सीमाओं के बिना नहीं है । सामांय में, रिकॉर्डिंग की इस शैली एक समय में एक ंयूरॉन रिकॉर्डिंग शामिल है । यह एक नई पीढ़ी GCaMP6 कैल्शियम संकेतक है, जो न्यूरॉन्स की बड़ी आबादी की गतिविधि के लिए एक टुकड़ा तैयारी में एक साथ छवि और vivo मेंकरने के लिए अनुमति देने के इमेजिंग शामिल दृष्टिकोण के विपरीत है ।
एक और पूरे सेल वोल्टेज दबाना रिकॉर्डिंग के लिए निहित दोष अंतरिक्ष दबाना त्रुटि (वोल्टेज को नियंत्रित करने में असमर्थता बहुत आगे सोमा से परे है), जो वोल्टेज के लौकिक नियंत्रण की सीमा4। कुल मिलाकर, इन वोल्टेज दबाना मुद्दों को कम कर रहे है जब tectal ंयूरॉंस से रिकॉर्डिंग हालांकि, क्योंकि उनके अपेक्षाकृत छोटे आकार, मामूली वृक्ष arborizations, और अपेक्षाकृत छोटे और धीमी धाराओं स्तनधारी ंयूरॉंस की तुलना में । tectal न्यूरॉन्स के इन विशेषताओं उन्हें विशेष रूप से वोल्टेज दबाना रिकॉर्डिंग के लिए उत्तरदायी प्रदान, कई मापदंडों के माप, और व्यक्तिगत ंयूरॉंस के लिए प्रोफाइल के निर्माण5,6.
भविष्य दिशाओं दृश्य उत्तेजनाओं के प्रसंस्करण में बाहरी परत ंयूरॉंस के समारोह की विशेषता के लिए vivo में क्षैतिज मस्तिष्क टुकड़ा तैयारी में एक अनुकूलन शामिल हैं ।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
NIH ग्रांट SBC COBRE 1P20GM121310-01 द्वारा समर्थित ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stemi Stereo 508 | Zeiss | 495009-0006-000 | Dissecting microscope |
| MS-222 "Tricane" | Finquel | ARF5G | Amphibian general anesthetic |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-3 | Used to prepare Stienberg's solution and external solution |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | P217-500 | Used to prepare Stienberg's solution and external solution |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-1KG | Used to prepare Stienberg's solution and external solution |
| Calcium nitrate tetrahyrate (Ca(NO3)•4H2O) | Sigma-Aldrich | 237124-500G | Used to prepare Stienberg's solution |
| Magnesium Sulfate (MgSO4) | Mallinckrodt Chemicals | 6066-04 | Used to prepare Steinberg's solution |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5080-500G | Used to prepare external recording solution |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | J.T. Baker | 2444-01 | Used to prepare external recording solution |
| D-glucose Anhydrous | Mallinckrodt Chemicals | 6066-04 | Used to prepare external recording solution |
| Tubocurarine hydrochloride pentahydrate | Sigma | T2379 | Nicotinic acetylcholine receptor antagonist |
| Insect Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | 0.1mm diameter stainless steel pins |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 761028 | Preweighed monomer and curing agent kit |
| Sterile Polystyrene Petri Dish - 60x15mm | Fisher Scientific | AS4052 | Small petri dishes |
| PrecisionGlide Needle 25Gx5/8 (.0.5mm X 16mm) | BD | 305122 | Syringe needles |
| 1mL Slip Tip Tuberculin Syringe | BD | 309659 | Disposable, sterile syringes |
| Borosilicate pipette glass | Sutter Instrument | BF150-86-10HP | Pulled to desired specifications using pipette pulling machine |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | Fabricates micropipettes for electrophysiology recording |
| Kimwipes Kimtech wipes | Kimberly-Clark | 34120 | Delicate task lint-free wipers |
| Axon Instruments MultiClamp 700B Headstage CV-7B | Molecular Devices | 1-CV-7B | Current clamp and voltage clamp headstage |
| MP-285 Motorized Manipulator with Tabletop Controller | Sutter Instrument | MP-285/T | Control for headstage on electrophysiology rig |
| Fiber-Coupled LED (Green) | Thorlabs | M530F2 | Fiber optic cable paired with green LED |
| Cluster Bipolar Electrode (25µm diameter) | FHC | 30207 | Bipolar stimulating electrode |
| ISO-Flex Stimulator | A.M.P.I. (Israel) | Contact manufacturer | Flexible stimulus isolator |
| Axon Instruments 700B Multipatch Amplifier | Molecular Devices | 2500-0157 | Amplifier for voltage- and current-clamp recording |
| Digidata 1322A digitizer | Molecular Devices | 2500-135 | Data acquisition system for electrophysiology recording |
| Axio Examiner.A1 | Zeiss | 491404-0001-000 | Microscope for electrophysiology |
| Micro-g Lab Table | TMC | 63-533 | Air table for electrophysiology microscope |
| Inspiron 620 Personal Desktop Computer with Windows 7 64-bit | Dell | D06D001 | Computer running electrophysiology software |
| c2400 CCD camera | Hamamatsu | 70826-5 | Charge-coupled device camera for electrophysiology imaging |
| 7 O'Clock Super Platinum Stainless Razorblades | Gillette | CMM01049 | Platinum-coated stainless razor blades |
| Transfer Pipets | Fisher Scientific | 13-711-7M | Disposable Polyethylene transfer pipets |
References
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